RU2731390C1 - Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты) - Google Patents

Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2731390C1
RU2731390C1 RU2020113326A RU2020113326A RU2731390C1 RU 2731390 C1 RU2731390 C1 RU 2731390C1 RU 2020113326 A RU2020113326 A RU 2020113326A RU 2020113326 A RU2020113326 A RU 2020113326A RU 2731390 C1 RU2731390 C1 RU 2731390C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
primer
nucleotide sequence
probe
sequence
cov
Prior art date
Application number
RU2020113326A
Other languages
English (en)
Inventor
Михаил Александрович Филиппов
Михаил Михайлович Минашкин
Ольга Геннадьевна Татарникова
Наталья Вячеславовна Позднякова
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех»
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех» filed Critical Общество с ограниченной ответственностью «Система-БиоТех»
Priority to RU2020113326A priority Critical patent/RU2731390C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2731390C1 publication Critical patent/RU2731390C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Описана тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, включающая праймер SBT0017 5'-GCTGGCACAGACTTAGAAGGT-3', праймер SBT0018 5'-AGCAGCGTACAACCAAGCTAA-3', зонд SBT0019 5'-GTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGCTG-3', для положительного контроля специфичные к гену GAPDH праймер SBT0014 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015 5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', зонд SBT0016 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или специфичные к гену ACTB праймер SBT0011 5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3', зонд SBT0013 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. Также описана тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, включающая праймер SBT003 5'-GTTCGCATTCAACCAGGACAG-3', праймер SBT004 5'-ACCTTCTAAGTCTGTGCCAGC-3' и зонд SBT0026 5'- CTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCC-3', для положительного контроля специфичные к гену GAPDH праймер SBT0014 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015 5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', зонд SBT0016 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или специфичные к гену ACTB праймер SBT0011 5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3', зонд SBT0013 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. Представлен способ выявления РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью указанных тест-систем. Изобретение может быть использовано для выявления генетического материала (РНК) коронавируса SARSCoV-2, ассоциированного с респираторным заболеванием COVID-19. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 5 пр.

Description

Область техники
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Изобретение может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии для выявления генетического материала (РНК) коронавируса SARS CoV-2, ассоциированного с респираторным заболеванием COVID-19, в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов. При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда возможно выявление генетического материала (РНК) коронавируса SARS CoV-2, ассоциированного с респираторным заболеванием COVID-19.
Предшествующий уровень техники
Вирус SARS-CoV-2 вызвал пандемию ранее не известного респираторного заболевания, угрожающего жизни человека, которому было присвоено название COVID-19, в 2019-2020 гг. В научных центрах мира ведется экстренная работа по созданию необходимых диагностических тест-систем и разработке вакцины для борьбы с новой болезнью.
Ниже приведены зарубежные аналоги, представляющие собой тест-системы с наборами специфических праймеров, способные обнаруживать генетический материал коронавирусов.
Известен патент Германии на изобретение №20315159, МПК C12Q 1/6886, C12Q 1/701, «Набор для обнаружения нового коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома». Набор реагентов для обнаружения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) - ассоциированного вируса (коронавирус, связанный с пневмонией человека; HPAC) с помощью обратной транскрипции-ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Набор для обнаружения тяжелого острого респираторного синдрома, связанного с респираторным синдромом (коронавирус, связанный с пневмонией человека; НРАС) с помощью обратной транскрипции-ПЦР в реальном времени (RT-PCR) включает прямой праймер (FP) и обратный праймер (RP), оба из приблизительно 18-31 нуклеотидов (п.н.) и зонд (P), приблизительно 18-35 п.н., который помечен флуоресцентным репортерным красителем (FRD) и гасящим красителем (QD), по меньшей мере один из которых является флуоресцентным красителем. FP и RP связываются соответственно с областями 69-98 и 123-168 последовательности 300 пар оснований, в то время как (P) связывается с областью 89-132. олигонуклеотиды длиной 18-31 п.н., связываются с участками 69-98 и 123-168.Также заявлен аналогичный набор, содержащий FP и RP 18-35 п.н., при этом связывание происходит соответственно с областями 1-240 и 60-300 и зонд 12-40 п.н., который связывается с областью 21-279.
Известен патент WO 2006022459, МПК C12Q 1/68, «ПРАЙМЕР И ЗОНД ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОРОНАВИРУСА SARS, НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПРАЙМЕР И/ИЛИ ЗОНД, И СПОСОБ ЕГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ». Патент включает:
1. праймер для обнаружения SARS (Тяжелый острый Респираторный Синдром), представленный как SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 Или SEQ ID NO: 9.
2. зонд для обнаружения коронавируса SARS (Тяжелый Острый респираторный Синдром), представленный В SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 10.
3. набор для обнаружения SARS (Тяжелый острый Респираторный Синдром)
4. Набор для обнаружения SARS (Тяжелый острый Респираторный Синдром) в котором он дополнительно включает ДНК-полимеразу или обратную транскриптазу.
5. Способ обнаружения Коронавируса SARS (Тяжелый Острый респираторный Синдром), включающий:
а) смешивание смеси ферментов, Содержащей ДНК-полимеразу и/или обратную транскриптазу, с реакционной смесью, содержащей олигонуклеотиды, указанные в п. 1 или 2;
b) добавление Образца РНК к смеси, полученной на стадии a);
c) амплификацию реакционного раствора, содержащего образец РНК, полученный на стадии b), используя RT-ПЦР-процесс.
Наиболее близким к заявляемому решению является патент РФ на изобретение №2504585, МПК C12Q 1/68, «Набор Олигодезоксирибонуклеотидных Праймеров И Флуоресцентно-Меченного Зонда Для Идентификации Рнк Коронавируса Человека, Ассоциированного С Тяжелым Острым Респираторным Синдромом». Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом, содержит пару внутренних и один внешний олигонуклеотиды, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченный ДНК-зонд, имеющие следующую структуру: внешний обратный праймер
NR: 5'-CTTTTGGCAATGTTGTK(G/T)CCTT-3'; внутренние прямой (F) и обратный (R) праймеры 5'→3' F: 5'-AAAATGTCTGATAATGGACCCC-3' и R: 5'-ACCACCACGAR(A/G)CTCGTCG-3'; флуоресцентно-меченный ДНК-зонд
Z: 5'-TY(C/T)CACCAAATGTAATGCGGGG-3'.
Набор праймеров и зонд позволяют идентифицировать коронавирус человека, ассоциированный с ТОРС, а также коронавирусы, подобные ТОРС-коронавирусу человека, выделенные от пальмовых циветт, енотовых собак и плодоядных летучих мышей методом ПЦР в реальном времени с получением более продолжительного амплифицированного фрагмента NP-гена коронавируса.
Известные тест-системы предназначены для обнаружения вирусов, родственных SARS-CoV-2, в частности, коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС), которому присвоено название SARS-CoV-1. Недостаток этих тест-систем состоит в том, что они не обладают специфичностью к геномному материалу SARS-CoV-2 и, следовательно, не могут быть использованы для дифференциальной диагностики SARS-CoV-2. Помимо детектирования разнообразных ранее известных коронавирусов вместо наиболее важного с медицинской точки зрения нового вируса SARS-CoV-2, к недостаткам приведенных решений можно отнести отсутствие контроля на экспрессию референсного гена человека, который указывает на эффективность выделения РНК из образца, синтеза кДНК и прохождения ПЦР.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является создание быстрого и надежного теста на вирус SARS-CoV-2 на основе синтеза кДНК с помощью MMLV-ревертазы (обратной транскрипции - ОТ) и классической ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), где обе реакции протекают в одной пробирке. Набор праймеров также может быть использован в обычной ПЦР в реальном времени без синтеза кДНК, если кДНК уже была синтезирована любым другим способом.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в детекции РНК вируса SARS-CoV-2 за счет специфического распознавания области гена 3CLpro (3CL протеиназы вируса), которая является ключевой в созревании репликазного комплекса вируса, ответственного за его размножение. Данный ген 3CLpro является очень консервативным, и он практически не может быть подвержен эволюционным изменениям, так как данные изменения могут привести к потере способности вируса размножаться. [Anand K., Ziebuhr J., Wadhwani P. et al. Coronavirus Main Proteinase (3CLpro) Structure: Basis for Design of Anti-SARS Drugs // Science, 2003, 300: 1763-7].
Поставленная задача решается за счет того, что создана тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 путем
проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая праймер SBT0017, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GCTGGCACAGACTTAGAAGGT-3', праймер SBT0018, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGCAGCGTACAACCAAGCTAA-3', и зонд SBT0019, имеющий последовательность 5'-GTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGCTG-3', а также для положительного контроля прохождения всех этапов анализа включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека GAPDH праймер SBT0014, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015, имеющий нуклеотидную последовательность 5'- TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', и зонд SBT0016, имеющий последовательность 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека ACTB праймер SBT0011, имеющий нуклеотидную последовательность
5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3',
и зонд SBT0013, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. (Вариант 1)
Также создана тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая праймер SBT003, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GTTCGCATTCAACCAGGACAG-3', праймер SBT004, имеющий нуклеотидную последовательность
5'-ACCTTCTAAGTCTGTGCCAGC-3', и зонд SBT0026, имеющий последовательность 5'-CTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCC-3',
а также для положительного контроля прохождения всех этапов анализа включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека GAPDH праймер SBT0014, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015, имеющий нуклеотидную последовательность 5'- TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', и зонд SBT0016, имеющий последовательность 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека ACTB праймер SBT0011, имеющий нуклеотидную последовательность
5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3',
и зонд SBT0013, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. (Вариант 2).
Способ выявления РНК вируса SARS-CoV-2 по варианту 1 или 2 включает выделение РНК из биологического материала, синтез кДНК и проведение ПЦР-РВ, при этом синтез кДНК проводят при 45°С в течение 30 минут, после чего MMLV ревертазу инактивируют прогреванием при 95°С в течение от 2 до 5 минут, далее полученную кДНК амплифицируют в ПЦР-РВ с участием специфичной к вирусному гену 3CLpro пары праймеров и зонда по варианту 1 или 2, причем в качестве контроля в той же или параллельной, но с тем же образцом, реакции амплифицируется кДНК гена домашнего хозяйства GAPDH с участием пары праймеров и зонда, или кДНК гена домашнего хозяйства ACTB с участием пары праймеров и зонда, при этом температурный режим ПЦР-РВ включает следующие этапы: прогревание при 95°С в течение от 2 до 5 минут, совмещенное с инактивацией MMLV ревертазы, и от 45 до 49 циклов амплификации 95°С - от 5 до 15 сек, 55°С - от 20 сек до 1 мин, а детекцию флуоресценции проводят в ходе каждого цикла при температуре 55°С по каналам HEX/VIC для вирусной последовательности и FAM для последовательности гена домашнего хозяйства, при этом результаты интерпретируют на основании появления характерной кинетической кривой и ее пересечения с пороговой линией.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Карта плазмиды pAG110-3CLpro.
Фиг. 2. Кривые накопления флуоресценции, когда в качестве матрицы в ОТ-ПЦР-РВ используются 10-кратные серийные разведения плазмиды pAG110-3CLpro так, что количество плазмиды в каждой реакции составило от 1×10-9 грамма до 1×10-16 грамма, а в качестве набора праймеров и зонда - SBT0017, SBT0018 и SBT0019. Соответственно, крайняя левая кривая соответствует накоплению ПЦР-продукта в реакции с 1×10-9 грамма плазмиды, а крайняя правая - 1×10-16 грамма плазмиды. Горизонтальная линия обозначает выбранный порог, выше которого результат прохождения ПЦР считается положительным.
Фиг. 3. Кривые накопления флуоресценции, когда в качестве матрицы в ОТ-ПЦР-РВ используются 10-кратные серийные разведения плазмиды pAG110-3CLpro так, что количество плазмиды в каждой реакции составило от 1×10-9 грамма до 1×10-16 грамма, а в качестве набора праймеров и зонда - SBT003, SBT004 и SBT0026. Соответственно, крайняя левая кривая соответствует накоплению ПЦР-продукта в реакции с 1×10-9 грамма плазмиды, а крайняя правая - 1×10-16 грамма плазмиды. Горизонтальная линия обозначает выбранный порог, выше которого результат прохождения ПЦР считается положительным.
Реализация изобретения
Предложенная тест-система в любом из вариантов комплектации включает пару праймеров и флуоресцентный зонд, предназначенные соответственно для амплификации и детектирования высококонсервативного участка генома коронавируса SARS CoV-2 в ходе полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Разработаны две пары ДНК-олигонуклеотидов, специфичных к области гена 3CLpro. Каждая пара олигонуклеотидов обладает активностью прямого и обратного праймеров в ПЦР, и каждая из этих пар праймеров может быть использована как альтернатива другой. Кроме того, к каждой паре разработан флуоресцентно-меченный ДНК-зонд с красителем HEX и гасителем флуоресценции BHQ-1. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Таблица 1. Набор праймеров 1 к вирусному гену.
Название Последовательность Узнаваемый ген Назначение Длина Температура плавления Длина ампликона
SBT0017 GCTGGCACAGACTTAGAAGGT 3CLpro Прямой праймер 21 н.о. 58°С 117н.о.
SBT0018 AGCAGCGTACAACCAAGCTAA 3CLpro Обратный праймер 21 н.о. 58°С
SBT0019 GTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGCTG 3CLpro Флуоресцентный зонд 28 н.о. 66°С
Таблица 2. Набор праймеров 2 к вирусному гену.
Название Последовательность Узнаваемый ген Назначение Длина Температура плавления Длина ампликона
SBT0003 GTTCGCATTCAACCAGGACAG 3CLpro Прямой праймер 21 н.о. 58°С 228н.о.
SBT0004 ACCTTCTAAGTCTGTGCCAGC 3CLpro Обратный праймер 21 н.о. 58°С
SBT0026 CTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCC 3CLpro Флуоресцентный зонд 29 н.о. 65°С
Кроме того, предложенная тест-система в любом из вариантов комплектации включает (табл. 3) пару праймеров и флуоресцентный зонд, который снабжен красителем FAM и гасителем флуоресценции BHQ-1, предназначенные соответственно для амплификации и детектирования участка гена домашнего хозяйства человека в качестве положительного контроля выделения РНК из каждого образца и прохождения с этой РНК реакции обратной транскрипции (ОТ) и впоследствии ПЦР-РВ. Также тест-система включает в качестве положительного контроля ПЦР-РВ плазмиду с клонированным участком гена 3CL протеиназы вируса SARS CoV-2.
Надежность теста, а именно снижение доли ложноотрицательных результатов, достигается за счет детектирования участков РНК, транскрибированной с геном домашнего хозяйства, постоянно присутствующей в клетках человека. Отсутствие такого контроля создает ситуацию, когда конечный пользователь может не понять, что в той или иной реакционной смеси либо отсутствует РНК, либо РНК испорчена, в результате чего она не может являться матрицей для синтеза кДНК и последующей ПЦР-РВ. Таким образом, возможно неосознанное получение ложноотрицательного результата, что является очень нежелательной практикой при анализе на присутствие вируса, представляющего собой чрезвычайную эпидемическую угрозу.
В качестве генов домашнего хозяйства были выбраны гены GAPDH и ACTB, первый из которых кодирует конститутивный метаболический фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, а второй - необходимый компонент цитоскелета бета-актин. Чтобы обеспечить детекцию именно сплайсированной РНК, а не геномной ДНК человека, были подобраны референсные праймеры (табл. 3), комплементарные к разным экзонам выбранных генов, а именно для GAPDH 5'-фланкирующий праймер SBT0014 картируется на экзон 4, тогда как 3'-фланкирующий праймер SBT0015 картируется на экзон 5; для ACTB 5'-фланкирующий праймер SBT0011 картируется на экзон 1, тогда как 3'-фланкирующий праймер SBT0012 картируется на экзон 2.
Таблица 3. Наборы референсных праймеров
Название Последовательность Узнаваемый ген Назначение Длина Температура плавления Длина ампликона
SBT0014 TCCAAAATCAAGTGGGGCGA GAPDH Прямой праймер 20 н.о. 58°С 115н.о.
SBT0015 TGATGACCCTTTTGGCTCCC GAPDH Обратный праймер 20 н.о. 58°С
SBT0016 CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG GAPDH Флуоресцентный зонд 26 н.о. 65°С
SBT0011 CGTCTTCCCCTCCATCGTG ACTB Прямой праймер 19 н.о. 58°С 114н.о.
SBT0012 AGGGTGAGGATGCCTCTCTT ACTB Обратный праймер 20 н.о. 59°С
SBT0013 GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC ACTB Флуоресцентный зонд 27 н.о. 65°С
Изобретение подтверждается примерами.
Пример 1.
Выбор высококонсервативной нуклеотидной последовательности в геноме коронавируса SARS-CoV-2 и подбор последовательности праймеров и флуоресцентно-меченного зонда.
Оригинальная последовательность коронавируса SARS-CoV-2 «NCBI Reference Sequence: NC_045512.2» была проанализирована на поиск открытых рамок считывания с использованием программы ApE plasmid editor (https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/). Первая открытая рамка считывания (по литературным данным, соответствующая ORF1a и содержащая высококонсервативную кодирующую последовательность для 3CL протеиназы) была выбрана для проведения анализа кодируемых белков. Для этого методами компьютерного анализа была проведена трансляция ее первой рамки и установлена последовательность белка, которая представляет собой первичный полипептид ORF1a. Данная последовательность была подвергнута анализу на гомологии с использованием сервиса SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/). Анализ выявил консервативную последовательность 3CL протеиназы вируса SARS-CoV-2, которая была наиболее близка по гомологии к последовательности 3CL протеиназы коронавируса SARS-CoV-1 [Anand K., Ziebuhr J., Wadhwani P. et al. Coronavirus Main Proteinase (3CLpro) Structure: Basis for Design of Anti-SARS Drugs // Science, 2003, 300: 1763-7]. Была определена последовательность белка 3CLpro вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:1.
Согласно полученной аминокислотной последовательности была определена нуклеотидная последовательность 3CLpro SEQ ID NO:2
К этой последовательности были подобраны нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров и флуоресцентно-меченного зонда (два альтернативных набора праймеров и зонда). Температуры плавления разработанных олигонуклеотидов были получены с использованием программы ApE plasmid editor. Последовательности генов GAPDH и ACTB человека были найдены в общедоступной базе данных (www.ensembl.org), для каждого из этих генов были разработаны нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров и флуоресцентно-меченного зонда так, чтобы их температуры плавления приблизительно совпадали с температурами плавлениями соответственно праймеров и зондов для вирусной последовательности.
Пример 2.
Конструирование плазмиды, содержащей клонированный участок генома коронавируса SARS-CoV-2.
Нуклеотидная последовательность 3CLpro SEQ ID NO:2 была использована для создания экспрессионной рамки считывания 3CL протеиназы для ее последующей экспрессии. Для этого последовательность была модифицирована: на 5'-конец был добавлен старт-кодон (ATG), последовательность Козак (GCCACC), а также рестрикционный сайт EcoRI (GAATTC); на 3'-конец были добавлены 2 стоп-кодона (TAATAG) и рестрикционный сайт NheI (GCTAGC). Итоговая последовательность представлена SEQ ID NO:3. Итоговая последовательность используется для функциональной экспрессии белка с целью последующего поиска ингибиторов 3CL протеиназы.
Данная последовательность была синтезирована в компании TopGene (www.topgene.com) и клонирована в вектор pAG110. Карта созданной плазмиды представлена на фиг.1. В настоящей тест-системе итоговая последовательность в составе плазмиды используется как положительный контроль прохождения ПЦР, т.к. внесенные изменения не затрагивают участки, узнаваемые праймерами в составе настоящей тест-системы, и не меняют свойства ампликона. То, что полученная плазмида действительно содержит последовательность гена 3CLpro вируса SARS-CoV-2, узнаваемую патентуемыми праймерами, подтверждается успешным прохождением ПЦР-РВ с этими праймерами (фиг.2 и 3), когда плазмида использовалась в качестве матрицы.
Пример 3.
Проведение реакций для анализа пробы на присутствие РНК вируса SARS-CoV-2.
Выделение РНК из образца. В качестве положительных образцов использовались мазки из носоглотки и ротоглотки пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19. Выделение РНК проводили классическим методом с использованием тризола/триреагента (https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/tri-reagent.html) или методом, аналогичным используемому в наборе RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit от компании Qiagen (https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/rna-purification/total-rna/rneasy-lipid-tissue-mini-kit/).
Синтез кДНК и ПЦР-РВ. Синтез кДНК производился двумя альтернативными способами. В одном случае использовался набор MMLV RT kit («Евроген»), после чего полученная кДНК использовалась для постановки ПЦР-РВ с использованием набора qPCRmix-HS («Евроген») согласно инструкциям производителя. Однако было обнаружено, что кДНК, полученная таким образом, часто непригодна для постановки мультиплексной ПЦР (когда в одной пробирке кДНК смешивается и с праймерами, специфичными к последовательности вируса, и с праймерами, специфичными к последовательности гена домашнего хозяйства человека) - в таком формате реакции происходит ингибирование амплификации вирусных последовательностей. При этом участки и вирусного, и человеческого гена нормально амплифицируются и детектируются, когда один и тот же образец тестируется в одной пробирке с праймерами к вирусному гену, а в другой - к человеческому (формат стандартной, или синглплексной ПЦР-РВ), т.е. праймеры и зонды пригодны для постановки реакции.
Также использовался набор «БиоМастер» («Биолабмикс»), предназначенный для синтеза кДНК и постановки ПЦР-РВ в одной и той же пробирке. Этот набор оказался пригодным для постановки мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ. Набор использовался согласно инструкциям производителя (но с объемом реакционной смеси 20 мкл и пропорционально уменьшенными объемами всех реагентов - табл. 4). Для стандартной, или синглплексной ОТ-ПЦР-РВ набор использовался таким же образом, за исключением того, что для одного и того же образца бралась пара пробирок и в одной из них флуоресцентный микс С, а в другой флуоресцентный микс V заменялся на воду, и полученные в этой паре пробирок результаты интерпретировались в совокупности.
В соответствии с температурами плавления праймеров и зондов был выбран температурно-временной режим реакций (табл. 5). Синтез кДНК проводили при 45°С в течение 30 минут, после чего MMLV ревертазу инактивировали прогреванием при 95°С в течение от 2 до 5 минут. Далее полученную кДНК амплифицировали в ПЦР-РВ с участием специфичной к вирусному гену 3CLpro пары праймеров и зонда, причем в качестве контроля в той же или параллельной реакции амплифицировали кДНК гена домашнего хозяйства GAPDH с участием пары праймеров и зонда, либо кДНК гена домашнего хозяйства ACTB с участием пары праймеров и зонда. Температурный режим ПЦР-РВ включал следующие этапы: прогревание при 95°С в течение от 2 до 5 минут (совмещено с инактивацией MMLV ревертазы) и от 45 до 49 циклов амплификации (95°С - от 5 до 15 сек, 55°С - от 20 секунд до 1 мин), а детекцию флуоресценции проводили в ходе каждого цикла при температуре 55°С по каналам HEX/VIC (для вирусной последовательности) и FAM (для последовательности гена домашнего хозяйства).
При постановке реакций использовались амплификаторы для ПЦР-РВ зарегистрированных в России моделей Applied Biosystems “QuantStudio 5” и Bio-Rad “CFX96”. Сигнал от вирусной последовательности регистрировался по каналу HEX/VIC, от референсной человеческой - по каналу FAM. Результаты интерпретировали, как описано в примере 5.
Таблица 4. Смесь для мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ.
Компонент Объем
2× буфер для ОТ-ПЦР-РВ 10 мкл
БиоМастер-микс 0.8 мкл
Флуоресцентный микс С, содержащий:
Праймеры к человеческому гену в концентрации 3.077 мкМ
Зонд к человеческому гену в концентрации 1.923 мкМ		 2.6 мкл
Флуоресцентный микс V
содержащий:
Праймеры к вирусному гену в концентрации 3.077 мкМ
Зонд к вирусному гену в концентрации 1.923 мкМ		 2.6 мкл
РНК-матрица Переменный
Вода, обработанная ДЭПК До 20 мкл
Таблица 5. Температурно-временной режим амплификации.
№ п/п Температурно-временной режим Число циклов
1 45°С - 30 мин 1
2 95°С - от 2 до 5 мин 1
3 95°С - от 5 до 15 сек От 45 до 49
4 55°С - от 20 сек до 1 мин Считывание сигнала флуоресценции
Таким образом, была показана принципиальная совместимость предложенных праймеров и зондов с широко используемыми наборами российского производства для синтеза кДНК и ПЦР, но предпочтение было отдано набору «БиоМастер», т.к. он позволяет проводить реакцию с патентуемыми праймерами в более удобном формате мультиплексной ПЦР, причем синтез кДНК и ее амплификация в ходе ПЦР-РВ проходят в одну стадию (в одной пробирке), что также удобнее.
Пример 4.
Демонстрация чувствительности ПЦР в реальном времени с использованием разведений плазмидной ДНК pAG110-3CLpro.
В условиях, указанных в примере 3 (табл. 4 и 5), была поставлена ОТ-ПЦР-РВ, где в качестве матрицы использовалась плазмида pAG110-3CLpro, сконструированная, как описано в примере 2. В реакцию вносилось количество матрицы, равное 1×10-9 грамма плазмиды pAG110-3CLpro, далее использовались последовательные 10-кратные разведения матрицы, вплоть до 1×10-16 грамма. Были получены характерные кривые накопления флуоресценции (фиг. 2 и 3).
Таким образом, был определен нижний порог чувствительности патентуемого способа определения РНК вируса SARS-CoV-2, который в абсолютном значении составил ~25 копий плазмидной ДНК, что соответствует ~2,5×104 копий на мл образца.
Пример 5.
Учет и интерпретация результатов амплификации. Интерпретация результатов анализа осуществляется в соответствии с таблицей 6, где ОКО обозначает отрицательный контрольный образец ОТ-ПЦР-РВ, а ОКО-В обозначает отрицательный контрольный образец выделения РНК. В качестве обоих контрольных образцов на соответствующих стадиях анализа вносят деионизованную воду, свободную от нуклеаз. Положительным сигналом считают наличие кривой накопления флуоресценции характерной сигмовидной формы и ее пересечение с установленной в соответствии с принципами постановки ПЦР-РВ, единообразно для всех образцов на соответствующем уровне пороговой линией (горизонтальная линия на фиг. 2 и 3). Отрицательным сигналом считают отсутствие такой кривой.
Таблица 6. Интерпретация результатов анализа проб с помощью набора реагентов «SBT-DX-SARS-CoV-2»
Наличие сигнала по каналу Образец Интерпретация
HEX FAM
Результаты всего анализа не подлежат учету в любом из следующих случаев:
- - ПКО 3CL Ложноотрицательный результат, ингибирование ОТ-ПЦР-РВ
+ любой ОКО-В Ложноположительный результат, контаминация в процессе выделения НК
+ ОКО Ложноположительный результат, контаминация в ходе постановки ОТ-ПЦР-РВ
Результаты анализа не подлежат учету для конкретной пробы:
- - проба Ложноотрицательный результат, ингибирование ОТ-ПЦР-РВ
Результаты анализа подлежат учету при получении следующих результатов:
+ любой ПКО 3CL Набор реагентов специфичен в отношении НК коронавируса SARS-CoV-2
- + проба В пробе не обнаружена РНК коронавируса SARS-CoV-2
+ любой В пробе присутствует РНК коронавируса SARS-CoV-2
Таким образом, приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно создание быстрого и надежного теста на вирус SARS-CoV-2 на основе синтеза кДНК с помощью MMLV-ревертазы и классической ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), где обе реакции протекают в одной пробирке.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость данного изобретения. При этом набор праймеров также может быть использован в обычной ПЦР в реальном времени без синтеза кДНК, если кДНК уже была синтезирована любым другим способом.
Перечень сокращений
РНК - рибонуклеиновая кислота
SARS-CoV-2 - ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 2
COVID-19 - коронавирусное заболевание 2019
ПЦР - полимеразная цепная реакция
SARS - тяжелый острый респираторный синдром
НРАС - коронавирус, связанный с пневмонией человека
RT-PCR - полимеразная цепная реакция c обратной транскрипцией
FP - прямой праймер
RP - обратный праймер
P - зонд
FRD - флуоресцентный репортерный краситель
QD - гасящий краситель
RT-ПЦР - полимеразная цепная реакция c обратной транскрипцией
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
NP - белок нуклеокапсида
SARS-CoV-1 - ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 1
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
MMLV - вирус лейкоза мышей Молони
ОТ - обратная транскрипция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
3CLpro - 3СL протеиназа, 3С-подобная протеиназа
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
ACTB - бета-актин
ORF1a - открытая рамка считывания 1а
ОТ-ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция c обратной транскрипцией в реальном времени
мкМ - микромолей на литр
мкл - микролитров
ДЭПК - диэтилпирокарбонат
мин - минут
сек - секунд
ОКО - отрицательный контрольный образец полимеразной цепной реакции c обратной транскрипцией в реальном времени
ОКО-В - отрицательный контрольный образец выделения рибонуклеиновой кислоты
ПКО - положительный контрольный образец полимеразной цепной реакции c обратной транскрипцией в реальном времени
НК - нуклеиновая кислота

Claims (5)

1. Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая праймер SBT0017, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GCTGGCACAGACTTAGAAGGT-3', праймер SBT0018, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGCAGCGTACAACCAAGCTAA-3', и зонд SBT0019, имеющий последовательность 5'-GTTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGCTG-3',
а также для положительного контроля прохождения всех этапов анализа включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека GAPDH праймер SBT0014, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', и зонд SBT0016, имеющий последовательность 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека ACTB праймер SBT0011, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3', и зонд SBT0013, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. (Вариант 1)
2. Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая праймер SBT003, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GTTCGCATTCAACCAGGACAG-3', праймер SBT004, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-ACCTTCTAAGTCTGTGCCAGC-3', и зонд SBT0026, имеющий последовательность 5'-CTGGTGTTTACCAATGTGCTATGAGGCCC-3',
а также для положительного контроля прохождения всех этапов анализа включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека GAPDH праймер SBT0014, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3', праймер SBT0015, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3', и зонд SBT0016, имеющий последовательность 5'-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTG-3', или включающая специфичные к гену домашнего хозяйства человека ACTB праймер SBT0011, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-CGTCTTCCCCTCCATCGTG-3', праймер SBT0012, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3', и зонд SBT0013, имеющий нуклеотидную последовательность 5'-GATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTC-3'. (Вариант 2)
3. Способ выявления РНК вируса SARS-CoV-2, включающий выделение РНК из биологического материала, синтез кДНК и проведение ПЦР-РВ, отличающийся тем, что синтез кДНК проводят при 45ºС в течение 30 минут, после чего MMLV ревертазу инактивируют прогреванием при 95 ºС в течение от 2 до 5 минут, далее полученную кДНК амплифицируют в ПЦР-РВ с участием специфичной к вирусному гену 3CLpro тест-системы по п. 1 или 2, причем в качестве контроля в той же или параллельной, но с тем же образцом, реакции амплифицируется кДНК гена домашнего хозяйства GAPDH с участием пары праймеров и зонда или кДНК гена домашнего хозяйства ACTB с участием пары праймеров и зонда, при этом температурный режим ПЦР-РВ включает следующие этапы: прогревание при 95 ºС в течение от 2 до 5 минут, совмещенное с инактивацией MMLV ревертазы, и от 45 до 49 циклов амплификации 95 ºС – от 5 до 15 с, 55 ºС – от 20 с до 1 мин, а детекцию флуоресценции проводят в ходе каждого цикла при температуре 55 ºС по каналам HEX/VIC для вирусной последовательности и FAM для последовательности гена домашнего хозяйства, при этом результаты интерпретируют на основании появления характерной кинетической кривой и ее пересечения с пороговой линией.
RU2020113326A 2020-04-12 2020-04-12 Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты) RU2731390C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020113326A RU2731390C1 (ru) 2020-04-12 2020-04-12 Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020113326A RU2731390C1 (ru) 2020-04-12 2020-04-12 Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2731390C1 true RU2731390C1 (ru) 2020-09-02

Family

ID=72421601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020113326A RU2731390C1 (ru) 2020-04-12 2020-04-12 Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты)

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2731390C1 (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2756474C1 (ru) * 2021-05-24 2021-09-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2761481C1 (ru) * 2021-09-07 2021-12-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Министерства здравоохранения Российской Федерации Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
RU2765497C1 (ru) * 2021-02-02 2022-01-31 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН) Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2
US11361847B1 (en) 2021-02-06 2022-06-14 Timothy A. Hodge System and method for rapidly reporting testing results
RU2779025C1 (ru) * 2022-05-20 2022-08-30 федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050233314A1 (en) * 2003-06-30 2005-10-20 National Health Research Institutes Sensitive and quantitative detection of pathogens by real-time nested PCR
RU2694501C1 (ru) * 2018-01-16 2019-07-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
RU2699792C1 (ru) * 2018-12-19 2019-09-11 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Способ прогнозирования выживаемости больных светлоклеточным почечно-клеточным раком

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050233314A1 (en) * 2003-06-30 2005-10-20 National Health Research Institutes Sensitive and quantitative detection of pathogens by real-time nested PCR
RU2694501C1 (ru) * 2018-01-16 2019-07-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
RU2699792C1 (ru) * 2018-12-19 2019-09-11 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Способ прогнозирования выживаемости больных светлоклеточным почечно-клеточным раком

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DataBasa GenBank: LY657404.1 от 04.12.2019 [Найдено 30.04.2020]. *
DataBasa GenBank: LY657404.1 от 04.12.2019 [Найдено 30.04.2020]. DataBasa GenBank: MO304808.1 от 11.10.2019 [Найдено 30.04.2020]. DataBasa GenBank: MO040934.1 от 10.10.2019 [Найдено 30.04.2020]. *
DataBasa GenBank: MO040934.1 от 10.10.2019 [Найдено 30.04.2020]. *
DataBasa GenBank: MO304808.1 от 11.10.2019 [Найдено 30.04.2020]. *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2765497C1 (ru) * 2021-02-02 2022-01-31 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН) Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2
US11361847B1 (en) 2021-02-06 2022-06-14 Timothy A. Hodge System and method for rapidly reporting testing results
RU2756474C1 (ru) * 2021-05-24 2021-09-30 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2761481C1 (ru) * 2021-09-07 2021-12-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева» Министерства здравоохранения Российской Федерации Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
RU2779025C1 (ru) * 2022-05-20 2022-08-30 федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1
RU2791958C1 (ru) * 2022-10-06 2023-03-14 Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) Олигонуклеотиды для определения мутации S:N501Y SARS-CoV-2

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2731390C1 (ru) Тест-система и способ для выявления РНК коронавируса SARS-COV-2, вируса-возбудителя коронавирусного заболевания 2019 COVID-19, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Варианты)
BG108526A (bg) Изследвания за диагностициране на parvovirus b19
CN111286559B (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN112739833A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN111521781B (zh) 一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法
Kim et al. A portable detection assay for apple stem pitting virus using reverse transcription-recombinase polymerase amplification
JP2006223234A (ja) 遺伝子検査方法
TWI377255B (en) Nucleic acid detection
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN106435032B (zh) 一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重rt-pcr引物、试剂盒和方法
KR20210113083A (ko) SARS-CoV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-CoV-2의 진단방법
CN113046476A (zh) 一种快速检测新型冠状病毒n501y突变的引物组合物及试剂盒
CN112831605A (zh) 多酶恒温扩增检测试剂盒及其应用
US20230167511A1 (en) An ultrasensitive rapid and portable case13d-based diagnostic assay
KR101236197B1 (ko) 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단
KR101617142B1 (ko) 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트
CN111004869B (zh) 用于h1n1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的荧光定量pcr引物和参考标准品
WO2017106184A2 (en) Detection of live attenuated influenza vaccine viruses
JPH07184695A (ja) Ｃ型肝炎ウイルスの簡易検出法
JP6226460B2 (ja) 核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ｄｎａチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法
CN113549709A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
WO2007119557A1 (ja) コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法
RU2595373C1 (ru) Набор для выявления днк провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2728342C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ выявления пестивируса Н крупного рогатого скота
CN116515840B (zh) 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner