KR102235340B1 - SNP marker set for predicting growth traits of Korean native chicken and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a set of SNP markers for predicting growth traits of native chickens and their use.
가축의 경제 형질을 향상시키기 위해 후보 유전자내 유전자 마커의 이용은 여러 연구에서 보고된 바 있다. 현재에는 마커 도움 선발(marker associated selection, MAS)을 통한 가축의 선발이 가축 육종 프로그램에서 보편화된 방법 중 하나이다. 이는 게놈 정보를 사용하면 개체 선발의 정확성과 속도를 높일 수 있기 때문이다. van der Beek와 van Arendonk의 연구(1996, Anim Sci. 62(1):171-180)에 따르면 5세대 동안 QTL(quantitative trait locus)과 연관된 마커를 이용하여 MAS를 실시하였을 경우 약 6 내지 13%의 개선된 유전적 개량량을 얻을 수 있을 것이라고 추정되었다. 더욱이 가금류를 포함한 가축의 생산 특성의 큰 변화를 설명하는 인과성 돌연변이 및 유전자를 확인하기 위한 전장유전체연관분석(genome-wide association study)이 상용화된 국내 교배종에서 보고되었다. 특히, 닭 성장과 도체 특성에 큰 영향을 미치는 QTL 영역에 대한 보고 중 육계-레그혼 교잡종을 이용한 연구에서 GGA(Gallus gallus chromosome) 1, 2 및 4 영역이 확인이 되었으며, 햄프셔-레그혼 교잡종을 이용한 연구에서는 GGA1, 2, 4 및 10, 한국 재래 닭을 이용한 연구에서는 GGA3, 4, 19 및 20 영역에서 확인되었다.The use of genetic markers in candidate genes to enhance economic traits in livestock has been reported in several studies. Currently, selection of livestock through marker associated selection (MAS) is one of the most common methods in livestock breeding programs. This is because the use of genomic information can increase the accuracy and speed of individual selection. According to a study by van der Beek and van Arendonk (1996, Anim Sci . 62(1):171-180), about 6 to 13% of MAS was performed using markers associated with quantitative trait locus (QTL) for 5 generations. It was estimated that an improved amount of genetic improvement could be obtained. Furthermore, a genome-wide association study to identify causal mutations and genes that explains the large change in the production characteristics of livestock, including poultry, has been reported in commercialized domestic hybrids. Particularly, among the reports on the QTL region that has a great influence on chicken growth and carcass characteristics, the GGA (Gallus gallus chromosome) 1, 2 and 4 regions were identified in the study using broiler-leghorn hybrids, and studies using Hampshire-leghorn hybrids. In GGA1, 2, 4 and 10, and GGA3, 4, 19 and 20 in the study using Korean native chickens.
GGA4 염색체에서 보고된 QTL 영역의 전장유전체분석 결과, TBC1D1(TBC1 domain family, member 1) 유전자는 포유류 및 닭을 포함한 가축 동물의 성장과 비만에 연관되어 있는 기능적 후보 유전자 중 하나로 확인되었다. 닭은 육계와 산란계로서의 가축화 과정에서 성장과 연관된 특정 유전자가 고정되었다. 최근 전장유전체의 re-sequencing 연구에 따르면 실용 브로일러 집단에서 TBC1D1 유전자가 고정된 성장 유전자 중 하나로 확인 되었다. Rab-GTPase-activating protein TBC1D1은 쥣과의 비만 세포 라이브러리의 스크린에서 세포 분화 및 성장을 조절하는 단백질로 먼저 밝혀졌다. TBC1D1은 골격근에서 포도당 흡수에 대한 생물학적 신호를 전달하는 Rab-GAP 단백질 패밀리에 속한다. TBC1D1 유전자의 변이는 돼지의 살코기 및 지방 침착과 에너지 항상성과 관련이 있다고 보고되었다. 유사하게, 토끼 TBC1D1의 엑손 1 영역의 변이(c.214G>A)는 35 일령 및 56 일령의 체중과 유의미한 연관이 있었다. 또 다른 여러 연구에서, TBC1D1 유전자의 변이는 마우스의 비만 특성 및 인간의 체질량 지수와 관련이 있었다. Wang 등(2014, Gene 547(2):288-294)의 연구에 따르면 이와 비슷한 기능적 연관성이 닭에서도 보고되었다. 닭에서 TBC1D1 유전자의 기능적 관여는, 햄프셔-레그혼 교잡종의 5 내지 20 주령 성장에 영향을 미치는 중요한 영역이 TBC1D1 유전자의 153 내지 159 cM (61.5 내지 88.4 Mb size)의 GGA4 영역에서 기록되었다(Nassar et al., 2015 Anim Genet. 46(4):441-446).As a result of full-length genomic analysis of the QTL region reported on the GGA4 chromosome, the TBC1D1 (TBC1 domain family, member 1) gene was identified as one of the functional candidate genes involved in growth and obesity in livestock animals including mammals and chickens. Chickens have specific genes associated with growth during domestication as broilers and laying hens. According to a recent full-length genome re-sequencing study, the TBC1D1 gene was identified as one of the fixed growth genes in the practical Broiler population. Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 was first identified as a protein that regulates cell differentiation and growth on the screen of a murine mast cell library. TBC1D1 belongs to the family of Rab-GAP proteins that transmit biological signals for glucose uptake in skeletal muscle. Mutations in the TBC1D1 gene have been reported to be associated with lean meat and fat deposits and energy homeostasis in pigs. Similarly, mutations in the exon 1 region of rabbit TBC1D1 (c.214G>A) were significantly associated with body weight at 35 and 56 days of age. In several other studies, mutations in the TBC1D1 gene were associated with obesity characteristics in mice and body mass index in humans. A similar functional association was reported in chickens, according to a study by Wang et al. (2014, Gene 547(2):288-294). Functional involvement of the TBC1D1 gene in chicken are, Hampshire - an important area that affects 5 to 20-week-old growth of leghorn chicken hybrids were recorded in GGA4 region of TBC1D1 153 to 159 cM (61.5 to 88.4 Mb size) of the gene (Nassar et al ., 2015 Anim Genet. 46(4):441-446).
이에 본 발명자는 한국 재래닭에서 TBC1D1 유전자의 성장 특성(0 내지 20 주령, 0-2 주 증체량 ~ 18-20 주 증체량), 체중, 도체중(carcass weight)과 관련된 SNP(single nucleotide polymorphism) 변이를 분석하고자 하였다.Accordingly, the present inventors analyzed the growth characteristics of the TBC1D1 gene in Korean native chickens (0 to 20 weeks of age, 0-2 weeks of gain to 18-20 weeks of gain), body weight, and single nucleotide polymorphism (SNP) mutations related to carcass weight. I tried to analyze it.
한편, 한국공개특허 제2017-0087429호에는 '닭의 산란 형질 관련 유전자 마커 및 이를 이용하여 닭의 산란 형질을 분별하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1686446호에는 '연산 오계 닭 품종 판단용 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent Publication No. 2017-0087429 discloses'a genetic marker related to spawning traits of chickens and a method for discriminating spawning traits of chickens using the same.' The SNP marker and its use are disclosed, but there is no description of the set of SNP markers for predicting the growth traits of the native chicken of the present invention and the use thereof.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토종닭의 TBC1D1 유전자 내 2개의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 도출하고, 각 SNP 염기에 기반한 KSAP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제작하였다. 그 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 재래닭의 유전자형을 분석한 결과, 상기 2개의 SNP 마커가 유전자형에 따라 체중, 증체량 및 도체중의 형질에 유의적인 관계가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above requirements, and the present inventors derived two SNP (single nucleotide polymorphism) markers in the TBC1D1 gene of native chickens, and a primer set for kompetitive allele specific PCR (KSAP) based on each SNP base. Was produced. Then, as a result of analyzing the genotype of native chickens using the primer set, the present invention was completed by confirming that the two SNP markers have a significant relationship with body weight, weight gain, and traits in carcasses depending on the genotype. .
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1, 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention comprises one or more primer sets selected from the group consisting of the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1, 2 and 3 and the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 4, 5 and 6 A primer set for kompetitive allele specific PCR (KASP) for predicting the growth traits of chickens is provided.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for predicting growth traits of native chickens, including the primer set and a reagent for performing an amplification reaction.
또한, 본 발명은 토종닭 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of separating genomic DNA from native chicken samples; Using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set of the present invention to amplify a target sequence; And it provides a method for predicting the growth traits of native chickens comprising; determining the genotype of the product of the amplification step.
본 발명에 따른 SNP 마커 기반 KASP용 프라이머 세트를 이용하면, 토종닭의 체중, 증체량 및 도체중과 같은 경제성과 관련한 성장 형질을 조기에 예측할 수 있으므로, 가금 생산 농가의 소득 증대에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.When the primer set for KASP based on the SNP marker according to the present invention is used, growth traits related to economic efficiency such as weight, weight gain, and carcass weight of native chickens can be predicted early, so that it can help increase the income of poultry producers. It is expected.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 2 및 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4, 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention comprises one or more primer sets selected from the group consisting of the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 and the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6 , It provides a primer set for KASP (kompetitive allele specific PCR) for predicting the growth traits of native chickens.
본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립유전자(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.The term "KASP (kompetitive allele specific PCR)" of the present invention is one of PCR-based analysis methods, and is a homogenous and fluorescence-based genotyping technique. KASP is a technology based on fluorescence resonance energy transfer for allele-specific oligo extension and signal generation.
본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트는 토종닭에서 성장 형질과 관련있는 TBC1D1 유전자의 SNP(single nucleotide polymorphism) 다형성을 검출할 수 있는 프라이머 세트이다(표 1).The primer set for KASP of the present invention is a primer set capable of detecting a single nucleotide polymorphism (SNP) polymorphism of the TBC1D1 gene related to growth traits in native chickens (Table 1).
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 성장 형질은 체중(body weight), 증체량(weight gain) 및 도체중(carcass weight)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the primer set of the present invention, the growth trait may be body weight, weight gain, and carcass weight, but is not limited thereto.
본 발명의 상기 KASP용 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2 및 3; 및 서열번호 4, 5 및 6; 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(29개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1, 2 및 3; 및 서열번호 4, 5 및 6;의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.The primers for KASP of the present invention include SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, depending on the sequence length of each primer; And SEQ ID NOs: 4, 5 and 6; 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, 21 or more, 22 or more, 23 or more, 24 or more, 25 or more, 26 or more contiguous nucleotides within It may include an oligonucleotide consisting of a fragment of. For example, the primers of SEQ ID NO: 1 (29 oligonucleotides) are 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, 21 or more in the sequence of SEQ ID NO: 1, It may include an oligonucleotide consisting of segments of 22 or more, 23 or more, 24 or more, 25 or more, 26 or more, 27 or more, 28 or more nucleotides. In addition, the primers are SEQ ID NOs: 1, 2 and 3; And SEQ ID NOs: 4, 5, and 6; may also include the addition, deletion or substitution of the nucleotide sequence.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence that is complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as an initiating point for the synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow the synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primers will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다. In the present invention, the oligonucleotide used as a primer may also comprise a nucleotide analogue, e.g., phosphorothioate, alkylphosphorothioate or peptide nucleic acid, or It may contain an intercalating agent. In addition, the primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers serving as an initiation point for DNA synthesis. If necessary, the primer nucleic acid sequence of the present invention may include a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g., horse radish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules, chemical groups (e.g., biotin), etc. have. The suitable length of the primer is determined by the characteristics of the primer to be used, but is usually used in a length of 15 to 30 bp. The primer does not have to be exactly complementary to the sequence of the template, but must be complementary enough to form a hybrid-complex with the template.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 KASP용 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 토종닭의 TBC1D1 유전자 내 rs80645709 위치에서 A 타입의 대립유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 rs80645709 위치에서 G 타입의 대립유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다. 또한, 상기 서열번호 4 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 토종닭의 TBC1D1 유전자 내 rs14742436 위치에서 C 타입의 대립유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 토종닭의 TBC1D1 유전자 내 rs14742436 위치에서 T 타입의 대립유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다. 상기 4개의 프라이머 세트 중, 서열번호 1 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 토종닭의 우수한 성장 형질과 관련된 염기 타입을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다.In the primer set for KASP for predicting the growth traits of native chickens according to an embodiment of the present invention, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 is of type A at position rs80645709 in the TBC1D1 gene of native chickens. It is a primer set capable of amplifying an allele, and the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 is a primer set capable of amplifying a G type allele at position rs80645709. In addition, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 is a primer set capable of amplifying the C type allele at position rs14742436 in the TBC1D1 gene of native chicken, and the oligonucleotide primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 The set is a set of primers capable of amplifying the T-type allele at the rs14742436 position in the TBC1D1 gene of native chickens. Among the four primer sets, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 are primer sets capable of amplifying the base type associated with excellent growth traits of native chickens. to be.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for predicting growth traits of native chickens, including the primer set and a reagent for performing an amplification reaction.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In the kit of the present invention, reagents for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffers, and the like. In addition, the kit of the present invention may further include a user's guide describing the optimum reaction performance conditions. The guide is a printout explaining how to use the kit, e.g., how to prepare PCR buffer, suggested reaction conditions, and so on. The guide includes a brochure in the form of a pamphlet or flyer, a label affixed to the kit, and a description on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 또한,The present invention also,
토종닭 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;Separating genomic DNA from the native chicken sample;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Amplifying a target sequence by performing an amplification reaction using the isolated genomic DNA as a template and using the primer set for KASP of the present invention; And
상기 증폭 단계의 산물의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 방법을 제공한다.It provides a method for predicting the growth traits of native chickens comprising; determining the genotype of the product of the amplification step.
본 발명의 방법은 토종닭 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 이에 한정하지 않으나, 근육, 표피, 혈액 또는 털 등일 수 있다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다.The method of the present invention includes the step of isolating genomic DNA from a sample of native chicken. The sample is not limited thereto, but may be muscle, epidermis, blood, or hair. As a method of separating the genomic DNA, a method known in the art may be used. For example, the CTAB method may be used, or the Wizard prep kit (Promega) may be used. Using the isolated genomic DNA as a template, and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention as a primer, a target sequence may be amplified. Methods of amplifying target nucleic acids include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, and transcription-based amplification system. amplification system), strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used. In the present invention, DNA includes not only DNA but also cDNA synthesized from mRNA.
상기 증폭 단계 산물의 유전자형을 결정하는 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, DNA 칩, 모세관 전기영동 등을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP(single nucleotide polymorphism) 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The method of determining the genotype of the amplification step product may be performed by various methods known in the art. For example, it may be performed through a DNA chip, capillary electrophoresis, or the like, but is not limited thereto. For capillary electrophoresis, for example, an ABI sequencer can be used. In addition, by performing direct determination of the nucleotide sequence of a nucleic acid by dideoxy method, or by hybridizing a probe containing a sequence of a single nucleotide polymorphism (SNP) or a probe complementary thereto with the DNA and measuring the degree of hybridization obtained therefrom. A method of determining the nucleotide sequence of the polymorphic site may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응된 산물의 유전자형이 토종닭의 TBC1D1 유전자 내 rs80645709 및 rs14742436 위치에서 각각 AA 및 CC 유전자형으로 결정되면, 해당 시료의 토종닭은 우수한 성장 형질을 가지는 것으로 예측될 수 있다.In the method for predicting the growth traits of native chickens according to an embodiment of the present invention, the genotype of the amplified reaction product using the primer set is AA and CC genotypes at positions rs80645709 and rs14742436 in the TBC1D1 gene of native chickens, respectively. If determined as, the native chicken of the sample can be predicted to have excellent growth traits.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and methods
한국 재래 닭 88 마리(F0) 부모 (15 수컷 및 73 암컷)에서 생성한 총 597 마리의 F1 세대 닭을 실험에 이용하였고, 총 597 마리 중 Gray-Brown(G = 110), Black (L = 88), Red-Brown(R = 135), White(W = 121) 및 Yellow-Brown(Y = 130)의 584 마리를 사용하였다. 모든 개체는 NIAS(National Institute of Animal Science)에서 제공한 기준(2012-C037)에 맞추어 동일한 사료 및 환경 조건으로 사육되었다. 성장 특성 중 체중(body weight, BW)은 0~20 주령까지 측정되었고, 도축시 체중(공복 시간 후 기록)을 기록하였다. 증체량(Weight gain, GR)의 경우 2주 간격으로 계산하였다. A total of 597 F first generation chickens produced by 88 Korean native chickens (F 0 ) parents (15 males and 73 females) were used in the experiment, and Gray-Brown (G = 110), Black (L = 88), Red-Brown (R = 135), White (W = 121) and Yellow-Brown (Y = 130) were used. All individuals were bred in the same feed and environmental conditions according to the standards (2012-C037) provided by the National Institute of Animal Science (NIAS). Among the growth characteristics, body weight (BW) was measured from 0 to 20 weeks of age, and body weight at slaughter (recorded after fasting time) was recorded. Weight gain (GR) was calculated every two weeks.
표준 매뉴얼에 따라 전혈 샘플로부터 게노믹 DNA를 분리하고 NanoDrop® 2000C 분광 광도계(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 농도를 측정하였다. TBC1D1 유전자는 여러 연구에서 확인 된 QTL 영역에서 기능적 후보 유전자로 선택되었으며, 본 발명에 기술된 SNP 변이는 한국 재래닭 전체 게놈 SNP 주석 정보(Gallus gallus 5.0; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002315.3/)를 필터링함으로써 획득되었다. 하기 표 1의 rs80645709 및 rs14742436 위치는 각각 GGA4의 g.70179137A>G 및 g.70175861T>C이다. 표적 SNP의 확인을 위해 KASP(kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트를 제작하였다(표 1). 부모(F0) 및 자손(F1) 샘플 두가지 모두 유전자형 분석을 실시하였고, 자손(F1) 샘플의 경우 부모(F0) 샘플의 유전자형 정보와의 대조를 통해 한번 더 유전자형 분석결과를 확인하였다.To remove the genomic DNA from whole blood samples according to standard manual, and the concentration was measured using a NanoDrop ® 2000C spectrophotometer (Thermo Scientific, USA). The TBC1D1 gene was selected as a functional candidate gene in the QTL region identified in several studies, and the SNP mutations described in the present invention are Korean native chicken whole genome SNP annotation information (Gallus gallus 5.0; https://www.ncbi.nlm.nih .gov/assembly/GCF_000002315.3/). The positions of rs80645709 and rs14742436 in Table 1 below are g.70179137A>G and g.70175861T>C of GGA4, respectively. For the identification of the target SNP, a set of KASP (kompetitive allele specific PCR) primers were prepared (Table 1). Genotyping was performed for both parent (F 0 ) and offspring (F 1 ) samples, and in the case of offspring (F 1 ) samples, the genotyping results were confirmed once more by comparing the genotyping information of the parent (F 0) sample. .
유전자형 데이터 및 정량적 데이터는 엑셀 및 R 소프트웨어를 통해 정리하였다. 표현형 데이터에 대한 기술 통계량은 MINITAB 버전 14 (MINITAB Inc., USA)를 사용하여 얻었다. R로 구현된 집단 유전학 패키지 "genetics"을 사용하여 집단의 각 SNP에 대한 유전자 빈도를 결정하였다. 육질 특성과 유전자형 사이의 연관성에 대한 통계적 분석은 MINITAB 버전 14에서 일반 선형 모델(General Liner Model, GLM)을 사용하여 자손의 평균 조정 된 표현형에 기초하여 수행되었다.Genotyping data and quantitative data were organized through Excel and R software. Descriptive statistics for phenotypic data were obtained using MINITAB version 14 (MINITAB Inc., USA). The population genetics package "genetics" implemented in R was used to determine the gene frequency for each SNP in the population. Statistical analysis of the association between meat quality characteristics and genotype was performed on the basis of the mean adjusted phenotype of offspring using the General Liner Model (GLM) in MINITAB version 14.
Yijklmn은 각 개체에 대해 측정된 표현형 데이터이며, μ는 전체 관측 평균, Si는 성별 효과, Lj는 계통 효과, Bk는 K 번째 batch에 따른 고정 효과, Sirem (계통)은 j 번째 계통에 중첩된 m 번째 아비의 고정 효과다. Damn (계통, 아비)는 모집단에서 j 번째 라인 및 m 번째 사이에 중첩된 n 번째 어미의 효과였으며 Mm은 m 번째 유전자형의 고정 효과다. eijklmn은 임의 잔차이다.Y ijklmn is the phenotypic data measured for each individual, μ is the overall observed mean, Si is the gender effect, Lj is the phylogenetic effect, Bk is the fixed effect according to the Kth batch, and Sirem (lineage) is superimposed on the jth lineage. This is the fixed effect of the m th father. Damn (line, father) was the effect of the nth ending overlapped between the jth line and the mth in the population, and Mm was the fixed effect of the mth genotype. eijklmn is an arbitrary residual.
실시예 1. Example 1. TBC1D1TBC1D1 유전자 내 SNP와 토종닭의 성장 형질간의 관련도 분석 Analysis of the relationship between SNPs in genes and growth traits of native chickens
한국 재래닭 SNP 주석 데이터로부터 2개의 선택된 SNP(g.70179137A>G 및 g.70175861T>C)를 평가하였다. 표 2는 각 SNP의 유전자형 및 대립유전자 빈도를 보여준다. SNP1 (A/G)의 경우, A 대립유전자가 0.54의 가장 높은 대립유전자 빈도를 가지며, SNP2 (T/C)의 경우, C 대립유전자가 가장 높은 대립유전자 빈도(0.56)를 보여주었다. 특히, SNP2는 메티오닌(ATG)에서 발린(GTG)으로의 아미노산 변화를 유도하는 과오 돌연변이(missense mutation)인 것으로 확인되었다(https://asia.ensembl.org/). 본 발명자는 상기 두 SNPs에 대해 중간 정도의 다형성(PIC) 값(각각 0.374 및 0.372)을 확인하였다.Two selected SNPs (g.70179137A>G and g.70175861T>C) were evaluated from the Korean native chicken SNP annotation data. Table 2 shows the genotype and allele frequency of each SNP. In the case of SNP1 (A/G), the A allele had the highest allele frequency of 0.54, and in the case of SNP2 (T/C), the C allele showed the highest allele frequency (0.56). In particular, SNP2 was confirmed to be a missense mutation that induces an amino acid change from methionine (ATG) to valine (GTG) (https://asia.ensembl.org/). The present inventors confirmed intermediate polymorphism (PIC) values (0.374 and 0.372, respectively) for the two SNPs.
TBC1D1은 잠재적인 QTL 영역임에도 불구하고, TBC1D1 유전자 다형성 및 닭에서의 성장 특성과의 잠재적 연관성을 논의한 연구는 거의 없다. 따라서 본 발명의 목적은 선택된 두 가지 SNPs의 성장 특성 효과를 평가하는 것이다. 이를 위해 본 발명자는 0 주령에서 20 주령 사이의 체중(BW) 데이터와 2주 간격으로 계산된 증체량(GR) 정보를 사용하였다. 또한 도축시 중량(weight at slaughter, SLW) 및 도체 중량(carcass weight, CW)에 대한 분석을 표 3에 정리하였다. Although TBC1D1 is a potential QTL region, few studies have discussed the potential association of TBC1D1 gene polymorphism and growth characteristics in chickens. Therefore, the object of the present invention is to evaluate the effect of the growth characteristics of the two selected SNPs. To this end, the present inventors used body weight (BW) data from 0 weeks to 20 weeks of age and weight gain (GR) information calculated at 2-week intervals. In addition, analysis of weight at slaughter (SLW) and carcass weight (CW) during slaughter is summarized in Table 3.
모든 고정 효과를 보정 후, 성장 특성을 평가한 결과 SNP1이 BW00, BW20, GR14-16 및 CW에 대해 유의한 것으로 나타났다(P < 0.05) (표 4). 본 발명의 연구 집단에서, BW20, GR14-16, GR18-20 및 CW에 대한 SNP1의 유전자형 AA는 각각의 형질에서 더 높은 값을 갖는다. 반면, GG 유전자형은 상기 각 형질에서 낮은 값을 보여주었다. 또한, AG 유전자형은 이러한 특성에 대한 평균값을 나타냈다. 이를 종합하면, A 유전자형의 대립유전자가 확인된 5개의 성장 특성에 유리한 영향을 미친다는 것을 유추할 수 있었다. 각각 A 타입 대립유전자를 가지는 경우 G 타입 대립유전자를 가진 개체보다 BW20 (:20 주령 시 체중), GR14-16 (:14 내지 16 주령 사이의 증체량), GR18-20 (:18 내지 20 주령 사이의 증체량) 및 CW (:도체중)에서 각각 39.284±13.285(g), 10.001±4.21(g), 8.669±4.228(g), 및 33.107±8.833(g) 가량 높은 것으로 확인되었다(표 4).After correcting for all fixation effects, as a result of evaluating the growth characteristics, SNP1 was found to be significant for BW00, BW20, GR14-16 and CW ( P <0.05) (Table 4). In the study population of the present invention, genotype AA of SNP1 for BW20, GR14-16, GR18-20 and CW has a higher value in each trait. On the other hand, the GG genotype showed a low value in each of the traits. In addition, the AG genotype represented the average value for these traits. Taken together, it could be inferred that the alleles of genotype A favorably influence the five identified growth traits. When each has type A allele, BW20 (body weight at 20 weeks of age), GR14-16 (weight gain between 14 and 16 weeks of age), GR18-20 (: between 18 and 20 weeks of age) than individuals with type G allele Weight gain) and CW (: carcass weight) were found to be 39.284±13.285(g), 10.001±4.21(g), 8.669±4.228(g), and 33.107±8.833(g) respectively (Table 4).
한편, SNP2의 CC 유전자형은 BW20, GR14-16 및 CW에서 더 높은 값을 나타냈다. 또한, TT 유전자형은 가장 낮은 값을 보여주었고, TC 유전자형은 중간 정도의 성장 특성을 나타냈다. 따라서, C 대립유전자가 재래닭의 F1 자손의 확인된 3개의 성장 형질에 유리한 영향을 줄 수 있음을 유추할 수 있었다. 3개의 형질은 각각 C 타입 대립유전자를 가지는 경우 T 타입 대립유전자를 가진 개체보다 BW20 (:20 주령 시 체중), GR14-16 (:14 내지 16 주령 사이의 증체량) 및 CW (:도체중)에서 각각 39.284±13.285(g), 10.001±4.21(g), 33.107±8.833(g) 가량 증가하였음을 알 수 있었다(표 4).On the other hand, the CC genotype of SNP2 showed higher values in BW20, GR14-16 and CW. In addition, the TT genotype showed the lowest value, and the TC genotype showed moderate growth characteristics. Therefore, it could be inferred that the C allele can have a beneficial effect on the three identified growth traits of the F 1 progeny of native chickens. The three traits were BW20 (weight at 20 weeks of age), GR14-16 (weight gain between 14 and 16 weeks of age) and CW (: carcass weight) than those with T type alleles when each of the three traits had a type C allele. It was found that they increased by 39.284±13.285(g), 10.001±4.21(g), and 33.107±8.833(g), respectively (Table 4).
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> SNP marker set for predicting growth traits of Korean native chicken and uses thereof <130> PN19343 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caaaattatg gtcagaggca ataaacaca 29 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaattatggt cagaggcaat aaacacg 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatctctgac ggaatcgttt gaaagtatt 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtcactgga aagatcaccc ac 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gggtcactgg aaagatcacc cat 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagaatgctg tcaagagcag tggat 25 <110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> SNP marker set for predicting growth traits of Korean native chicken and uses thereof <130> PN19343 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caaaattatg gtcagaggca ataaacaca 29 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaattatggt cagaggcaat aaacacg 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatctctgac ggaatcgttt gaaagtatt 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtcactgga aagatcaccc ac 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gggtcactgg aaagatcacc cat 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagaatgctg tcaagagcag tggat 25
Claims (6)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 방법.Separating genomic DNA from the native chicken sample;
Using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set of any one of claims 1 to 3 to amplify the target sequence; And
Determining the genotype of the product of the amplification step; comprising, a method for predicting the growth traits of native chickens.
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