RU2731058C1 - Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции - Google Patents
Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2731058C1 RU2731058C1 RU2019138271A RU2019138271A RU2731058C1 RU 2731058 C1 RU2731058 C1 RU 2731058C1 RU 2019138271 A RU2019138271 A RU 2019138271A RU 2019138271 A RU2019138271 A RU 2019138271A RU 2731058 C1 RU2731058 C1 RU 2731058C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blad
- test system
- oligonucleotide primers
- polymerase chain
- chain reaction
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложенная тест-система является комплексом, в который входит специфический набор реагентов, порядок действий при приготовлении реакционной смеси и специально разработанная программа для амплификации гена CD18 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени». Для проведения ПЦР используют специфические олигонуклеотидные праймеры. Изобретение позволяет выявить носителей синдрома недостаточной адгезии лимфоцитов у крупного рогатого скота (BLAD) в популяциях скота черно-пестрого корня (голштинская, черно-пестрая, ярославская и другие родственные породы).
Description
Известен способ одновременного определения синдрома недостаточнй адгезии лейкоцитов (BLAD) и комплексного порока позвоночника (CVM) у крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (патент RU 2601151). Недостатком данного способа является то, что для детекции результатов ПЦР и проведения генотипирования используют анализ кинетических кривых ПЦР с определением порогового (threshold) цикла. Надежность анализа зависит в данном случае от нескольких параметров: качества очистки образца ДНК, эффективности фермента Taq-полимеразы, оптических характеристик амплификатора. Варьирование этих параметров повышает вероятность ошибки и ограничивает возможность автоматизированного определения генотипа.
В предлагаемом способе используются аллель-специфичные FAM- и VIC-зонды и один общий для обоих аллелей зонд, несущий BHQ-гаситель. Гибридизация зондов происходит после завершения основного этапа амплификации с последующим плавлением. Это позволяет различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Установление температуры плавления аллель-специфичных зондов, характерной для каждого из аллелей, позволяет провести генотипирование образца в одной пробирке. Помимо температуры плавления при анализе генотипа может также учитываться форма кривой плавления, что повышает надежность анализа и позволяет автоматизировать и формализовать процедуру интерпретации полученных данных, снизив, при этом, вероятность ошибки оператора. Использование гибридизационных зондов значительно снижает требования к степени очистки препарата ДНК и иным варьирующим параметрам биохимической и аппаратной природы, делая предлагаемую тест-систему более универсальной и удобной в использовании.
Цель настоящего изобретения (тест-системы) - выявление носителей синдрома недостаточной адгезии лимфоцитов у крупного рогатого скота (BLAD) в популяциях скота черно-пестрого корня (голштинская, черно-пестрая, ярославская и другие родственные породы).
Тест-система предназначена для проведения исследований по идентификации однонуклеотидной замены (A → G) в позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у крупного рогатого скота (BLAD). Эта мутация нарушает нормальную функцию нейтрофилов, дефектные нейтрофилы теряют способность мигрировать через эпителий капилляров и субэпителиальные мембраны. Клинические симптомы проявления BLAD-синдрома в гомозиготном состоянии выражаются в предрасположенности к респираторным инфекциям, диарее и низкой естественной резистентности организма к бактериальным инфекциям. Гомозиготные телята заболевают в первые месяцы жизни. Для них характерен замедленный рост, взъерошенная и тусклая шерсть, шаткость зубов, язвы в ротовой полости, массовые кровоизлияния по всему желудочно-кишечному тракту, поносы. Больные животные не поддаются лечению и погибают в течение первого года жизни.
Разработка и реализация национальных программ против распространения BLAD-синдрома привели к тому, что частота аллели рецессивной аллели гена CD18 в последнее время значительно снизилась. Однако без систематического мониторинга популяций черно-пестрого скота и других пород с прилитием крови крупного рогатого скота голштинской породы частота встречаемости данной мутации может возрасти. Поэтому разработка новых, более совершенных, тест-систем для проведения ПЦР для выявления носителей BLAD по-прежнему актуальна.
Принцип действия: определение генотипа основано на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, общими для «дикого» и «мутантного» вариантов нуклеотидной последовательности.
BLAD-d 5'-TGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTT-3'
BLAD-r 5'-CGACTCGGTGATGCCATTGAGG-3'
После завершения температурной программы ПЦР флуоресцентные зонды гибридизуются на полненную матрицу путем понижения температуры реакционной смеси. Для определения варианта последовательности используется два типа олигонуклеотидов, гибридизующихся на матрицу рядом.
BLAD-pf 5'-CCCCATCGACCTGTACT-(FAM)
BLAD-pv 5'-CCCCATCGGCCTGTACT-(VIC)
BLAD-pq (BHQ)-ACCTGATGGACCTCTCCTACTC-(P)
Первый тип олигонуклеотидов мечен флуорофором, второй - гасителем флуоресценции.
Для генотипирования используется один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции (зонд BLAD-pq) и два сиквенс-специфичных олигонуклеотида несущих различные флуорофоры: BLAD-pf и BLAD-pv (FAM маркирует предковый аллель, VIC-мутантный аллель). Определение генотипа проводится путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Результаты регистрируются в режиме реального времени. Если анализируемый образец содержит только один вариант нуклеотидной последовательности гена, т.е. гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для зонда, образующего совершенный (полностью комплементарный) дуплекс существенно выше, нежели для зонда, образующего несовершенный (частично некомплементарный) дуплекс. При анализе гетерозиготного образца, содержащего оба варианта нуклеотидной последовательности, оба варианта зондов образуют совершенный дуплекс, поэтому температуры их плавления практически одинаковы.
Источники информации:
1. Марзанов Н.С., Марзанова С.Н., Девришов Д.А., Алексеев Я.И., Коновалова Н.В. Способ одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих cvm и blad у крупного рогатого скота, и тест-система для его осуществления [Текст] // Патент России RU 2601151 - 2017 г. - Бюлл. №34.
2. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР «в реальном времени» [Текст] // БИНОМ. Лаборатория знаний Москва - 2009 г. - 224 с. ISBN 978-5-9963-0086-0.
3. Справочная информация. Красители и тушители для ПЦР в «реальном времени» [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.oligos.ru/spravka-krasiteli-tushiteli.html. свободный - (31.10.2019).
Claims (10)
- Тест-система для выявления SNP-мутации в 383 позиции гена CD 18 включает набор реактивов: термостабильный фермент - Taq-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, два синтетических олигонуклеотидных праймера, специфичных к данному участку ДНК:
- BLAD-d 5'-TGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTT-3'
- BLAD-r 5'-CGACTCGGTGATGCCATTGAGG-3'
- и два вида зондов:
- аллель-специфичные флюоресцирующие
- BLAD-pf 5'-CCCCATCGACCTGTACT-(FAM)
- BLAD-pv 5'-CCCCATCGGCCTGTACT-(VIC)
- и общий для обоих аллелей гасящий
- BLAD-pq (BHQ)-ACCTGATGGACCTCTCCTACTC-(P),
- а также минеральное масло, защищающее реакционную смесь от испарения в ходе ПЦР.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019138271A RU2731058C1 (ru) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019138271A RU2731058C1 (ru) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2731058C1 true RU2731058C1 (ru) | 2020-08-28 |
Family
ID=72421497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019138271A RU2731058C1 (ru) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2731058C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2601151C2 (ru) * | 2015-02-11 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "АгроВет" | Способ одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих cvm и blad у крупного рогатого скота, и тест-система для его осуществления |
-
2019
- 2019-11-26 RU RU2019138271A patent/RU2731058C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2601151C2 (ru) * | 2015-02-11 | 2016-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "АгроВет" | Способ одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих cvm и blad у крупного рогатого скота, и тест-система для его осуществления |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AMARAL В.С., et al, Heat stress abatement during the dry period influences prolactin signaling in lymphocytes, Domestic Fnimal Endocrinology, 38 (2010), p.38-45. * |
| РЕБРИКОВ Д.В., и др., ПЦР "в реальном времени", БИНОМ. Лаборатория знаний Москва - 2009 г. - 224 с. ISBN 978-5-9963-0086-0. * |
| РЕБРИКОВ Д.В., и др., ПЦР "в реальном времени", БИНОМ. Лаборатория знаний Москва - 2009 г. - 224 с. ISBN 978-5-9963-0086-0. AMARAL В.С., et al, Heat stress abatement during the dry period influences prolactin signaling in lymphocytes, Domestic Fnimal Endocrinology, 38 (2010), p.38-45. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210222245A1 (en) | Autism associated genetic markers | |
| US20210123102A1 (en) | Single Nucleotide Polymorphism in HLA-B*15:02 and Use Thereof | |
| US6458544B1 (en) | Methods for determining single nucleotide variations and genotyping | |
| US6355433B1 (en) | Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension | |
| JP2013538589A (ja) | 自閉症を診断するための組成物及び方法 | |
| MXPA06009452A (es) | Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos. | |
| Spector et al. | Technical standards and guidelines: venous thromboembolism (Factor V Leiden and prothrombin 20210G> A testing): a disease-specific supplement to the standards and guidelines for clinical genetics laboratories | |
| JPWO2011062258A1 (ja) | Ｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
| US20080228406A1 (en) | System and method for fungal identification | |
| Monaghan et al. | Technical standards and guidelines for reproductive screening in the Ashkenazi Jewish population | |
| KR101684832B1 (ko) | 실시간 중합효소 연쇄반응법을 이용한 고양이 혈액형 검출용 조성물 및 이들을 이용한 검출방법 | |
| KR102124652B1 (ko) | 개의 불안장애 조기 예측 또는 진단용 조성물 | |
| JP2016527899A (ja) | Ｎｒａｓ核酸およびｂｒａｆ核酸のマルチプレックス解析のための組成物および方法 | |
| US20100216666A1 (en) | Method of performing a biological assay | |
| RU2731058C1 (ru) | Тест-система для выявления однонуклеотидной замены (A→G) позиции 383 гена CD18, ассоциированной с дефицитом адгезии лимфоцитов у коров (BLAD), с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции | |
| EP2789693B1 (en) | Amelogenin SNP on chromosome X | |
| CN110894531A (zh) | 用于猪的str基因座集及用途 | |
| KR102269653B1 (ko) | 고양이의 골연골이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 단일염기 다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법 | |
| CN105567809A (zh) | 具有不同表达量的基因的鉴定方法 | |
| TW201311908A (zh) | 診斷犬之青光眼的方法及套組 | |
| US20070134691A1 (en) | Methods and compositions for determining whether a subject carries a gene mutation associated with hereditary hearing loss | |
| KR101667189B1 (ko) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출 | |
| US20010024791A1 (en) | Molecular diagnostics for galactosemia | |
| JP2006296270A (ja) | Ｐｒｋａａ２遺伝子多型による２型糖尿病発症素因の検出方法 | |
| Teh et al. | The use of Taqman genotyping assays for rapid confirmation of β‐thalassaemia mutations in the Malays: accurate diagnosis with low DNA concentrations |