RU2673341C2 - Применение композиций, содержащих bifidobacterium animalis ssp. lactis lmg p-28149 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию на основе по меньшей мере одного пробиотика для применения с целью оказания лечебного действия на прибавку массы тела у человека с избыточной массой тела и/или для профилактики прибавки массы тела у человека, имеющего или имевшего избыточную массу тела, отличающуюся тем, что указанный пробиотик представляет собой Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149, присутствующий в живом состоянии в концентрации от 10до 10КОЕ на грамм композиции. Изобретение обеспечивает уменьшение или предупреждение избыточной массы тела и ожирения у человека с избыточной массой тела, которое является необременительным. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 5 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к композиции на основе по меньшей мере одного пробиотика для применения с целью оказания лечебного действия на прибавку массы тела у человека с избыточной массой тела и/или для профилактики прибавки массы тела у человека, имеющего или имевшего избыточную массу тела.

Под выражением "с избыточной массой тела" в смысле настоящего изобретения понимают то обстоятельство, что человек имеет аномальное и/или избыточное отложение жира в теле, главным образом в области живота, что представляет собой риск для его здоровья. В рамках настоящего изобретения термин "избыточная масса тела" охватывает также частный и крайний случай состояния ожирения у человека.

Под выражением "имевшего избыточную массу тела" в смысле настоящего изобретения следует понимать то обстоятельство, что человек претерпел потерю массы тела и имеет массу тела, считающуюся в качестве нормальной (на основе IMC или окружностей "талия/бедро"), по прошествии промежутка времени в интервале от 3 до 5 лет.

Трудно выработать простой индекс, который позволял бы определять избыточную массу тела и ожирение на уровне заданной группы людей. Например, шкала, используемая для определения индекса избыточной массы тела и ожирения у детей и подростков, в силу того, что их организм претерпевает ряд некоторых физиологических изменений, связанных с их ростом, отличается от шкалы, используемой в случае взрослых людей. С некоторых пор ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) в зависимости от возраста предлагает разные способы определения массы тела в зависимости от возраста индивида или среднего возраста эталонного индивида.

В порядке пояснительного примера избыточную массу тела в случае взрослых людей можно оценивать на основе индекса массы тела (IMC или BMI от английского "Body Mass Index"), который представляет собой простой показатель массы тела по отношению к росту, обычно используемый для оценки избыточной массы тела и ожирения в случае взрослых людей. Он соответствует значению массы, разделенной на квадрат значения роста, и выражается в кг/м².

IMC обладает преимуществом, состоящим в применении к обоим полам и к любым возрастным группам взрослых людей. Тем не менее, его следует принимать в качестве приблизительного указания, поскольку он не соответствует в обязательном порядке одной и той же процентной доле жировой массы в зависимости от конкретных людей.

В этом контексте ВОЗ определяет на основе IMC следующие пороговые значения для определения у взрослых людей наличия избыточной массы тела или ожирения:

- состоянию нормальной массы тела соответствует IMC в интервале от 20 до 25;

- состоянию избыточной массы тела соответствует IMC в интервале от 25 до 30;

и

- состоянию ожирения соответствует IMC, равный или превышающий 30.

Тем не менее, следует заметить, что IMC не дает каких-либо указаний относительно распределения абдоминального жира по сравнению с подкожным жиром.

Этот индекс, хотя и обладает преимуществом, позволяющим унифицировать классификацию по отношению к обоим полам и к любым возрастным группам взрослых людей, предпочтительно может быть истолкован комплементарным образом с другим индикатором, который может представлять собой, например, измерение окружности талии человека.

Таким образом, взрослый мужчина, окружность талии которого превышает 100 см, считается обладающим избыточной массой тела. У взрослой женщины этот порог составляет 88 см.

Этот параметр может быть обобщен по отношению к любым возрастным группам при определении отношения "окружность талии (A)/окружность бедра (H)".

Избыточная масса тела наблюдается при отношении, превышающем 1 в случае мужчин и превышающем 0,85 в случае женщин.

Термин "лечебное действие" применяется в рамках этого изобретения в силу того, что избыточная масса тела человека и, в частности, ожирение человека были признаны ВОЗ в качестве болезни.

Под термином "лечебный" в смысле настоящего изобретения следует понимать действие, которое нацелено на уменьшение массы тела человека с избыточной массой тела и/или для уменьшения прибавки массы тела у человека с избыточной массой тела. Следовательно, лечебное действие представляет собой действие, которое нацелено на достижение, предпочтительно в течение и/или после курса диеты, массы тела, считающейся в качестве нормальной у человека, то есть представляющей меньший риск для здоровья, в предопределенном диапазоне значений, основанном, например, на IMC, значение которого находится в интервале от 20 до 25 и предпочтительно равно 22.

Выражение "меньший риск для здоровья" в рамках настоящего изобретения следует интерпретировать так, что в случае массы тела, считающейся нормальной, риск развития метаболического синдрома является незначительным.

В частности, лечебное действие нацелено, главным образом, на уменьшение абдоминального жира у человека или по меньшей мере на накопление абдоминального жира.

Под термином "профилактика" в смысле настоящего изобретения следует понимать действие, которое нацелено на стабилизацию массы тела человека с избыточной массой тела или человека, имевшего избыточную массу тела (то есть человека, у которого масса тела уменьшилась), и, следовательно, на предотвращение или ограничение прибавки массы тела у человека с избыточной массой тела или человека, имевшего избыточную массу тела, предпочтительно в течение и/или после курса диеты. Профилактика охватывает также действие, которое нацелено на поддержание, предпочтительно в течение и/или после курса диеты, стабильной массы тела, предпочтительно считающейся в качестве нормальной у человека, в установленном диапазоне значений, основанном, например, на IMC (для справки: в интервале 20-25), при этом нормальная масса тела также может быть интерпретирована в свете отношения A/H, меньшего 0,85 в случае женщин и меньшего 1,00 в случае мужчин.

В настоящее время избыточная масса тела и ожирение в мировом масштабе ответственны (в силу связанных с ними болезней, таких как диабет II типа или сердечно-сосудистые заболевания) за смертность в большей степени, чем дефицит массы тела.

В частности, избыточная масса тела и ожирение достигли масштаба мировой эпидемии (с учетом того, что по меньшей мере около 3 миллионов человек умирают каждый год от патологий, связанных с избыточной массой тела или ожирением) и больше не ограничены странами, называемыми богатыми, но отныне они касаются также стран с низкими или средними доходами.

Кроме того, доказано, что высокое значение IMC, иногда совместно с высоким отношением A/H, образует фактор, благоприятствующий, с одной стороны, метаболическому синдрому, который определяется в рамках настоящего изобретения как сочетание факторов риска для здоровья: артериальная гипертензия, гипертриглицеридемия, низкое содержание холестерина HDL, состояние ожирения мужского типа (например, накопление абдоминального жира) и повышение уровня гликемии. Эти индикаторы составляют фактически основу определения, которая является общей для трех основных известных современных определений: определение ВОЗ (опубликованное в 1998 году и затем исправленное в 1999 году), определение согласно "National Cholesterol Education Program" (NCEP-ATPIII), опубликованное в 2001 году, и определение Международной федерации диабета, опубликованное в 2005 году.

На практике метаболический синдром неисчерпывающим образом выражается в следующих индикаторах: аномально высокое содержание инсулина; диабет II типа; гиперхолестеринемия (ассоциированная с низким содержанием "хорошего" холестерина HDL); гипертензия; значительное повышение прибавки массы тела с течением времени, при этом речь идет, главным образом, об абдоминальном ожирении; гипертриглицеридемия; стеатоз печени; развитие состояния системного воспаления; и гипертрофия адипоцитов.

В то же время, риск хронических болезней неисчерпывающим образом выражается в следующих индикаторах: скелетно-мышечные расстройства, в частности артроз, или некоторые типы раковых опухолей.

Таким образом, проблематика неконтролируемой прибавки массы тела, приводящей к избыточной массе тела у человека, представляет собой общественную проблему всемирного уровня, оказывающую заметное влияние на здоровье.

Именно с учетом этой перспективы ВОЗ разработала в своей мировой стратегии профилактики прибавки избыточной массы тела рекомендации, касающиеся питания и физических упражнений. Эта стратегия, принятая на Всемирной ассамблее здоровья (AMS) в 2004 году, определяет измерения, необходимые для побуждения людей следовать здоровому питанию и выполнять упражнения регулярным образом.

Тем не менее, хотя эта стратегия и основана на рекомендациях, предупреждающих прибавку массы тела, она не предлагает указаний касательно лечебных и профилактических действий в отношении прибавки массы тела у людей, имеющих избыточную массу тела или имевших избыточную массу тела и подверженных риску возобновления прибавки массы тела. На практике, в настоящее время, проблематика неконтролируемой прибавки массы тела нацелена в большей степени не только на людей с нормальной массой тела (то есть которые обладают нормальным значением IMC и/или нормальным значением окружности талии), склонных к прибавлению массы тела, а главным образом на людей, уже имеющих избыточную массу тела, поскольку ВОЗ указало, что около 1,4 миллиарда человек в возрасте 20 лет и старше имеют в настоящее время избыточную массу тела. Среди них больше 200 миллионов мужчин и около 300 миллионов женщин страдают ожирением, а обобщенно в мире больше одного человека из десяти взрослых людей страдает ожирением.

Следовательно, существует реальная потребность в лечении, которое позволяет уменьшать или предупреждать избыточную массу тела и ожирение у человека с избыточной массой тела. Такое лечение предпочтительно должно быть мало обременительным, поскольку известно, что основная причина, связанная с избыточной массой тела и ожирением, представляет собой отсутствие точного соблюдения режима, связанного с лечением, которое иногда может быть тяжелым.

В частности, настоящее изобретение описывается в рамках известной причинно-следственной связи, которая ассоциирует изменения кишечной микробиоты с развитием ожирения (Ley et co., 2006. Nature, 444: 1022-1023; Nadal et co., 2008. Int J. Obes., 33(7): 758-67).

В этом контексте были проведены многочисленные исследования, оставившие на предшествующем уровне техники большую группу документов, в которых указывается на осуществление лечения на основе пробиотиков при избыточной массе тела и ожирении.

В частности, было показано, что микробиота способствует поддержанию хорошего здоровья "хозяина". На практике, равновесное состояние микробиоты способствует регулированию кишечного гомеостаза и иммунному равновесию, так что любая неуравновешенность микробиоты интерпретируется как участие в развитии метаболического синдрома, в частности, у людей, имеющих генетическое предрасположение к развитию этого синдрома (Parks et al., Cell Metab, 2012).

Выявление связи "микробиота - прибавка массы тела" было движущей силой для большой группы исследований, обусловивших объекты разных заявок, наиболее подходящие из которых прокомментированы далее.

Прежде всего следует назвать международную заявку WO2007043933, в которой предлагается использовать штаммы Lactobacillus casei F19, L. acidophilus NCFB 1748 и Bifidobacterium lactis Bb12 в форме ферментированных молочных продуктов для уменьшения аппетита и отложения жира в некоторых тканях и таким образом контролировать массу тела у человека. Однако, кажется, что это скорее представляет собой совместное действие кальция и молочных белков, которое, видимо, лежит в основе эффекта, заявленного в этой заявке, чем присутствие указанных ранее штаммов бактерий. Кроме того, этот эффект нацелен только, на экспрессию генов, связанных с метаболизмом в тонком кишечнике, и не затрагивает, следовательно, другие органы и ткани вовлеченные в прибавку массы тела.

Далее, в US20100061967A1 также предлагается использование композиции бактерий для регулирования экспрессии пептидов, регулирующих механизм насыщения, причем это регулирование происходит исключительным образом в желудочно-кишечном тракте.

В международной заявке WO2009153662 описано использование композиции на основе Bifidobacteriesa и Lactobacilles при лечении диабета, то есть болезни, взятой из перечня индикаторов, связанных с метаболическим синдромом, индуцированным избыточной массой тела или ожирением, причем исключительно на основе способности, которой обладают эти микроорганизмы для уменьшения воспаления периферических тканей, но тем не менее без воздействия на центральную нервную систему и, следовательно, например, на механизм центрального регулирования насыщения.

Кроме того, в US20100150890 описано использование бактериальных пробиотиков в композиции для стимулирования функции симпатической нервной системы с целью стимулирования метаболизма и, следовательно, расходования энергии. Тем не менее, было показано, что симпатический тонус является активным также у некоторых людей, страдающих ожирением, и, таким образом, его активация не образует надежную альтернативу в рамках воздействия на избыточную массу тела и ожирения.

В US20100111915 показано общее использование композиции бактериальных пробиотиков в качестве альтернативы в рамках профилактики ожирения у детей. Согласно US20100111915 это использование основано на бифидогенных эффектах пробиотиков, хотя в этом документе не описано какое-либо реальное обоснование, которое позволяет установить, что увеличение числа бифидобактерий в кишечнике могло бы лежать в основе этого действия, предупреждающего появление ожирения у детей.

В US20050112112 предложено использование композиции микроорганизмов, генерирующих сахаридные полимеры, не расщепляемые человеком, исходя из моносахаридов и дисахаридов, содержащихся в желудочно-кишечном тракте, фактически уменьшая таким образом усвоение сахаров в организме.

Наконец, в JP10306028 описано, кроме того, действие, ингибирующее абсорбцию организмом холестерина, причем за счет использования бифидобактерий, комбинированных с хитозаном.

К сожалению, использование композиций предшествующего уровня техники, хотя оно и позволяет уменьшать избыточную массу тела или ожирение и уменьшать симптомы, связанные с метаболическим синдромом (в данном случае говорят, например, о ремиссии), оно не обеспечивает долговременное, более 3-5 лет (в данном случае говорят, например, об излечении), поддержание массы тела на уровне требуемой нормы (то есть соответствующей, например, значению IMC в интервале от 20 до 25).

В рамках настоящего изобретения следует отличать ремиссию от излечения. Говорят, что человек находится в состоянии ремиссии, если во время медицинского обследования (определение массы тела, окружности талии и т.д.) больше не выявляется избыточная масса тела. При этом об излечении говорят только после некоторого дополнительного срока, который изменяется в зависимости от типа избыточной массы тела. В общем случае, когда ремиссия длится в течение 3 или 5 лет, считается, что имеет место излечение.

Целью настоящего изобретения является смягчение недостатка предшествующего уровня техники за счет разработки композиции, соответствующей описанной ранее и отличающейся тем, что указанный ранее пробиотик представляет собой Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149.

Штамм по настоящему изобретению депонирован под номером LMG P-28149 в BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) и LMG (Laboratorium voor Microbiologie - Bacteriënverzameling) 27 января 2014 года согласно Будапештскому договору.

В рамках настоящего изобретения композиция предпочтительно содержит пробиотик Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 в активном состоянии. Под выражением "в активном состоянии" понимают концентрацию живых бактерий в композиции в интервале от 10⁸ до 10¹³ КОЕ на грамм композиции.

В рамках настоящего изобретения было замечено, что этот особый штамм пробиотика оказывает значительное положительное действие на насыщение, а также на восстановление кишечной микробиоты, связанной с ограничением прибавки массы тела.

В частности, была замечена роль присутствия Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 в повторном заселении кишечного тракта бактерией Akkermansia muciniphila, то есть бактерией, которая известна из-за своей роли при профилактике ожирения у человека и популяция которой сильно уменьшена у людей, имеющих избыточную массу тела или страдающих ожирением.

Кроме того, в то же время неожиданно было замечено противовоспалительное и иммунорегуляторное действие штамма по настоящему изобретению, которое ассоциировано с восстановлением экспрессии транскрипционного фактора PPARγ, вовлеченного в функцию регуляторных T-лимфоцитов белой жировой ткани.

Таким образом, композиция по настоящему изобретению предпочтительно обеспечивает лечебное или профилактическое действие в отношении разрегулирования кишечной микробиоты и воспалительных заболеваний, связанных с этим разрегулированием у человека с избыточной массой тела.

Следовательно, настоящая композиция нацелена преимущественно на лечебное или профилактическое действие на метаболический синдром, связанный с избыточной массой тела у человека.

При этом согласно настоящему изобретению было доказано, что композиция на основе Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 предпочтительно вызывает в организме следующие эффекты, которые сопровождаются уменьшением прибавки массы тела в режиме с высокой квотой жиров, предпочтительно в течение и/или после курса диеты, или стабилизацией массы тела: улучшение чувствительности к инсулину; уменьшение развития абдоминальной и подкожной жировой массы; уменьшение размера адипоцитов; уменьшение клеточной инфильтрации белых жировых тканей, в частности, провоспалительными макрофагами; уменьшение воспалительных маркеров; ограничение стеатоза печени; и ограничение или уменьшение содержания "плохого" холестерина.

Как можно констатировать, композиция по настоящему изобретению, содержащая по меньшей мере пробиотик Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149, действует на различные факторы, связанные с избыточной массой тела.

В рамках настоящего изобретения также было доказано профилактическое и лечебное действие на прибавку массы тела, а также действие на метаболический синдром у человека с избыточной массой тела не только специфического штамма Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 в активном или пассивном состоянии, но и соединений, происходящих из этого штамма.

В этом контексте композиция по настоящему изобретению может содержать также по меньшей мере один пробиотический элемент или комбинацию по меньшей мере двух пробиотических элементов, причем каждый элемент происходит из Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и выбран из группы, которую составляют компоненты клеточной стенки, клеточные органеллы, нуклеиновые кислоты, компоненты клеточной мембраны и клеточные метаболиты.

В порядке пояснения и неограничительным образом компоненты клеточной стенки выбирают из группы, которую составляют пептидогликаны, белки, полисахариды, тейхоевая кислота или комбинации этих соединений.

В порядке пояснения и неограничительным образом метаболиты выбирают из группы, которую составляют органические кислоты, неорганические кислоты, белки, пептиды, аминокислоты, ферменты, липиды, углеводы, гликолипиды, гликопротеины, витамины, соли, металлы или комбинации этих соединений.

В предпочтительном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит бутират или по меньшей мере одно из его производных соединений и/или пропионат или по меньшей мере одно из его производных соединений, причем индуцированию бутирата и/или пропионата благоприятствует Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149.

В случае необходимости композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один дополнительный пробиотик, причем дополнительный пробиотик выбирают из группы, которую составляют следующие пробиотики: Archaea, Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Fusobacteria, Metanobacteria, Spirochaetes, Fibrobacters, Deferribacteres, Deinococcus, Thermus, Cyanobacteria, Methanobrevibacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus, Subdolingranulum, Dorea, Bulleidia, Anaerofustis, Gemella, Roseburia, Catenibacterium, Dialister, Anaerotruncus, Staphylococcus, Micrococcus, Propionibacterium, Enterobacteriaceae (непатогенный вид), Faecalibacterium, Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Eubacterium, Akkermansia, Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium или комбинации этих пробиотиков.

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно может содержать также по меньшей мере штамм гриба и/или дрожжей, причем указанный штамм выбирают из группы, которую составляют Saccharomyces, Candida, Pichia, Debaryomyces, Torulopsis, Aspergillus, Rhizopus, Mucor и Penicillium.

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит наполнитель для инкапсулирования пробиотика, в котором инкапсулируют Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и в случае необходимости по меньшей мере один дополнительный пробиотик.

Указанные гриб и/или дрожжи преимущественно также инкапсулируют в наполнителе.

Альтернативным образом, наполнитель для инкапсулирования содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, которую составляют альгинат, хитозан, пектин, пуллулан, желатин, каррагинан, агаровый гель или комбинации этих веществ.

По меньшей мере одно указанное вещество предпочтительно представляет собой гидроколлоид.

Композиция по настоящему изобретению преимущественно содержит по меньшей мере один пищевой компонент, выбранный из группы, которую составляют моносахарид, полисахарид, аминокислота, пептид, белок, витамин, экстракт дрожжей, соль галогена, щелочного металла или щелочно-земельного металла, антиоксидант, глицерин, ацетат цинка, хлорид цинка, лактат цинка, аскорбиновая кислота, лимонная кислота, растительное масло, молочный жир или комбинации этих веществ.

В предпочтительном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой симбиотическую композицию, содержащую по меньшей мере один пребиотик.

По меньшей мере один пребиотик неограничительным образом предпочтительно выбирают из группы, которую составляют олигосахариды, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, ксилоолигосахариды, инулин или его производные соединения, лактулоза или ее производные соединения, маннаноолигосахариды или комбинации этих соединений.

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит первое кишечнорастворимое покрытие, покрывающее Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и в случае необходимости по меньшей мере один дополнительный пробиотик. В частности, первое кишечнорастворимое покрытие выбирают из группы, которую составляют этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, полимеры (такие как, например, Eudragit^®) или комбинации этих веществ.

Альтернативным образом, композиция содержит, кроме того, второе внешнее покрытие, выбранное из группы, которую составляют альгинат, хитозан, пектин, пуллулан, желатин, каррагинан, агаровый гель, целлюлоза, гемицеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или комбинации этих веществ.

В другом возможном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит один или несколько биологически совместимых эксципиентов.

Композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для оказания лечебного или профилактического действия на прибавку избыточной массы тела (то есть на прибавку, существенно превосходящую прибавку массы тела, сопровождающую беременность) у беременных женщин или у родивших женщин, или у мужчин, имеющих или имевших синдром кувад.

Согласно настоящему изобретению композиция может находиться в форме пищевой композиции, пищевого продукта на основе композиции или также пищевой добавки, содержащей Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 предпочтительно в активном состоянии.

Под выражением "пищевая композиция" в смысле настоящего изобретения следует понимать композицию, которая обычно имеется на рынке продуктов питания (например, легкая закуска, готовые блюда, напитки и т.д.).

Под выражением "пищевая добавка" в смысле настоящего изобретения следует понимать пищевые продукты, назначение которых состоит в предоставлении дополнения к питательным веществам или веществам, обладающим питательными свойствами и/или физиологическим действием.

Согласно настоящему изобретению может быть предусмотрена композиция для применения и приема пероральным или сублингвальным путем, а также респираторным, в частности назальным или бронхиальным, или также ректальным путем.

Композиция может представлять собой также жидкую композицию на основе по меньшей мере одного происходящего из пробиотика элемента, приемлемую для инъекций и предназначенную для подкожных инъекций.

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно может быть расфасована в виде таблеток, глобул, желатиновых капсул, гранул, порошков, флюидов, жидкостей, кремов или спреев.

Согласно настоящему изобретению композиция может быть использована для оказания лечебного или профилактического действия на прибавку избыточной массы тела (то есть на прибавку, существенно превосходящую прибавку массы тела, сопровождающую беременность) у беременных женщин или у родивших женщин, или у мужчин, имеющих или имевших синдром кувад.

Другие варианты осуществления и применения терапевтической композиции по настоящему изобретению указаны в приложенной формуле изобретения.

Настоящее изобретение относится также к нетерапевтическому косметическому применению композиции, содержащей по меньшей мере один пробиотик, в отношении человека, имеющего или имевшего избыточную массу тела, причем пробиотик представляет собой Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149.

Композиция для нетерапевтического косметического применения предпочтительно содержит по меньшей мере один дополнительный пробиотик, выбранный из группы, которую составляют следующие пробиотики: Archaea, Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Fusobacteria, Metanobacteria, Spirochaetes, Fibrobacters, Deferribacteres, Deinococcus, Thermus, Cyanobacteria, Methanobrevibacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus, Subdolingranulum, Dorea, Bulleidia, Anaerofustis, Gemella, Roseburia, Catenibacterium, Dialister, Anaerotruncus, Staphylococcus, Micrococcus, Propionibacterium, Enterobacteriaceae (непатогенный вид), Faecalibacterium, Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Eubacterium, Akkermansia, Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium или комбинации этих пробиотиков.

Композиция для нетерапевтического косметического применения преимущественно содержит штамм гриба и/или дрожжей, выбранный из группы, которую составляют Saccharomyces, Candida, Pichia, Debaryomyces, Torulopsis, Aspergillus, Rhizopus, Mucor и Penicillium.

В композиции для нетерапевтического косметического применения Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и в случае необходимости по меньшей мере один дополнительный пробиотик предпочтительно инкапсулированы в наполнителе для инкапсулирования.

В композиции для нетерапевтического косметического применения наполнитель для инкапсулирования преимущественно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, которую составляют альгинат, хитозан, пектин, пуллулан, желатин, каррагинан, агаровый гель или комбинации этих веществ.

Композиция для нетерапевтического косметического применения преимущественно содержит по меньшей мере один пищевой компонент, выбранный из группы, которую составляют моносахарид, полисахарид, аминокислота, пептид, белок, витамин, экстракт дрожжей, соль галогена, щелочного металла или щелочно-земельного металла, антиоксидант, глицерин, ацетат цинка, хлорид цинка, лактат цинка, аскорбиновая кислота, лимонная кислота, растительное масло, молочный жир или комбинации этих веществ.

Композиция для нетерапевтического косметического применения предпочтительно содержит, кроме того, по меньшей мере один пребиотик, образуя таким образом симбиотическую композицию.

Композиция для нетерапевтического косметического применения предпочтительно содержит первое кишечнорастворимое покрытие, покрывающее Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и в случае необходимости по меньшей мере один дополнительный пробиотик.

В композиции для нетерапевтического косметического применения первое кишечнорастворимое покрытие преимущественно выбирают из группы, которую составляют этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, Eudragit^® или комбинации этих веществ.

Композиция для нетерапевтического косметического применения предпочтительно содержит второе внешнее покрытие, выбранное из группы, которую составляют альгинат, хитозан, пектин, пуллулан, желатин, каррагинан, агаровый гель, целлюлоза, гемицеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или комбинации этих веществ.

Композиция для нетерапевтического косметического применения преимущественно содержит, кроме того, один или несколько биологически совместимых эксципиентов.

Другие варианты применения композиции для нетерапевтического косметического применения по настоящему изобретению указаны в приложенной формуле изобретения.

Настоящее изобретение относится также к культуральной среде пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149, содержащей по меньшей мере один источник белка и по меньшей мере один источник углеводов, причем культуральная среда отличается тем, что она содержит, кроме того, глутатион.

Глутатион представляет собой трипептид, участвующий в поддержании редокс-потенциала цитоплазмы клеток и в некотором числе реакций обезвреживания и удаления химически активных соединений кислорода.

Неожиданным образом в рамках настоящего изобретения было показано, что такая культуральная среда, содержащая глутатион, оптимизирует эффективность штамма № LMG P-28149 пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis, у которого было замечено лечебное или профилактическое действие на прибавку массы тела у человека, имеющего или имевшего избыточную массу тела.

Культуральная среда согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит глутатион в концентрации от 20 до 30 г/л культуральной среды.

Согласно настоящему изобретению источник белка для культуральной среды преимущественно выбирают из группы, которую составляют пептон молочной сыворотки, пептон казеина, растительный или бактериальный пептон и их комбинации.

Согласно настоящему изобретению источник углеводов культуральной среды предпочтительно содержит по меньшей мере один вид сахара или смесь сахаров, выбранных из группы, которую составляют лактоза, глюкоза, галактоза, фруктоза, мальтодекстрин, крахмал, трегалоза, мальтотриоза и комбинации этих соединений.

Согласно настоящему изобретению культуральная среда предпочтительно содержит, кроме того, по меньшей мере один вид аминосахара, например глюкозамин или галактозамин.

Согласно настоящему изобретению культуральная среда предпочтительно содержит, кроме того, по меньшей мере один вид экстракта дрожжей.

Согласно настоящему изобретению культуральная среда предпочтительно содержит, кроме того, по меньшей мере один вид яичного экстракта.

Другие варианты культуральной среды согласно настоящему изобретению указаны в приложенной формуле изобретения.

Настоящее изобретение относится также к способу получения пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 ферментацией, причем указанный способ включает по меньшей мере одну стадию культивирования пробиотика в культуральной среде согласно настоящему изобретению.

Другие варианты способа согласно настоящему изобретению указаны в приложенной формуле изобретения.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения могут быть выяснены из описания, приведенного далее в неограничительном порядке со ссылкой на описанные далее примеры.

Эти примеры включают результаты, полученные на мышах и дополненные результатами, полученными in vitro, исходя из иммунных клеток, выделенных из крови человека.

Хотя результаты испытаний, приведенные далее в примерах 1-4, были получены на мышах, разумеется, подобные результаты ожидаются и в случае человека.

В частности, в рамках настоящего изобретения было показано специфическое действие штамма на прибавку массы тела у млекопитающего, в частности у грызуна.

На практике, прием штамма LMG P-28149 пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis индивидуально или в комбинации по меньшей мере с одним другим пробиотиком индуцирует уменьшение прибавки массы тела вместе с улучшением воспалительных и метаболических показателей у млекопитающего, в частности у грызуна, с избыточной массой тела, включая резистентность к инсулину.

В частности, в рамках настоящего изобретения были показаны метаболические защитные эффекты композиции на основе штамма пробиотика согласно настоящему изобретению, которые в то же время связаны с восстановлением в среде жировых тканей экспрессии PPARγ и реорганизацией клеток, и защитный эффект против стеатоза печени.

Композиция на основе штамма по настоящему изобретению позволяет также регулировать экспрессию рецепторов, связанных с транспортом жирных кислот, и, в частности, восстановление рецепторов, сопряженных с G-белком (GPR41 и GPR43) и вовлеченных в транспорт жирных кислот с короткими цепями (AGCC), которые являются важными факторами механизма насыщения, индуцированного приемом питательных веществ.

Кроме того, было показано положительное действие штамма по настоящему изобретению на размер адипоцитов и на продуцирование провоспалительных цитокинов и хемокинов (MCP-1, IL-6, TNF-альфа и т.д.), причем некоторые из них непосредственно лежат в основе резистентности к инсулину.

Было замечено, что штамм по настоящему изобретению позволяет в то же время восстанавливать липидный профиль и метаболизм глюкозы у млекопитающего, предрасположенного к риску развития болезней, непосредственно связанных с метаболическим синдромом, таких как дислипедимия (и, следовательно, диабет II типа) и гипергликемия.

Наконец, была показана связь между приемом штамма пробиотика согласно настоящему изобретению и повторным заселением кишечного тракта бактерией Akkermansia, то есть бактерией, которая известна из-за своей роли при профилактике ожирения у человека и имеет сильно уменьшенную популяцию у людей, имеющих избыточную массу тела или страдающих ожирением.

На фиг. 1 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Ls33 на (A) изменение прибавки массы тела (в%), (B) толерантность к глюкозе (GT), (C) массу (вес) жировой ткани придатка яичка (EWAT) и (D) массу (вес) подкожной жировой ткани (SCWAT). Результаты выражены в виде среднего значения (для группы из 10-15 мышей) ±среднее квадратичное отклонение (SEM). **p < 0,01; ***p < 0,001. * соответствует сравнению режима с повышенной квотой липидов (HFD) относительно контрольного режима (LFD) с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима).

На фиг. 2 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Mix на (A) изменение прибавки массы тела (в%), (B) суммарное потребление корма (в г/день/мышь), (C) толерантность к инсулину (IT) и (D) толерантность к глюкозе (GT). Результаты выражены в виде среднего значения (для группы из 5-14 мышей) ±среднее квадратичное отклонение (SEM). **p < 0,01; ***p < 0,001; ^#p < 0,05; ^##p > 0,01; ^###p < 0,001. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно солевого фосфатного буферного раствора (PBS) с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков согласно настоящему изобретению).

На фиг. 3 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Mix на (A) массу (вес) EWAT, (B) массу (вес) SCWAT, (C) количество лептина в крови (нг/мл), (D) количество адипонектина в крови (мкг/мл), (E) гистологию EWAT (репрезентативные срезы для каждой из экспериментальных групп) и (F) распределение размеров адипоцитов в EWAT. Результаты выражены в виде среднего значения (для группы из 10-15 мышей) ±среднее квадратичное отклонение (SEM). **p < 0,01; ***p < 0,001; ^#p < 0,05; ^##p < 0,01; ^###p < 0,001. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно PBS с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков согласно настоящему изобретению).

На фиг. 4 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Mix на (A) клеточный состав EWAT (анализ экспрессии специфических генов моноцитов/макрофагов (F4/80, CD68, CD11b, CD11c), регуляторных T-лимфоцитов (FoxP3) и химиокина MCP-1), (B) присутствие макрофагов в EWAT (специфическая иммунофлуоресцентная маркировка F4/80 и количественное определение относительно интегральной плотности [IntDen]), (C) воспаление EWAT (анализ экспрессии генов провоспалительных цитокинов Tnfα, IL-1α, IL-6 и IL-17) и (D) экспрессию PPAR-гамма (PPARγ) на уровне информационной РНК (слева, экспрессия генов) и белка (в центре и справа, вестерн-блот и количественное определение [в произвольных единицах A.U.]). Результаты выражены в виде среднего значения (для группы из 5-14 мышей) ±среднее квадратичное отклонение (SEM). **p < 0,01; ***p < 0,001; ^##p < 0,01; ^###p < 0,001. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно PBS с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков).

На фиг. 5 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Mix на (A) факторы, вовлеченные в метаболизм липидов (анализ экспрессии генов FABP1, APO CII и CD36), (B) рецепторы жирных кислот с короткими цепями (AGCC или SCFA по-английски, анализ экспрессии генов GPR41 и GPR43). Результаты выражены в виде среднего значения (для группы из 5-14 мышей) ±среднее квадратичное отклонение (SEM). **p < 0,01; ***p < 0,001; ^##p < 0,01; ^###p < 0,001. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно PBS с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков).

На фиг. 5C показан общий уровень продуцирования AGCC (SCFA) (слева) и пропорциональные уровни ацетата, бутирата и пропионата (справа) после инкубации в течение 24 и 48 ч со смесью пробиотика Mix в модели, имитирующей экосистему кишечника (SHIME), in vitro. *** сравнение в момент времени 0.

На фиг. 6 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Mix на (A) состав кишечной микробиоты и, в частности, на популяцию Bifidobacteria и Akkermansia muciniphila. Вид Bifidobacterium, детектированный у мышей HFD, получавших или не получавших Mix, и определяли анализом TGGE для 5 репрезентативных мышей из групп HFD-PBS и HFD-Mix. Маркеры M1 или M2 соответствуют смесям указанных штаммов. *p < 0,05; **p < 0,01; ^#p < 0,05; ^##p < 0,01. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно PBS с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков согласно настоящему изобретению).

На фиг. 7 показано в ходе развития избыточной массы тела и последующего ожирения у мышей действие Mix на (A) массу (вес) поджелудочной железы, печени и селезенки, (B) накопление липидных капелек (стеатоз, см. репрезентативные гистологические срезы для каждой из экспериментальных групп) и (C) различные маркеры воспаления или маркеры, вовлеченные в липидный метаболизм или ответную реакцию на инсулин (анализ экспрессии генов mcp-1, IL-6, TNFα, IL-10, IL-17, srebp-1c, APOCII Fabp1 и IRS2). Результаты выражены в виде среднего значения (для группы из 5-14 мышей) ±среднее квадратичное отклонение (SEM). **p < 0,01; ***p < 0,001; ^##p < 0,01; ^###p < 0,001; ^####p > 0,0001. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно PBS с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков согласно настоящему изобретению).

На фиг. 8a и 8b показано влияние пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 по настоящему изобретению на прибавку массы тела с течением времени в зависимости от того, был ли пробиотик культивирован (фиг. 8a) или не был культивирован (фиг. 8b) в культуральной среде согласно настоящему изобретению. LFD=режим с низкой квотой жира; LFD=режим с высокой квотой жира; HFD B. lactis=режим с высокой квотой жира в сочетании с приемом композиции по настоящему изобретению в случае культивирования пробиотика в присутствии глутатиона (фиг. 8a) или в отсутствие глутатиона (фиг. 8b).

Описанная далее методика экспериментов была использована для получения результатов in vivo, обсужденных в примерах 1-4, приведенных далее.

Методика экспериментов in vivo

Мыши, штаммы бактерий и режимы

Испытания осуществляли на мышах-самцах C57BL/6J в возрасте 5 недель на начало эксперимента.

Штамм Ls33 Lactobacillus L. salivarius был поставлен компанией "Danisco" (Мэдисон, WI, США).

Смесь пробиотиков (обозначенная как Mix в приведенных далее примерах) содержит два разных штамма: штамм L. rhamnosus LMG S-28148 и штамм Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 в соотношении по КОЕ (колониеобразующие единицы) 1:1 (всего 10⁹ КОЕ). Режимы, установленные для мышей, отличались в первом режиме низкой квотой жиров (LFD: D12450B; 10% килокалорий, поступающих с жирами) и во втором режиме высокой квотой жиров (HFD: D12492, 60% килокалорий, поступающих с жирами). Режимы были предоставлены компанией "Research Diet".

Методика эксперимента с животными

В течение 5 последовательных дней в неделю каждая мышь получала при пероральном введении 30 мкл Ls33-10⁹ КОЕ (колониеобразующие единицы или число колониеобразующих единиц, содержащихся в оральной композиции) в стерилизованной воде (H₂O) (группа Ls33-H₂O), стерилизованную воду (группа H₂O) или смесь пробиотиков (группа Mix; 5·10⁸ КОЕ по каждому штамму) в солевом фосфатном буферном растворе (PBS) (группа Mix-PBS или группа PBS).

После курса в течение недели мыши, которым вводили Ls33, воду, Mix или PBS, были случайным образом отнесены к режиму LFD (n=5 в группе) или HFD (n=15 в группе). Массу тела и потребление корма регистрировали еженедельно.

Во время забивания отбирали кровь, белые жировые ткани придатков яичек (EWAT) и подкожных отложений (SCWAT), печень, селезенку, тонкий кишечник и поджелудочную железу.

Испытания на толерантность к инсулину и глюкозе

Испытания на толерантность к глюкозе (GTT) и инсулину (ITT) осуществляли после соблюдения режима в течение 12 и 14 недель соответственно. Животным не давали корм в течение 6 часов перед внутрибрюшинным введением (IP) глюкозы (D-глюкоза, 1 г/кг массы тела) (GTT) или инсулина (0,75 МЕ/кг массы тела) (ITT). Содержание глюкозы в крови определяли автоматическим глюкометром, реализуемым в торговой сети (например, "ACCU-CHEK^® performa"), в пробах крови, отбираемых из хвоста перед инъекцией глюкозы (GTT) или инсулина (ITT) и в разное время после инъекции глюкозы (GTT) или инсулина (ITT).

Анализы крови

Плазматическое содержание лептина, адипонектина, MCP-1 и инсулина определяли, используя коммерчески реализуемые наборы ELISA. Содержание неэтерифицированных жирных кислот (NEFA), триглицеридов, глицерина, холестерина HDL и холестерина LDL определяли, используя аналитические наборы, доступные в продаже (например, набор Abcam, разработанный в Кембридже, Великобритания).

Гистологические и иммуногистохимические анализы

Образцы печени и белых жировых тканей (EWAT) фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида, затем покрывали парафином, готовили срезы и на лезвии окрашивали гематоксилинэозином (H&E). Морфометрический анализ белых жировых тканей (EWAT) по меньшей мере по 10 полям (что соответствует приблизительно 100 адипоцитов) на срез осуществляли, используя программу техники получения изображений "Image J" (NIH image, National Center for Biotechnology Information).

Анализ экспрессии генов

Осуществляли экстракцию общей РНК фрагментов белых жировых тканей, печени и кишечника (по методике, известной специалистам в данной области техники) для последующей ретротранскрипции (каждую из категорий указанных тканей ретротранскрибировали в количестве 1 мкг). Количественную ПЦР (Polymerase Chain Reaction (полимеразная цепная реакция)) в режиме реального времени (RT-qPCR) осуществляли согласно методике, известный специалистам в данной области техники.

Статистический анализ

Результаты выражены в виде среднего значения±среднее квадратичное отклонение (SEM). Статистический анализ был осуществлен с использованием проверки по критерию Крускала-Уоллиса с последующей проверкой по U-критерию Манна-Уитни. Различия между экспериментальными группами считаются статистически значимыми в случае, когда значение p составляет меньше 0,05.

Описанная далее методика экспериментов была использована для получения результатов in vitro, обсужденных в примерах 5 и 6.

Методика экспериментов in vitro

Имитатор микробной экосистемы человека - модель SHIME

Реактор SHIME, имитирующий желудочно-кишечный тракт человека, был отрегулирован согласно процедуре, хорошо известной специалистам в данной области техники.

В реактор вводили Mix и определяли продуцирование жирных кислот с короткими цепями (AGCC или SCFA по-английски) в моменты времени t=0, t=24 ч и t=48 ч при инкубации при 37°C в анаэробной атмосфере.

Оценка противовоспалительного действия штамма Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 на клетки крови человека

Свежую кровь человека, полученную от четырех здоровых доноров, разбавляли в соотношении 1:1 раствором PBS-Ca (GIBCO), наносили на слой фиколла (GIBCO) и центрифугировали при 400 g в течение 30 минут при 20°C.

Одноядерные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из крови после центрифугирования и суспендировали в конечном объеме 50 мл раствора PBS-Ca с последующей трехкратной промывкой при 750 g в течение 10 минут при 20°C. Затем PBMC ресуспендировали в среде RPMI (GIBCO), дополненной 10% (об./об.) декомплементированной эмбриональной телячьей сыворотки (сыворотка, нагретая при 56°C в течение 30 минут), 1% (масс./об.) L-глутамина (GIBCO) и гентамицином (30 пг/мл) (GIBCO). Определяли число PBMC и регулировали их количество до 2·10⁶ клеток на мл. Препарат распределяли (по 1 мл) по культуральным планшетам на 24 лунки.

Пример 1. Ls33 в сравнении с Mix

Этим примером поясняется влияние Ls33 на развитие избыточной массы тела и ожирения у мышей.

На фиг. 1 для курса длительностью 15 недель в случае Ls33 или воды и режима кормления с низкой квотой жиров (LFD) или с высокой квотой жиров (HFD) показаны следующие индикаторы:

- (A) изменение прибавки массы тела, выраженное в процентах по отношению к массе, определенной в день j=0;

- (B) испытание на толерантность к глюкозе (GTT), осуществленное после соблюдения режима в течение 12 недель. Содержание глюкозы (в мг/дл) определяли у мышей непосредственно после воздержания от корма в течение 6 часов в моменты времени t (в мин), указанные на графике, после внутрибрюшинной инъекции (IP) глюкозы (соответствует моменту времени t=0);

- (C) масса (вес) жировой ткани придатка яичка (EWAT) (в г) после соблюдения режима в течение 15 недель (взвешивание при забивании);

- (D) масса (вес) подкожной жировой ткани (SCWAT) (в г) после соблюдения режима в течение 15 недель (взвешивание при забивании).

Как показывают результаты, представленные на этой фигуре, штамм Ls33, несмотря на его противовоспалительную активность, доказанную in vitro и в других патологических моделях (например, в случае интестинального воспаления), не оказывает никакого действия (положительного или отрицательного) на разные индикаторы от A до D.

В отличие от этого введение смеси Mix оказывает значительное защитное действие. Эти результаты показаны на фиг. 2.

На этой фигуре после воздействия в течение 17 недель смесью пробиотиков (Mix) или PBS при режиме с низкой квотой жиров (LFD) или с высокой квотой жиров (HFD) показаны соответствующие результаты:

- (A) изменение прибавки массы тела, выраженное в процентах по отношению к массе, определенной в день j=0;

- (B) суммарное потребление корма мышью в день (г/день/мышь);

- (C) испытание на толерантность к инсулину (ITT), осуществленное через 14 недель после начала соблюдения режима: содержание глюкозы в крови определяли после внутрибрюшинной инъекции (IP) инсулина. Результаты показывают нормализованные значения содержания (в% по отношению к содержанию глюкозы, определенному перед инъекцией) ±SEM и средние значения±SEM площади под кривой (AUC) для каждой нормализованной кривой содержания глюкозы после инъекции инсулина;

- (D) испытание на толерантность к глюкозе (GTT), осуществленное после соблюдения режима в течение 12 недель. После инъекции IP глюкозы у мышей определяли содержание глюкозы (в мг/дл) и рассчитывали значения AUC.

Для мышей из группы HFD-Mix была замечена прибавка массы тела менее значительная (прибавка 80,97%±4,96%), чем прибавка, полученная в группе HFD-PBS (прибавка 113,51%±4,89%) (см. фиг. 2A).

Как следует из фиг. 2B, у мышей из группы HFD, получавших смесь пробиотиков Mix, уменьшено суммарное потребление корма (Food intake (потребление корма), FI). Представляет интерес то обстоятельство, что полезные эффекты, отмеченные в отношении прибавки массы тела и индекса FI, после начала курса проявляются быстро (начиная с четвертой недели).

Введение смеси Mix улучшает гомеостаз глюкозы в группе HFD, о чем свидетельствует уменьшенное содержание глюкозы и инсулина согласно таблице 1, приведенной далее.

Таблица 1

Группы/ индикаторы	LFD-PBS	LFD-Mix	HFD-PBS	HFD-Mix
Глюкоза, мг/дл	180,4 ± 30,88	160,3 ± 28,96	231,67 ± 21,7*	198,43 ± 15##
Инсулин, нг/мл	0,72 ± 0,37	0,98 ± 0,24	2,96 ± 0,57*	1,57 ± 0,23#
NEFA, ммоль/л	0,85 ± 0,06	1,07 ± 0,07	1,06 ± 0,03	0,9 ± 0,08
Глицерин, ммоль/л	0,13 ± 0,06	0,24 ± 0,05	0,38 ± 0,1	0,34 ± 0,05
Триглицериды, ммоль/л	0,4 ± 0,009	0,46 ± 0,02	0,41 ± 0,03	0,41 ± 0,03
Холестерин, ммоль/л	1,35 ± 0,05	1,33 ± 0,05	1,94 ± 0,04***	1,72 ± 0,3###
HDL, ммоль/л	1,09 ± 0,04	1,07 ± 0,04	1,5 ± 0,01 ***	1,35 ± 0,02###
LDL, ммоль/л	0,25 ± 0,01	0,26 ± 0,01	0,45 ± 0,04***	0,36 ± 0,02###

Результаты, приведенные в этой таблице, выражены в виде среднего значения±среднее квадратичное отклонение (SEM) (соответствует группам из 5-154 мышей). *p < 0,05; ***p < 0,001; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. * соответствует сравнению режима HFD относительно режима LFD с идентичным вмешательством в содержание (определение эффекта режима). ^# соответствует сравнению Mix относительно PBS с идентичным режимом (определение эффекта действия пробиотика или смеси пробиотиков).

В то же время, как показано в таблице 1, хотя эффекты смеси Mix являются ограниченными в отношении содержания NEFA, глицерина и триглицеридов, она оказывает действие, понижающее содержание холестерина в крови, поскольку оно ассоциировано с уменьшением содержания общего холестерина и холестерина HDL.

Кроме того, индекс HOMA-IR ((содержание инсулина натощак/содержание глюкозы натощак)/22,5) значительно меньше у мышей из группы HDF-Mix по сравнению с контрольной группой (32,04±5,86 против 81,57±19,63; p < 0,01), что указывает на улучшенную чувствительность к инсулину, подтвержденную результатами испытания на толерантность к инсулину (см. фиг. 2C).

Аналогичным образом, мыши, получавшие Mix, более толерантны к инъекциям глюкозы (см. фиг. 2D).

Пример 2. Действие Mix на воспаление белых жировых тканей

На фиг. 3 показано действие Mix на:

- (A) массу (вес) EWAT (в г);

- (B) массу (вес) SCWAT (в г);

- (C) количество лептина в крови (в нг/мл), определенное способом ELISA (методика количественного иммуноферментного определения) в сыворотке мышей, предварительно не получавших корм в течение 6 часов;

- (D) количество адипонектина в крови (в мкг/мл), определенное способом в сыворотке мышей, предварительно не получавших корм в течение 6 часов;

- (E) гистологию жировых тканей придатков яичек (демонстрация срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и представляющих каждую из экспериментальных групп). Масштабная линейка соответствует 100 мкм. Стрелки черного цвета указывают на наличие клеточной инфильтрации; и

- (F) распределение размеров адипоцитов EWAT. Результаты представлены в виде долей адипоцитов в% по классам размеров (0-20 мкм, 20-40 и т.д.), в то время как на фиг. 7 показано действие Mix на:

- (A) массу (вес) поджелудочной железы, печени и селезенки (в г);

- (B) накопление липидных капелек (т.е. стеатоз) в печени (демонстрация срезов, окрашенных H&E и представляющих каждую из экспериментальных групп). Масштабная линейка соответствует 100 мкм; и

- (C) экспрессию в печени генов, кодирующих про- и противовоспалительные цитокины и рецепторы, вовлеченные в транспорт и метаболизм липидов.

По сравнению с контрольными группами HFD группа HFD-Mix отличается заметным уменьшением адипозных масс EWAT и SCWAT (см. фигуры 3A и 3B).

Заметное уменьшение масс (весов) поджелудочной железы, печени и селезенки наблюдается также у особей из группы HFD-Mix (см. фиг. 7A).

Кроме того, в то время как у мышей из контрольной группы HFD развился стеатоз печени, прием смеси пробиотиков Mix позволяет ограничивать содержание липидных капелек в тканях (см. фиг. 7B).

Согласованно с уменьшением массы белых жировых тканей содержание в крови лептина оказывается значительно более низким в группе HFD-Mix (см. фиг. 3C), тогда как содержание адипонектина проявляет тенденцию к более высоким значениям (см. фиг. 3D).

Гистологическое исследование жировых тканей придатков яичек показало более высокую плотность в мелких адипоцитах у мышей из группы HFD-Mix (см. фиг. 3E и 3F).

Следует заметить, что хотя у мышей контрольной группы жировые ткани инфильтрованы заметным образом клетками, окруженными адипоцитами (отмечены стрелкой на фиг. 3E), образцы тканей, отобранных у мышей из группы, получавших пробиотический Mix, в меньшей степени отличаются такой инфильтрацией.

Во время развития ожирения макрофаги поступают в белые жировые ткани, тогда как регуляторные T-клетки FoxP3+CD4+ уходят из этих тканей.

На фиг. 4 в случае мышей с избыточной массой тела показано действие Mix на воспаление жировых тканей.

Как показано на фиг. 4A, по сравнению с контрольными тканями LFD уровни экспрессии нескольких специфических маркеров моноцитов/макрофагов (F4/80, Cd68, Cd11b и Cd11c) увеличены у мышей из группы HFD, тогда как относительное содержание маркера Foxp3 уменьшено.

Введение смеси пробиотиков Mix в значительной степени уменьшает индуцируемую режимом HFD экспрессию маркеров моноцитов/макрофагов и увеличивает уровни экспрессии маркера Foxp3.

Влияние смеси Mix и, следовательно, штамма пробиотика согласно настоящему изобретению на поступление макрофагов в белые жировые ткани подкрепляется результатами, показанными на фиг. 4B.

Соответственно уменьшению поступления макрофагов с одновременным увеличением накопления противовоспалительных регуляторных T-лимфоцитов в этом примере показано, что жировые ткани придатков яичек у мышей, получавших смесь Mix, отличаются уровнем воспаления меньшим, чем в контрольных тканях, как то показывают уменьшенные уровни экспрессии специфических информационных РНК Il6, Tnfα, Il-1α и Il-17 (см. фиг. 4C).

Кроме того, показано, что курс на основе смеси Mix ограничивает уменьшение PPARγ (одновременно с уровнем информационной РНК и белка), индуцируемое режимом HFD (см. фиг. 4D).

Пример 3. Действие Mix на метаболизм липидов в тонком кишечнике и продуцирование жирных кислот с короткими цепями (AGCC/SCFA)

В этом примере показано, что уровни экспрессии генов (GPR41 и GPR43), ответственных за транспорт жирных кислот с короткими цепями (SCFA от Short-Chain Fatty Acids (жирные кислоты с короткими цепями)), уменьшены в тонком кишечнике мышей, находившихся в режиме HFD, что указывает на то, что в группе HFD AGCC в меньшей мере действуют положительно, так как они меньше детектируются, в то время как их содержание значительно увеличено у животных, получавших смесь Mix в режиме HFD (см. фиг. 5B).

Взаимным образом, введение Mix оказывает действие по ограничению увеличения генов, вовлеченных в липидный метаболизм, индуцируемый режимом с жирным кормом (см. фиг. 5A).

Пример 4. Действие Mix на микробиоту и уровень заселения бактерией Akkermansia muciniphila

Анализ некоторых бактерий микробиоты осуществляли посредством количественной ПЦР (qPCR), исходя из содержимого слепой кишки мышей, находившихся в условиях режима HFD с приемом или без приема Mix, а с другой стороны, мышей, находившихся в условиях режиме LFD с приемом или без приема Mix.

Результаты, представленные на фиг. 6, показывают изменение состава микробиоты мышей HFD-Mix, в частности, с восстановлением уровня заселения бактерией Akkermansia muciniphila у мышей, находившихся в условиях режима HFD и получавших штамм пробиотика или смесь пробиотиков согласно настоящему изобретению.

Пример 5. Действие Mix на продуцирование AGCC: применение модели SHIME

В этом примере была использована динамическая модель in vitro имитации кишечника, предназначенная для воспроизводства микробной экосистемы кишечника человека.

Как показывают результаты, полученные в этом моделировании (см. фиг. 5C), применение штамма № LMG P-28149 пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis обеспечивает увеличение, в срок 48 ч после введения, производство общих AGCC (общих SCFA), благоприятствуя продуцированию в кишечнике бутирата и пропионата, то есть двух метаболитов, которые благоприятствуют насыщению, индуцированному приемом питательных веществ у человека. Содержание бутирата и пропионата, продуцируемых в восходящей ободочной кишке, связанной с реактором SHIME до момента T0 и после моментов T24 ч и T48 ч инкубации смеси Mix согласно настоящему изобретению приведены в таблице 2. Эти данные выражены в ммоль/л±SED.

Таблица 2

Период/продукты	T0	T24 ч	T48 ч
Ацетат	3,53 ± 0,38	10,96 ± 0,91	3,10 ± 0,16
Пропионат	1,10 ± 0,03	3,87 ± 0,51	7,07 ± 0,16
Изобутират	0,00 ± 0,00	0,24 ± 0,05	1,30 ± 0,05
Бутират	0,69 ± 0,07	3,25 ± 0,27	12,27 ± 0,22
Изовалерат	0,11 ± 0,00	0,50 ± 0,05	2,44 ± 0,04
Изокапроат	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00
Капроат	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00
Итого	5,44 ± 0,33	18,84 ± 1,46	26,19 ± 0,36

Определение важности наличия глутатиона в культуральной среде штамма Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149

На фиг. 8a и 8b показано влияние пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 по настоящему изобретению на прибавку массы тела с течением времени в зависимости от того, был ли пробиотик культивирован (фиг. 8a) или не был культивирован (фиг. 8b) в культуральной среде согласно настоящему изобретению.

Как можно констатировать, сравнивая фигуры 8a и 8b и более предпочтительно кривые HFD B. lactis, в случае, когда режим с жирным кормом связан с приемом композиции по настоящему изобретению, в которой пробиотик Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 получен культивированием в культуральной среде, содержащей глутатион, с течением времени наблюдается значительное уменьшение прибавки массы (фиг. 8a) в отличие от случая приема композиции по настоящему изобретению, содержащей пробиотик, полученный культивированием в культуральной среде, не содержащей глутатион (фиг. 8b).

Разумеется, настоящее изобретение никоим образом не ограничивается описанными ранее вариантами осуществления и, конечно, в него могут быть внесены изменения без выхода за пределы приложенной формулы изобретения.

Перечень сокращений

AGCC (SCFA): жирная кислота с короткой цепью

EWAT: белые жировые ткани придатков яичек

GT(T): испытание на толерантность к глюкозе

HDL: липиды высокой плотности

H&E: гематоксилин и эозин

HFD: режим с высокой квотой жиров

IMC: индекс массы тела

(HOMA)-IR: (гомеостатическая модель) для оценивания резистентности к инсулину

IT(T): (испытание) на толерантность к глюкозе

(V)LDL: липид с (очень) низкой плотностью

LFD: режим с низкой квотой жиров

NEFA: неэтерифицированная жирная кислота

PBS: солевой фосфатный буферный раствор

PBMC: одноядерные клетки периферической крови

SCWAT: подкожные белые жировые ткани

SEM: среднее квадратичное отклонение

SHIME: имитатор микробной экосистемы кишечника человека

WAT: белые жировые ткани

Claims (16)

1. Композиция на основе по меньшей мере одного пробиотика для применения с целью оказания лечебного действия на прибавку массы тела у человека с избыточной массой тела и/или для профилактики прибавки массы тела у человека, имеющего или имевшего избыточную массу тела, отличающаяся тем, что указанный пробиотик представляет собой Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149, присутствующий в живом состоянии в концентрации от 10⁸ до 10¹³ КОЕ на грамм композиции.

2. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая Lactoba callus rhamnosus no. LMG S-28148.

3. Композиция по п. 1, в которой Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и в случае необходимости по меньшей мере один дополнительный пробиотик инкапсулированы в наполнителе для инкапсулирования.

4. Композиция по п. 3, в которой наполнитель для инкапсулирования содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, которую составляют альгинат, хитозан, пектин, пуллулан, желатин, каррагинан, агаровый гель или комбинации этих веществ.

5. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один пищевой компонент, выбранный из группы, которую составляют моносахарид, полисахарид, аминокислота, пептид, белок, витамин, экстракт дрожжей, соль галогена, щелочного металла или щелочно-земельного металла, антиоксидант, глицерин, ацетат цинка, хлорид цинка, лактат цинка, аскорбиновая кислота, лимонная кислота, растительное масло, молочный жир или комбинации этих веществ.

6. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один пребиотик, образуя таким образом симбиотическую композицию.

7. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая первое кишечнорастворимое покрытие, покрывающее Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149 и в случае необходимости по меньшей мере один дополнительный пробиотик.

8. Композиция по п. 7, в которой первое кишечнорастворимое покрытие выбрано из группы, которую составляют этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, Eudragit^® или комбинации этих веществ.

9. Композиция по п. 1, содержащая второе внешнее покрытие, выбранное из группы, которую составляют альгинат, хитозан, пектин, пуллулан, желатин, каррагинан, агаровый гель, целлюлоза, гемицеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или комбинации этих веществ.

10. Композиция по п. 1, содержащая также один или несколько биологически совместимых эксципиентов.

11. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композицию получают из культуральной среды, содержащей по меньшей мере один источник белка, по меньшей мере один источник углеводов и глутатион в концентрации от 20 до 30 г/л культуральной среды.

12. Культуральная среда для пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149, содержащая по меньшей мере один источник белка и по меньшей мере один источник углеводов, причем культуральная среда отличается тем, что она дополнительно содержит глутатион в концентрации от 20 до 30 г/л культуральной среды.

13. Культуральная среда по п. 12, отличающаяся тем, что источник углеводов содержит по меньшей мере один вид сахара или смесь сахаров, выбранных из группы, которую составляют лактоза, глюкоза, галактоза, фруктоза, мальтодекстрин, крахмал, трегалоза, мальтотриоза и комбинации этих соединений.

14. Культуральная среда по п. 12, отличающаяся тем, что она содержит также по меньшей мере один вид аминосахара, например глюкозамин или галактозамин.

15. Культуральная среда по п. 12, отличающаяся тем, что она содержит также по меньшей мере один вид экстракта дрожжей.

16. Способ получения ферментацией пробиотика Bifidobacterium animalis ssp. lactis № LMG P-28149, причем способ включает по меньшей мере одну стадию культивирования указанного пробиотика в культуральной среде по любому из пп. 12-15.

Images