RU2745902C1 - Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs - Google Patents

Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs Download PDF

Info

Publication number
RU2745902C1
RU2745902C1 RU2019142090A RU2019142090A RU2745902C1 RU 2745902 C1 RU2745902 C1 RU 2745902C1 RU 2019142090 A RU2019142090 A RU 2019142090A RU 2019142090 A RU2019142090 A RU 2019142090A RU 2745902 C1 RU2745902 C1 RU 2745902C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mc4r
pigs
gene
melanocortin
meat
Prior art date
Application number
RU2019142090A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Маргарет Сержевна Форнара
Николай Владимирович Бардуков
Ольга Васильевна Костюнина
Наталия Анатольевна Зиновьева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста"
Priority to RU2019142090A priority Critical patent/RU2745902C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2745902C1 publication Critical patent/RU2745902C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to methods for determining polymorphism of genes, in particular melanocortin 4 receptor gene (MC4R) associated with meat and fattening properties of pigs. Technical result of the proposed invention is achieved by the fact that a method of determining polymorphism G→A G→A in position 2207 of gene MC4R (Asp298Asn)(number GenBank FJ357500), associated with meat and fattening properties of pigs, including PCR with real-time detection of results, where allele G corresponds to fluorescence curves on the FAM channel, and allele A—fluorescence curves on the R6G channel.
EFFECT: what is presented is a method for determining polymorphism of melanocortin 4 receptor gene (MC4R) associated with meat and fattening properties of pigs.
1 cl, 2 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена рецептора меланокортина 4 (MC4R), ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, и может быть использовано в рамках проведения маркерной селекции.The invention relates to molecular genetics, in particular to methods for determining gene polymorphism, in particular the gene for the melanocortin 4 receptor (MC4R) associated with meat and fattening qualities of pigs, and can be used in the framework of marker selection.

Поиск и идентификация ДНК-маркеров, ассоциированных с показателями продуктивности сельскохозяйственных животных, приобретает особую актуальность в связи с интенсификацией отраслей животноводства [Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных / Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Костюнина О.В., Быкова А.С, Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. // Зоотехния. - 2009. - №8. - с. 26-27; Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных / Зиновьева Н.А., Костюнина О.В., Гладырь Е.А., Банникова А.Д., Харзинова В.Р., Ларионова П.В., Шавырина К.М., Эрнст Л.К. // Зоотехния. - 2010. - №1. - с. 8-10]. Один из главных генов, определяющих уровень развития продуктивных признаков свиней, - ген рецептора меланокортина 4 (MC4R), представляющий собой один из пяти идентифицированных рецепторов меланокортина, которые являются семидоменными трансмембранными рецепторами, сопряженными с G-белками, расположенными в ядрах гипоталамуса [Molecular cloning of anovel melanocortin receptor / I. Gantz, Y. Konda, T. Tashiro et al. // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268 (11). - P. 8246-8250].The search and identification of DNA markers associated with indicators of productivity of farm animals is of particular relevance in connection with the intensification of livestock industries [Molecular methods in the diagnosis of diseases and hereditary defects in farm animals / Gladyr E.A., Zinovyeva N.A., Ernst L. K., Kostyunina O.V., Bykova A.S., Bannikova A.D., Kudina E.P., Brem G. // Animal Science. - 2009. - No. 8. - from. 26-27; The role of DNA markers of signs of productivity of farm animals / Zinovieva N.A., Kostyunina O.V., Gladyr E.A., Bannikova A.D., Kharzinova V.R., Larionova P.V., Shavyrina K.M. , Ernst L.K. // Animal science. - 2010. - No. 1. - from. 8-10]. One of the main genes that determine the level of development of productive traits in pigs is the melanocortin 4 receptor (MC4R) gene, which is one of five identified melanocortin receptors, which are seven-domain transmembrane receptors coupled to G-proteins located in the nuclei of the hypothalamus [Molecular cloning of anovel melanocortin receptor / I. Gantz, Y. Konda, T. Tashiro et al. // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268 (11). - P. 8246-8250].

Ген рецептора меланокортина 4 у свиней расположен на хромосоме 1 (SSCI) в участке q22-q27. Влияние полиморфизма гена MC4R широко изучалось на признаках: потребление корма, рост, развитие и упитанность свиней. Экспрессия рецептора MC4R происходит в той области мозга, которая регулирует аппетит, влияет на потребление корма и баланс энергии. Мутация G→A, обуславливающая замену Asp298Asn в аминокислотной последовательности впервые была выявлена Kim K.S. с соавторами [А missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135].The gene for the melanocortin 4 receptor in pigs is located on chromosome 1 (SSCI) in the q22-q27 region. The influence of the MC4R gene polymorphism has been extensively studied on the traits: feed intake, growth, development and body condition of pigs. Expression of the MC4R receptor occurs in the region of the brain that regulates appetite, feed intake and energy balance. The G → A mutation causing the Asp298Asn substitution in the amino acid sequence was first identified by Kim K.S. et al. [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135].

Функциональный анализ этой мутации показал дефектную передачу сигнала мутантного белка MC4R (298 Asn) к аденилатциклазе в мембране нейтральных клеток, что обуславливает пониженный внутриклеточный уровень АМФ после корректного связывания лиганда с рецептором [Functional and phylogenetic analyses of a melanocortin-4 receptor mutation in domestic pigs / K.S. Kim, J.M. Reecy, W.H. Hsu, L.L. Anderson, M.F. Rothschild // Domestic Animal Endocrinology. - 2004. - V. 26. - P. 75-86]. Последствием мутации в гене MC4R является нарушение проведения лептинового сигнала, который посредством обратной отрицательной связи регулирует секрецию клеток жировой ткани, что в свою очередь приводит к нарушению липидного обмена и изменению процесса формирования признаков, характеризующих мясные и откормочные качества свиней [Степень влияния гена MC4R на фенотип организма / Л.В. Гетманцева / Тезисы докладов XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011». -Москва. - 2011. - С. 89].Functional analysis of this mutation showed defective signal transmission of the mutant MC4R protein (298 Asn) to adenylate cyclase in the membrane of neutral cells, which causes a decreased intracellular AMP level after correct binding of the ligand to the receptor [Functional and phylogenetic analyzes of a melanocortin-4 receptor mutation in domestic pigs KS Kim, J.M. Reecy, W.H. Hsu, L.L. Anderson, M.F. Rothschild // Domestic Animal Endocrinology. - 2004. - V. 26. - P. 75-86]. The consequence of a mutation in the MC4R gene is a disturbance in the conduction of the leptin signal, which through a negative feedback regulates the secretion of adipose tissue cells, which in turn leads to a disturbance in lipid metabolism and a change in the formation of traits characterizing the meat and fattening qualities of pigs [The degree of influence of the MC4R gene on the phenotype organism / L.V. Getmantseva / Abstracts of the XVIII International Scientific Conference of Students, Postgraduates and Young Scientists "Lomonosov 2011". -Moscow. - 2011. - S. 89].

В качестве экономически значимой в свиноводческой промышленности данная мутация стала рассматриваться в Бельгии, где в качестве отцовской породы часто используется медленно растущая порода свиней пьетрен.As economically significant in the pig industry, this mutation has come to be seen in Belgium, where the slow-growing Pietrain pig breed is often used as the parent breed.

Изучение зависимости между полиморфизмом MC4R и выходом мяса в тушах, потреблением корма и увеличением живой массы свиней, Chen М. и соавторы [Different allele frequencies of MC4R gene variants in Chinese pig breeds / M. Chen, A. Wang, J. Fu, N. Li // Archiv fuer Tierzucht Dummerstorf. - 2004. - V. 47(5). - P. 463-468], Kim K.S. и соавторы [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, Т.Н. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 419-421] и Meidther K. и коллеги [Association of the melanocortin 4 receptor with feed intake and daily gain in F2 Mangalitsa × Pietrain pigs / K. Meidther, A.K. Wermter, A. Hinney, H. Remschmidt, J. Hebebrand, R. Fries // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(3). - P. 245-247] показали, что ген MC4R может быть использован в качестве генетического маркера для этих признаков в селекции животных. Van den Maagdenberg K. и коллеги [The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E. Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1 (8). - P. 1089-1098] обнаружили, что мутация в гене рецептора меланокортина влияет на увеличение массы туши и упитанности свиней, но не оказывает влияния на качество мяса.Study of the relationship between MC4R polymorphism and meat yield in carcasses, feed consumption and increase in live weight of pigs, M. Chen et al. [Different allele frequencies of MC4R gene variants in Chinese pig breeds / M. Chen, A. Wang, J. Fu, N Li // Archiv fuer Tierzucht Dummerstorf. - 2004. - V. 47 (5). - P. 463-468], Kim K.S. and coauthors [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, T.N. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37 (4). - P. 419-421] and Meidther K. and colleagues [Association of the melanocortin 4 receptor with feed intake and daily gain in F2 Mangalitsa × Pietrain pigs / K. Meidther, A.K. Wermter, A. Hinney, H. Remschmidt, J. Hebebrand, R. Fries // Animal Genetics. - 2006. - V. 37 (3). - P. 245-247] showed that the MC4R gene can be used as a genetic marker for these traits in animal breeding. Van den Maagdenberg K. and colleagues [The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1 (8). - P. 1089-1098] found that a mutation in the melanocortin receptor gene affects the increase in carcass weight and fatness of pigs, but does not affect the quality of meat.

Figure 00000001
и коллеги [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer /
Figure 00000002
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45] сообщали, что свиньи с генотипом АА гена MC4R характеризуются большим количеством жира по сравнению со свиньями с генотипом GG гена MC4R. Было описано значительное влияние аллеля А гена MC4R на повышение упитанности туш у ландраса, крупной белой породы, помесей крупная белая × дюрок [А missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. - V. 164. - P. 637-644], ландрас × лантанг [Different allele frequencies of MC4R gene variants in Chinese pig breeds / M. Chen, A. Wang, J. Fu, N. Li // Archiv fuer Tierzucht Dummerstorf. - 2004. -V. 47(5). - P. 463-468] и гемпшир × ландрас [Evaluation of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene as a positional candidate for a fatness QTL in a cross between Landrace and Hampshire / C.S. Bruun, C.B. Jorgensen, V.H. Nielsen, L. Andersson, M. Fredholm // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 359-362]. Влияние полиморфизма гена рецептора меланокортина 4 на увеличение упитанности туш было также обнаружено у свиней породы дюрок [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, Т.Н. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 419-421], и у шести линий свиней крупной белой породы английского происхождения [A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35(5). - P. 386-390]. Исследование Van den Maagdenberg K. и соавторов [The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E. Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1 (8). - P. 1089-1098] на помесных свиньях крупной белой × пьетрен, ландрас × крупная белая подтвердили, что мутация в гене рецептора меланокортина 4 оказывает существенное влияние на упитанность. Анализ влияния аллеля А гена MC4R показал, что этот аллель связан с меньшим количеством мяса в области шеи и затылка [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer /
Figure 00000002
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45].
Figure 00000001
and colleagues [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer /
Figure 00000002
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45] reported that pigs with the AA genotype of the MC4R gene are characterized by a higher amount of fat compared to pigs with the GG genotype of the MC4R gene. A significant effect of the A allele of the MC4R gene on increasing the fatness of carcasses in Landrace, large white breed, large white × duroc crosses has been described [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / KS Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, MF Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. - V. 164. - P. 637-644], Landrace × Lantang [Different allele frequencies of MC4R gene variants in Chinese pig breeds / M. Chen, A. Wang, J. Fu, N. Li // Archiv fuer Tierzucht Dummerstorf. - 2004. -V. 47 (5). - P. 463-468] and Hampshire × Landrace [Evaluation of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene as a positional candidate for a fatness QTL in a cross between Landrace and Hampshire / CS Bruun, CB Jorgensen, VH Nielsen, L Andersson, M. Fredholm // Animal Genetics. - 2006. - V. 37 (4). - P. 359-362]. The effect of polymorphism in the melanocortin 4 receptor gene on increasing body fatness was also found in pigs of the Duroc breed [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / KS Kim, JJ Lee, HY Shin, BH Choi, CK Lee, JJ Kim, BW Cho, T.H. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37 (4). - P. 419-421], and in six lines of large white pigs of English origin [A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / RD Houston, ND Cameron, KA Rance / / Animal Genetics. - 2004. - V. 35 (5). - P. 386-390]. Research by Van den Maagdenberg K. et al. [The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E. Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1 (8). - P. 1089-1098] on crossbred pigs large white × pietrain, landrace × large white confirmed that a mutation in the melanocortin 4 receptor gene has a significant effect on fatness. Analysis of the influence of the A allele of the MC4R gene showed that this allele is associated with less meat in the neck and back of the head [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer /
Figure 00000002
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45].

Литературные данные о влиянии полиморфизма MC4R на продуктивные показатели неоднозначны. Однако, выявлено довольно заметное влияние данного полиморфизма на среднесуточный прирост живой массы, потребление корма, рост мышц, содержание жира в туше и длину туши [Melanocortin-4 receptor (MC4R) genotypes have no major effect on fatness in a Large White × Wild Boar intercross / H.B. Park,

Figure 00000003
L. Marklund, L. Andersson // Animal Genetics. - 2002. - V. 33. - P. 155-157; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. -V. 164. - P. 637-644; A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35(5). - P. 386-390; An effect of a missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene on production traits in Polish pig breeds is doubtful / M. Stachowiak, M. Szydlowski, M. Obarzanek -Fojt,
Figure 00000004
// Animal Genetics. - 2006. - V. 37(1). - P. 55-57; Evaluation of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene as a positional candidate for a fatness QTL in a cross between Landrace and Hampshire / C.S. Bruun, C.B. Jorgensen, V.H. Nielsen, L. Andersson, M. Fredholm // Animal Genetics. - 2006. -V. 37(4). - P. 359-362; Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs / R. Jokubka, S. Maak, S. Kerziene, H.H. Swalve // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2006. - V. 123. - P. 12-22].Literature data on the influence of MC4R polymorphism on productivity indicators is ambiguous. However, a rather noticeable effect of this polymorphism on the average daily body weight gain, feed intake, muscle growth, carcass fat content and carcass length was revealed [Melanocortin-4 receptor (MC4R) genotypes have no major effect on fatness in a Large White × Wild Boar intercross / HB Park,
Figure 00000003
L. Marklund, L. Andersson // Animal Genetics. - 2002. - V. 33. - P. 155-157; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. -V. 164. P. 637-644; A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / RD Houston, ND Cameron, KA Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35 (5). - P. 386-390; An effect of a missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene on production traits in Polish pig breeds is doubtful / M. Stachowiak, M. Szydlowski, M. Obarzanek-Fojt,
Figure 00000004
// Animal Genetics. - 2006. - V. 37 (1). - P. 55-57; Evaluation of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene as a positional candidate for a fatness QTL in a cross between Landrace and Hampshire / CS Bruun, CB Jorgensen, VH Nielsen, L. Andersson, M. Fredholm // Animal Genetics. - 2006. -V. 37 (4). - P. 359-362; Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs / R. Jokubka, S. Maak, S. Kerziene, HH Swalve // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2006. - V. 123. - P. 12-22].

Результаты некоторых исследователей показывают, что аллель А является желательным для повышения откормочных и мясных качеств свиней, но в случае, когда целью селекции является снижение толщины шпика предпочтителен аллель G [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer /

Figure 00000002
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45].The results of some researchers show that the A allele is desirable for improving the fattening and meat qualities of pigs, but in the case when the purpose of breeding is to reduce the thickness of the fat, the G allele is preferable [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer /
Figure 00000002
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45].

Доказан существенный эффект мутации в данном гене на потребление корма, что в свою очередь оказывало влияние на толщину шпика и скорость роста: различия составили 5-8%. Причем, действие полиморфизма на указанные признаки проявлялось практически во всех изученных коммерческих линиях. Полученные результаты позволяют предположить, что аллель, связанный с высокой скоростью роста, обуславливает повышенную мраморность [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135].A significant effect of a mutation in this gene on feed consumption was proved, which in turn influenced the thickness of the bacon and the growth rate: the differences were 5-8%. Moreover, the effect of polymorphism on these traits was manifested in almost all studied commercial lines. The results obtained suggest that the allele associated with high growth rate causes increased marbling [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135].

Коллектив авторов под руководством Kim K.S. [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, В.Н. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, Т.Н. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 419-421] изучали комплексное действие полиморфизмов в генах рецептора меланокортина 4 (MC4R) и высокомобильной группы белков 1 (HMGA1) у свиней породы дюрок и для обоих генов установили аддитивное действие на признаки среднесуточного прироста и мясности. Максимальные различия от эффекта комплексных генотипов составили: по толщине шпика 2 мм, по среднесуточному приросту 70 г/день и по содержанию мяса в туше 2%.A team of authors led by Kim K.S. [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, V.N. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, T.N. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37 (4). - P. 419-421] studied the complex effect of polymorphisms in the genes of the melanocortin 4 receptor (MC4R) and highly mobile protein group 1 (HMGA1) in pigs of the Duroc breed and for both genes found an additive effect on the signs of average daily gain and meat content. The maximum differences from the effect of complex genotypes were: 2 mm in fat thickness, 70 g / day average daily gain, and 2% meat content in the carcass.

Лядский И.К. и сотрудники [Связь Asp298Asn полиморфизма гена MC4R с толщиной спинного сала у свиней крупной белой породы / И.К. Лядский, А.А. Гетя, К.Ф. Почерняев // Цитология и генетика. - 2011. - V. 45. - №2. - С. 52-56] исследовали связь Asp298Asn-полиморфизма гена MC4R с развитием такого признака, как толщина хребтового шпика у свиней крупной белой породы популяции АФ «Оржицкая» (Украина). Ими обнаружена тенденция формирования более тонкого хребтового шпика у животных с генотипом AG. Достоверной разницы по его толщине у групп животных с различным генотипом гена MC4R, обусловленным Asp298Asn-полиморфизмом, установлено не было.Lyadsky I.K. and colleagues [Relationship between Asp298Asn polymorphism of the MC4R gene with the thickness of the back fat in pigs of large white breed / I.K. Lyadsky, A.A. Getya, K.F. Pochernyaev // Tsitol Genet. - 2011. - V. 45. - No. 2. - pp. 52-56] investigated the relationship of Asp298Asn polymorphism of the MC4R gene with the development of such a trait as the back fat thickness in large white pigs of the Orzhitskaya AF population (Ukraine). They found a tendency for the formation of a thinner backbone in animals with the AG genotype. There was no significant difference in its thickness in groups of animals with different genotypes of the MC4R gene caused by Asp298Asn polymorphism.

Salajpal K. с соавторами [Effect of MC4R polymorphism on physsiological stress response in pigs / K. Salajpal,

Figure 00000005
D. Karoly,
Figure 00000006
B. Liker // Agriculture: Scientific and Professional Review. - 2007. - V. 1. - P. 46-50] изучали влияние полиморфизма MC4R на свиньях двух кроссов: (дюрок×шведский ландрас)×пьетрен (n=25) и (шведский ландрас×крупная белая)×пьетрен (n=21). Ими установлено, что генотип по MC4R оказывал существенное влияние на толщину шпика, измеренную в области m. gluteus medius, а также на мясность туши в процентах (р<0,05). Гомозиготные GG особи характеризовались меньшей толщиной шпика и более высокой мясностью по сравнению с гетерозиготными особями, что полностью согласуется с ранее полученными результатами эффекта аллеля G гена MC4R на толщину шпика [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits /K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. - V. 164. - P. 637-644; A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35(5). - P. 386-390] и статистически значимом снижении толщины шпика в ряду GG>AG>AA [Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs / R. Jokubka, S. Maak, S. Kerziene, H.H. Swalve // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2006. - V. 123. - P. 12-22]. При этом сила влияния генотипа по MC4R носит породоспецифичный характер.Salajpal K. et al. [Effect of MC4R polymorphism on physsiological stress response in pigs / K. Salajpal,
Figure 00000005
D. Karoly,
Figure 00000006
B. Liker // Agriculture: Scientific and Professional Review. - 2007. - V. 1. - P. 46-50] studied the effect of MC4R polymorphism on pigs of two crosses: (Duroc × Swedish Landrace) × Pietrain (n = 25) and (Swedish Landrace × Large White) × Pietrain (n = 21). They found that the MC4R genotype had a significant effect on the fat thickness measured in the m. gluteus medius, as well as carcass meat content in percent (p <0.05). Homozygous GG individuals were characterized by a smaller fat thickness and higher fat content compared to heterozygous individuals, which is fully consistent with the previously obtained results of the effect of the G allele of the MC4R gene on fat thickness [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness , growth, and feed intake traits / KS Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, MF Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. - V. 164. - P. 637-644; A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / RD Houston, ND Cameron, KA Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35 (5). - P. 386-390] and a statistically significant decrease in fat thickness in the series GG>AG> AA [Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs / R. Jokubka, S. Maak, S. Kerziene , HH Swalve // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2006. - V. 123. - P. 12-22]. At the same time, the strength of the influence of the MC4R genotype is breed-specific.

В подавляющем большинстве исследований, выполненных как на чистопородных животных, синтетических линиях свиней, так и на двух-, трех- и четырехпородных кроссах, имеет место следующее соотношение генотипов MC4R по скорости роста: AA>GG [Изучение полиморфизма ДНК-маркеров и их влияния на показатели мясной и откормочной продуктивности свиней различных пород и кроссов / А.Н. Левитченков // Дисс. канд. биол. наук. - Дубровицы. - ВИЖ. - 2009. - 108 с]. По толщине шпика рядом авторов установлена зависимость AA>GG и AG>GG. В некоторых исследованиях обнаружена обратная связь (AA<GG) или не выявлено каких-либо зависимостей между генотипами по MC4R и уровнем развития данного признака. Таким образом, влияние генотипа по MC4R проявляется по-разному в зависимости от породной принадлежности свиней.In the overwhelming majority of studies carried out both on purebred animals, synthetic lines of pigs, and on two-, three- and four-breed crosses, the following ratio of MC4R genotypes in terms of growth rate takes place: AA> GG [Study of polymorphism of DNA markers and their effect on indicators of meat and fattening productivity of pigs of various breeds and crosses / A.N. Levitchenkov // Diss. Cand. biol. sciences. - Dubrovitsy. - VIZH. - 2009. - 108 s]. A number of authors established the dependence AA> GG and AG> GG for the thickness of the bacon. In some studies, an inverse relationship (AA <GG) was found or no relationships were found between the MC4R genotypes and the level of development of this trait. Thus, the influence of the MC4R genotype manifests itself in different ways depending on the breed of pigs.

В качестве прототипа заявленного способа, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату, можно считать выявление полиморфизма MC4R с использованием метода ПЦР с последующим рестрикционным гидролизом образующегося фрагмента (анализа ПДРФ - полиморфизма длин амплифицированных фрагментов) [Kim, K.S. Rapid communication: Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene / K.S. Kim, N.J. Larsen, M.F. Rothshild // J.Anim. Sci. - 2000. - V. 78. - P. 791-792], использование которого подразумевает проведение ПЦР-ПДРФ анализа, что сопряжено с использованием эндонуклеаз рестрикции и последующее разделение продуктов в агарозном геле. Несмотря на относительную дешевизну данного способа, данный способ характеризуется большей трудоемкостью и продолжительностью генотипирования. Отличие нашего способа заключается в выявлении полиморфизма MC4R с использованием метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США). Данный способ характеризуется меньшей трудоемкостью и позволяет идентифицировать генотипы в течение 2 часов.As a prototype of the claimed method, the closest in technical essence and the achieved result can be considered the identification of MC4R polymorphism using the PCR method followed by restriction hydrolysis of the resulting fragment (RFLP analysis - amplified fragment length polymorphism) [Kim, K.S. Rapid communication: Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene / K.S. Kim, N.J. Larsen, M.F. Rothshild // J.Anim. Sci. - 2000. - V. 78. - P. 791-792], the use of which implies PCR-RFLP analysis, which is associated with the use of restriction endonucleases and the subsequent separation of products in an agarose gel. Despite the relative cheapness of this method, this method is characterized by greater laboriousness and duration of genotyping. The difference between our method lies in the detection of MC4R polymorphism using the PCR method with detection of results in real time (RT-PCR) on a QuantStudio 5 device (Thermo Fisher Scientific, USA). This method is less laborious and allows you to identify genotypes within 2 hours.

Следует отметить, что простота нашего способа определения полиморфизма MC4R на основе ПЦР-РВ, позволит использовать его в селекционной практике с целью идентификации животных, являющихся носителями благоприятных генетических вариантов.It should be noted that the simplicity of our method for determining the MC4R polymorphism based on RT-PCR will make it possible to use it in breeding practice in order to identify animals that are carriers of favorable genetic variants.

Суть разработанной тест-системы основана на использовании двух специфических праймеров MC4R-TM-F и MC4R-TM-R и двух аллель-специфичных зондов, помеченных флуоресцентными метками. Зонд, предназначенный для идентификации аллеля А, ассоциированного с мясными и откормочными качествами у свиней, помечен красителем R6G, а зонд для идентификации аллеля G помечен красителем FAM.The essence of the developed test system is based on the use of two specific primers MC4R-TM-F and MC4R-TM-R and two allele-specific probes labeled with fluorescent labels. The probe for identifying the A allele associated with meat and feeding qualities in pigs is labeled with R6G, and the probe for identifying the G allele is labeled with FAM.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, затрат сил и времени методов, возможно выявление желательного аллеля А гена MC4R, что позволит применить данный метод в селекции животных.The method differs in that with the use of several technically simple and not requiring expensive reagents, time and effort expenditures, it is possible to identify the desired allele A of the MC4R gene, which will make it possible to apply this method in animal breeding.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля А гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами у свиней, с целью идентификации носителей желательных генетических вариантов и разработки программ их использования в селекции.When creating the present invention, the task was to develop a method for detecting the A allele of the MC4R gene associated with meat and fattening qualities in pigs in order to identify carriers of the desired genetic variants and develop programs for their use in breeding.

Задача нашего изобретения - создание способа идентификации полиморфизма в гене MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, и может быть использовано в рамках проведения маркерной селекции.The objective of our invention is to create a method for identifying polymorphism in the MC4R gene associated with meat and fattening qualities of pigs, and can be used in the framework of marker selection.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма в гене MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, для использования в селекции свиней, включающий метод полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Система основана на использовании двух специфических праймеров MC4R-TM-F и MC4R-TM-R и двух аллель-специфичных зондов, помеченных флуоресцентными метками. Зонд, предназначенный для идентификации аллеля А, ассоциированного с мясными и откормочными качествами у свиней, помечен красителем R6G, а зонд для идентификации аллеля G помечен красителем FAM. Это обеспечит снижение трудоемкости, увеличение производительности, возможности использования реагентов отечественного производства, относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.The technical result of the invention is achieved by the fact that the proposed method for diagnosing polymorphism in the MC4R gene associated with meat and fattening qualities of pigs for use in pig breeding, including the method of polymerase chain reaction with detection of results in real time (RT-PCR). The system is based on the use of two specific primers MC4R-TM-F and MC4R-TM-R and two allele-specific probes labeled with fluorescent labels. The probe for identifying the A allele associated with meat and feeding qualities in pigs is labeled with R6G, and the probe for identifying the G allele is labeled with FAM. This will provide a decrease in labor intensity, an increase in productivity, the possibility of using domestically produced reagents, and a relatively low cost of the developed method.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, затрат сил и времени методов, возможно выявление желательного аллеля А гена MC4R, что позволит применить данный метод в селекции животных.The method differs in that with the use of several technically simple and not requiring expensive reagents, time and effort expenditures, it is possible to identify the desired allele A of the MC4R gene, which will make it possible to apply this method in animal breeding.

Сущность изобретения - определение полиморфизма гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, методом ПЦР-РВ.The essence of the invention is the determination of the polymorphism of the MC4R gene associated with meat and fattening qualities of pigs by RT-PCR.

Разрабатываемый способ базируется на определении нуклеотидной замены G→А в позиции 2207 гена MC4R (Asp298Asn). С этой целью был выбран участок гена MC4R с мутацией, обуславливающей желательный генетический вариант. В электронной базе была найдена нуклеотидная последовательность интересующего нас участка ДНК (номер GenBank FJ357500).The developed method is based on the determination of the G → A nucleotide substitution at position 2207 of the MC4R gene (Asp298Asn). For this purpose, a region of the MC4R gene with a mutation causing the desired genetic variant was selected. In the electronic database, the nucleotide sequence of the DNA region of interest to us was found (GenBank number FJ357500).

Тест-система предусматривает амплификацию в режиме реального времени фрагмента длиной 226 п.о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров MC4R-TM-F ТТС ССС TGA ТТТ ТТТ ССТ CAG ТТС TTG GCT СС и MC4R-TM-R ATT АСС CTG АСС АТС TTG ATT G и двух аллель-специфичных зондов, окрашенных красителями FAM MC4R-ТМ - TCG ATG ATG GAA ТТА САС AT и R6G MC4R-ТМ - TTG ATG ATG GAA ТТА САС AT.The test system provides for real-time amplification of a 226 bp fragment containing the mutation region using two specific primers MC4R-TM-F TTC CCC TGA TTT TTT CCT CAG TTC TTG GCT CC and MC4R-TM-R ATT ACC CTG АСС АТС TTG ATT G and two allele-specific probes stained with FAM MC4R-ТМ dyes - TCG ATG ATG GAA ТТА САС AT and R6G MC4R-ТМ - TTG ATG ATG GAA ТТА САС AT.

Дизайн тест-системы представлен на Фиг. 2А.The test system design is shown in FIG. 2A.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по MC4R, (n=96) из проб ткани (ушной выщип, n=48 (хряки) и n=.48 (свиноматки) выделяли ДНК: по 24 образца каждого из видов биоматериала методом экстракции перхлоратом с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и по .24 образца - с использованием колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Референтные генотипы генерировали посредством прямого определения последовательности в области мутации методом пиросеквенирования, предусматривающего амплификацию фрагмента длиной 226 п.о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров P-MC4R For (5' - ТАС ССТ GAC CAT СТТ GAT TG - 3') и P-MC4R Rev (5' - ATA GCA АСА GAT GAT CTC ТТТ G - 3', биотинилирован на 3'-конце) с последующим пиросеквенированием с использованием секвенирующего праймера Seq MC4R (5' - GTG ТАА ТТС CAT CAT С - 3').To create a series of reference samples with known genotypes for MC4R, (n = 96), DNA was isolated from tissue samples (ear pinch, n = 48 (boars) and n = .48 (sows): 24 samples of each of the biomaterials by the perchlorate extraction method) using magnetic particles (Isogen LLC, Russia) and .24 samples each - using Nexttec columns (Nexttec Biotechnologie GmbH, Germany) in accordance with the manufacturers' recommendations Reference genotypes were generated by direct determination of the sequence in the mutation region by pyrosequencing, involving amplification a 226 bp fragment containing the mutation region using two specific primers P-MC4R For (5 '- TAC CCT GAC CAT CTT GAT TG - 3') and P-MC4R Rev (5 '- ATA GCA ACA GAT GAT CTC TTT G - 3 ', biotinylated at the 3' end) followed by pyrosequencing using the Seq MC4R sequencing primer (5 '- GTG TAA TTC CAT CAT C - 3').

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма гена рецептора меланокортина 4 - MC4R на основе метода ПЦР с последующим пиросеквенированием (А) и результаты генотипирования референтных образцов (В).FIG. 1 - theoretical model of the test system for determining the polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene - MC4R based on the PCR method with subsequent pyrosequencing (A) and the results of genotyping of the reference samples (B).

На фиг. 1А представлены теоретически смоделированные гистограммы возможных генотипов MC4R, где на верхнем рисунке гистограмма соответствует генотипу АА, на среднем - AG и на нижнем - GG. На фиг. 1В представлены результирующие пикограмма последовательности гена GBP1 в области исследуемой мутации соответствующая генотипу ТТ, на фиг. 1В - результирующие пикограммы последовательности MC4R в области исследуемой мутации, где на верхнем рисунке пикограмма соответствует генотипу АА, на среднем - AG и на нижнем - GG.FIG. 1A shows theoretically modeled histograms of possible MC4R genotypes, where the histogram in the upper figure corresponds to the AA genotype, in the middle - AG, and in the lower one - GG. FIG. 1B shows the resulting picogram of the GBP1 gene sequence in the region of the studied mutation corresponding to the TT genotype, FIG. 1B - the resulting picograms of the MC4R sequence in the area of the studied mutation, where the picogram in the upper figure corresponds to the AA genotype, in the middle - AG, and in the lower one - GG.

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=96), в том числе 23 образца с генотипом GG (нежелательный по мясным и откормочным качествам), 32 образца с генотипом AG (гетерозиготный), 40 образцов с генотипом АА (желательынй по мясным и откормочным качествам).As a result of genotyping, a series of reference samples (n = 96) was created, including 23 samples with the GG genotype (undesirable for meat and fattening qualities), 32 samples with the AG genotype (heterozygous), 40 samples with the AA genotype (desirable for meat and fattening qualities).

Определение полиморфизма MC4R предложенным способом выполняли следующим образом:Determination of MC4R polymorphism by the proposed method was performed as follows:

1. исходя из локализации мутации были подобраны два специфических праймера:1.based on the localization of the mutation, two specific primers were selected:

MC4R-TM-F ТТС ССС TGA ТТТ ТТТ ССТ CAG ТТС TTG GCT ССMC4R-TM-F TTS CCC TGA TTT TTT CCT CAG TTS TTG GCT CC

MC4R-TM-R АТТ АСС CTG АСС АТС TTG ATT G.MC4R-TM-R АТТ АСС CTG АСС АСС TTG ATT G.

2. исходя из последовательности гена, были подобраны два аллель-специфичных зонда, окрашенные красителями:2.Based on the sequence of the gene, two allele-specific probes were selected, stained with dyes:

MC4R-ТМ - /6-FAM/- TCG ATG ATG GAA ТТА САС AT -/BHQ-1/MC4R-TM - / 6-FAM / - TCG ATG ATG GAA TTA SAC AT - / BHQ-1 /

MC4R-ТМ - /R6G/- TTG ATG ATG GAA ТТА САС AT -/BHQ-1/.MC4R-TM - / R6G / - TTG ATG ATG GAA TTA SAC AT - / BHQ-1 /.

Фиг. 2А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.FIG. 2A illustrates the above-described embodiment of the present invention.

3. реакции проводили в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1×ПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмоль каждого из праймеров, 2 мМ MgCl2, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: 1 цикл - 95°С 5 мин, 44 цикла последовательно - 94°С -45 с., 62°С - 45 с., 72°С - 45 с., заключительная элонгация при 72°С - 8 мин;3.Reactions were carried out in 15 μL of the reaction mixture of the following composition: 1 × PCR buffer (16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 67.7 mM Tris-HCl, pH = 8.8, 0.1% (v / v) Tween 20, 1.5 mM MgCl 2 ), 0.2 mM dNTP, 10 pmol of each primer, 2 mM MgCl 2 , 1 U of Taq polymerase and 1 μL of DNA at the following temperature-time regime: 1 cycle - 95 ° С 5 min, 44 cycles sequentially - 94 ° С -45 s., 62 ° С - 45 s., 72 ° С - 45 s., Final elongation at 72 ° С - 8 min;

4. определение аллелей А и G гена MC4R осуществляли методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, где аллелю G соответствуют кривые флуоресценции на канале FAM, а аллелю А - кривые флуоресценции на канале R6G. (Фиг. 2Б);4. determination of alleles A and G of the MC4R gene was carried out by PCR with detection of results in real time, where allele G corresponds to fluorescence curves on the FAM channel, and allele A corresponds to fluorescence curves on the R6G channel. (Fig. 2B);

5. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.5. The effectiveness of the developed test system was assessed by comparing the results of genotyping of reference samples.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма гена MC4R было апробировано на 250 свиньях породы крупная белая. Исследование выявило частоту генотипов АА, AG и GG - 42,8; 40,3 и 16,9%%, соответственно. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся носителями желательного аллеля А гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней.Example. The control use of the proposed method for determining the polymorphism of the MC4R gene was tested on 250 large white pigs. The study revealed the frequency of genotypes AA, AG and GG - 42.8; 40.3 and 16.9 %%, respectively. Thus, the developed method can be used to identify animals that carry the desired allele A of the MC4R gene associated with meat and fattening qualities of pigs.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма гена MC4R свиней, ассоциированного с мясными и откормочными качествами, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции свиней.The proposed method is applicable in the genetics of farm animals to detect polymorphism of the MC4R gene of pigs associated with meat and fattening qualities, with the aim of further using the results obtained in breeding and selection of pigs.

Claims (1)

Способ диагностики полиморфизма гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, где аллелю G соответствуют кривые флуоресценции на канале FAM, а аллелю A – кривые флуоресценции на канале R6G, суть которого заключается в определении нуклеотидной замены G→A в позиции 2207, номер GenBank FJ357500, гена MC4R посредством амплификации фрагмента, содержащего область мутации, с использованием двух специфичных праймеров: ТТС ССС TGA ТТТ ТТТ ССТ CAG ТТС TTG GCT СС и ATT АСС CTG АСС АТС TTG ATT G и двух аллель-спецефичных зондов, окрашенных красителями FAM и R6G в режиме реального времени.A method for diagnosing polymorphism of the MC4R gene associated with meat and fattening qualities of pigs by PCR with detection of results in real time, where allele G corresponds to fluorescence curves on the FAM channel, and allele A corresponds to fluorescence curves on the R6G channel, the essence of which is to determine the nucleotide substitution G → A at position 2207, GenBank number FJ357500, of the MC4R gene by amplifying the fragment containing the mutation region using two specific primers: TTC CCC TGA TTT TTT CCT CAG TTC TTG GCT CC and ATT ACC CTG ACC ATC TTG ATT G and two alleles -specific probes stained with FAM and R6G dyes in real time.
RU2019142090A 2019-12-18 2019-12-18 Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs RU2745902C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019142090A RU2745902C1 (en) 2019-12-18 2019-12-18 Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019142090A RU2745902C1 (en) 2019-12-18 2019-12-18 Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2745902C1 true RU2745902C1 (en) 2021-04-02

Family

ID=75353452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019142090A RU2745902C1 (en) 2019-12-18 2019-12-18 Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2745902C1 (en)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jokubka, R., Maak, S., Kerziene, S. and Swalve, H.H., Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2006, 123, pp. 17-22. *
Young EH, Wareham NJ, Farooqi S, et al., The V103I polymorphism of the MC4R gene and obesity: population based studies and meta-analysis of 29 563 individuals, Int J Obes (Lond), 2007, 31(9), pp.1437‐1441. *
Костюнина О.В. и др. Полиморфизм гена рецептора меланокортина MC4R и его влияние на мясные и откормочные качества свиней, Достижения науки и техники АПК, 2012, номер 8, стр. 49-51. *
Костюнина О.В. и др. Полиморфизм гена рецептора меланокортина MC4R и его влияние на мясные и откормочные качества свиней, Достижения науки и техники АПК, 2012, номер 8, стр. 49-51. Young EH, Wareham NJ, Farooqi S, et al., The V103I polymorphism of the MC4R gene and obesity: population based studies and meta-analysis of 29 563 individuals, Int J Obes (Lond), 2007, 31(9), pp.1437‐1441. Jokubka, R., Maak, S., Kerziene, S. and Swalve, H.H., Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2006, 123, pp. 17-22. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7303878B2 (en) Genetic markers for improved meat characteristics in animals (MC4R)
US20220056530A1 (en) Method to predict the pattern of locomotion in horses
Hirayama et al. Effects of genetic background on responses to superovulation in Japanese Black cattle
KR100827544B1 (en) Development of molecular marker associated with backfat thickness and marbling in Hanwoo
KR102235340B1 (en) SNP marker set for predicting growth traits of Korean native chicken and uses thereof
RU2745902C1 (en) Method for determining polymorphism of the melanocortin 4 receptor gene (mc4r) associated with meat and fattening properties of pigs
US20170058362A1 (en) Method of identifying the presence of foreign alleles in a desired haplotype
Tahmoorespur et al. Association of the polymorphism in the 5’flanking region of the ovine IGF-I gene with growth traits in the Baluchi sheep
Jafari et al. Growth hormone gene polymorphism in two Iranian native fowls
Deobald et al. Characterization of two Pro-opiomelanocortin gene variants and their effects on carcass traits in beef cattle
KR101307008B1 (en) Diagnosis method of high meat producing Hanwoo using the DNA marker associated with marbling score
KR102001528B1 (en) Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use thereof
Hristova et al. Analysis of DNA polymorphism of CAST gene in Local Karnobat and Stara Zagora sheep breeds.
KR20130128603A (en) Snp for determination of meat quantity in hanwoo and diagnosis method of meat quantity using the same
KR101289484B1 (en) Method of genetic test for diagnosis of marbling trait in Korean cattle
KR101321219B1 (en) Diagnosis method of marbling heritability by genome analysis in Hanwoo
JP4119975B2 (en) Dog selection method, and PCR primers and polynucleotide probes used in the selection method
Heikal et al. Genetic improvement of litter size in four goat breeds in Egypt using polymorphism in bone morphogenetic protein 15 gene
Meena et al. Genetic polymorphism of melatonin receptor 1A (MTNR1A) gene in Indian sheep breeds
Trakovická et al. Impact of SNPs in candidate genes on economically important traits in Pinzgau cattle
RU2782833C1 (en) Method for determining polymorphism of genetic markers of dairy productivity of cattle
Sheikh et al. DRB3. 2 gene polymorphism and its association with pashmina production in Changthangi goat
RU2734964C1 (en) Method for determining productivity of cows of cattle by polymorphism in lep gene
Choroszy et al. Polymorphism of selected microsatellite DNA sequences in Simmental cattle chosen for identification of QTLs for meat traits
CN109897904B (en) Molecular marker for identifying breeding traits of white pigs based on PRLR gene and application