RU2738901C1

RU2738901C1 - Test system for detecting genome of ppr virus by real-time polymerase chain reaction

Info

Publication number: RU2738901C1
Application number: RU2020117387A
Authority: RU
Inventors: Александр Владимирович Спрыгин; Артём Сергеевич Белый; Ирина Николаевна Шумилова; Александр Александрович Нестеров; Павел Владимирович Прутников; Яна Евгеньевна Пестова; Ксения Александровна Шалина; Светлана Владимировна Кононова; Ольга Петровна Бьядовская; Александр Владимирович Кононов
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-12-18

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to a highly sensitive test system consisting of a ready PCR mixture, Taq-DNA polymerase, reverse transcriptase, positive control and negative control, which enables to detect genome of peste des petits ruminants virus in the shortest possible time. There are developed oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for amplification and detection of M gene section of PPR virus: Forward CCCAT/GGTG/AAGA/GGTCATCG; Reverse CT(A/C/T)CCGACT/GGGGGGAGA; probe FAM CC+TGGTC+TGGG+AGACAG BHQ1. "+" sign shows nucleotides with LNA modifications.

EFFECT: invention can be used to detect RNA of all genetic variants of PPR viruses in samples of a wide range of pathological and biomaterial for the purpose of stating and specifying clinical and laboratory diagnostics in veterinary science.

1 cl, 2 tbl, 3 ex, 1 dwg

Description

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к выявлению генома вируса чумы мелких жвачных.The invention relates to veterinary virology, to molecular diagnostics, and in particular to the detection of the plague of small ruminant virus genome.

Чума мелких жвачных животных (ЧМЖ) является эмерджентным заболеванием для Российской Федерации, т.к. ранее никогда не регистрировалась на территории страны. В связи со значительным социально-экономическим ущербом, негативным воздействием на продовольственную безопасность многих стран мира, ЧМЖ включена в число нотифицируемых заболеваний списка МЭБ. Высокая степень неблагополучия по данной болезни среди стран, близко граничащих с Россией, обуславливает необходимость наличия высокочувствительных методов диагностики, позволяющих оперативно проводить мониторинг эпизоотической ситуации в стране.Plague of small ruminants (PPR) is an emerging disease in the Russian Federation, because has never been registered in the country before. Due to the significant socio-economic damage, negative impact on food security in many countries of the world, PPR is included in the number of notifiable diseases of the OIE list. The high degree of trouble with this disease among countries close to Russia, necessitates the availability of highly sensitive diagnostic methods that allow for prompt monitoring of the epizootic situation in the country.

Возбудителем является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Morbillivirus, семейства Paramyxoviridae. Болезнь впервые зарегистрирована в 1942 г. в Кот-д'Вуар [1]. В естественных условиях к вирусу чувствительны овцы, козы, антилопы, горные овцы и козы. Крупный рогатый скот, буйволы и яки также восприимчивы, что подтверждается обнаружением антител в сыворотке крови в реакции нейтрализации. Однако случаи клинического проявления болезни у этих видов животных проявляются исключительно редко [2, 3].The causative agent is an RNA-containing virus belonging to the genus Morbillivirus, of the Paramyxoviridae family. The disease was first reported in 1942 in the Cote d'Voire [1]. In natural conditions, sheep, goats, antelopes, mountain sheep and goats are susceptible to the virus. Cattle, buffaloes and yaks are also susceptible, as evidenced by the detection of antibodies in the serum in the neutralization reaction. However, cases of clinical manifestation of the disease in these animal species are extremely rare [2, 3].

Возбудитель является пантропным вирусом и передается аэрогенным и алиментарным путем, выделяется с выдыхаемым воздухом, выделениями изо рта, носа, глаз, половых органов.The pathogen is a pantropic virus and is transmitted by aerogenic and alimentary routes, excreted with exhaled air, secretions from the mouth, nose, eyes, genitals.

Источник вируса - больные и переболевшие животные, трупы павших от ЧМЖ животных, контаминированные вирусом корма, вода, подстилка, инвентарь, одежда обслуживающего персонала. Тесный контакт между животными является основным условием передачи вируса ЧМЖ [4].The source of the virus is sick and recovered animals, corpses of animals that have died from PPR, feed contaminated with the virus, water, bedding, inventory, clothing of service personnel. Close contact between animals is the main condition for PPR virus transmission [4].

Основной путь заноса в благополучные регионы - ввоз/перемещение зараженных животных (в т.ч. при незаконной трассировке), а также через инфицированные продукты животного происхождения, при возврате транспортных средств после доставки животных в зараженные регионы или хозяйства, где не используются меры биологической безопасности.The main route of entry into safe regions is the import / movement of infected animals (including during illegal tracing), as well as through infected products of animal origin, when vehicles are returned after the delivery of animals to infected regions or farms where biological safety measures are not used ...

Нозоареал ЧМЖ охватывает страны Африки и Евразии, включая европейскую часть Турции. Заболевание получило распространение в 55 странах: 35 странах Африки и 20 странах Евразии. По данным МЭБ за 30 летний период (1984-2013 гг.) было зарегистрировано свыше 38 тыс.вспышек заболевания. Наиболее сложная ситуация по ЧМЖ наблюдается в Турции и Иране. Первые случаи ЧМЖ в Иране были диагностированы в 1994 г. в провинции Элам на границе с Ираком. С тех пор заболевание регистрируется практически на всей территории страны.Nozoareal PPR covers the countries of Africa and Eurasia, including the European part of Turkey. The disease has spread in 55 countries: 35 countries in Africa and 20 countries in Eurasia. According to the OIE, over a 30-year period (1984-2013), more than 38 thousand outbreaks of the disease were recorded. The most difficult PPR situation is observed in Turkey and Iran. The first cases of PPR in Iran were diagnosed in 1994 in Elam province on the border with Iraq. Since then, the disease has been registered almost throughout the country.

Первые случаи регистрации вспышек ЧМЖ в Китае относятся к июлю 2007 г. Было зарегистрировано 273 вспышки ЧМЖ, при этом наибольшее их число имело место на востоке Китая, в том числе на территории провинций, непосредственно граничащих с Казахстаном, Кыргызстаном и Таджикистаном, а также с Забайкальским, Хабаровским и Приморским краями и Амурской областью Российской Федерации [5].The first recorded outbreaks of PPR in China date back to July 2007. 273 outbreaks of PPR were recorded, with the largest number occurring in eastern China, including in the provinces directly bordering Kazakhstan, Kyrgyzstan and Tajikistan, as well as the Transbaikal , Khabarovsk and Primorsky regions and Amur region of the Russian Federation [5].

Для Российской Федерации опасность проникновения ЧМЖ наиболее высока для Северо-Кавказского и Южного Федеральных округов (уровень вероятности 0,4 - 0,6), а также для зон отгонно-пастбищного животноводства Уральского, Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (уровень вероятности 0,2-0,4) [6].For the Russian Federation, the risk of PPR penetration is highest for the North Caucasian and Southern Federal Districts (probability level 0.4 - 0.6), as well as for the areas of distant pasture animal husbandry in the Ural, Siberian and Far Eastern Federal Districts (probability level 0.2- 0.4) [6].

В Казахстане массовое распространение заболевания среди мелкого рогатого скота отмечали в южной части страны в 2003 г., тогда же из проб патологического материала, отобранного от больных овец, выделили высоковирулентный штамм «Кентау» вируса ЧМЖ. Вспышки на территории Казахстана диагностировали также в 2005 и 2006 гг. [7]. Так же вспышка ЧМЖ была официально зарегистрирована 12 января 2016 г. в Грузии.In Kazakhstan, a massive spread of the disease among small ruminants was noted in the southern part of the country in 2003, at the same time a highly virulent Kentau strain of PPR virus was isolated from samples of pathological material taken from sick sheep. Outbreaks in the territory of Kazakhstan were also diagnosed in 2005 and 2006. [7]. Also, an outbreak of PPR was officially registered on January 12, 2016 in Georgia.

Всего в 2016 г. (с января по март) в Грузии было выявлено три очага ЧМЖ. Благодаря проведению интенсивных противоэпизоотических мероприятий заболевание не получило распространения.In total, three foci of PPR were identified in Georgia in 2016 (from January to March). Thanks to intensive antiepizootic measures, the disease did not spread.

В Монголии ЧМЖ впервые зарегистрирована 24 августа 2016 г. в сумоне Мьянгад западного аймака Ховд. По состоянию на июнь 2017 г. новых очагов ЧМЖ в Монголии не отмечали, однако значительное опасение вызывают зарегистрированные в январе и феврале 2017 г. случаи выявления заболевания среди диких сайгаков в аймаке Ховд, с распространением на территорию соседнего аймака Говь-Алтай.In Mongolia, PPR was first recorded on August 24, 2016 in the Myangad sumon of the western Khovd aimag. As of June 2017, no new outbreaks of PPR were noted in Mongolia, however, cases of detection of the disease among wild saigas in the Khovd aimag that were registered in January and February 2017, with the spread to the neighboring aimag Gov-Altai, cause considerable concern.

Поскольку клинические признаки ЧМЖ не являются патогномоничными (специфичными), диагноз на ЧМЖ следует подтверждать лабораторными исследованиями [5]. Согласно руководству МЭБ диагноз на ЧМЖ может быть поставлен с помощью метода иммунодиффузии в агарозном геле, который является одним из самых простых и нетребовательных методов. Однако данный подход занимает много времени и недостаточно чувствителен, поскольку в случае мягкого течения заболевания количество антигена может быть недостаточно, в результате чего возможны ложноотрицательные результаты.Since the clinical signs of PPR are not pathognomonic (specific), the diagnosis of PPR should be confirmed by laboratory tests [5]. According to the OIE guidelines, PPR can be diagnosed using the agarose gel immunodiffusion method, which is one of the simplest and most undemanding methods. However, this approach takes a long time and is not sensitive enough, since in the case of a mild course of the disease, the amount of antigen may not be enough, as a result of which false-negative results are possible.

Наиболее распространенным лабораторным методом диагностики ЧМЖ является ИФА, который считается предпочтительным при недоступности молекулярных методов исследования или при неудовлетворительном состоянии биологических образцов. Данный метод также может быть рекомендован при проведении мониторинговых исследований сывороток крови с целью выявления циркуляции вируса у восприимчивого поголовья и оценки иммунитета. Однако в случае подозрения на наличие вируса необходимо использовать методы, выявляющие геном возбудителя.The most common laboratory method for the diagnosis of PPR is ELISA, which is considered preferable when molecular methods of research are unavailable or when biological samples are in poor condition. This method can also be recommended when carrying out monitoring studies of blood sera in order to detect the circulation of the virus in susceptible livestock and assess immunity. However, if a virus is suspected, it is necessary to use methods that identify the genome of the pathogen.

Наиболее распространенными и надежными лабораторными методами обнаружения генома является ПЦР.The most common and reliable laboratory method for genome detection is PCR.

Целью изобретения является создание тест-системы для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.The aim of the invention is to create a test system for detecting the genome of the PPR virus by the method of polymerase chain reaction in real time.

Известен способ выявления шести вирусных патогенов овец и коз с помощью ПЦР в формате мультиплекс с детекцией продуктов реакции в электрофоретическом геле [8]. Недостатком данного способа является использование электрофореза, что является источником повышенных рисков кросс-контаминации ампликонами в лаборатории.A known method of detecting six viral pathogens of sheep and goats using PCR in multiplex format with the detection of reaction products in an electrophoretic gel [8]. The disadvantage of this method is the use of electrophoresis, which is a source of increased risks of cross-contamination with amplicons in the laboratory.

Известен способ детекции геномов 8 патогенов МРС, включая вирус ЧМЖ, с помощью ПЦР в режиме реального времени [9]. Недостатком этого способа является одновременная амплификация 8 локусов бактерий и вируса, что сказывается на чувствительности детекции нуклеиновой кислоты, находящейся в наименьшей концентрации, что может приводить к ложноотрицательным результатам.A known method of detecting genomes of 8 pathogens of MRS, including PPR virus, using real-time PCR [9]. The disadvantage of this method is the simultaneous amplification of 8 loci of bacteria and virus, which affects the sensitivity of the detection of nucleic acid, which is in the lowest concentration, which can lead to false negative results.

Наиболее близким к заявляемому методу является метод ПЦР в режиме реального времени для детекции генома вируса ЧМЖ [10]. Недостатком данного метода является отсутствие валидационных характеристик, подтверждающих специфичность разработки на разных генотипах вируса ЧМЖ.The closest to the claimed method is the real-time PCR method for detecting the PPRV genome [10]. The disadvantage of this method is the lack of validation characteristics that confirm the specificity of the development for different genotypes of PPRV.

Таким образом, разработка надежного чувствительного и специфичного метода обнаружения генома всех возможных генетических вариантов вируса ЧМЖ, с возможностью исследования широкого спектра биологического материала (внутренние органы, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), является актуальной технической проблемой. Для ее решения была создана тест-система ПЦР-РВ, содержащая специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, а также осуществлен подбор условий проведения исследований с помощью разработанного диагностикума, обеспечивающий минимальный риск контаминации тестируемых образцов и исключающих субъективность при оценке результатов.Thus, the development of a reliable sensitive and specific method for detecting the genome of all possible genetic variants of the PPR virus, with the possibility of studying a wide range of biological material (internal organs, blood serum, whole blood, cell culture), is an urgent technical problem. To solve it, a PCR-RT test system was created containing specific oligonucleotide primers and a fluorescently labeled oligonucleotide probe, and the selection of research conditions was carried out using the developed diagnosticum, which provides a minimum risk of contamination of the tested samples and excludes subjectivity in evaluating the results.

Изобретение относиться к тест-системе для специфичной идентификации генома всех генетических вариантов вируса чумы мелких жвачных методом ПЦР в режиме реального времени, состоящей из смеси олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, фермента Taq-полимеразы, обратной транскриптазы, положительного контроля и отрицательного контроля.The invention relates to a test system for the specific identification of the genome of all genetic variants of the plague ruminant virus by real-time PCR, consisting of a mixture of oligonucleotide primers and a fluorescently labeled probe, Taq polymerase enzyme, reverse transcriptase, positive control and negative control.

Флуоресценцию измеряют по каналу FAM. Пересечение кривой флуоресценции и линии порогового цикла (Ct), свидетельствует о наличии в образце генома вируса чумы мелких жвачных, причем, чем меньше показатель Ct, тем выше концентрация генома вируса ЧМЖ в исследуемом образце. Отсутствие пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией свидетельствует об отсутствии генома вируса чумы мелких жвачных в тестируемом материале.Fluorescence is measured by the FAM channel. The intersection of the fluorescence curve and the threshold cycle line (Ct) indicates the presence of plague ruminant virus genome in the sample, and the lower the Ct value, the higher the concentration of the PPRV genome in the sample. The absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line indicates the absence of the plague ruminant virus genome in the test material.

Изобретение может быть использовано для выявления РНК вируса чумы мелких жвачных в пробах биологического материала, с целью проведения клинической и лабораторной диагностики, а также научно-исследовательских работ в области ветеринарии.The invention can be used to detect RNA of the plague of small ruminants virus in samples of biological material for the purpose of clinical and laboratory diagnostics, as well as research work in the field of veterinary medicine.

Техническим результатом изобретения является: высокая специфичность в отношении всех возможных генетических вариантов вируса чумы мелких жвачных; расширенный спектр пригодного для проведения исследований биологического материала (внутренние органы, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), без риска получения ложноположительных результатов; минимальные требования для постановки ПЦР-РВ, что дает возможность использования широкого спектра амплификаторов; сокращение времени тестирования проб на наличие генома вируса чумы мелких жвачных, в том числе и при проведении массовых исследований; расширение арсенала средств диагностики чумы мелких жвачных.The technical result of the invention is: high specificity for all possible genetic variants of the plague of small ruminant virus; an expanded range of biological material suitable for research (internal organs, blood serum, whole blood, cell culture), without the risk of obtaining false positive results; minimum requirements for RT-PCR production, which makes it possible to use a wide range of amplifiers; reducing the time for testing samples for the presence of the plague of small ruminant virus genome, including during mass research; expanding the arsenal of diagnostic tools for plague of small ruminants.

Представленный метод включает последовательности олигонуклеотидов, специфичные только для генотипов вируса чумы мелких жвачных и имеющие следующую нуклеотидную последовательность:The presented method includes sequences of oligonucleotides that are specific only for the genotypes of the plague ruminant virus and have the following nucleotide sequence:

Знаком «+» отмечены нуклеотиды с модификацией LNA. Сущность изобретения заключается в том, что тест-система способна выявлять различные генетические варианты вируса чумы мелких жвачных. Высокая степень специфичности тест-системы подтверждена с помощью лабораторных исследований на панели проб гомологичных и гетерологичных вирусов.The "+" sign marks nucleotides with the LNA modification. The essence of the invention lies in the fact that the test system is capable of detecting various genetic variants of the plague of small ruminant virus. The high degree of specificity of the test system is confirmed by laboratory studies on a panel of samples of homologous and heterologous viruses.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлена линейность результатов ПЦР в режиме реального времени при тестировании 10-кратных разведений выделенной РНК вируса чумы мелких жвачных (штамм «ВНИИЗЖ») (Фиг. 1).The essence of the invention is illustrated in the graphic image, which shows the linearity of the results of PCR in real time when testing 10-fold dilutions of the isolated RNA of the plague of small ruminants virus (strain "ARRIAH") (Fig. 1).

Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, генерируемой в результате разрушения гибридизационного зонда, находящегося на 5'-конце флуорофор FAM, а на 3'-конце - гасителя BHQ1. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены, и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. При накоплении в ходе ПЦР специфических продуктов зонд гибридизируется на ампликон, что ведет к его разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.The detection of amplification products is carried out by recording the fluorescence generated as a result of the destruction of the hybridization probe located at the 5'-end of the FAM fluorophore, and at the 3'-end of the quencher BHQ1. In the absence of a target, the fluorophore and quencher are close together, and only negligible fluorescence is observed, since the quencher absorbs the radiation emitted by the fluorophore. When specific products accumulate during PCR, the probe hybridizes to the amplicon, which leads to its destruction due to the 5'-exonuclease activity of Taq polymerase. As a result, the fluorophore is separated from the quencher and its radiation can be detected. Thus, the increase in fluorescence is directly proportional to the amount of synthesized PCR product.

Набор для выявления генома вируса чумы мелких жвачных в ПЦР-РВ состоит из следующих компонентов:The kit for detecting the genome of the plague of small ruminants virus in RT-PCR consists of the following components:

№1 реакционная смесь, объем 450 мкл - 2 пробирки;No. 1 reaction mixture, volume 450 µl - 2 test tubes;

№2 фермент Taq-ДНК-полимераза, объем 14 мкл - 1 пробирка;No. 2 enzyme Taq-DNA polymerase, volume 14 µl - 1 tube;

№3 фермент обратная траскриптаза, объем 10 мкл - 1 пробирка;No. 3 reverse transcriptase enzyme, volume 10 µl - 1 tube;

№4 отрицательный контрольный образец, объем 100 мкл - 1 пробирка.No. 4 negative control sample, volume 100 µl - 1 tube.

№5 положительный контрольный образец, объем 150 мкл - 1 пробирка;No. 5 positive control sample, volume 150 µl - 1 tube;

В качестве отрицательного контроля используется деионизованная вода, а в качестве положительного контроля - вирусная РНК, что позволяет контролировать не только процесс амплификации, но и процесс обратной транскрипции.Deionized water is used as a negative control, and viral RNA is used as a positive control, which makes it possible to control not only the amplification process, but also the reverse transcription process.

ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией проводится в программируемом амплификаторе в одну стадию с использованием смеси, включающей на одну реакцию: реакционную смесь (№1), ферментов Taq-ДНК-полимеразы (№2) и обратной транскриптазы (№3). Перед началом постановки реакции необходимо разморозить все компоненты реакции, встряхнуть их на шейкере, затем центрифугировать несколько секунд на низкоскоростной центрифуге.Real-time PCR with reverse transcription is carried out in a programmable amplifier in one stage using a mixture that includes one reaction: reaction mixture (No. 1), Taq-DNA polymerase (No. 2) and reverse transcriptase (No. 3) enzymes. Before starting the reaction, it is necessary to defrost all the reaction components, shake them on a shaker, then centrifuge for several seconds on a low-speed centrifuge.

Смесь для проведения реакции готовят в пробирке в расчете на одну реакцию следующим образом:The reaction mixture is prepared in a test tube per reaction as follows:

- реакционная смесь №1- reaction mixture No. 1 17 мкл,17 μl, - фермент Taq-ДНК-полимераза №2- enzyme Taq-DNA polymerase No. 2 0,25 мкл,0.25 μl, - фермент обратная транскриптаза №3- enzyme reverse transcriptase No. 3 0,125 мкл0.125 μl

Приготовленную в отдельных пробирках смесь для проведения реакции переносят по 17 мкл в пробирки соответствующего объема и вносят 8 мкл суммарной РНК. В соответствующие пробы вносят также выделенные образцы нуклеиновой кислоты отрицательного и положительного контролей. Общий объем смеси - 25 мкл.The mixture prepared in separate test tubes for the reaction is transferred by 17 μl into tubes of the corresponding volume and 8 μl of total RNA is added. The isolated negative and positive control nucleic acid samples are also added to the corresponding samples. The total volume of the mixture is 25 μl.

Пробирки устанавливают в амплификатор для постановки ПЦР в режиме реального времени, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий краситель (FAM), устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.The tubes are installed in the thermocycler for performing PCR in real time, the location and characteristics of the samples are noted in the program, the working dye (FAM) is selected, and the temperature-time profile of the reaction is set in the program.

Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя. Режим термического профиля должен соответствовать показателям, описанным в таблице 1.The cycler is programmed according to the manufacturer's instructions. The thermal profile mode should correspond to the indicators described in Table 1.

Если регистрируемое значение Ct≤35, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается положительным.If the recorded value Ct≤35, the result of detecting the plague virus genome is considered positive.

Если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается отрицательным.If the Ct value is not recorded, the result of detecting the plague ruminant virus genome is considered negative.

Если регистрируемое значение Ct находится в пределах от 35 до 37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается сомнительным, и подлежит повторному исследованию. Если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается положительным; если значение Ct≤37, результат обнаружения генома вируса ЧМЖ считается отрицательным.If the recorded Ct value is in the range from 35 to 37, the result of PPRV genome detection is considered doubtful and should be re-examined. If, when conducting a repeated study, the recorded value Ct≤37, the result of the detection of the PPRV genome is considered positive; if Ct <37, the result of PPRV genome detection is considered negative.

Результат считается достоверным только в случае, если:The result is considered reliable only if:

- для положительного контроля амплификатором на канале FAM регистрирует значение порогового цикла амплификации - Ct≤35;- for positive control with the amplifier on the FAM channel, the value of the amplification threshold cycle is recorded - Ct≤35;

- для отрицательного контроля амплификатором не регистрирует какого-либо значений порогового цикла на канале FAM.- for negative control, the amplifier does not register any threshold cycle values on the FAM channel.

Результат считается недостоверным (не подлежат учету) в случае, если:The result is considered unreliable (not subject to accounting) if:

- для образца положительного контроля регистрируется значение Ct>35;- for a positive control sample, a Ct value> 35 is recorded;

- для образца отрицательного контроля регистрируется какое-либо значение Ct.- any Ct value is recorded for the negative control sample.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.

Пример 1. Оценка специфичности тест-системы.Example 1. Evaluation of the specificity of the test system.

Для оценки специфичности тест-системы использовались следующие образцы генома различных генотипов вируса чумы мелких жвачных и гетерологичных вирусов: штамм «ВНИИЗЖ» вируса ЧМЖ, штамм «Nigerial975» вируса ЧМЖ, штамм «Morocco2008» вируса ЧМЖ, вируса ЧМЖ штамма «Ethiopia1994», вируса заразного узелкового дерматита КРС штамма «ВНД КРС/Дагестан/2015» (диагностический), вируса оспы овец штамма «Афганский». Результаты оценки специфичности изложены в таблице 2.To assess the specificity of the test system, the following genome samples of various genotypes of the plague of small ruminant viruses and heterologous viruses were used: strain "ARRIAH" PPR virus, strain "Nigerial975" PPR virus, strain "Morocco2008" PPR virus, PPR virus strain "Ethiopia1994" cattle nodular dermatitis strain "VND cattle / Dagestan / 2015" (diagnostic), sheep pox virus strain "Afghani". The results of the specificity assessment are set out in Table 2.

Из таблицы 2 видно, что разработанная тест-система специфично выявляет различные штаммы вируса чумы мелких жвачных.Table 2 shows that the developed test system specifically detects various strains of the plague of small ruminant virus.

Работу с нуклеиновой кислотой проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» [11].Work with nucleic acid was carried out under conditions regulated by MU 1.3. 2569-09 "Organization of the work of laboratories using methods of amplification of nucleic acids when working with material containing microorganisms of I-IV pathogenicity groups" [11].

Процедуру выделения нуклеиновых кислот из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «РИБО-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва).The procedure for the isolation of nucleic acids from the test material was carried out using a set of reagents "RIBO-sorb" (FGUN TsNIIE Rospotrebnadzor, Moscow).

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе по описанной выше программе.Real-time PCR and registration of results were carried out in the device according to the program described above.

Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.The results were interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which corresponds to the presence (or absence) of the Ct value in the corresponding column in the table of results. The result was considered positive if the fluorescence accumulation curve for the corresponding sample had a characteristic "sigmoid" shape and crossed the threshold line.

При тестировании специфичности тест-системы с использованием нуклеиновых кислот различных генотипов вируса ЧМЖ и гетерологичных вирусов ложноположительных и ложноотрицательных результатов не выявлено (Таблица 2).When testing the specificity of the test system using nucleic acids of different genotypes of PPRV and heterologous viruses, no false-positive and false-negative results were found (Table 2).

Пример 2. Оценка чувствительности тест-системы.Example 2. Evaluation of the sensitivity of the test system.

Для оценки чувствительности тест-системы использовали 10-кратные последовательные серийные разведения выделенной РНК вируса чумы мелких жвачных с титром 4,17 lg ТЦД₅₀/см³. Тест-система выявляла вирусную РНК с чувствительностью 0,17 lg ТЦД₅₀/см³. Для оценки эффективности амплификации было проведено 3 повторных эксперимента, и полученные средние значения Ct для каждого разведения использовались для вычисления эффективности реакции. Полученные данные приведены на графическом изображении (Фиг. 1), на нем представлен график линейной регрессии, согласно которой значение эффективности амплификации (Е) составило 98,3%.To assess the sensitivity of the test system, we used 10-fold serial dilutions of the isolated RNA of the plague of small ruminants virus with a titer of 4.17 lg TCD ₅₀ / cm ³ . The test system detected viral RNA with a sensitivity of 0.17 lg TCD ₅₀ / cm ³ . To evaluate the amplification efficiency, 3 repeated experiments were performed, and the obtained average Ct values for each dilution were used to calculate the reaction efficiency. The data obtained are shown in the graphical image (Fig. 1), it shows a linear regression graph, according to which the value of the amplification efficiency (E) was 98.3%.

Пример 3. Оценка воспроизводимости тест-системы.Example 3. Evaluation of the reproducibility of the test system.

Воспроизводимость тест-системы определяли с помощью величины стандартного отклонения (SD) для каждой серии разведений, используя полученные значения Ct. SD варьировало от 0,04 до 0,67 на протяжении четырех 10-кратных разведений выделенной РНК. Коэффициент детерминированности r² составил 0,9915.The reproducibility of the test system was determined using the standard deviation (SD) for each dilution series using the obtained Ct values. SD ranged from 0.04 to 0.67 over four 10-fold dilutions of the isolated RNA. The coefficient of determinism r ² was 0.9915.

Таким образом, предлагаемое изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления генетического материала вируса чумы мелких жвачных в биологических и культуральных образцах, с целью постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач, проведения мониторинга распространения вируса ЧМЖ среди восприимчивых животных. Использование специфических праймеров и зонда позволяет выявить генетический материал всех генетических вариантов вируса ЧМЖ методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.Thus, the proposed invention can be used in veterinary practice to identify the genetic material of the plague of small ruminants virus in biological and cultural samples, in order to establish and clarify the diagnosis, to solve research problems, to monitor the spread of PPR virus among susceptible animals. The use of specific primers and a probe makes it possible to identify the genetic material of all genetic variants of the PPR virus by PCR with hybridization-fluorescence detection in real time.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».Sources of information taken into account in the preparation of the description of the invention to the application for the grant of a patent of the Russian Federation for the invention "Test system for detecting the PPRV genome by polymerase chain reaction in real time."

1. Gargadennec L. & Lalarme A. La peste des petits ruminants // Bull. Serv. Zoo. A.O.F. - 1942. - 5: 15-21.1. Gargadennec L. & Lalarme A. La peste des petits ruminants // Bull. Serv. Zoo. A.O.F. - 1942 .-- 5: 15-21.

2. Libeau, G. & Lefevre, P.C. Comparison of rinderpest and peste des petits ruminants viruses using anti-nucleoprotein monoclonal antibodies. Vet. Microbiol. - 1990. - 25: 1-16.2. Libeau, G. & Lefevre, P.C. Comparison of rinderpest and peste des petits ruminants viruses using anti-nucleoprotein monoclonal antibodies. Vet. Microbiol. 1990. 25: 1-16.

3. Mitra-Kaushik, S., R. Nayak, and M. S. Shaila. Identification of a cytotoxic T-cell epitope on the recombinant nucleocapsid proteins of rinderpest and peste des petits ruminants viruses presented as assembled nucleocapsids // Virology. - 2001. - 279:210-220.3. Mitra-Kaushik, S., R. Nayak, and M. S. Shaila. Identification of a cytotoxic T-cell epitope on the recombinant nucleocapsid proteins of rinderpest and peste des petits ruminants viruses presented as assembled nucleocapsids // Virology. - 2001 .-- 279: 210-220.

4. Kumar, N. Peste Des Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive Review / N. Kumar, S. Maherchandani, S.K. Kashyap, et al. // Viruses. - 2014. - 6: 2287-2327.4. Kumar, N. Peste Des Petits Ruminants Virus Infection of Small Ruminants: A Comprehensive Review / N. Kumar, S. Maherchandani, S.K. Kashyap, et al. // Viruses. - 2014 .-- 6: 2287-2327.

5. Office International des Epizooties (OIE). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2017. Chapter 2.07.10. Peste des petits ruminants (infection with peste des petits ruminants virus). Available http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/. No date.5. Office International des Epizooties (OIE). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2017. Chapter 2.07.10. Peste des petits ruminants (infection with peste des petits ruminants virus). Available http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/. No date.

6. Парилов С.В. Анализ и прогноз мировой эпизоотической ситуации по оспе овец и коз и чуме мелких жвачных животных в 2011 - 2015 гг. // Научный журнал Куб. ГАУ. - 2011. - 69 (05).6. Parilov S.V. Analysis and forecast of the world epizootic situation in sheep pox and goat pox and plague of small ruminants in 2011 - 2015. // Scientific journal Cube. GAU. - 2011 .-- 69 (05).

7. Koshemetov Zh., Sansyzbay A., Sandybayev N. et al. Peste des petits ruminants: Monitoring, diagnostic and spread on the territory of the Central Asia. Life Sci. J. - 2014.- 11(7):48 - 54.7. Koshemetov Zh., Sansyzbay A., Sandybayev N. et al. Peste des petits ruminants: Monitoring, diagnostic and spread on the territory of the Central Asia. Life Sci. J. - 2014. - 11 (7): 48 - 54.

8. Патент CN 105331742. Multiplex-PCR (polymerase chain reaction) kit for detecting six viruses of sheep and goats simultaneously.8. Patent CN 105331742. Multiplex-PCR (polymerase chain reaction) kit for detecting six viruses of sheep and goats simultaneously.

9. Патент CN 108504780. Taqman fluorescence quantitative PCR kit and method for simultaneously detecting eight common sheep viruses and bacteria.9. Patent CN 108504780. Taqman fluorescence quantitative PCR kit and method for simultaneously detecting eight common sheep viruses and bacteria.

10. Сальников Н.И., Живодеров С.П., Янжиева Д.В., Кольцов А.Ю., Усадов Т.Р., Сухер М.М., Моргунов Ю.П., Луницин А.В. Тест-система для выявления генома вируса чумы мелких жвачных животных методом от-пцр в реальном времени. Сельскохозяйственная биология, 2019 -54 (2): 359-368.10. Salnikov N.I., Zhivoderov S.P., Yanzhieva D.V., Koltsov A.Yu., Usadov T.R., Suher M.M., Morgunov Yu.P., Lunitsin A.V. A test system for detecting the genome of the plague virus of small ruminants by real-time RT-PCR. Agricultural Biology, 2019-54 (2): 359-368.

11. МУ 1.3.2569-09 Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности.11. MU 1.3.2569-09 Organization of the work of laboratories using methods for amplifying nucleic acids when working with material containing microorganisms of I-IV pathogenicity groups.

Claims

1. Test system, including a ready-made PCR mixture containing oligonucleotide primers and a fluorescently-labeled probe for amplification and detection of the M gene region of the PPR virus:

Forward CCCAT / GGTG / AAGA / GGTCATCG

Reverse CT (A / C / T) CCGACT / GGGGGGAGA

probe FAM CC + TGGTC + TGGG + AGACAG BHQ1

enzyme Taq-DNA polymerase, reverse transcriptase, positive control, negative control; characterized in that oligonucleotide primers and a probe are used in the real-time PCR reaction, which consists of the following stages: reverse transcription at 50 ° С - 15 min, denaturation at 95 ° С for 10 min and thermal cycling at 94 ° С - 10 sec , 56 ° С - 20 sec; 72 ° C - 20 sec - 40 cycles, the sample is considered positive for the presence of the PPRV genome, if Ct value ≤ 35, the sample is considered negative for the presence of the PPRV genome, if the Ct value is absent / not recorded, however, if the Ct value for samples are in the range from 35 to 37, the result of detecting the plague of ruminant virus genome is considered doubtful, it is necessary to repeat the reaction; when re-examining the recorded value of Ct≤37, the result of detection of the PPRV genome is considered positive, if the Ct value is absent / not recorded or more than 37, the sample is considered negative for the presence of the PPRV genome.

2. The test system according to claim 1, with a sensitivity of 0.17 lg TCD ₅₀ / cm ³ , which allows detecting and detecting the genome / RNA of the plague of small ruminants virus in an expanded spectrum of biological material.