RU2723188C1 - Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур - Google Patents

Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур Download PDF

Info

Publication number
RU2723188C1
RU2723188C1 RU2019113055A RU2019113055A RU2723188C1 RU 2723188 C1 RU2723188 C1 RU 2723188C1 RU 2019113055 A RU2019113055 A RU 2019113055A RU 2019113055 A RU2019113055 A RU 2019113055A RU 2723188 C1 RU2723188 C1 RU 2723188C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
bacteriophage
microorganism
monolayer
degree
cells
Prior art date
Application number
RU2019113055A
Other languages
English (en)
Inventor
Александр Викторович Алимов
Юлия Александровна Захарова
Ольга Семёновна Федотова
Наталья Анатольевна Шмелева
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ЕНИИВИ" Роспотребнадзора)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ЕНИИВИ" Роспотребнадзора) filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ЕНИИВИ" Роспотребнадзора)
Priority to RU2019113055A priority Critical patent/RU2723188C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2723188C1 publication Critical patent/RU2723188C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Предложен способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, предусматривающий осуществление в течение 1 часа совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл. После чего проводят оценку результата по сравнению с контролем без бактериофага. Изобретение обеспечивает сокращение времени проведения реакции. 4 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, результат учитывают в течение 1 часа. Использование способа позволяет проводить оценку эффективности лечебно-профилактического бактериофага в меньшем объеме препарата - 0,2 мл и сократить время проведения реакции до 1 часа.
За последние годы практически не появилось новых антибактериальных препаратов (АБП), в то время как устойчивость к «старым» АБП неуклонно растет и во многих случаях уже достигла критической отметки. В этой связи ключевыми задачами являются разработка и внедрение в клиническую практику дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в качестве которых, несомненно, можно рассматривать бактериофаги.
Доступность и эффективность фаготерапии находит все более широкое применение этого метода в клинической практике, включая тяжелые формы инфекционной патологии, так как антимикробный эффект бактериофагов обусловлен внедрением их в бактериальную клетку без нарушения нормальной микрофлоры. Простота культивирования, короткий период генерации, высокий выход фагового потомства и возможность точного количественного учета способствуют не только успешно решать многие проблемы молекулярной генетики и общей вирусологии, но и позволяют широко использовать бактериофаги с диагностической и лечебно-профилактической целью при оказании медицинской помощи.
При этом актуальным в клинической практике является получение быстрого результата, поскольку постановка реакции по оценке фагочувствительности установленного патогена дополнительно требует определенного времени.
В настоящее время известен способ определения чувствительности выделенного микроорганизма к бактериофагу путем посева бактериальной культуры на агаризиванную питательную среду (Методические рекомендации «Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями с оказанием медицинской помощи» М. 2014 г.). О чувствительности бактериальной культуры к фагу судят по образованию зон лизиса в местах нанесенной на плотную питательную среду суспензии бактериофага. Результаты оценивают по пятибалльной шкале (по количеству «крестов»): «++++» прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста, «+++» зона лизиса с единичными колониями вторичного роста, «++» образование зоны лизиса с большим количеством колониями вторичного роста, «+» низкая активность, «-» отсутствие литической активности.
Недостатками этого способа является постановка теста в искусственно созданных условиях на синтетических питательных средах (in vitro) и получение результата через 18-24 часов.
Техническим результатом представленного изобретения является приближение условий культивирования к организму человека (in vivo), а также быстрота получения ответа с меньшими затратами.
Ближайшим прототипом изобретения является патент № 2296163 от 2012 г. «Способ оценки специфической активности бактериофагов» (авторы: Тихолов Р.М., Афиногенова А.Г., Кравцов А.Г., Афиногенов Г.Е.).
Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.
Недостатками метода является объем бактериофага (1,8 мл), что экономически затратно и постановка эксперимента в течение 2-х часов, что не позволяет отнести представленную методику к экспресс-методу диагностики.
Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток по сравнению с контролем проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебно-профилактическим бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом в объеме 0,2 мл в течение 1 часа.
Способ осуществляется следующим образом.
Из пробирок на покровное стекло с монослоем легочных фибробластов (ЛЭЧ-3) эмбриона человека, сливают ростовую среду и добавляют 0,2 мл препарата бактериофага и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 108 КОЕ/мл. Пробирки с покровным стеклом инкубируют 1 часа при 37 ± 1 °С, периодически встряхивая. Затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий 3-х кратно ФР (фосфатным буфером с pH 7,2). Препараты (покровное стекло) фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке с покровным стеклом с монослоем ЛЭЧ-3 проводят совместное ингибирование 0,2 мл поддерживающей среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА×ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.
В качестве примера использовали официальные препараты стафилококковый, синегнойный бактериофаг (псевдомонас аеругиноза) и экспериментальную серию бактериофага «Дифаг» против Аcinetobacter baumannii и Pseudomonas aeriginosa.
Пример 1. Определение бактериолитической активности препаратов: стафилококкового бактериофага в отношении S.aureus №456, синегнойного бактериофага против Ps.aeriginosa № 461, двухкомпонентного бактериофага «Дифаг» в отношении A. baumannii № 31 на культуре клеток (КК) ЛЭЧ-3. Среда для культивирования тест-микроорганизма - мясо-пептонный бульон (МПБ), для культивирования фибробластов - питательная среда Игла МЕМ.
В пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ- 3 наносят 0,2 мл суточной культуры соответствующего микроорганизма в дозе ~1,5х108 КОЕ/мл (0,5 по МакФарланду) с добавлением 0,2 мл бактериофага с литической активностью 10-5--7 (опытный инокулят). В качестве контрольного инокулята использовали смесь 0,2 мл питательной среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной тест-культуры соответствующего микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ-3. Пробирки инкубировали 1 часа при t 37 ± 1 °С, периодически встряхивая, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов 3-х кратно ФР, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без бактериофага по показателю микробной нагрузки (таблица 1,2,3).
Таблица 1.
Адгезивная активность S.aureus в присутствии специфического стафилококкового бактериофага.
Показатели процесса адгезии S.aureus
ИА ПК% МН % адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий +бактериофаг 10 10 100 1,3
контроль:
КК+ бактерий 25 30 750 100
Примечание: КК- клеточная культура
Таблица 2.
Адгезивная активность P.aeriginosa в присутствии специфического синегнойного бактериофага
Показатели процесса адгезии P.aeriginosa
ИА ПК% МН % адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий + бактериофаг 2 7 14 2,3
контроль:
КК+ бактерий 10 30 300 100
Таблица 3.
Адгезивная активность A.baumannii в присутствии специфического бактериофага «Дифаг»
Показатели процесса адгезии A.baumannii
ИА ПК% МН % адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий +бактериофаг 5 5 25 5,3
контроль:
КК+ бактерий 16 30 480 100
Как видно из данных таблиц, процент адгезии тест-штаммов достоверно снизился относительно контроля соответственно: S.aureus на 98,7%, P.aeriginosa на 97,7%, A.baumannii на 94,7%.
Снижение адгезивной активности бактерий происходило за счет бактериолитического эффекта бактериофага. Это подтверждали результатами проведенного дополнительного теста.
Производили высев инокулятов из пробирок на чашки Петри с МПА (мясо-пептонный агар) до начала инкубации и после 1 часа термостатирования при t=37 ± 1°С (таблица 4). Результаты высева инокулятов из соответствующих контрольных и опытных пробирок.
Таблица 4.
Присутствие тест-штамма микроорганизма в МПБ
(в контроле и в опыте)
Наличие микроорганизмов в МПБ* (КОЕ/мл)
S.aureus P.aeriginosa A.baumannii
контроль опыт контроль опыт контроль опыт
Инкубация микроорганизма без бактериофага (контроль) 5.108 4.108 4.108 3.108 3.108 2.108
Инкубация микроорганизма с бактериофагом (опыт) 0 0 0 0 0 0
* Учёт результата по высеву на мясо-пептонный агар.
Представленные в таблице данные свидетельствуют об отсутствии жизнеспособных клеток микроорганизмов как в контрольной, так и в опытной пробирках после 1 часа инкубации. Отсутствие роста микрофлоры на плотной питательной среде в контроле связано со 100% адгезией тест-штаммов к культуре клеток фибробластов в пробирках. В то же время отсутствие роста тест-культур на МПА после 1 часа инкубации в опыте свидетельствует о гибели тест-штаммов за счет бактериолитического действия бактериофага в связи с отсутствием адгезированных клеток микроорганизмов к культуре клеток фибробластов в пробирках.

Claims (1)

  1. Способ оценки специфической активности бактериофагов в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток, отличающийся тем, что в течение 1 часа осуществляют совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, после чего проводят оценку результата по сравнению с контролем без бактериофага.
RU2019113055A 2019-04-27 2019-04-27 Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур RU2723188C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019113055A RU2723188C1 (ru) 2019-04-27 2019-04-27 Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019113055A RU2723188C1 (ru) 2019-04-27 2019-04-27 Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2723188C1 true RU2723188C1 (ru) 2020-06-09

Family

ID=71067492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019113055A RU2723188C1 (ru) 2019-04-27 2019-04-27 Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2723188C1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2296163C2 (ru) * 2005-04-08 2007-03-27 ФГУ "Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им.Р.Р.Вредена Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию " Способ оценки специфической активности бактериофагов

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2296163C2 (ru) * 2005-04-08 2007-03-27 ФГУ "Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им.Р.Р.Вредена Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию " Способ оценки специфической активности бактериофагов

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINIKH O. et al. Bacteriophage-based biosorbents coupled with bioluminescent ATP assay for rapid concentration and detection of Escherichia coli, Journal of Microbiological Methods, 2010, vol.82, Issue 2, pp.177-183 *
MINIKH O. et al. Bacteriophage-based biosorbents coupled with bioluminescent ATP assay for rapid concentration and detection of Escherichia coli, Journal of Microbiological Methods, 2010, vol.82, Issue 2, pp.177-183. SOOTHILL J.S. Treatment of experimental infections of mice with bacteriophages, J. Med. Microbiol., 1992, Vol.37, Issue 4, pp.258-261. ЗАХАРОВА Ю.А. и др. Изучение специфической активности и безопасности лечебно-профилактического препарата бактериофага против Acinetobacterbaumannii и Pseudomonasaeruginosa, Медицинский алфавит, 2016, Т.1, N 6(269), стр.42-46. АСЛАНОВ Б.И., ЗУЕВА Л.П. и др. Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике. Федеральные клинические рекомендации. - Москва, 2014. - 39 с. WU Y. ET AL. Influence of phage population on the phage‐mediated bioluminescent adenylate kinase (AK) assay for detection of bacteria. Lett Appl Microbiol. 2001 Oct; 33(4):311-5. *
SOOTHILL J.S. Treatment of experimental infections of mice with bacteriophages, J. Med. Microbiol., 1992, Vol.37, Issue 4, pp.258-261. *
WU Y. ET AL. Influence of phage population on the phage‐mediated bioluminescent adenylate kinase (AK) assay for detection of bacteria. Lett Appl Microbiol. 2001 Oct; 33(4):311-5. *
АСЛАНОВ Б.И., ЗУЕВА Л.П. и др. Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике. Федеральные клинические рекомендации. - Москва, 2014. - 39 с. *
ЗАХАРОВА Ю.А. и др. Изучение специфической активности и безопасности лечебно-профилактического препарата бактериофага против Acinetobacterbaumannii и Pseudomonasaeruginosa, Медицинский алфавит, 2016, Т.1, N 6(269), стр.42-46. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
de Breij et al. Three-dimensional human skin equivalent as a tool to study Acinetobacter baumannii colonization
KR101908411B1 (ko) 신규한 국내형 메티실린-내성 황색포도상구균 균주 및 이를 이용한 바이오필름 억제제 스크리닝 방법
CA3082772A1 (en) Therapeutic bacteriophage compositions
WO2016110177A1 (zh) 碱性抗菌肽及其靶向设计和应用
RU2455355C1 (ru) ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Pseudomonas aeruginosa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ОСНОВЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ
CN107937324A (zh) 一株卷曲乳杆菌及其应用
RU2296163C2 (ru) Способ оценки специфической активности бактериофагов
RU2723188C1 (ru) Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур
CN110898075B (zh) 聚六亚甲基双胍在制备抑制和/或杀灭犬小孢子菌的药物中的应用
Youssef et al. Ecological effects of antibiotic production by dermatophyte fungi
RU2668406C1 (ru) Способ первичного посева биоматериала, выделенного из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом
Rahman et al. Isolation and identification of Escherichia coli from urine samples and their antibiotic susceptibility pattern
Anghel et al. Pathogenic features and therapeutical implications of biofilm development ability in microbial strains isolated from rhinologic chronic infections
RU2451085C2 (ru) Способ определения антибактериальной активности аэробных споровых микроорганизмов bacillus subtilis
Fadhel et al. Prevalence of S. epidermidis and S. aureus and their biofilm ability among Iraqi patients suffering from urinary tract infection
Bitew et al. Clinical and microbiological profile of keratitis in menelik II memorial hospital, Addis Ababa, Ethiopia
Al-naddawi et al. The synergism and antagonism behavior of aqueous extraction for black tea, green tea and coffee against the effectiveness of certain antibiotics
Gagana et al. Biofilm formation of Malassezia pachydermatis from dogs
Padmaja et al. Trichoderma sp. as a microbial antagonist against Rhizoctonia solani
RU2182172C1 (ru) Штамм бактерий bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности
RU2446214C1 (ru) Способ определения степени эпидемической опасности патогенных и потенциально-патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования
RU2818369C1 (ru) Способ оценки сохранения жизнеспособности лактобактерий при воздействии различных концентраций антисептика
RU2237709C2 (ru) Микробиологическая среда для выделения trichophyton verrucosum
RU2711954C1 (ru) Способ предварительной идентификации нетуберкулезных микобактерий с использованием универсальной хромогенной среды
Inovejas et al. Methanol extract and nanocomposite of Trichoderma sp. as a potential bio-control against Fusarium moniliforme in tomato (Lycopersicon esculentum).