KR102001528B1 - Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use thereof - Google Patents

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성필남
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신상민
양병철
박남건
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Abstract

The present invention relates to a genetic marker and kit for identifying Korean native pigs, and a method for identifying Korean native pigs using the same. According to the present invention, even if the hair color is similar, by using the unique nucleotide sequence of Korean native pigs, it is possible to quickly, accurately and economically identify the Korean native pigs.

Description

한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도{Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use thereof}Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use approximately}

본 발명은 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 한국 재래돼지 고유의 SNP 마커를 이용하여 한국 재래돼지를 신속, 정확하고 경제적으로 식별할 수 있는 한국 재래돼지 식별용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 한국 재래돼지 식별 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a gene marker for identifying a Korean native pig and its use. More specifically, the present invention relates to a composition, kit for identifying Korean native pigs, and a method for identifying Korean native pigs using the same, which can quickly and accurately and economically identify Korean native pigs using SNP markers unique to Korean native pigs. will be.

한국 재래돼지(Korean Native pig, KNP)는 일반 개량종에 비해 단단한 지방 조직, 백색의 지방색, 풍부하고 담백한 육즙과 쫄깃하고 부드러운 식감 및 육색이 붉고 마블링이 우수한 특성이 있어 소비자의 선호도가 높은 것으로 보고되었다.Korean native pigs (KNP) have been reported to have higher consumer preference because they have hard fat tissue, white fat color, rich and light gravy, chewy and soft texture, red meat, and marbling, compared to general breeds. .

특히 한국 재래돼지 중 제주도의 흑돼지는 기름기가 적고 육질이 부드러워 선호도가 매우 높고 판매가격도 상대적으로 높은 편이다.In particular, the black pigs on Jeju Island, among Korean traditional pigs, are very oily and tender in quality, so they are highly preferred and their selling prices are relatively high.

이에 흑모색의 버크셔가 제주 흑돼지로 둔갑하여 판매되는 경우가 종종 발생하고 있다. As such, black Berkshire is often sold as Jeju black pork.

한편, 모색은 질적 형질로 알려져 있으나, 사실상 품종 또는 개체 수준에서 품종식별에는 어려움이 있다. 따라서, 유전자 수준에 신속, 정확하고 경제적으로 한국 재래돼지를 식별할 수 있는 방법에 대한 요구가 있어 왔다.On the other hand, the groping is known as a qualitative trait, but there is a difficulty in identifying the breed at the breed or individual level. Therefore, there has been a need for a method that can identify Korean native pigs at the genetic level quickly, accurately and economically.

본 발명의 배경기술로는 한국 공개특허제10-2016-006348호에 흑돈육과 비흑돈육 판별에 유용한 단일염기다형성 마커 및 이의 용도에 대해 기재되어 있다. Background art of the present invention is disclosed in Korean Patent Laid-Open No. 10-2016-006348 for a single base polymorphic marker useful for discriminating black pork and non-black pork and its use.

본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this invention, many patent documents are referred and the citation is shown. The disclosure of the cited patent document is incorporated by reference in its entirety as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the content of the present invention are more clearly explained.

본 발명의 목적은 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a genetic marker for identifying Korean native pigs.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 한국 재래돼지 식별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for identification of Korean native pigs comprising an agent capable of detecting or amplifying the genetic markers.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 한국 재래돼지 식별용 키트를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a kit for identifying a Korean native pig comprising the composition.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 마커에 의한 유전자형을 확인하여 한국 재래돼지를 식별하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for identifying Korean native pigs by checking the genotype by the genetic marker.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 386번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 386번째 염기를 포함하는 5 내지 600개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물이 제공된다.According to an aspect of the present invention, in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, the 386th base is A or G, and the base sequence of SEQ ID NO: 1 includes 5 to 600 consecutive bases including the 386th base. Provided is a composition for identifying Korean native pigs, comprising an agent capable of detecting or amplifying a SNP marker comprising a polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제제는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the preparation may include a primer set represented by SEQ ID NOs: 2 and 3.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종과 한국 재래돼지 품종을 식별할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, it is possible to identify the land race, Duroc, Great Yorkshire, and Berkshire varieties and Korean native pig varieties.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 버크셔 품종과 제주 재래돼지 품종을 식별할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, it is possible to identify the Berkshire varieties and Jeju native pig varieties.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for identifying Korean native pigs, comprising the composition.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 마이크로어레이가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a microarray for identifying a Korean native pig, comprising the composition.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산으로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 재래돼지 식별 방법이 제공된다.According to another aspect of the invention, a) extracting a nucleic acid from a pig sample; b) amplifying a polymorphic site of said SNP marker from said extracted nucleic acid; And c) determining the base of the amplified polymorphic site.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 b)에서 증폭은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, amplification in step b) may use a primer set represented by SEQ ID NOs: 2 and 3.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 대립 유전자형이 A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, if the allele of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) is A / A type, it may be determined as a Korean native pig breed.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 A인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, if the base type of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) can be determined as a Korean native pig breed.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 G인 경우 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 또는 버크셔 품종으로 판단할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, when the base type of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 is G, it may be determined as a Landrace, Duroc, Great Yorkshire, or Berkshire variety.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 한국 재래돼지 고유의 유전자 서열을 이용하여 한국 재래돼지를 신속, 정확하고 경제적으로 식별할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the Korean native pigs can be quickly, accurately and economically identified by using a gene sequence unique to Korean native pigs.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 한국 재래돼지 식별을 위한 유전자 진단 체계 기반을 마련할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, it is possible to prepare a basis for a genetic diagnosis system for identifying Korean native pigs.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 모색이 유사한 경우에도 한국 재래돼지 품종을 외래돼지 품종과 정확하게 식별할 수 있어 돈육의 투명한 유통체계를 확립하는 데 일조할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, even if the groping is similar, Korean native pig breeds can be accurately identified with foreign pig breeds, which can help establish a transparent distribution system of pork.

도 1은 백색품종인 랜드레이스와 흑모색의 제주 재래돼지를 교배하여 나오는 자손의 모색을 분류하여 나타낸 사진이다.
도 2는 제주 재래돼지와 랜드레이스 교배 축군에서 전신 흑모색에 대한 GWAS 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 KIT 유전자의 엑손2 영역의 c.586 G>A 신규 돌연변이를 나타내는 서열분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석을 한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 엑손2 염기서열(서열번호 1) 중 SNP 마커 위치를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의해 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, A/A형으로 나타남을 확인한 결과의 도면이다.
Figure 1 is a photograph showing the classification of the offspring coming from crossing the white race land race and the black pig Jeju native pig.
Figure 2 is a graph showing the results of the GWAS analysis for whole body black color in Jeju traditional pig and land race breeding herds.
Figure 3 is a sequencing result showing a c.586 G> A novel mutation of the exon2 region of the KIT gene according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a diagram showing the results of the network analysis between varieties using the base mutation of the pig KIT gene according to an embodiment of the present invention.
5 is a view showing the position of the SNP markers in the swine KIT exon 2 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming that allelic types are shown as G / G and A / A types as the mutation of the 386th base in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by A or G according to one embodiment of the present invention. to be.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Certain terms are defined herein for convenience of understanding the invention. Unless defined otherwise herein, scientific and technical terms used herein have the meanings that are commonly understood by one of ordinary skill in the art. Also, unless specifically indicated in the context, the singular forms "a", "an", and "the" are intended to include their plural forms as well.

본 발명의 일 측면에 의하면, 한국 재래돼지를 외래 돼지와 식별할 수 있는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커가 제공된다. According to one aspect of the present invention, there is provided a Single Nucleotide Polymorphism (SNP) marker that can be distinguished from Korean pigs.

상기 SNP 마커는 KIT 유전자의 엑손2에 위치하며 한국 재래돼지와 외래 돼지를 정확하게 식별할 수 있어, 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커로서 유용하게 활용될 수 있다. 상기 SNP 마커는 KIT 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있다.The SNP marker is located at exon 2 of the KIT gene and can accurately identify Korean native pigs and foreign pigs, and thus can be usefully used as a gene marker for identifying Korean native pigs. The SNP marker may be all or part of a polynucleotide including the SNP region of the KIT gene.

본 발명의 용어 "KIT" 유전자는, 멜라노사이트 이동과 생존에 중요한 역할을 하며 비만/줄기세포 성장 인자 수용체(mast/stem cell growth factor receptor)를 암호화하는 유전자로서, 돼지의 KIT 유전자는 8번 염색체에 암호화되어 있으며 21개의 엑손으로 이루어져 있다. 한국 재래돼지 품종과 외래 품종을 정확하게 식별할 수 있는 KIT 유전자에서 유래한 본 발명의 SNP 마커는 알려진 바가 없고, 본 발명자에 의해 최초 발견되었다.The term "KIT" gene of the present invention, which plays an important role in melanocyte migration and survival and encodes the mast / stem cell growth factor receptor, pig KIT gene is chromosome 8 Encoded in, it consists of 21 exons. The SNP markers of the present invention derived from the KIT gene, which can accurately identify Korean native pig varieties and foreign varieties, are not known and were first discovered by the present inventors.

본 발명의 용어 "SNP(Single Nucleotide Polymorphism)"란, 단일염기다형성으로, 게놈에서 단일염기(A, T, C, 또는 G)가 종의 멤버들간 또는 한 개체의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.The term "Single Nucleotide Polymorphism" (SNP) in the present invention refers to single nucleotide polymorphism, which occurs when a single nucleotide (A, T, C, or G) in the genome differs between members of a species or between paired chromosomes of an individual. Refers to the diversity of DNA sequences.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라고 한다. As used herein, the term "polymorphism" refers to a case in which two or more alleles exist in one locus, and among polymorphic sites, only a single base differs according to an individual. It is called polymorphism.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대 SNP는 두 종류의 대립인자를 갖는다.As used herein, the term “allele” refers to several types of genes that exist at the same locus of homologous chromosomes. Alleles are also used to indicate polymorphism, for example SNPs have two kinds of alleles.

백색품종인 랜드레이스와 흑모색의 제주 재래돼지를 교배하여 F2 자손 1200여두를 생산하여 생산되는 자손의 모색은 다양하게 나오는데 이를 정리를 해보면 크게 6가지 형태로 구분된다(도 1).Land races, which are white varieties, and Jeju native pigs of black color are produced by producing more than 1200 F2 offspring. There are various types of offspring, which can be classified into six types (Figure 1).

백색품종인 랜드레이스와 흑모색의 제주 재래돼지의 교배 참조축군을 대상으로 유전자형을 이용한 GWAS(Genome wide association study) 분석을 수행한 결과 한국 재래돼지의 특이적인 유전자가 8번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 2).Analysis of genome wide association study (GWAS) using genotypes of cross-breed reference stocks of white races, Landrace and Jeju black pigs, showed that the specific genes of Korean native pigs were on chromosome 8. It could be confirmed (Fig. 2).

KIT 유전자에 대해 서열 분석을 한 결과 KIT 유전자의 엑손2 영역에 c.586 G>A 돌연변이를 존재함을 확인할 수 있었다(도 3).Sequence analysis of the KIT gene confirmed that the c.586 G> A mutation was present in the exon2 region of the KIT gene (FIG. 3).

또한, 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석한 결과 제주 재래돼지는 외래 돼지 품종과 비교해서 유전적으로 독립된 집단으로 구분됨을 확인할 수 있었다(도 4).In addition, as a result of analyzing the network between varieties using the base mutation of the pig KIT gene according to an embodiment of the present invention it was confirmed that the Jeju native pigs are classified into a genetically independent group compared to the foreign pig breed (Fig. 4).

본 발명의 일 실시예에 의하면, KIT 엑손2의 SNP 마커에 의한 유전자형은 G/G 유전자형 및 A/A 유전자형이 존재하며, A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다(도 5, 도 6 및 표 1). 표 1에 나타난 바와 같이, 제주 재래돼지 및 내륙 재래돼지는 A/A 유전자형인 반면, 외래 돼지 품종은 모두 G/G 유전자형을 가지고 있다. According to an embodiment of the present invention, the genotype by the SNP marker of KIT exon 2 is present in the G / G genotype and A / A genotype, in the case of A / A type can be determined as a Korean native pig breed (Fig. 5, 6 and Table 1). As shown in Table 1, Jeju native pigs and inland native pigs are A / A genotypes, while foreign pig varieties all have G / G genotypes.

따라서, 본 발명의 SNP 마커 부위를 증폭하고 파이로 시퀀싱(Pyro-sequencing) 방법으로 상기 SNP 마커의 유전자형을 확인하면, 한국 재래돼지 여부를 정확하게 식별할 수 있다. Therefore, by amplifying the SNP marker region of the present invention and confirming the genotype of the SNP marker by Pyro-sequencing method, it is possible to accurately identify whether or not Korean native pig.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종과 한국 재래돼지 품종을 식별할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, it is possible to identify the land race, Duroc, Great Yorkshire, and Berkshire varieties and Korean native pig varieties.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 유사한 흑색의 모색을 가진 버크셔 품종과 제주 재래돼지 품종을 식별할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, it is possible to identify the Berkshire breed and Jeju native pig breed having a similar black color.

본 발명에 있어, "파이로시퀀싱(pyrosequencing)"은 표지된 프라이머(labeled primer)가 필요하지 않으며 젤 전기영동 과정이 없이, DNA의 염기 서열을 30~40 염기쌍(bp) 정도만을 염기 서열 분석함으로써 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 파이로시퀀싱 방법은 실시간으로 수행되는, 전기영동을 하지 않고 이루어지는 시퀀싱 방법으로서, 프라이머-디렉티드 PCR에서 한번에 하나씩 순차적인 뉴클레오티드의 첨가와 병합에 의해 이루어지고 뉴클레오티드가 병합되면서 방출되는 파이로포스페이트는 ATP 설파릴레이즈(sulfurylase) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 효소와 짝지어져 빛을 방출시키며, 이 빛을 검출하는 방식으로 이루어진다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 뉴클레오티드의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 이 빛은 병합된 뉴클레오티드의 수와 비례하여 상대적 높이를 갖는 피크로 보여지고, 이를 보고 실시간으로 시퀀스를 결정할 수 있다.In the present invention, "pyrosequencing" does not require a labeled primer and does not require gel electrophoresis, and by sequencing the base sequence of the DNA only about 30-40 base pairs (bp) This is a quick and accurate way to analyze. Pyro sequencing method is a sequencing method performed in real time, without electrophoresis, pyrophosphate is released by the addition and merging of sequential nucleotides one at a time in primer-directed PCR and released as the nucleotides merge It is paired with sulfurylase and luciferase enzymes to emit light, which is done by detecting this light. The emitted light exhibits signal peaks in the order of reaction of each nucleotide sequentially entered, and the light is shown as a peak having a relative height in proportion to the number of merged nucleotides, which can be determined in real time.

피크의 패턴은 호모 및 헤테로, 야생형 및 돌연변이 시료 간 다르게 나타나므로, 야생형의 유전자 염기서열과 분석된 염기서열을 비교하여, 염기서열 차이를 통해 돌연변이의 타입 및 정확한 위치를 확인, 결정할 수 있으며, 빠르고, 간단하고, 경제적인 방식으로 다량의 시료를 처리할 수 있는 장점이 있다.Patterns of peaks differ between homo and hetero, wild-type, and mutant samples, so you can compare the nucleotide sequence of the wild-type with the analyzed sequencing to identify and determine the type and exact location of the mutation through sequence differences. The advantage is that a large amount of sample can be processed in a simple and economic manner.

종래의 직접적 DNA 시퀀싱 방법은 현재 자동화된 염기서열분석기기에 의해 수행됨에도 불구하고, 염기서열 분석할 PCR 산물과 같은 DNA 시료를 수득한 후에 정제하여 시퀀싱 반응을 수행한 후, 시퀀싱 반응으로 생성된 DNA를 침전시키고, 이를 자동화된 DNA 염기서열분석기기에 로딩하여 서열을 읽게 되므로 서열분석에 요구되는 시간이 훨씬 많은 단점이 있는 반면, 파이로시퀀싱은 염기서열 분석할 PCR 산물만 준비된다면 시퀀싱 프라이머를 가지고 반응시키고, 이는 파이로시퀀싱 기기에 의해 대략 10분 내에 염기서열의 분석이 가능하다.Although the conventional direct DNA sequencing method is currently performed by an automated sequencing apparatus, a DNA sample such as a PCR product to be sequenced is obtained, purified, and then subjected to a sequencing reaction, and then DNA generated by the sequencing reaction. While the time required for sequencing is much shorter because it is precipitated and loaded into an automated DNA sequencing apparatus, pyro sequencing has a sequencing primer if only PCR products to be sequenced are prepared. After the reaction, the sequence can be analyzed in approximately 10 minutes by a pyro sequencing device.

또한, 뉴클레오티드 분배 순서 (nucleotide dispensation order)가 디자인될 수 있으므로 단일 뉴클레오티드에 의해 달라지는 염기서열 변이는 여러 피크에서 다른 양상으로 나타나는 뚜렷한 파이로그램으로 생성된다. 더욱이, 특정 뉴클레오티드 분배 전략을 사용함으로써 파이로시퀀싱 사이클의 수를 감소시킬 수 있고, 이에 따라 서열의 질과 판독 길이를 증가시킬 수 있다.In addition, since nucleotide dispensation orders can be designed, sequence variations that vary by a single nucleotide are generated as distinct pyograms that appear in different patterns at different peaks. Moreover, the use of specific nucleotide distribution strategies can reduce the number of pyro sequencing cycles, thereby increasing the quality of the sequence and the read length.

본 발명의 일 구체예로서 사용될 수 있는 공정을 간단히 설명하면 이하와 같다. 파이로시퀀싱을 통해 변이(Mutation 혹은 Variation)를 검출하고자 하는 염기서열을 포함하는 유전자를 pyro-PCR 프라이머 세트(한쪽 가닥의 분리 정제를 위해 순방향 혹은 역방향 프라이머의 한쪽의 5' 말단에 바이오틴을 컨쥬게이션한다)를 이용하여 RT-PCR 및 PCR을 통해 증폭하고, 이렇게 증폭된 PCR 산물은 아비딘이 컨쥬게이션된 비드와 반응 후 아비딘과 바이오틴의 친화력을 이용하여 PCR로 증폭된 DNA의 한쪽 가닥만 분리 비드에 고정한다. 이렇게 분리 정제된 한쪽 가닥의 DNA 주형을 이용하여 파이로시퀀싱 프라이머와 어닐링한 후 파이로시퀀서(pyro-sequencer)에서 뉴클레오티드 분배 순서에 따라 분주된 뉴클레오티드가 기질/효소와 함께 DNA 주형과 반응하여 나타난 파이로그램(pyrogram)을 이용하여 염기서열의 변이의 정도를 분석한다.Brief description of the processes that can be used as one embodiment of the present invention is as follows. Conjugation of a biotin to the 5 'end of the forward or reverse primer for pyro-PCR primer set (single-stage purification of one strand for isolation and purification of one strand) of the gene containing the sequence to be detected by pyro sequencing (Mutation or Variation) Amplified by RT-PCR and PCR, and the amplified PCR product is reacted with the conjugated beads of avidin, and then only one strand of the DNA amplified by PCR using affinity between avidin and biotin is separated into the beads. Fix it. After annealed with the pyro sequencing primer using a single strand of DNA template thus separated and purified, the resulting nucleotides were reacted with the substrate / enzyme with the DNA template according to the sequence of nucleotide distribution in the pyro-sequencer. Pyrogram is used to analyze the degree of variation in the nucleotide sequence.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 386번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 386번째 염기를 포함하는 5 내지 600개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물이 제공된다.According to another aspect of the present invention, in the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, the 386th base is A or G, and the base sequence of SEQ ID NO: 1 includes 5 to 600 consecutive bases including the 386th base. Provided is a composition for identifying Korean native pigs, comprising an agent capable of detecting or amplifying a SNP marker comprising a polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof.

본 발명에 있어서, SNP 마커를 증폭 또는 검출할 수 있는 제제는 상기와 같은 유전자 변이 부위, 즉 SNP 마커를 증폭 및 파이로시퀀싱 방법을 통해 검출하여 한국 재래돼지 여부를 식별할 수 있는 조성물을 의미하며, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 파이로시퀀싱 프라이머, 및 PCR 방법에 이용되는 증폭용 조성물일 수 있다.In the present invention, the agent capable of amplifying or detecting the SNP marker refers to a composition capable of identifying Korean native pigs by detecting such a genetic mutation site, that is, the SNP marker through amplification and pyro sequencing methods. , A primer capable of specifically amplifying a polynucleotide including the SNP marker, a pyro sequencing primer, and an amplification composition used in a PCR method.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제제는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the preparation may include a primer set represented by SEQ ID NOs: 2 and 3.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머들의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. As used herein, the term “primer” refers to a short sequence that functions as a starting point for copying a template strand with a base sequence having a short free 3 ′ hydroxyl group. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. The length of PCR conditions, sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.

도 5에는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 엑손2 염기서열(서열번호 1) 중 SNP 마커 및 분석용 프라이머 제작을 위한 위치가 나타나 있다.Figure 5 shows the position for the production of SNP markers and analytical primers in swine KIT exon 2 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for identifying Korean native pigs, comprising the composition.

본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the kit may be, but is not limited to, an RT-PCR kit or a microarray chip kit including an agent capable of detecting or amplifying SNP markers.

본 발명의 키트는 한국 재래돼지를 식별할 수 있는 유전자를 증폭시킨 후 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드의 양상을 확인함으로써 한국 재래돼지 여부를 식별할 수 있다. 상기 PCR 키트는, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.The kit of the present invention can identify whether or not Korean native pig by amplifying a gene that can identify Korean native pig and then cutting the band with restriction enzymes. The PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer (variable pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs) in addition to each primer pair specific for a polynucleotide comprising a SNP marker or its complementary polynucleotide. ), Enzymes such as Taq-polymerase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. Specifically, the PCR kit may be a kit for performing PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism).

본 발명에서, PCR-RFLP 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다. In the present invention, the PCR-RFLP method is a technique for analyzing the restriction fragment length polymorphism of the gene fragments using PCR technology among various DNA analysis techniques for improving the genetic characteristics or ability of the livestock, a specific point mutation (point mutation) When there is a restriction enzyme recognition site at the site of mutation, it is a method to determine the desired genotype of each individual more quickly and accurately by using various fragment lengths generated by restriction enzymes depending on the genotype difference of each individual. .

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 마이크로어레이가 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a microarray for identifying a Korean native pig, comprising the composition.

본 발명에 있어 "마이크로어레이"란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. In the present invention, "microarray" refers to a microarray in which a group of polynucleotides is immobilized at a high density on a substrate, and each of the polynucleotide groups is immobilized in a predetermined region. Such microarrays are well known in the art. Microarrays are disclosed, for example, in US Pat. Nos. 5,445,934 and 5,744,305, the contents of which are incorporated herein by reference.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산으로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 한국 재래돼지 식별 방법이 제공된다.According to another aspect of the invention, a) extracting a nucleic acid from a pig sample; b) amplifying a polymorphic site of said SNP marker from said extracted nucleic acid; And c) determining the base of the amplified polymorphic site.

본 발명에 있어, 상기 a) 및 b) 단계에서 돼지 시료로부터 핵산을 추출하고 SNP 마커의 다형성을 부위를 증폭하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 핵산을 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.In the present invention, the method of extracting the nucleic acid from the swine sample in step a) and b) and amplifying the polymorphism site of the SNP marker may be made through a method known in the art. For example, it can be done by directly purifying DNA from tissue or cells or by specifically amplifying and isolating specific regions using amplification methods such as PCR. In the present invention, a nucleic acid is meant to include not only DNA but also cDNA and RNA molecules synthesized from mRNA. Extracting the nucleic acid from the sample of interest may include, for example, PCR amplification, ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)), transcription Transcription amplification (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)) and self-sustaining sequence replication (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874 (1990)) And nucleic acid based sequence amplification (NASBA) and the like.

본 발명에 있어, 상기 시료는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다. 이에 한정되는 것은 아니나, 피부조직일 수 있다. In the present invention, the sample may be a hair, urine, blood, various body fluids, separated tissues, samples such as isolated cells or saliva, but is not particularly limited thereto. It is not limited thereto, but may be skin tissue.

본 발명에 있어, 상기 b) 단계에서 증폭은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.In the present invention, the amplification in step b) may use a primer set represented by SEQ ID NO: 2 and 3.

본 발명에 있어, 상기 c) 단계에서 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, AffymetrixGeneChip), 및 BeadArrayTechnologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다. In the present invention, the method of determining the base of the amplified polymorphic site in step c) comprises sequencing, hybridization by microarray, allele specific PCR, dynamic allele hybridization technique (dynamic allele-specifichybridization (DASH), PCR prolongation analysis, PCR-SSCP, PCR-RFLP analysis or TaqMan technique, SNPlex platform (Applied Biosystems), mass spectrometry (e.g. Sequenom's MassARRAY system), mini-sequencing using sequencing methods, Bio-Plex systems (BioRad), CEQ and SNPstream systems (Beckman), Molecular Inversion Probe array technologies (e.g., AffymetrixGeneChip), and BeadArray Technologies (e.g., Illumina GoldenGate and Infinium assays) It may be carried out by, but is not particularly limited thereto. One or more alleles can be identified in the SNP markers by the methods or other methods available to those skilled in the art.

상기 혼성화란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다. 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다.Hybridization refers to a process in which two complementary strands of nucleic acids combine to form a double stranded molecule (hybrid). In the process of the invention said hybridization is a process carried out under high stringency hybridization conditions.

혼성화 정도를 검출하기 위해, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지물질로 표지될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 P32 또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.To detect the degree of hybridization, the target sequence can be labeled with a detectable label. In one embodiment, the labeling material may be, but is not limited to, a material that emits fluorescence, phosphorescence, or radioactivity. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When amplifying the target sequence, PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer to allow the target sequence to be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. In addition, the label using the radioactive material may add radioactive isotopes such as P32 or S35 to the PCR reaction solution during the PCR, while the amplification product is synthesized and the radioactive material is incorporated into the amplification product, thereby amplifying the radiolabeled product.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.The TaqMan method comprises the steps of: (1) designing and constructing a primer and a TaqMan probe to amplify a desired DNA fragment; (2) labeling probes of different alleles with FAM dye and VIC dye (Applied Biosystems); (3) using the DNA as a template and performing PCR using the primers and probes described above; (4) after the PCR reaction is completed, analyzing and confirming the TaqMan assay plate with a nucleic acid analyzer; And (5) determining the genotype of the polynucleotides of step (1) from the analysis result.

상기 서열 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. The sequencing may use conventional methods for sequencing and may be performed using an automated genetic analyzer. In addition, allele-specific PCR refers to a PCR method for amplifying a DNA fragment in which the mutation is located with a primer set including a primer designed with the base at which the mutation site is located as the 3 'end. The principle of the method is, for example, when a specific base is substituted from A to G, PCR by designing a primer containing A as the 3 'terminal base and a reverse primer capable of amplifying a DNA fragment of a suitable size. When the reaction is performed, when the base of the mutation position is A, the amplification reaction is normally performed, and a band of the desired position is observed. When the base is substituted with G, the primer may complementarily bind to template DNA. The amplification reaction is not performed properly because the 3 'end is not complementary.

DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.DASH may be performed by a conventional method, preferably by a method by Prince et al.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 세트로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.PCR extension analysis, on the other hand, first inactivates a DNA fragment containing a base on which a single nucleotide polymorphism is located by amplifying with a primer set, and then deactivating all nucleotides added to the reaction by inactivating the specific extension primer, dNTP. By adding a mixture, didioxynucleotide, reaction buffer and DNA polymerase to effect primer extension. At this time, the extension primer is a 3 'end of the base immediately adjacent to the 5' direction of the base where the mutation site is located, the dNTP mixture excludes a nucleic acid having the same base as the didioxynucleotide, the didioxynucleotide is a mutation It is selected from one of the base types shown. For example, if there is a substitution from A to G, when a mixture of dGTP, dCTP and TTP and ddATP are added to the reaction, the primer is extended by DNA polymerase at the base where the substitution takes place and after several bases A The primer extension is terminated by ddATP at the position where the base first appears. If the substitution has not occurred, since the extension reaction is terminated at the position, it is possible to determine the base type showing the mutation by comparing the length of the extended primer.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.In this case, as the detection method, when the fluorescent primer is labeled with an extended primer or didioxynucleotide, the mutation can be detected by detecting fluorescence using a gene analyzer (for example, Model 3700, manufactured by ABI, etc.) used for general sequencing. In the case of using unlabeled extension primers and didioxynucleotides, the variation can be detected by measuring molecular weight using a matrix assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) technique.

도 6에는 본 발명의 일 실시예에 의해 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형, A/A형으로 나타나는 것이 분석되었다. 6, the alleles were analyzed to appear as G / G and A / A types as the mutation of the 386th base in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is represented by A or G.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 대립 유전자형이 A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, if the allele of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) is A / A type, it may be determined as a Korean native pig breed.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 A인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, if the base type of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) can be determined as a Korean native pig breed.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 G인 경우 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 또는 버크셔 품종으로 판단할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, when the base type of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 is G, it may be determined as a Landrace, Duroc, Great Yorkshire, or Berkshire variety.

따라서, 본 발명의 SNP의 유전자형을 검출하거나 또는 상기 유전자형을 검출할 수 있는 프라이머를 이용하면, 한국 재래돼지 품종만 선별적으로 정확하게 식별할 수 있다. Therefore, by detecting the genotype of the SNP of the present invention or by using a primer capable of detecting the genotype, it is possible to selectively and accurately identify only Korean native pig varieties.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 한국 재래돼지 관련  1: Korean traditional pig GWASGWAS (genome-wide association study) 분석(genome-wide association study) analysis

백색 품종인 랜드레이스 돼지와 흑모색의 제주 재래흑돼지의 교배 참조축군을 대상으로 흑모색에 대한 SNP chip(Porcine 60K Beadchip, Illumina)을 이용하여 GWAS 분석을 수행하였다(도 2). 도 2는 제주 재래돼지와 랜드레이스 교배 축군에서 전신 흑모색에 대한 GWAS 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, GWAS 분석 결과 8번 염색체에서 가장 유의성이 높았으며, 그 영역에는 돼지의 모색과 관련된 KIT 유전자가 있어 이를 후보 유전자로 선정하였다.GWAS analysis was performed using a SNP chip (Porcine 60K Beadchip, Illumina) for black color in the cross reference reference group of white breeds of Landrace pigs and black color Jeju native black pigs (FIG. 2). Figure 2 is a graph showing the results of the GWAS analysis for whole body black color in Jeju traditional pig and land race breeding herds. As shown in FIG. 2, GWAS analysis showed the highest significance in chromosome 8, and the region had a KIT gene related to the groping of pigs and was selected as a candidate gene.

돼지 KIT 유전자는 백색과 유색을 식별하는데 사용되는 중요한 모색유전자로 알려져 있다. 구체적으로 백색의 모색을 가진 품종으로는 랜드레이스, 대 요크셔 품종이 있으며 이들 품종은 KIT 유전자가 최소 2개 이상 반복되는 CNV(copy number variation)를 갖고 있는 특성이 있다. 따라서 유전자 구조가 복잡하고 그 길이가 길어서 변이체 탐색에 있어 가장 빠른 방법을 선정하기 위하여 돼지 피부를 채취하여 mRNA 서열을 RT-PCR 방법으로 증폭하여 상기 시퀀싱 방법으로 염기서열을 해독하였다. 그 결과 exon2에서 단백질 서열이 변화하는 Non-synonymous SNP(c.586G>A )가 확인되었다(도 3).The porcine KIT gene is known to be an important color gene used to identify whites and colors. Specifically, white-grown varieties include land races and large Yorkshire varieties, and these varieties have CNV (copy number variation) with at least two KIT genes. Therefore, in order to select the fastest method for searching for a variant because the gene structure is complex and its length is large, pig skin was collected, the mRNA sequence was amplified by RT-PCR method, and the base sequence was decoded by the sequencing method. As a result, non-synonymous SNPs (c.586G> A) with a protein sequence change in exon2 were identified (FIG. 3).

실시예Example 2: 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한  2: base mutation of the pig KIT gene 품종간Breed 네트워크 분석 Network analysis

예비 실험단계에서 돼지 KIT 유전자를 대상으로 6품종(랜드레이스, 대요크셔, 두록, 제주재래돼지, 버크셔 및 햄프셔)에 대하여 KIT 유전자의 5'-UTR, exon, 3'-UTR 영역에서 변이체를 확인하고 이 변이체의 염기서열 상동성을 이용하여 유전적 거리를 계산하여 네트워크 분석을 진행하였다.In the preliminary experiments, variants were identified in the 5'-UTR, exon, and 3'-UTR regions of the KIT gene for six varieties (land race, large Yorkshire, Dourok, Jeju native pig, Berkshire, and Hampshire) in the preliminary experimental phase. The genetic distance was calculated using the sequence homology of the variants, and network analysis was performed.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 돼지 KIT 유전자의 염기변이를 이용한 품종간 네트워크 분석을 한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 제주 재래돼지가 외래 돼지 품종에 비해 유전적으로 독립된 집단으로 구분되는 것이 확인되어 제주 재래돼지 특히 서열이 존재할 가능성이 크다.Figure 4 is a diagram showing the results of the network analysis between varieties using the base mutation of the pig KIT gene according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 4, it is confirmed that Jeju native pigs are divided into genetically independent populations compared to foreign pig varieties, and thus, Jeju native pigs, in particular, sequences are more likely to exist.

실시예Example 3: SNP 유전자형 분석 3: SNP genotyping

파이로-시퀀서(Pyro-sequencer)를 이용한 유전자형 분석을 수행하여 상기 SNP(c.586G>A) 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.Genotyping using a Pyro-sequencer was performed to prepare primers capable of detecting the SNP (c.586G> A) mutation as follows.

KIT_new_ex2F: biotin-GGC-CAT-TCA-AAC-TCC-TGA-TT(서열번호 2)KIT_new_ex2F: biotin-GGC-CAT-TCA-AAC-TCC-TGA-TT (SEQ ID NO: 2)

KIT_ new_ex2R: CAG-AAG-CAA-GCC-AGC-AAG-AG(서열번호 3)KIT_ new_ex2R: CAG-AAG-CAA-GCC-AGC-AAG-AG (SEQ ID NO: 3)

KIT_ new_ex2_MINI: GAT-ACT-CGC-GCT-TCA-CGT-TT(서열번호 4)KIT_ new_ex2_MINI: GAT-ACT-CGC-GCT-TCA-CGT-TT (SEQ ID NO: 4)

입력 [C/T]TGATGGTGATGCC(서열번호 5)Input [C / T] TGATGGTGATGCC (SEQ ID NO: 5)

PCR product size: 344bpPCR product size: 344bp

집단분석을 위해 상기와 같이 프라이머 1쌍을 제작하였는데 KIT_new_ex2F에는 biotin-dye를 결합하여 제작하였다.One pair of primers were prepared as described above for population analysis. KIT_new_ex2F was prepared by combining biotin-dye.

PCR 증폭 후에 파이로-시퀀서를 이용하여 매뉴얼에 따라 유전자형 분석을 진행하여 유전자형을 판독하였다. 이때 유전자 증폭은 95℃에서 5분간 denaturation을 진행하고, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 총 35 cycle 후에 72℃에서 10분간 extension 후에 8℃에서 보관하였다. After PCR amplification, genotyping was performed according to the manual using a Pyro-Sequencer to read the genotype. At this time, gene amplification was performed at 95 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute for a total of 35 cycles.

상기 파이로-시퀀싱 분석 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 서열번호 1의 염기서열에서 386번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 G/G형 및 A/A형으로 각각 나타나는 것을 알 수 있었다.As a result of the pyro-sequencing analysis, as shown in FIG. 6, allelic types are shown as G / G type and A / A type as the 386th mutation of the 386th base is represented as A or G. Could know.

실시예Example 4: 돼지 품종별 KIT  4: KIT by pig breed 엑손2Exxon 2 유전자형 집단분석 Genotype Population Analysis

국내에서 사육하고 있는 대표적인 돼지 품종인 랜드레이스, 두록, 대요크셔 및 흑모색의 버크셔 품종과 재래돼지돼지 품종별 KIT 엑손2 유전자형을 분석하여 표 1에 나타내었다.KIT exon 2 genotypes of each of the typical pig breeds, such as Landrace, Dourok, Great Yorkshire, and dark brown Berkshire breeds and conventional pork breeds, are analyzed and shown in Table 1.

Figure 112018018413730-pat00001
Figure 112018018413730-pat00001

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 재래돼지는 제주재래돼지 44두와 내륙 재래돼지 5두를 포함하여 전체 49두가 A/A 유전자형으로 고정되어 있는 반면, 나머지 4개의 품종은 G/G 유전자형을 가지고 있다.As shown in Table 1, a total of 49 dogs, including 44 Jeju native pigs and 5 inland native pigs, are fixed to the A / A genotype, while the remaining four breeds have the G / G genotype. have.

따라서, 본 발명의 SNP의 유전자형을 검출하거나 또는 상기 유전자형을 검출할 수 있는 프라이머를 이용하면, 한국 재래돼지 품종만 선별적으로 정확하게 식별할 수 있다. Therefore, by detecting the genotype of the SNP of the present invention or by using a primer capable of detecting the genotype, it is possible to selectively and accurately identify only Korean native pig varieties.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use thereof <130> NPF31848 <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 618 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnag cattttagat ttttatcaca tgttttcagt gtctgtgacc ggccattcaa 180 actcctgatt gttgatatgc tgcagatcct gagaagcttt tcctcgtcga ccctcccttg 240 tatgggaagg aggacaatga cgcgctggtc cgatgtcctc tgacggaccc agaggtgacc 300 aattactccc tcacgggctg cgaggggaaa ccccttccca aggatttgac cttcgtcgcg 360 gaccccaagg ccggcatcac catcagaaac gtgaagcgcg agtatcatcg gctctgtctc 420 cactgctccg ccaaccaggg gggcaagtcc gtgctgtcga agaaattcac cctgaaagtg 480 agggcaggta cgagctcttg ctggcttgct tctgggagct ggcatatccg ctgatctaaa 540 agtagacatc tctcttctca ctggtccatg tttgtatgtc acttggatag ccgctctggt 600 cttttccccc agcttcaa 618 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 ggccattcaa actcctgatt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 cagaagcaag ccagcaagag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 gatactcgcg cttcacgttt 20 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 tgatggtgat gcc 13 <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Gene marker for discrimination of Korean Native pig and use          about <130> NPF31848 <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 618 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnag cattttagat ttttatcaca tgttttcagt gtctgtgacc ggccattcaa 180 actcctgatt gttgatatgc tgcagatcct gagaagcttt tcctcgtcga ccctcccttg 240 tatgggaagg aggacaatga cgcgctggtc cgatgtcctc tgacggaccc agaggtgacc 300 aattactccc tcacgggctg cgaggggaaa ccccttccca aggatttgac cttcgtcgcg 360 gaccccaagg ccggcatcac catcagaaac gtgaagcgcg agtatcatcg gctctgtctc 420 cactgctccg ccaaccaggg gggcaagtcc gtgctgtcga agaaattcac cctgaaagtg 480 agggcaggta cgagctcttg ctggcttgct tctgggagct ggcatatccg ctgatctaaa 540 agtagacatc tctcttctca ctggtccatg tttgtatgtc acttggatag ccgctctggt 600 cttttccccc agcttcaa 618 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 ggccattcaa actcctgatt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 cagaagcaag ccagcaagag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 gatactcgcg cttcacgttt 20 <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 tgatggtgat gcc 13

Claims (11)

서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 386번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 386번째 염기를 포함하는 5 내지 600개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물로서, 상기 조성물은 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종과 한국 재래돼지 품종을 식별할 수 있는 것인, 조성물.
In the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1, the 386th base is A or G, and the polynucleotide consisting of 5 to 600 consecutive bases including the 386th base as the base sequence of SEQ ID NO. A composition for identifying Korean native pigs, comprising an agent capable of detecting or amplifying SNP markers comprising polynucleotides, said composition capable of identifying landrace, Duroc, Daeyokshire, and Berkshire varieties and Korean native pig varieties. That is, the composition.
제1항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 조성물.
The method of claim 1,
The formulation comprises a primer set represented by SEQ ID NO: 2 and 3, Korean traditional pig identification composition.
삭제delete 제1항에 있어서,
버크셔 품종과 제주 재래돼지 품종을 식별할 수 있는, 한국 재래돼지 식별용 조성물.
The method of claim 1,
Korean native pig identification composition, which can identify Berkshire varieties and Jeju native pig varieties.
제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 키트.
Korean traditional pig identification kit containing the composition of any one of Claims 1, 2, and 4.
제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 한국 재래돼지 식별용 마이크로어레이.
A microarray for identifying Korean native pigs, comprising the composition according to any one of claims 1, 2 and 4.
a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 핵산으로부터 제1항의 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 랜드레이스, 두록, 대요크셔, 및 버크셔 품종으로부터 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
a) extracting nucleic acid from a pig sample;
b) amplifying the polymorphic site of the SNP marker of claim 1 from the extracted nucleic acid; And
and c) determining the base of the amplified polymorphic site, the method of identifying Korean native pigs from Landrace, Duroc, Great Yorkshire, and Berkshire varieties.
제7항에 있어서,
단계 b)에서 증폭은 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
The method of claim 7, wherein
Amplification in step b) using a primer set represented by SEQ ID NO: 2 and 3, the method of identifying Korean native pigs.
제7항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 대립 유전자형이 A/A 형인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
The method of claim 7, wherein
If the allele of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) is A / A type, it is determined that the Korean native pig breed, Korean native pig.
제7항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 A인 경우 한국 재래돼지 품종으로 판단하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
The method of claim 7, wherein
If the base type of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) is determined to be a Korean native pig breed, a method for identifying Korean native pigs.
제7항에 있어서,
단계 c)에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 386번째 염기에 해당하는 SNP의 염기타입이 G인 경우 랜드레이스, 두록, 대요크셔 또는 버크셔 품종으로 판단하는, 한국 재래돼지를 식별하는 방법.
The method of claim 7, wherein
If the base type of the SNP corresponding to the 386th base of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 in step c) is G, judging by the land race, Dourok, Dae Yorkshire or Berkshire varieties, Korean native pigs.
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