RU2643297C2

RU2643297C2 - Калебин а при жировом гепатозе

Info

Publication number: RU2643297C2
Application number: RU2015126932A
Authority: RU
Inventors: Кальянам Нагабхушанам; Анджу Маджид; Мухаммед Маджид
Original assignee: Кальянам Нагабхушанам; Анджу Маджид; Мухаммед Маджид
Priority date: 2015-04-19
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2018-01-31
Also published as: SG10201503805XA; MY182000A; PT3085370T; PH12015000188A1; EP3085370B1; CA2893321A1; ES2702629T3; AU2015203157A1; EP3085370A1; KR20160124401A; TR201819806T4; RU2015126932A; KR101763474B1; CA2893321C; PH12015000188B1; PL3085370T3

Abstract

Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира (HFD). Применяют перорально калебин А в эффективной концентрации. Способ позволяет ослабить аккумуляцию триглицеридов, гепатоцеллюлярную баллонную дистрофию и воспалительную инфильтрацию и повысить эффективность лечения. 11 табл., 4 пр., 14 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка представляет собой заявку на патент с частичным продолжением одновременно находящейся на рассмотрении заявки на патент США 14274096, поданной 09 мая 2014 года, которая, в свою очередь, представляет собой заявку на патент с частичным продолжением заявки 13/347071, поданной 10 января 2012 года и получившей статус патента США №8933121 13 января 2015 года, которая, в свою очередь, представляет собой не предварительную заявку, поданную на основе предварительной заявки 61431147, поданной 10 января 2011 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение в целом относится к лекарственным средствам для управления ожирением. Более конкретно оно относится к потенциалу калебина А как средства против ожирения в отношении его способности вызывать липолиз в высокодифференцированных адипоцитах. Также раскрыта способность калебина А к ослаблению у млекопитающих жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ожирение является наиболее распространенным расстройством обмена веществ в промышленно развитых странах и становится все более серьезной проблемой в развивающихся странах. Его характеризуют как мировую эпидемию, и индивидуумы с избыточной массой тела и ожирением (ИМТ (индекс массы тела) 25 и выше) подвергаются повышенному риску различных хронических физических недомоганий и психологических проблем, таких как депрессия, расстройства пищевого поведения и низкая самооценка. Ожирение связано с различными заболеваниями, такими как сердечнососудистые заболевания, сахарный диабет, остеоартрит, обструктивное апноэ во сне и рак. WHO (Всемирная организация здравоохранения) рассматривает ожирение как одну из 10 основных причин предотвратимой смерти во всем мире.

При ожирении происходит увеличение массы жировой ткани вследствие образования новых жировых клеток (адипоцитов) в результате процесса адипогенеза и/или отложения повышенных количеств цитоплазматических триглицеридов в клетке. Жировая клетка развивается, во время того как продуцируемые внутри липидные капли сливаются в единую большую массу. В конечном итоге, вследствие усиленного адипогенеза и аккумуляции скоплений адипоцитов под дермой кожи образуется целлюлит.

Исследования адипогенеза продолжаются в надежде на то, что управление данным процессом у людей могло бы привести к снижению бремени ожирения и диабета. На молекулярном уровне при лечении ожирения несколько маркеров, таких как лептин, адипонектин, TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) и т.д., служили в качестве мишеней.

Несмотря на то, что для лечения данного расстройства доступны лекарственные средства, существует постоянная необходимость в безопасном естественном подходе, позволяющем помогать управлять ожирением и связанными с ним социально-экономическими последствиями, и ведется его поиск.

Известно, что калебин А защищает нейроны от β-амилоидного повреждения (Park S Y et al., J Nat Prod. 2002 September; 65(9): 1227-31), вызывает апоптоз и модулирует активность семейства МАРК (митоген-активируемые протеинкиназы) в клетках рака желудка человека, резистентных к лекарственным средствам (Li Y et al., Eur J. Pharmacol. 2008 Sep.4; 591(1-3): 252-8). Zeng Y et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 2007 June; 55(6):940-3) обсуждают два новых производных калебина, 4ʺ-(4ʺ'-гидроксифенил-3ʺ'-метокси)-2ʺ-оксо-3ʺ-бутенил-3-(4'-гидроксифенил)-пропеноат и 4ʺ-(4ʺ'-гидроксифенил)-2ʺ-оксо-3ʺ-бутенил-3-(4'-гидроксифенил-3ʺ-метокси)-пропеноат.

В настоящем изобретении раскрыты потенциал калебина А в отношении предупреждения аккумуляции жира во время терминальной дифференцировки адипоцитов (жировых клеток) и его применения в управлении ожирением. В настоящем изобретении раскрыт потенциал калебина А в отношении благоприятного модулирования биохимических маркеров, ассоциированных с ожирением. Примечательные биомодуляторные свойства калебина А включают ингибирование продуцирования лептина, усиление экспрессии адипонектина и ингибирование локального (адипоцит) и системного воспаления, вызванного следующими провоспалительными цитокинами: фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1 (IL-1β).

Соответственно, основная задача настоящего изобретения заключается в раскрытии потенциала калебина А в качестве средства против ожирения. Другая задача настоящего изобретения заключается в раскрытии способности калебина А к индуцированию липолиза в высокодифференцированных адипоцитах. Еще одна задача настоящего изобретения также заключается в раскрытии способности калебина А к ослаблению у млекопитающих жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира.

Изобретение осуществляет указанные выше задачи и обеспечивает дополнительные связанные с ними преимущества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении раскрыты потенциал калебина А в отношении ингибирования адипогенеза и его применения для управления ожирением. В настоящем изобретении раскрыт потенциал калебина А в отношении благоприятного модулирования биохимических маркеров, ассоциированных с ожирением у млекопитающих. Примечательные биомодуляторные свойства калебина А включают ингибирование продуцирования лептина, усиление экспрессии адипонектина и ингибирование локального (адипоцит) и системного воспаления, вызванного следующими провоспалительными цитокинами: фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1 (IL-1β). Как часть настоящего изобретения также раскрыта способность калебина А к стимуляции липолиза в полностью дифференцированных адипоцитах. Кроме того, в настоящем изобретении также раскрыта способность калебина А к ослаблению у млекопитающих жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего ниже более подробного описания, рассматриваемого вместе с сопровождающими графическими материалами, которые иллюстрируют в качестве примера принцип изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Патент или поданная заявка содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете. Копии данного патента или заявки на патент, публикация с цветным(и) графическим(и) материалом(ами) будут предоставлены ведомством по запросу и при оплате необходимой пошлины.

На Фиг. 1 показано графическое представление процента ингибирования адипогенеза под действием калебина А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл, исследованного способом окрашивания масляным красным О.

На Фиг. 2 показано графическое представление процента ингибирования продуцирования лептина в адипоцитах человека под действием калебина А в концентрациях 0,5,1,0 и 2,0 мкг/мл. Значение Р*: менее 0,01; **: менее 0,001.

На Фиг. 3 показано графическое представление процента усиления экспрессии адипонектина в адипоцитах человека под действием калебина А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Значение Р*: менее 0,01.

На Фиг. 4 и 5 показано графическое представление процента подавления экспрессии TNF-α (значение Р*: менее 0,01; **: менее 0,001) и экспрессии IL-6 (значение Р *: менее 0,01), соответственно, в адипоцитах человека под действием калебина А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл.

На Фиг. 6 показано графическое представление действия многократной дозы калебина А на экспрессию TNF-α и IL-1β в сыворотке от обработанных мышей Swiss Albino. Число животных =6 на группу, значение Р: * менее 0,01; ** менее 0,001, t-критерий Стьюдента.

На Фиг. 7 показано графическое представление действия многократной дозы калебина А на экспрессию IL-6 в сыворотке от обработанных мышей Swiss Albino. Число животных =6 на группу, значение Р: * менее 0,01; ** менее 0,001, t-критерий Стьюдента.

На Фиг. 8 показано, что калебин А ингибирует дифференцировку и адипогенез преадипоцитов 3T3-L1.

На Фиг. 9 (А) и (В) соответственно показаны фотографии и графическое представление воздействий пищевой добавки на массы тела экспериментальных групп мышей C57B L/6.

На Фиг. 10 (А), (В) и (С) показано действие добавки калебина А на относительные массы жировой ткани у мышей C57B L/6, которых кормили рационом с высоким содержанием жира (HFD).

На Фиг. 11 показано действие добавки калебина А на экспрессию лептина в сыворотке мышей C57B L/6.

На Фиг. 12 показано действие добавки калебина А на экспрессию адипонектина в сыворотке мышей C57B L/6.

На Фиг. 13 показаны гистологические срезы, окрашенные гематоксилином/эозином (г/э), и соответствующие графические представления способности калебина А (0,25% и 1%) к восстановлению размера адипоцитов в группе мышей HFD.

На Фиг. 14 показано воспаление, выраженное в печени группы HFD при (i) исследовании макроскопической морфологии, и (ii) воспаление с баллонной дистрофией и аккумуляция триглицеридов в гистологических срезах (г/э), и способность калебина А (0,25% и 1%) к уменьшению воспаления, баллонной дистрофии и содержания триглицеридов в печени. Те же результаты также представлены графически.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении раскрыты потенциал калебина А в отношении предупреждения аккумуляции жира во время терминальной дифференцировки адипоцитов (жировых клеток) и его применения для управления ожирением. В настоящем изобретении раскрыт потенциал калебина А в отношении благоприятного модулирования биохимических маркеров, ассоциированных с ожирением. Примечательные биомодуляторные свойства калебина А включают ингибирование продуцирования лептина, усиление экспрессии адипонектина и ингибирование локального (адипоцит) и системного воспаления, вызванного следующими провоспалительными цитокинами: фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1 (IL-1β).

В наиболее предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу ингибирования адипогенеза, причем указанный способ включает стадию приведения адипоцитов в контакт с эффективным количеством калебина А. Иными словами, настоящее изобретение относится к способу предупреждения накопления жира во время терминальной дифференцировки адипоцитов млекопитающих. (Фиг. 1 и 8).

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу подавления экспрессии лептина в адипоцитах, причем указанный способ включает стадию приведения адипоцитов в контакт с эффективным количеством калебина А (Фиг. 2).

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии адипонектина в адипоцитах, причем указанный способ включает стадию приведения адипоцитов в контакт с эффективным количеством калебина А (Фиг. 3).

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу подавления экспрессии провоспалительного цитокина TNF-α в адипоцитах, причем указанный способ включает стадию приведения адипоцитов в контакт с эффективным количеством калебина А (Фиг. 4).

В еще одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу подавления экспрессии провоспалительного цитокина интерлейкина-6 в адипоцитах, причем указанный способ включает стадию приведения адипоцитов в контакт с эффективным количеством калебина А (Фиг. 5).

В конкретном воплощении адипоциты, относящиеся к описанному выше, представляют собой адипоциты человека.

В еще одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу снижения вызванной ожирением системной экспрессии провоспалительных цитокинов у млекопитающих, причем указанный способ включает стадию введения эффективного количества калебина А субъекту, нуждающемуся в этом. В конкретных воплощениях провоспалительные цитокины, указанные в данном документе в данном параграфе, включают фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1β (IL-1β) [Фиг. 6 и 7].

В еще одних наиболее предпочтительных воплощениях настоящее изобретение относится к следующему:

1. Способ управления ожирением у млекопитающих с риском избыточной аккумуляции телесного жира, включающий стадию перорального введения указанным млекопитающим с пищей эффективных количеств калебина А, чтобы вызвать эффект ингибирования адипогенеза.

2. Применение калебина А в управлении ожирением у млекопитающих с риском избыточной аккумуляции телесного жира, включающее стадию перорального введения указанным млекопитающим с пищей эффективных количеств калебина А, чтобы вызвать эффект ингибирования адипогенеза.

3. Способ ингибирования адипогенеза у млекопитающих с риском избыточной аккумуляции телесного жира, включающий стадию перорального введения указанным млекопитающим с пищей эффективных количеств калебина А.

4. Способ снижения массы тела млекопитающих с ожирением, включающий стадию перорального введения указанным млекопитающим эффективных количеств калебина А.

5. Применение калебина А в способе для снижения массы тела млекопитающих с ожирением, включающее стадию перорального введения указанным млекопитающим эффективных количеств калебина А.

6. Способ усиления системной экспрессии адипонектина у млекопитающих с ожирением, включающий стадию перорального введения указанным млекопитающим с пищей эффективных количеств калебина А.

7. Способ, способствующий предупреждению, задержке начала и/или замедлению прогрессирования сахарного диабета типа II у млекопитающего с ожирением, включающий стадию перорального введения терапевтически эффективных количеств калебина А указанному млекопитающему, для достижения повышения уровней системной экспрессии адипонектина.

8. Способ лечения ожирения у млекопитающих, включающий стадию перорального введения указанным млекопитающим с пищей эффективных количеств калебина А, чтобы вызвать эффекты ингибирования адипогенеза, снижения массы тела и повышенной системной экспрессии адипонектина.

9. Способ стимуляции безжировой массы тела у млекопитающего, включающий стадию перорального введения указанным млекопитающим с пищей эффективных количеств калебина А, чтобы вызвать эффект увеличения безжировой массы тела посредством сдвига соотношения безжировой массы тела и жировой ткани в пользу безжировой массы тела.

В еще одном предпочтительном воплощении субъект представляет собой млекопитающее.

В еще одном предпочтительном воплощении субъект представляет собой человека.

Потенциальное терапевтическое значение калебина А в качестве молекулы против ожирения может быть понятно с помощью конкретных примеров, раскрытых ниже в данном документе.

Пример I

Острая пероральная токсичность калебина А

В Таблице I перечислены параметры, исследованные в отношении острой пероральной токсичности калебина А.

Результаты:

Смертность у мышей не наблюдали при введении вплоть до 2000 мг/кг перорально (р.о.) в течение наблюдения вплоть до двух недель.

Пример II

Окрашивание адипогенных культур масляным красным О и оценка лептина, адипонектина, TNF-α и IL-6 с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа)

Терминальная дифференцировка адипоцитов сопровождается аккумуляцией больших количеств липидов в больших цитоплазматических везикулах. Традиционным аналитическим способом оценки дифференцировки адипоцитов в культуре клеток является окрашивание красителем масляным красным О (ORO). ORO представляет собой жирорастворимый ярко-красный краситель, который является надежным индикатором дифференцировки адипоцитов (адипогенеза).

Принцип:

Масляный красный О (растворитель красный 27, Судан красный 5В, C.I. 26125 и C₂₆H₂₄N₄O) представляет собой лизохромный (жирорастворимый краситель) диазокраситель, используемый для окрашивания нейтральных триглицеридов и липидов на замороженных срезах и некоторых липопротеинов на парафиновых срезах. Он имеет вид красного порошка с максимумом поглощения при 518 (359) нм. Масляный красный О является одним из красителей, используемых для окрашивания Суданом. Подобные красители включают Судан III, Судан IV и Судан черный В. Окрашивание необходимо проводить на свежих срезах, поскольку спиртовая фиксация удаляет липиды. Масляный красный О в значительной степени заменил Судан III и Судан IV, поскольку он обеспечивает значительно более глубокий красный цвет, и поэтому окраску гораздо проще увидеть.

Масляный красный О является маслорастворимым красителем. Маслорастворимые красители проявляют более высокую растворимость красителя в липидных веществах в тканях/клетках, чем в обычных водно-спиртовых растворителях красителей. Следовательно, данный краситель будет глубоко окрашивать клетки.

Методика:

Клетки 3T3-L1 в количестве приблизительно 60×104 клеток высевают на 48-72 ч до получения 70-80% конфлюентности. Через 48 ч добавляют по 200 мкл свежеприготовленной AIM (среды для индуцирования адипогенеза). Спустя 72 ч в лунки добавляют 200 мкл АРМ (среды для прогрессирования адипогенеза) с тестируемыми соединениями в различных концентрациях. Клетки инкубируют в течение 48 ч в увлажненной атмосфере (37°С) 5% СО₂ и 95% воздуха. Супернатант собирают и хранят для оценки лептина, адипонектина, IL-6 и TNF-α с помощью ELISA. Клетки фиксируют путем добавления 100 мкл 10% формалина и проводят окрашивание ORO. OD (оптическую плотность) считывают при 492 нм в микропланшет-ридере. Результаты выражают в виде значений IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования), используя программное обеспечение Graphpad Prism.

Процент ингибирования адипогенеза рассчитывают следующим образом:

% ингибирования = С-Т/Т*100,

где С - поглощение масляного красного О в дифференцирующихся/недифференцированных клетках

Т - поглощение масляного красного О в дифференцирующихся/недифференцированных клетках, обработанных тестируемым соединением. Оценку лептина, адипонектина, IL-6 и TNF-α проводят в соответствии с руководством пользователя от R&D Systems.

ССЫЛКИ

1. Wu Z, Xie Y, Morrison R F, Bucher NLR, Farmer SR 1998. PPARγ induces the Insulin-dependent Glucose Transporter GLUT4 in the absence of C/ЕВРα during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes. J Clin Invest. 101: 22-32.

2. A pre-adipose 3T3 cell variant highly sensitive to adipogenic factors & to human growth hormone. L A Salazar-Olivo, F Castro-Munozledo & W Kuri-Harcuch. Department of Cell Biology, Centra de Investigation у de Estudios Avanzados del I.P.N., Mexico D.F., Mexico. Journal of Cell Science, 1995. Vol 108, Issue 5 2101-2107.

3. A Nuclear Receptor Atlas: 3T3-L1 Adipogenesis. Mingui Fu, Tingwan Sun, Angie L. Bookout, Micheal Downes, Ruth T. Yu, Ronald M. Evans and David J. Mangelsdorf. Molecular Endocrinology, 2005. 19 (10): 2437-2450.

4. ʺExpression of a Constitutively Active Akt Ser/Thr Kinase in 3T3-L1 Adipocytes Stimulates Glucose Uptake and Glucose Transporter 4 Translocation, Aimee D Kohn et al., J. Biol. Chem. 1996, 271: 31372-31378.

Результат:

На Фиг. 1 показан процент ингибирования адипогенеза, равный 32,43%, 38,59% и 35,8% соответственно под действием калебина А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл, исследованный способом окрашивания масляным красным О.

На Фиг. 2 показан процент ингибирования продуцирования лептина (34,92%, 41,04% и 39,48% соответственно) в адипоцитах человека калебином А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Значимость действия калебина А на ингибирование продуцирования лептина в адипоцитах человека и корреляция с управлением ожирением вытекает из следующих фактов (Заметки о патофизиологии эндокринной системы, Университет штата Колорадо; Notes on Pathophysiology of the Endocrine System, Colorado State University).

Лептин представляет собой белковый гормон, экспрессируемый главным образом в адипоцитах. Он оказывает важное влияние на регулирование массы тела, метаболизма и репродуктивную функцию. Масса белка, кодируемого геном ожирения (ob), составляет приблизительно 16 кДа. При нормальных концентрациях биологическая функция лептина главным образом заключается в том, чтобы воздействовать на гипоталамические центры головного мозга, контролирующие голод, аппетит, регуляцию температуры тела и энергетический метаболизм. Таким образом, лептин у индивидуума, не страдающего ожирением, мог бы приводить к потере массы за счет двух важных механизмов: (i) ослабление чувства голода и сокращение потребления пищи, наиболее вероятно, посредством ингибирования нейропептида Y, который контролирует пищевое поведение, и (ii) увеличение расхода энергии за счет повышенной температуры тела, повышенного потребления кислорода и потери массы жировой ткани. Тем не менее, избыточная секреция лептина, в случае ожирения или в экспериментальных моделях индуцированного ожирения, приводит к нарушенным функциям гипоталамических центров так, что субъект с ожирением неспособен достигать насыщения и, как правило, переходит на режим чрезмерного потребления пищи. Следовательно, становится крайне необходимым вызвать эффективное снижение избыточных уровней лептина при ожирении, и калебин А является перспективным в данной области, как показано на Фиг. 2.

На Фиг. 3 показан процент усиления экспрессии адипонектина (27,12%, 34,06% и 32,8% соответственно) в адипоцитах человека под действием калебина А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Адипонектин представляет собой цитокин, продуцируемый почти исключительно адипоцитами, и экспрессируется на очень высоких уровнях у худых и здоровых индивидуумов. С другой стороны, у индивидуумов с ожирением снижены уровни экспрессии данного адипокина, и они склонны к ишемической болезни сердца (ИБС), сахарному диабету и гипертензии.

ССЫЛКИ

1. Tamar. R. Aprahamian and Flora Sam, "Adiponectin in Cardiovascular Inflammation and Obesity, Int J. Inflam. 2011; 2011: 376909;

2. Hotta K, Funahashi T, Arita Y, et al. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2000; 20(6): 1595-1599;

3. Iwashima Y, Katsuya T, Ishikawa K, et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension. 2004; 43(6):1318-1323;

4. Kumada M, Kihara S, Sumitsuji S, et al. Association of hypoadiponectinemia with coronary artery disease in men. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2003; 23(1): 85-89 и

5. Lindsay R S, Funahashi T, Hanson R L, et al. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population. The Lancet. 2002; 360(9326): 57-58.

Показано, что калебин А (Фиг. 3) эффективно повышает уровни адипонектина в адипоцитах человека и, таким образом, является перспективным в области лечения ожирения.

На Фиг. 4 и 5 показан процент ингибирования TNF-α (36,03%, 40,81% и 45,47% соответственно) и IL-6 (21,31%, 32,37% и 31,7% соответственно) калебином А в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. В pa6oтe Bastard JP et al., "Recent Advances in the relationship between obesity, inflammation and insulin resistance", Eur Cytokine Netw. 2006 March; 17(1): 4-12 упоминается, что ожирение ассоциировано со слабовыраженным воспалением белой жировой ткани (БЖТ). Авторы также отмечают, что при ожирении БЖТ характеризуется повышенной экспрессией провоспалительных молекул, таких как TNF-α и IL-6, которые оказывают действие не только на БЖТ, но также на другие системные органы организма. На Фиг. 4 и 5 продемонстрировано, что калебин А эффективен в снижении экспрессии TNF-α и IL-6 в адипоцитах и был бы полезным средством для модулирования эффектов локального и системного воспаления при ожирении.

Пример III

Модулирование системного воспаления калебином А

Авторами настоящего изобретения также представлены дополнительные данные, подтверждающие способность калебина А к подавлению внутриклеточного TNF и внеклеточного IL-1β в системах нейтрофилов мышей (Таблица II, Таблица III). Нейтрофилы выделяют методом разделения в градиенте плотности гистопака, тестируют на их способность продуцировать TNF-α in vitro после стимуляции липополисахаридом (ЛПС). Клетки инкубировали в темноте с антителом против мышиного TNF-α, меченным фикоэритрином (РЕ), и после промывания стерильным PBS (фосфатно-солевым буферным раствором) образцы ресуспендировали в PBS (рН 7,4) и анализировали непосредственно на проточном цитометре (BDLSR; Becton Dickinson). Флуоресцентный триггер устанавливали на параметр РЕ (FL1) популяций нейтрофилов, дающих сигнал выше порогового значения (10000 событий). В данном исследовании в качестве стандартного ингибитора TNF-α использовали ролипрам в концентрации 100 мкг/мл. Выравнивание флуоресценции, анализ данных и представление данных проводили, используя программное обеспечение Cell Quest Pro (Becton Dickinson).

ССЫЛКИ

1. Clara, В., R. С. Arancha, G. M. Andre's, P. Atanasio, A. Julia, and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-α-secreting cells using direct immunofluorescence surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264:77-87.

2. Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani, Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-α cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009, 1939-1943.

Таблица II

Авторами настоящего изобретения также представлены данные по исследованию способности калебина А снижать экспрессию внеклеточного TNF-α, IL-1 бета [Фиг. 6] и IL-6 [Фиг. 7] в сыворотке от обработанных мышей (модели in vivo). Самцов мышей Swiss albino в возрасте 6-8 недель содержали при 22±2°С при режиме освещенности свет/темнота 12/12 ч. Мыши получали пероральную обработку тестируемыми лекарственными средствами в возрастающих дозах (масс/об) в течение 6 суток с последующим внутривенным введением путем инъекции 1 мг/кг ЛПС согласно способу, описанному в работе Brieva A, Guerrero А, Alonso-Lebrero J L and Pivel J P. 2001. Immunoferon, a glycoconjugate of natural origin, inhibits LPS-induced TNF-α production and inflammatory responses. International Immunopharmacology 1, 1979-1987. В каждой группе использовали по шесть мышей, и эксперименты проводили в трех повторностях. Продуцирование TNF-α, IL-1 бета и IL-6 оценивали с помощью коммерческих наборов для ELISA (R&D Systems) в сыворотке от обработанных мышей через 90 мин после введения путем инъекции ЛПС. Ролипрам в количестве 30 мг/кг использовали в качестве стандартного лекарственного средства.

На Фиг. 6 и 7 продемонстрировано, что калебин А является эффективным в снижении TNF-α, IL-1 бета и IL-6, что, таким образом, указывает на то, что соединение является полезным средством для модулирования эффектов местного и системного воспаления при ожирении.

Пример IV

Ингибирование адипогенеза калебином А

Культура клеток и дифференцировка адипоцитов

Преадипоциты мыши 3T3-L1, приобретенные из Американской Коллекции Типовых Культур (Rockville, MD), выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 2 мМ глутамина (GIBCO BRL), 1% пенициллина/стрептомицина (10000 единиц пенициллина/мл и 10 мг стрептомицина/мл) и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО₂. Кратко, клетки высевали в 24-луночный планшет (2×10⁴/мл) или 10 см чашку с DMEM, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), и культивировали до достижения полной конфлюентности. Через двое суток после конфлюентности (определенных как сутки 0) клетки инкубировали в среде для дифференцировки (MDI), содержащей 1,7 мкМ инсулин, 0,5 мМ 3-изобутилметилксантин (IBMX) и 12,7 мкМ дексаметазон (DEX) в DMEM, содержащей 10% FBS, в течение 2 суток. Затем данную среду заменяли DMEM, содержащей 10% FBS и инсулин (1,7 мкМ), с калебином А или без него, которую заменяли каждые 2 суток. Конечные концентрации диметилсульфоксида (ДМСО) в культуральной среде составляли менее 0,05%. Клетки собирали через 8 суток (на сутки 10) для окрашивания масляным красным О.

Окрашивание масляным красным О

По окончании дифференцировки клетки дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), фиксировали 10% формалином в течение 60 мин, окрашивали 0,5% масляным красным О в изопропаноле в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток красителя масляного красного О дважды отмывали дистиллированной водой, и затем высушивали. Окрашенные липидные капли внутри клеток визуализировали с помощью светового микроскопа и фотографировали цифровой камерой при 100× увеличении. Для количественного определения аккумуляции липидов окрашенные липидные капли растворяли в изопропаноле и измеряли поглощение при 520 нм.

На Фиг. 8 показано, что калебин А ингибирует дифференцировку и адипогенез преадипоцитов 3T3-L1. Дифференцировка преадипоцитов 3T3-L1, окрашенных масляным красным О и сфотографированных (сверху и в центре). Преадипоциты 3T3-L1 инкубировали с MDI (DMEM с IBMX, DEX и инсулином) в течение 2 суток, а затем заменяли DMEM, содержащей инсулин, с калебином А или без него (0, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мкМ) соответственно в течение 8 суток. Липидное содержимое экстрагировали из клеток, окрашенных масляным красным О, 2-пропанолом и определяли количественно с помощью спектрофотометрического анализа при 520 нм.

Эксперимент на животных - Исследование I

Самцов мышей C57B L/6J в возрасте 5 недель приобретали в центре подопытных животных BioLASCO (Taiwan Co., Ltd., Taipei, Тайвань) и содержали в контролируемой атмосфере (25±1°С при относительной влажности 50%) и при режиме освещенности 12 ч свет/12 ч темнота. После 1 недели акклимации животных случайным образом распределяли в четыре группы по 8 животных в каждой, как описано ниже: обычный рацион (ND, 15% энергии в виде жира), рацион с высоким содержанием жира (HFD, 40% энергии в виде жира) и HFD с добавлением 0,25% или 1% калебина А (2,5 г или 10 г калебина А/кг корма) соответственно в течение 12 недель (Таблица V). Экспериментальные рационы представляли собой модифицированный рацион Purina 5001 (LabDiet, PMI Nutrition International), и состав перечислен в Таблице IV. Животные имели свободный доступ к пище и воде в течение всего периода времени. Чашки с пищей пополняли свежим кормом ежесуточно. За поглощением животными пищи следили ежесуточно, и массу тела регистрировали еженедельно. Весь протокол эксперимента на животных, используемый в данном исследовании, был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Национального морского университета Гаосюн (IACUC, NKMU). В конце исследования все животные голодали в течение ночи, и их умерщвляли путем асфиксии СO₂. Образцы крови отбирали из сердца для биохимического анализа. Печень, селезенку, почку и жировые тела (перигонадный, ретроперитонеальный и мезентериальный жир) немедленно извлекали, взвешивали (Таблица VI) и фотографировали. На Фиг. 9 (А) представлены репрезентативные фотографии каждой группы в конце недели 12. За массой тела следили еженедельно, и среднюю массу тела каждой группы выражали в виде среднего ±SE. Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. (*) Р меньше 0,01 по сравнению с группой ND; (#) Р меньше 0,01 по сравнению с группой HFD. ND, обычный рацион, и HFD, рацион с высоким содержанием жира (Фиг. 9 (В)).

На Фиг. 10 (А), (В) и (С) показаны фотографии перигонадного жира, ретроперитонеального жира и мезентериального жира, а также графическое представление % относительных масс перигонадного, ретроперитонеального и мезентериального жира.

^а Мышей кормили рационом в течение 12 недель, как описано в разделе Материалы и методы, и следили за массой тела дважды в неделю. Средняя масса тела каждой группы выражена в виде среднего ±SE (n=8 на группу), и статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. ND, обычный рацион; HFD, рацион с высоким содержанием жира. *, Р менее 0,01, и ***, Р менее 0,0001 по сравнению с группой ND. #, Р менее 0,01, и ##Р менее 0,001 по сравнению с группой HFD.

^а Мышей кормили HFD с добавлением калебина А или без него (0,25 и 1%) в течение 12 недель. Мышей из каждой группы умерщвляли в конце недели 12; печень, селезенку и почку извлекали, фотографировали, взвешивали и регистрировали. Данные представлены в виде среднего ±SE (n=8 на группу). Относительная масса органа выражена в виде процента от массы тела (масса печени/масса тела ×100). ND, обычный рацион, и HFD, рацион с высоким содержанием жира.

Эксперимент на животных - Исследование 2 - Демонстрация потери массы тела в моделях млекопитающих с ожирением

Подробное описание системы тестирования

Проведение теста

А. Условия содержания животных

a. Условия: Животных содержали в стандартных лабораторных условиях: кондиционированный воздух с надлежащей подачей свежего воздуха (воздухообмен 12-15 в час), комнатная температура 22±3°С, относительная влажность 30-70%, при режиме освещенности 12 часов света и 12 часов темноты. Температуру и относительную влажность регистрируют один раз в сутки.

b. Содержание: отдельных животных держали в стандартной полипропиленовой клетке (размер: длина (L) 290× ширина (В) 140 × высота (Н) 140 мм) с сетчатой решеткой из нержавеющей стали сверху, имеющей приспособления для хранения гранул корма и питьевой воды в бутылке для воды, оборудованной поилкой из нержавеющей стали. В качестве материала подстилки помещают чистую стерилизованную шелуху зерен риса.

c. Акклиматизация: Животных акклиматизировали к лабораторным условиям в течение 5 суток и наблюдали за клиническими показателями ежесуточно.

d. Рацион: Животных неограниченно кормили кормом для лабораторных животных AMRUT, изготовленным Pranav Agro Industries Limited, Sangli, Maharastra, на протяжении акклиматизации. Для индуцирования ожирения и в основном исследовании использовали рацион Open Source Diet D12450 В (с 10 ккал % жира) и рацион с высоким содержанием жира Open Source Diet D12492 (с 60 ккал % жира), изготовленный Research Diet Inc. США, поставляемый Indus Marketing, Hyderabad, Andhra Pradesh, Индия.

e. Вода: Чистой питьевой водой обеспечивали неограниченно на протяжении периода акклиматизации и индуцирования ожирения. Родниковую воду, полученную с помощью почвенного бура, пропущенную через установку обратного осмоса, поставляли в пластмассовых бутылках для воды с поилками из нержавеющей стали.

B. Группирование

Группирование животных проводили на последние сутки акклиматизации способом рандомизации и стратификации по массе тела. Группирование животных проводили таким образом, чтобы варьирование массы тела используемых животных не превышало ±20% средней массы тела каждой группы.

C. Дизайн исследования

Животных делили на 5 групп, а именно группу 1, 2, 3, 4 и 5, состоящих из 10 животных (5 самцов и 5 самок) каждая. Подробное описание групп, дозы и количество/пол животных на группу представлены в Таблице VII.

D. Обработка животных

a. Объем дозы: Объем дозы/животное =10 мл/кг массы тела для всех животных на протяжении периода исследования

b. Индуцирование ожирения: Животных контрольной группы G1 кормили кормом D12450B обычного контрольного рациона, содержащим 10 ккал % жира, а животных групп G2-G5 кормили кормом D12492 рациона с высоким содержанием жира, содержащим 60 ккал % жира, во время индуцирования ожирения и во время основного исследования.

с.Основное исследование: Основное исследование начинали после индукции ожирения. Животным вводили 3 дозы калебина А с суток 29 ежесуточно, непрерывно в течение периода 28 суток. Скармливание рационов при основном исследовании продолжалось аналогичным образом, как проводили при индукции ожирения. Животным контрольной группы G1 и контрольной группы рациона с высоким содержанием жира G2 вводили 0,5% КМЦ (карбоксиметилцеллюлозу), тогда как животные других групп получали тестируемый препарат с суток 29 по сутки 56 периода исследования. Объем вводимой дозы поддерживали в соответствии с еженедельной массой тела отдельных животных. Общая продолжительность исследования составляла 61 сутки (период акклиматизации 5 суток + индукция ожирения 28 суток + основное исследование 28 суток).

Статистический анализ: Необработанные данные, полученные в настоящем исследовании, подвергали компьютерной статистической обработке. Компьютерную распечатку данных (в форме приложения) сверяли с исходными необработанными данными. После проверки данные подвергали однофакторному ANOVA (дисперсионный анализ) с апостериорным критерием Даннета в отношении данных по массе тела, гематологии и параметрам клинической химии, массе органов, используя GraphPad Prism, версия 5.01, программное обеспечение GraphPad. Все анализы и сравнения оценивали при 95% уровне значимости (Р меньше 0,05), обозначенном верхними индексами ^а, когда G1 сравнивают с G3, G4, G5 и G6, и ^b, когда G2 сравнивают с G3, G4, G5 и G6 на протяжении всего отчета, как указано ниже: *: Статистически значимый (Р менее 0,05), во всех случаях, когда это применимо.

Данные подвергали однофакторному статистическому анализу ANOVA путем сравнения следующих групп:

группы G1 {контрольная группа (с 10 ккал % жира)} с группой G3 {калебин А 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группой G4 {калебин А - 10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} и группой G5 {калебин А 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, как представлено ниже:

группы G2 - контроль рациона с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира) с группой G3 {калебин А 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группой G4 {калебин А 10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} и группой G5 {калебин А 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, как представлено ниже:

Результаты

Масса тела: Массы тела отдельных животных регистрировали в день поступления на сутки 1, и затем еженедельно (±1 сутки) в течение периода исследования.

Краткое представление еженедельной массы тела самцов и самок приведено в Таблицах VIII (a)/VIII (b) и IX (а)/IX (b) соответственно.

У самцов имело место статистически значимое увеличение значений средней еженедельной массы тела на сутки 15 в группе G5 {калебин А - 20 мг/кг + Рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G1 {Контрольная группа (с 10 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были связаны с различием в содержании жира в корме.

У самцов имело место статистически значимое увеличение значений средней еженедельной массы тела на сутки 22 и сутки 29 в группе G3 {калебин А -5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G4 {калебин А - 10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G5 {калебин А - 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены различием в содержании жира в корме.

У самцов имело место статистически значимое увеличение значений средней еженедельной массы тела на сутки 36 в группе G3 {калебин А - 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены различием в содержании жира в корме.

У самцов имело место статистически значимое уменьшение значений средней еженедельной массы тела на сутки 36 в группе G3 {калебин А - 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G4 {калебин А -10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G2 {контроль рациона с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были связаны с эффектом введения тестируемого препарата калебина А.

У самцов имело место статистически значимое уменьшение значений средней еженедельной массы тела на сутки 43, 50 и на сутки 56 в группе G3 {калебин А - 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G4 {калебин А -10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G5 {калебин А - 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G2 {контроль рациона с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены введением тестируемого препарата калебина А.

У самок имело место статистически значимое увеличение значений средней еженедельной массы тела на сутки 15 и сутки 22 в группе G5 {калебин А - 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены различием в содержании жира в корме.

У самок имело место статистически значимое увеличение значений средней еженедельной массы тела на сутки 29 и сутки 36 в группе G3 {калебин А - 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G4 {калебин А -10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G5 {калебин А - 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены различием в содержании жира в корме.

У самок имело место статистически значимое увеличение значений средней еженедельной массы тела на сутки 43 в группе G3 {калебин А - 5 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G4 {калебин А - 10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G1 {контрольная группа (с 10 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены различием в содержании жира в корме.

У самок имело место статистически значимое уменьшение значений средней еженедельной массы тела на сутки 43, 50 и сутки 56 в группе G3 {калебин А - 5 мг/кг +рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G4 {калебин А - 10 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}, группе G5 {калебин А - 20 мг/кг + рацион с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)} по сравнению с группой G2 {контроль рациона с высоким содержанием жира (с 60 ккал % жира)}. Считалось, что данные изменения были обусловлены введением тестируемого препарата калебина А.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что калебин А имел эффект снижения массы тела у самцов и самок С57 с ожирением, индуцированным рационом с высоким содержанием жира, в тестируемых концентрациях 5, 10 и 20 мг/кг массы тела.

Кроме того, после завершения периода исследования (сутки 57) животных умерщвляли гуманным способом путем воздействия избытка СО₂ в газовой камере, и отмечали массы органов. Головной мозг, тимус, печень, надпочечники, почки (парные), селезенку, сердце и яичники/семенники (парные) от всех животных соответствующим образом отрезали от какой-либо примыкающей ткани и взвешивали во влажном состоянии как можно скорее, чтобы избежать высыхания. Несмотря на то, что в целом статистически значимое различие в массах органов у самцов и самок отсутствовало, наблюдались специфичные для органов улучшения в массе, например, для печени в группе самцов (см. Таблицу X). Данный результат подтверждает результаты в Таблице VI для печени. Можно отметить, что в работе Behnke, A. R. 1953. Lean body mass. А.М.А. Arch. Int. Med. 91, 585 на печень указывают, как на показатель стимуляции безжировой массы тела, а в Н.F. Kraybill et al., J ANIM SCI 1954, 13: 548-555 указывают на то, что другие внутренние органы также могут в равной степени прогнозировать стимуляцию безжировой массы тела. Весьма возможно, что статистическая значимость в отношении устойчивого увеличения масс органов без признаков токсичности может быть достигнута при большем объеме выборки (большем количестве тестируемых животных) на протяжении продолжительных периодов тестирования. Результаты Таблицы VI и Таблицы X можно интерпретировать как предварительный показатель потенциала калебина А не только в отношении ингибирования адипогенеза и снижения массы тела, но также в отношении способствования безжировой массе тела.

Дополнительно, по окончании периода исследования у всех животных отбирали образцы крови в пробирки, содержащие антикоагулянт, представляющий собой калиевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (K₂-ЭДТА), для оценки системной экспрессии лептина и адипонектина. Образцы крови отбирали гуманным способом пункции ретро-орбитального сплетения при слабом эфирном наркозе с помощью тонкой капиллярной трубки. Образцы крови, отобранные в пробирки без антикоагулянта, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут с получением сыворотки, которую подвергали методу ELISA для оценки лептина и адипонектина. Значимость экспрессии лептина и адипонектина в качестве биомаркеров при ожирении обсуждалось выше (стр. 11, строки 22-24 и 26-28). Калебин А демонстрировал незначительный эффект на ингибирование экспрессии лептина в сыворотке животных с ожирением (Фиг. 11) и демонстрировал значительный эффект повышения уровней экспрессии адипонектина в сыворотке животных с ожирением (Фиг. 12). О низких системных уровнях адипонектина упоминали как о прогностических факторах при прогрессировании болезненных состояний, таких как сахарный диабет типа II (Chamukuttan Snehalatha et al, "Plasma Adiponectin Is an Independent Predictor of Type 2 Diabetes in Asian Indians", Diabetes Care December 2003 vol. 26 no. 12 3226-3229). Способность калебина А к значительному повышению уровней системного адипонектина в моделях ожирения на млекопитающих указывает на его способность помогать в предупреждении начала сахарного диабета типа II у указанных млекопитающих.

Калебин А и его действие на липолиз и размер липоцита Полностью дифференцированные адипоциты (8 суток), предварительно не обработанные калебином А, как описано в кратком изложении методических стадий (стр. 16, строки 16-30, стр. 17, строки 1-2), обрабатывали калебином А в концентрациях 5-30 мкМ. Липолиз был связан с распадом липидов до глицерина, который высвобождался в клеточную культуральную среду, и его там выявляли. Наблюдали, что калебин А в концентрации 5-20 мкМ не вызывал высвобождения глицерина в среду. Глицерин выявляли, когда для обработки адипоцитов использовали калебин А в концентрации 30 мкМ. Таким образом, в другом наиболее предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу индукции липолиза в адипоцитах млекопитающих, включающему стадию обработки адипоцитов млекопитающих варьирующими концентрациями калебина А для того, чтобы вызвать эффект дозозависимого липолиза в указанных адипоцитах. Ссылаясь на вышеописанное (стр. 17, строки 22-30, стр. 18, строки 1-23), индукция ожирения у самцов мышей C57B L/6J в результате кормления HFD в течение периода 12 недель и оценка гистологических срезов эпидидимального жира (адипоцитов) или в общем жировой соединительной ткани показали заметное увеличение адипоцитов в размере. Эпидидимальные жировые тела отсекали и фиксировали в 10% забуференном формалине в течение по меньшей мере 24 часов, затем обезвоживали последовательностью этанольных растворов и обрабатывали для заключения в парафин. Делали срезы толщиной 5-6 мкм, депарафинировали, регидратировали, окрашивали гематоксилином и эозином (г/э) и подвергали оценке с помощью микроскопа с фотокамерой. Размер адипоцита определяли с помощью светового микроскопа Nikon (Япония), оборудованного окулярным микрометром, при 200× увеличении в 10 случайных полях на срез. При обработке мышей HFD калебином А в концентрациях 0,25% и 1% наблюдали заметное уменьшение размера адипоцитов, и адипоциты демонстрировали нормальную морфологию (Фиг. 13). Таким образом, в еще одном наиболее предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу восстановления размера адипоцитов в жировой ткани млекопитающих с ожирением, причем указанный способ включает стадию приведения (а) увеличенных адипоцитов млекопитающих, увеличение которых является результатом рациона с высоким содержанием жира, в контакт с (b) калебином А, происходящим в результате перорального введения эффективных концентраций калебина А указанным млекопитающим, для достижения эффекта восстановления нормального размера адипоцита в жировой ткани.

Калебин А и его действие на жировой гепатоз, индуцированный у мышей, которых кормили рационом с высоким содержанием жира (Фиг. 14)

Мышей C57BL/6J, которых кормили HFD в течение периода 12 недель, оценивали в отношении уровней GOT (глутамат-оксалоацетат-трансаминазы) и GTP (глутамат-пируват трансаминазы) в сыворотке. Результаты указывали на повышенные уровни GOT и GTP в сыворотке (Таблица XI) по сравнению с группой ND.

Данные представляли в виде среднего ±SE (n=8 на группу). Средние значения в каждой колонке с разными индексами (а, b, с) достоверно различаются (р меньше 0,05) на основании однофакторного анализа ANOVA и множественного рангового критерия Дункана. ND: обычный рацион; HFD: рацион с высоким содержанием жира.

По сравнению с группой ND печень группы HFD была значительно увеличена, как видно при макроскопическом морфологическом наблюдении (индуцированное HFD повреждение печени - жировой гепатоз). Часть печени в различных группах отсекали и фиксировали в 10% забуференном формалине в течение по меньшей мере 24 часов, затем обезвоживали последовательностью этанольных растворов и обрабатывали для заключения в парафин. Делали срезы толщиной 5-6 мкм, депарафинировали, регидратировали, окрашивали гематоксилином и эозином (г/э) и подвергали оценке с помощью микроскопа с фотокамерой. Гистопатологию печени оценивали в соответствии с системой NAFLD (неалкогольная жировая болезнь печени), кратко изложенной в Kleiner, D.E., Brunt, Е.М., Van, N.M., Behling, С. et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005, 41, 1313-1321. Балл гепатоцеллюлярной баллонной дистрофии ранжировали 0-2 на основании числа клеток, подвергшихся баллонной дистрофии, на поле при увеличении ×200 (ранжирование: 0 = нет клеток, подвергшихся баллонной дистрофии; 1 = мало клеток, подвергшихся баллонной дистрофии; 2 = выраженные клетки, подвергшиеся баллонной дистрофии) в срезах, окрашенных г/э. Число инфильтрирующих иммунных клеток считали при увеличении 200× в пяти различных областях. В группе HFD наблюдали значительную воспалительную дистрофию, гепатоцеллюлярную баллонную дистрофию и аккумуляцию триглицеридов. Количественный анализ показал повышенные уровни триглицеридов в печени по сравнению с группой ND. Введение калебина А в концентрациях 0,25% и 1% дозозависимо ослабляло индуцированную HFD аккумуляцию триглицеридов, гепатоцеллюлярную баллонную дистрофию и воспалительную инфильтрацию. Соответственно, в другом наиболее предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу лечения у млекопитающих жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира (HFD), включающему стадию приведения гепатоцитов, подвергнутых HFD, характеризующихся воспалительной инфильтрацией, гепатоцеллюлярной баллонной дистрофией и высокими уровнями триглицеридов, в контакт с калебином А, происходящим в результате перорального введения эффективных концентраций калебина А указанным млекопитающим, для того, чтобы вызвать эффект дозозависимого ослабления жирового гепатоза. В качестве альтернативы в другом наиболее предпочтительном воплощении настоящее изобретение также относится к калебину А для лечения жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира (HFD), у млекопитающих.

Хотя изобретение было описано со ссылкой на предпочтительное воплощение, специалистам в данной области техники следует четко понимать, что изобретение не ограничено этим. Скорее, объем изобретения следует интерпретировать только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.

Claims

Способ лечения жирового гепатоза, индуцированного рационом с высоким содержанием жира (HFD) у млекопитающих, включающий стадию приведения гепатоцитов, подвергнутых HFD, в контакт с калебином А, происходящий в результате перорального введения эффективных концентраций калебина А указанным млекопитающим.