KR101763474B1 - 간 지방증에 대한 칼레빈 a - Google Patents

Abstract

본 발명은, 포유동물에서 고지방 식단(HFD) 유도된 간 지방증을 감소시키는데 있어서 칼레빈 A의 가능성을 나타낸 것이다.

Description

간 지방증에 대한 칼레빈 A{CALEBIN A FOR HEPATIC STEATOSIS}

관련된 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 차례로 2011년 1월 10일자 출원된 가출원 61431147의 비-가출원인, 2012년 1월 10일자로 출원된 13/347071의 일부-계속 특허 출원이고, 2015년 1월 13일자 US 특허 번호 8933121로서 차례로 등록되고, 2014년 5월 9일에 출원된 동시-계류중인 US 특허 출원 14274096의 일부-계속-특허 출원이다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로, 비만 관리를 위한 약제에 관한 것이다. 보다 명확하게, 이는 잘 분화된 지방세포에서 지방분해를 일으키는 이의 능력에 관하여 칼레빈 A(Calebin A)의 항-비만 가능성에 관한 것이다. 또한, 포유동물에서 고 지방 유도된 간 지방증을 감소시키기 위해 칼레빈 A의 능력이 기재되어 있다.

선행기술의 기재

비만은 산업화된 국가에서 가장 일반적인 영양 장애(nutritional disorder)이고, 개발도상국에서 점점 커지는 문제이다. 이는 전세계적인 유행으로서 기재되어 있고, 과체중 및 비만인 개인(25 이상의 BMI)은, 다양한 육체적인 질병 및 우울증, 식이장애 및 낮은 자긍심(low self esteem)과 같은 심리적인 문제에 대한 위험을 증가시킨다. 심장혈관계 질병, 진성당뇨병(diabetes mellitus), 골관절염(osteoarthritis), 폐쇄성 수면무호흡증(obstructive sleep apnea) 및 암과 같은 다양한 질병과 관련되어 있다. WHO는, 전세계적으로 예방할 수 있는 사망의 10 위의 원인 중의 하나일 수도 있는 것으로 비만을 고려하고 있다.

비만에서, 세포 당 세포질의 트리글리세리드의 증가된 양의 침전(deposition) 및/또는 지방생성의 과정을 통해 새로운 지방 세포(new fat cells)[지방세포(adipocytes))]의 생성으로 인하여 지방 조직 덩어리(adipose tissue mass)가 증가하고 있다. 지방 세포는, 내부적으로 생산된 지질 방울이 단일의 큰 덩어리(single large mass)로 합져짐으로써 발달된다. 결국, 셀룰라이트는 스킨 피부(skin dermis) 아래의 지방세포의 덩어리(chunk)의 축적 및 증가된 지방생성(enhanced adipogenesis) 때문에 발생된다.

지방생성의 연구는, 사람에서의 이러한 과정의 처리가 비만 및 당뇨병의 책임을 감소시키는 것으로 유도될 수 있는 희망으로 진행되고 있다. 분자의 수준에서, 몇몇의 마커는, 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), TNF-α등과 같은 비만을 치료하는데 타겟이 되고 있다.

약물이 상기 질환에 가능할지라도, 비만 및 이의 관련된 사회-경제적인 결과(its related socio-economic consequences)를 관리하는데 도움을 주기 위해, 안전한 천연의 접근법을 탐구하고, 이에 대한 끊임없는 필요가 있다.

칼레빈 A 는, β-아밀로이드 공격(β-amyloid insult)으로부터 뉴런 세포를 보호하는 것으로 알려져 있고(Park SY et al, J Nat Prod. 2002 September; 65(9):1227-31), 약물 저항성 인간 위장 암 세포에서의 MAPK 패밀리 활동성을 조절하고, 아포토시스를 유도한다(Li Y et al, Eur J. Pharmacol. 2008 Sep. 4; 591(1-3):252-8). Zeng Y et al.(Chem Pharm Bull (Tokyo) 2007 Jun; 55(6):940-3)에는, 두 가지의 신규한 칼레빈 유도체, 4"-(4"'-히드록시페닐-3"'-메톡시)-2"-옥소-3"-부테닐-3-(4'-히드록시페닐)-프로페노에이트 및 4"-(4"'-히드록시페닐)-2"-옥소-3"-부테닐-3-(4'-히드록시페닐-3'-메톡시)-프로페노에이트가 기재되어 있다.

본 발명은, 지방 세포(adipocytes)[지방 세포(fat cells)]의 말기 분화(terminal differentiation) 동안에 지방 축적을 예방하기 위한 칼레빈 A의 가능성 및 비만 관리에서 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하게 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체 조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증(systemic inflammation)을 저해하는 것을 포함한다.

이에 따라서, 칼레빈 A의 항-비만 가능성을 나타내기 위한 것이 본 발명의 목적이다. 잘 분화된 지방세포에서 지방 분해를 유도하기 위한 칼레빈 A의 능력을 나타내는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다. 고 지방 식단 유도된 간 지방증을 감소시키도록, 칼레빈 A의 능력을 나타내는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.

본 발명은 상기의 목적을 이행하고, 추가적으로 관련된 장점을 제공한다.

본 발명의 요약

본 발명은, 지방 생성(adipogenesis)을 저해하는데 있어서 칼레빈 A의 가능성 및 비만 관리에서의 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은, 포유동물에서 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하기 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증을 저해하는 것을 포함한다. 완전하게 분화된 지방세포에서 지방분해를 자극하기 위해 칼레빈 A의 능력이 또한 본 발명의 일부로서 나타낸다. 추가적으로, 본 발명은 또한, 포유동물에서 고지방 식단 유도된 간 지방증을 감소시키도록 칼레빈 A의 능력을 나타낸 것이다.

본 발명의 그 밖의 특성 및 장점은, 본 발명의 원리가 예로서 설명된, 첨부된 도면과 첨부되어 설명된, 하기의 보다 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

출원된 특허 또는 출원은, 색을 넣어 수행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 칼라 도면(들)를 가지는 이러한 특허 또는 특허 출원, 공개의 복사본은, 필요한 수수료의 지불 및 요청에 따라 사무소에 의해 제공될 것이다.
도 1은, 오일-레드-O-염색 방법(Oil-Red-O-Staining method)에 의해 연구된 바와 같은, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 영향을 받은 퍼센트 지방생성 저해(percentage adipogenesis inhibition)의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.
도 2는, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의해 영향을 받은 인간 지방세포에서 렙틴 생성의 퍼센트 저해의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다. P 수치 ^*:<0.01; ^**:<0.001.
도 3은, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의해 영향을 받은 인간 지방세포에서 아디포넥틴 발현의 퍼센트 증가의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다. P 수치 ^*:<0.01.
도 4 및 5는, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의해 영향을 받은 인간 지방세포에서, 각각 TNF-α 발현(P 수치 ^*:<0.01; ^**:<0.001) 및 IL-6 발현(P 수치 ^*:<0.01)의 퍼센트 저해의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.
도 6은, P-수치: ^*<0.01; ^**<0.001 스튜던트 't' 테스트, 그룹 당 동물 = 6의, 처리된 스위스 알비노 마우스로부터의 혈청에서, TNF-α 및 IL-1β의 발현에서 칼레빈 A의 다수 투여의 효과의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.
도 7은, P-수치: ^*<0.01; ^**<0.001 스튜던트 't' 테스트, 그룹 당 동물 = 6의, 처리된 스위스 알비노 마우스로부터의 혈청에서 IL-6의 발현에서 칼레빈 A의 다수 투여의 효과의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.
도 8은, 칼레빈 A가 3T3-L1 지방전구세포(preadipocyte)의 지방 생성 및 분화(dierentiation)를 저해함을 나타낸 것이다.
도 9의 (A) 및 (B)는 각각, C57BL/6 마우스의 실험 집단의 체중에서 식단 보충물의 효과의 사진 및 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.
도 10a, 10b 및 10c는, 고지방 식단(HFD)-공급된 C57BL/6 마우스에서 상대적인 지방 조직 중량에서 칼레빈 A 보충물의 효과를 나타낸 것이다.
도 11은, C57BL/6 마우스의 혈청에서 렙틴 발현에서 칼레빈 A 보충물의 효과를 나타낸 것이다.
도 12는, C57BL/6 마우스의 혈청에서 아디포넥틴 발현에서 칼레빈 A 보충물의 효과를 나타낸 것이다.
도 13은, HFD 마우스 그룹에서 지방세포 크기를 회복하기 위한, 칼레빈 A(0.25 % 및 1 %)의 능력의 H&E 조직학적 부분 및 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.
도 14는, 조직학적 (H&E) 부분에서 (ⅰ) 전체의 형태학의 조사 및 (ⅱ) 풍선 변형을 가지는 염증 및 트리글리세리드의 축적에서 HFD 그룹의 간에서 분명한 염증 및 간에서 염증, 풍선의 변형 및 트리글리세리드 함량을 감소시키기 위한 칼레빈 A(0.25 % 및 1 %)의 능력을 나타낸 것이다. 상기 동일한 결과는 또한 그래프적으로 나타낸 것이다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은, 지방세포(adipocytes)(지방 세포)의 말기 분화 동안에 지방 축적을 예방하기 위한 칼레빈 A의 가능성 및 비만 관리에서 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은, 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하게 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증을 저해하는 것을 포함한다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 지방생성을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉하는 단계를 포함한다. 다시 말해서, 본 발명은, 포유동물의 지방세포의 말기 분화 동안에 지방의 축적을 예방하는 방법에 관한 것이다. (도 1 및 8).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 지방 세포에서 렙틴 발현을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉하는 단계를 포함한다(도 2).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 지방세포에서 아디포넥틴의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함한다(도 3).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 지방세포에서 전-염증성 사이토카인 TNF-α 발현을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함한다(도 4).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 지방세포에서 전-염증성 사이토카인 인터류킨-6 발현을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉하는 단계를 포함한다(도 5).

특정한 실시형태에서, 본원에 나타낸 상기 지방세포는 인간 지방세포이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 포유동물에서 전-염증성 사이토카인의 전신성 발현 유도된 비만을 감소시키는 방법에 관한 것이고(the present invention relates to a method of reducing obesity induced systemic expression of pro-inflammatory cytokines in mammals), 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 이러한 단란에서 본원에 나타낸 상기 전-염증성 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1β(IL-1β)를 포함한다[도 6 및 7].

다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

1. 지방생성 저해의 효과를 유발하도록 상기 포유동물에 칼레빈 A의 유효량의 식이요법의 경구 보충(dietary oral supplementation)의 단계를 포함하는, 체지방의 과도한 축적을 가지는 포유동물에서 비만 관리의 방법.

2. 지방 생성 저해의 효과를 유발하도록, 상기 포유동물에 대한 칼레빈 A의 유효량의 식이요법의 경구 보충의 단계를 포함하는, 체지방의 과도한 축적의 위험을 가지는 포유동물에서 비만의 관리에서의 칼레빈 A의 용도.

3. 포유동물에 칼레빈 A의 유효량의 식이요법의 경구 보충의 단계를 포함하는, 체지방의 과도한 축적의 위험을 가지는 포유동물에서 지방생성을 저해하는 방법.

4. 포유동물에 칼레빈 A의 유효량을 경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 비만 포유동물의 체중을 감소시키는 방법.

5. 포유동물에 칼레빈 A의 유효량을 경구적으로 투여하는 단계를 포함하는, 비만 포유동물의 체중을 감소시키는 방법에서의 칼레빈 A의 용도.

6. 포유동물에서 칼레빈 A의 유효량의 식이요법의 경구 보충의 단계를 포함하는, 비만 포유동물에서 아디포넥틴의 전신성 발현을 증가시키는 방법.

7. 비만 포유동물에서, 제2형 당뇨병을 예방하거나, 발병을 늦추거나 및/또는 진행을 지연시키는데 있어서 도움을 주기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 전신성 아디포넥틴 발현 레벨에서 증가를 달성하기 위해, 상기 포유동물에 칼레빈 A의 치료학적 유효량을 경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.

8. 포유동물에서 비만을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, 지방생성 저해의 효과, 체중 감소 및 아디포넥틴의 증가된 전신성 발현을 야기하는 상기 포유동물에 칼레빈 A의 유효량의 식이요법의 경구 보충의 단계를 포함하는 것인, 방법.

9. 포유동물에서 무지방 신체 중량(lean body mass)을 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은, 무지방 신체 중량에 유리한 지방 조직 및 무지방 신체 중량 사이의 비율을 이동함으로써 무지방 신체 중량에서의 증가의 효과를 야기하는, 상기 포유동물에 칼레빈 A의 유효량의 식이요법의 경구 보충의 단계를 포함하는 것인, 방법.

다른 바람직한 실시형태에서, 상기 대상은 포유동물이다.

다른 바람직한 실시형태에서, 상기 대상은 인간이다.

항-비만 분자로서 칼레빈 A의 잠재적인 치료학적 수치는, 하기에 본원에 설명된 특정한 실시예를 통해 이해될 수도 있다.

실시예 Ⅰ

칼레빈 A의 급성 경구 독성(Acute Oral Toxicity)

표 Ⅰ는, 칼레빈 A의 급성 경구 독성에 대해 연구된 파라미터를 나타낸 것이다.

결과:

어떠한 사망도, 2 주의 관찰에서 마우스에서 2000 mg/kg p.o.까지 관찰되었다.

[표 Ⅰ]

실시예 Ⅱ

지방세포화 배양물의 오일-레드-O-염색 및 ELISA에 의한 렙틴, 아디포넥틴, TNF-α 및 IL-6의 평가(Oil Red-O-Staining of Adipogenic Cultures and Estimation of Leptin, Adiponectin, TNF-α and IL-6 by ELISA)

지방세포의 말기 분화는, 큰 세포질 소낭(large cytoplasmic vesicles)에서 지질의 많은 양의 축적에 의해 동반된다. 세포 배양에서 지방세포 분화를 측정하기 위한 공통의 분석은, 염료 오일 레드-O(ORO)를 사용한다. ORO는, 지방세포 분화(지방 생성)의 믿을 수 있는 지표인 지용성 선홍색 염료이다.

원리:

오일 레드-O(용매 레드 27, 수단 레드 5B, C.I. 26125, 및 C26H24N4O)는, 파라핀 절편에서 몇몇의 지방단백질 및 동결 절편에서 천연의 트리글리세리드 및 지질을 착색하기 위해 사용된 용성 색소(지용성 염료) 디아조 염료이다. 518(359) nm에서 최대 흡수를 가지는 적색 분말의 출현을 가진다. 오일 레드-O 는, 수단 염색을 위해 사용된 염료 중의 하나이다. 유사한 염료는 수단 Ⅲ, 수단 Ⅳ, 및 수단 블랙 B를 포함한다. 상기 염색은, 알코올 고정화(alcohol fixation)가 지질을 제거하기 때문에, 신선한 샘플에서 실행되어야 한다. 오일 레드 O 는, 보다 많은 짙은 적색을 제공하기 때문에, 수단 Ⅲ 및 수단 Ⅳ를 대체하고, 상기 염색은 보는 것을 보다 쉽게 한다.

오일 레드-O는 유용성 염료(oil soluble dye)이다. 유용성 염료는, 보통의 히드로 알코올성 염료 용매(usual hydro alcoholic dye solvents)보다 조직/세포에서의 지질 물질에서 염료의 보다 큰 용해도를 나타낸다. 이런 이유로, 이는 상기 세포에서 진하게 염색될 것이다.

방법론:

3T3-L1 세포 대략 60×104 세포는, 70 내지 80 %의 집합(confluence)을 수득하기 위해, 48 내지 72 hrs 동안 접종된다. 48 hrs 후에, 신선하게 제조된 200 μl의 AIM(지방 생성 유도 배지)이 첨가되었다. 72 hrs 후에, 상이한 농도로 상기 테스트 화합물을 가지는 200 μl APM(지방 생성 진행 배지)이 상기 웰에 첨가되었다. 상기 세포는 5 % CO2 및 95 % 공기의 습기 있는 대기(37 ℃)에서 48 hrs 동안 배양된다. 상기 상청액은 수집되고, ELISA에 의해 렙틴, 아디포넥틴, IL-6 및 TNF-α의 평가를 위해 저장되었다. 세포는 100 μl의 10 % 포르말린을 첨가함으로써 고정되고, ORO 염색이 실행된다. OD는 마이크로플레이트 리더기에서 492 nm에서 판독된다. 상기 결과는, Graphpad prism 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀ 수치로서 나타낸 것이다.

지방생성의 저해의 퍼센트는 하기한 바와 같이 계산된다:

% 저해(inhibition)=C-T/T * 100

이 식에서, 샘플 처리된 C - 분화하는/분화하지 않는 세포에서 오일 레드 0의 흡광도(absorbance).

T - 샘플 처리된 분화하는/분화하지 않는 세포에서 오일 레드 0의 흡광도. 렙틴, 아디포넥틴, IL-6 및 TNF-α의 평가는, R&D Systems으로부터의 사용자의 매뉴얼에 따라 수행된다.

참고문헌

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2. A pre-adipose 3T3 cell variant highly sensitive to adipogenic factors & to human growth hormone. L A Salazar-Olivo, F Castro-Munozledo & W Kuri-Harcuch. Department of Cell Biology, Centro de Investigation y de Estudios Avanzados del I.P.N., Mexico D.F., Mexico. Journal of Cell Science, 1995.Vol 108, Issue 5 2101-2107.

3. A Nuclear Receptor Atlas: 3T3-L1 Adipogenesis. Mingui Fu, Tingwan Sun, Angie L. Bookout, Micheal Downes, Ruth T. Yu, Ronald M. Evans and David J. Mangelsdorf. Molecular Endocrinology, 2005. 19 (10): 2437-2450.

4. " Expression of a Constitutively Active Akt Ser/Thr Kinase in 3T3-L1 Adipocytes Stimulates Glucose Uptake and Glucose Transporter 4 Translocation, Aimee D Kohn et al, J. Biol. Chem. 1996, 271:31372-31378.

결과 :

도 1은, 오일-레드-0-염색 방법(Oil-Red-O-Staining method)에 의해 연구되는 0.5, 1.0, 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의해 영향을 받아 각각 32.43 %, 38.59 % 및 35.8 %의 퍼센트 지방 생성 저해를 나타낸 것이다.

도 2 는, 0.5, 1.0, 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의해 인간 지방세포에서 렙틴 생성의 퍼센트 저해(각각 34.92 %, 41.04 % 및 39.48 %)를 나타낸 것이다. 하기의 사실로부터 비만 관리 흐름(obesity management stems)에 대한 인간 지방세포에서 렙틴의 생성의 저해에 있어서 칼레빈 A의 효과 및 이의 연관성의 중요성[Colorado State University, 내분비 기관의 병리생리학(Pathophysiology of the Endocrine System)을 참고하라].

렙틴은 지방세포에서 대부분 발현되는 단백질 호르몬이다. 이는, 체중, 대사(metabolism) 및 생식기능(reproductive function)을 조절하는데 있어서 중요한 효과를 갖는다. 상기 비만(obese)(ob) 유전자에 의해 코드화되는(Encoded), 상기 단백질은 질량으로 대략 ~ 16 kDa이다. 정상의 농도에서, 렙틴의 생물학적 기능은, 배고픔, 식욕, 체온의 조절 및 에너지 대사를 조절하는 상기 뇌의 시상하부 중심(hypothalamic centers)에서의 이의 효과에 대부분 귀속된다. 따라서, 비-비만형 개체(non-obese individual)에서 렙틴은, 두 가지 중요한 매커니즘에 의해 체중 손실을 유발할 수 있다. (ⅰ) 섭식 행동(feeding behavior)을 조절하는 신경펩티드 Y(neuropeptide Y)의 저해를 통해 가장 가능성이 있게 배고픔 및 음식 소비에서의 감소, 및 (ⅱ) 증가된 체온, 산소 소비 및 지방 조직 덩어리의 손실을 통해 에너지 소비에서의 증가. 그러나, 유도된 비만의 실험용 모델(experimental models) 또는 비만의 경우에서와 같이 렙틴의 과잉 분비(excessive secretion)는, 비만 대상이 포만(satiation)을 이루는데 실패하고, 섭식 방식(feeding mode) 상에서 근거로 하는 경향이 있는, 시상하부 중심의 분열된 기능(disrupted functions)을 유도한다. 이런 이유로, 이는 비만에서 과잉 레벨의 렙틴의 효과적인 감소를 유도하기 위해 반드시 해야 하고, 칼레빈 A는 도 2에서 나타낸 바와 같은 이러한 영역에서 가능성(promise)을 나타낸다.

도 3은, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의한 인간 지방세포에서 아디포넥틴 발현의 퍼센트 상승(percentage enhancement)(각각 27.12 %, 34.06 % 및 32.8 %)을 나타낸 것이다. 아디포넥틴은 지방세포에 의해 대부분 독점적으로(exclusively) 생산된 사이토카인이고, 지방이 적고(lean) 건강한 개체에 의해 매우 높은 레벨로 발현된다. 그러나, 비만인 개체(Obese individuals)는 이러한 아디포킨(adipokine)의 감소된 레벨을 발현하고, 관동맥성 심장병(coronary heart disease, CAD), 진성 당뇨병 및 고혈압에 걸리기 쉽다.

참고문헌

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3. Iwashima Y, Katsuya T, Ishikawa K, et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension. 2004; 43(6):1318-1323;

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5. Lindsay R S, Funahashi T, Hanson R L, et al. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population. The Lancet. 2002; 360(9326):57-58.

칼레빈 A 는, 인간 지방세포에서 아디포넥틴의 레벨이 효과적으로 증가됨을나타낸 것이고(도 3), 따라서 비만 관리의 영역에서의 가능성을 나타낸다.

도 4 및 5 는, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의한 TNF-α(각각 36.03 %, 40.81 % 및 45.47 %) 및 IL-6 (각각 21.31 %, 32.37 % 및 31.7 %)의 퍼센트 저해를 나타낸 것이다. Bastard JP et al, "Recent Advances in the relationship between obesity, inflammation and insulin resistance", Eur Cytokine Netw. 2006 March; 17(1):4-12는, 비만이 백색 지방 조직(white adipose tissue, WAT)의 저등급 염증(low-grade inflammation)과 관련됨을 인용하고 있다. 상기 저자는, 비만에서, WAT 상에서의 효과뿐만 아니라, 상기 몸의 다른 전신 기관(systemic organs) 상에서의 TNF-α 및 IL-6와 같은 전-염증성 분자의 증가된 발현에 의해 특징지어짐을 또한 언급하였다. 도 4 및 5 는, 칼레빈 A 가 지방세포에서 TNF-α 및 IL-6 발현을 감소시키는데 효과적이고, 이는 비만에서 국소 및 전신성 염증의 효과를 조절하기 위한 유용한 제제일 수도 있음을 나타낸다.

실시예 Ⅲ

칼레빈 A에 의한 전신성 염증의 조절

본 발명자는 또한, 쥐과 호중구 시스템(murine neutrophil systems)에서 세포외 IL-1β 및 세포내 TNF를 억제하기 위해 칼레빈 A의 능력을 지지하기 위한 추가적인 증거를 제시하고 있다(표 Ⅱ, 표 Ⅲ). 호중구는, 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)와 함께 생체외 TNF-α 다음 자극을 생산하기 위해, 이들의 능력에 대해 테스트된 히스토파퀴 기울기 방법에 의해 분리된다(Neutrophils are isolated by histopaque gradient method tested for their ability to produce in vitro TNF-α following stimulation with Lipopolysaccharide (LPS)). 상기 세포는, 어둠 속에서 피코에리트린(phycoerythrin)(PE)-표지된 항-마우스 TNF-α와 함께 배양되고, 멸균 PBS와 세척된 후에, 샘플은 PBS (pH 7.4)에서 재현탁되고, 흐름 세포계산기(flow cytometer)(BDLSR; Becton Dickinson)에서 직접적으로 수득된다. 형광 트리거(fluorescence trigger)는, 제어된 호중구 개체군(the gated neutrophil populations)[10,000 사건(events)]의 상기 PE(FL1) 파라미터 상에서 놓여진다. 100 ㎍/ml에서의 로리프램(Rolipram)은 이러한 연구에서 TNF-α의 표준 저해제로서 사용되었다. 형광 보상(Fluorescence compensation), 데이터 분석, 및 데이터 제시(data presentation)는 Cell Quest Pro 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 수행되었다.

참고문헌

1. Clara, B., R. C. Arancha, G. M. Andre's, P. Atanasio, A. Julia, and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-α-secreting cells using direct immunofluorescence surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264:77-87.

2. Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani, Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-α cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009, 1939-1943.

[표 Ⅱ]

[표 Ⅲ]

본 발명자는, 처리된 마우스(생체내 모델)로부터의 혈청에서 세포외 TNF-α, IL-1 베타[도 6] 및 IL-6[도 7]의 발현을 감소시키기 위해, 칼레빈-A의 능력에서의 연구 데이터를 또한 추가적으로 제시하고 있다. 6 내지 8 주된 스위스 알비노 수컷 마우스는 12/12h 주야 주기(12/12 h light dark cycle)에서 22 ± 2 ℃에서 유지되었다. 마우스는 6 일 동안 단계별로 다른 투여량(graded doses)(w/v)으로 테스트 약물의 경구 처리를 받은 다음에, Brieva A, Guerrero A, Alonso-Lebrero J L and Pivel J P. 2001에 의해 기재된 방법에 따라 1 mg/kg의 LPS의 정맥내 주사를 받는다. 이무노페론(Inmunoferon), 천연의 기원의 당결합체(glycoconjugate of natural origin)는 LPS-유도된 TNF-α 생산 및 염증성 반응을 저해한다. International Immunopharmacology 1, 1979-1987. 6 마리의 마우스는 각각의 그룹에서 사용되었고, 실험은 세 번 수행되었다. TNF-α, IL-1 베타 및 IL-6 생산은, LPS 주입 후에 90 min, 처리된 마우스로부터의 혈청에서 상업적인 ELISA 키트(R&D Systems)에 의해 평가되었다. 30 mg/kg에서의 로리프램은 표준 약물로서 사용되었다.

도 6 및 7은, 칼레빈 A가 TNF-α, IL-1베타 및 IL-6를 감소시키는데 효과적임을 나타내고, 따라서 상기 화합물은 비만에서 국소 및 전신성 염증의 효과를 조절하는데 유용한 화합물임을 나타낸다.

실시예 Ⅳ

칼레빈 A에 의한 지방생성 저해

세포 배양 및 지방세포 분화

American Type Culture Collection (Rockville, MD)으로부터 구입한 마우스 3T3-L1 전-지방세포(pre-adipocytes)는, 습기 있는 5 % CO2 대기 하에서, 37 ℃에서, 2 mM 글루타민(GIBCO BRL), 1 % 페니실린/스트렙토마이신(10000 유닛(units)의 페니실린/mL 및 10 mg 스트렙토마이신/mL) 및 10 % 태아 송아지 혈청(FCS)으로 보충된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 성장되었다. 간단히, 세포는, 완전히 집합하기 위해(to full confluence), 10 % 소태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM을 가지는 24-웰(2×10⁴/mL) 또는 10 cm 접시 내로 접종되었다. 집합 후 2 일에(0 일로 정의됨), 세포는, 2 일 동안, 10 % FBS를 함유하는 DMEM에서 1.7 μM 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸메틸잔틴(IBMX) 및 12.7 μM 덱사메타손(DEX)을 함유하는 분화 배지(MDI)에서 배양되었다. 상기 배지는 매 2일 마다 교체되는 칼레빈 A와 함께 또는 칼레빈 A 없이, 10 % FBS 및 인슐린(1.7 μM)을 함유하는 DMEM으로 교체되었다. 배양 배지에서 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)의 최종 농도는 < 0.05 % 이었다. 상기 세포는 오일 레드 O 염색에 대해 8 일 후에(10 일에) 채취되었다.

오일 레드-O 염색

분화의 말단에서, 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 두 번 세척되고, 60 min 동안 10 % 포르말린으로 고정되고, 실온에서 1 h 동안 이소프로판올에서 0.5 % 오일 레드 O로 염색되었다. 과량의 오일 레드-O 염료는 증류수로 두 번 세척된 다음에 건조된다. 세포 내에 상기 염색된 지질 방울(stained lipid droplets)은 광학 현미경에 의해 시각화되고, 100× 배율에서 디지털 카메라로 사진 찍었다. 지질 축적을 수량화하기 위해, 상기 염색된 지질 방울이 이소프로판올에 용해되고, 상기 흡광도는 520 nm에서 측정되었다.

도 8은, 칼레빈 A가 3T3-L1 전지방세포(preadipocytes)의 분화(dierentiation) 및 지방생성을 저해함을 나타낸 것이다. 3T3-L1 전지방세포의 분화(Dierentiation)는 오일 레드 O로 염색되고, 사진찍혔다(윗 부분 및 중간 부분). 3T3-L1 전지방세포는, 2 일 동안 MDI(IBMX, DEX, 및 인슐린과 DMEM)와 배양된 다음에, 8 일 동안 각각, 칼레빈 A(0, 5, 10, 15, 20, 25 및 30 μM)와 함께 또는 칼레빈 A 없이 인슐린을 함유하는 DMEM으로 교체되었다. 지질 함량은 2-프로판올에 의해 오일 레드 O 염색된 세포로부터 추출되었고 520 nm에서 분광학적 분석에 의해 수량화되었다.

동물 실험-연구 Ⅰ

5 주된 수컷 C57BL/6J 마우스는, BioLASCO 실험적인 동물 센터(Taiwan Co., Ltd., Taipei, Taiwan)로부터 구매되었고, 12-h 낮/12-h 밤 주기로 조절된 대기(50 % 상대 습도에서 25 ± 1 ℃)에서 살았다. 순응의 1 주일 후에, 동물은, 하기와 같이 각각 8 마리의 동물의 4 개의 그룹으로 임의적으로 분배되었다: 12 주 동안, 각각, 정상 식단(ND, 지방으로서 15 % 에너지), 고지방 식단(HFD; 지방으로서 40 % 에너지), 및 0.25 % 또는 1 % 칼레빈 A로 보충된 HFD(2.5 g 또는 10 g 칼레빈 A /kg 식단)( 표 Ⅴ). 상기 실험적인 식단은 Purina 5001 식단(LabDiet, PMI Nutrition International) 으로부터 변경되었고, 상기 조성물은 표 Ⅳ에서 나열되었다. 동물은 항상 식량 및 물에 자유롭게 접근된다. 식품 컵은 매일 신선한 식단으로 보충되었다. 동물의 상기 식단 섭취는 매일 모니터링되었고, 체중은 매주 기록되었다. 이러한 연구에서 사용된 모든 동물의 실험적인 프로토콜은, 국립 카오슝 해양 대학교의 동물 보호 및 사용에 관한 관리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the National Kaohsiung Marine University, IACUC, NKMU)에 의해 승인되었다. 상기 연구의 말에, 모든 동물은 밤새 단식시키고, CO₂ 질식에 의해 희생되었다. 혈액 샘플은 생화학적 분석을 위해 심장으로부터 수집되었다. 간, 비장, 신장 및 지방체(fat pads)[페리고나달(perigonadal), 복막후(retroperitoneal) 및 그물막 지방(mesenteric fat)]는 즉시 제거하고, 중량을 측정하였고(표 Ⅵ), 사진 찍혔다. 도 9 (A)는, 12 주의 말에서 각각의 그룹의 대표적인 사진을 나타낸 것이다. 체중은 주마다 모니터링되었고, 각각의 그룹의 평균 체중은, 평균 ± SE로서 나타내었다. 통계분석은 스튜던트 t 테스트에 의해 수행되었다. ND 그룹과 비교된, (*) P < 0.01; HFD 그룹과 비교된, (#) P < 0.01. ND, 정상 식단 및 HFD, 고-지방 식단과 비교됨(도 9 (B)).

도 10a, 10b 및 10c는, 페리고나달 지방(perigonadal fat), 복막후 및 그물막 지방의 사진 및 % 상대적인 페리고나달, 복막후 및 그물막 지방 중량의 그래프적인 표시를 나타낸 것이다.

[표 Ⅳ]

[표 Ⅴ]

^a마우스는 물질 및 방법에서 기재된 바와 같이 12 주 동안 식단을 제공하였고, 체중은 매주 두 번씩 모니터링되었다. 각각의 그룹의 상기 평균 체중은 상기 평균 ±SE (n = 그룹 당 8)로서 나타내었고, 통계적 분석은 스튜던트 't' 테스트에 의해 실행되었다. ND, 정상 식단; HFD, 고-지방 식단. ND 그룹과 비교된 ^*, P< 0.01, 및 ^***, P< 0.0001. HFD 그룹과 비교된 #, P < 0.01, 및 ##P< 0.001(ND, normal diet; HFD, high-fat diet. ^*, P< 0.01, and ^***, P< 0.0001 compared with ND group. #, P < 0.01,and ##P< 0.001 compared with HFD group).

[표 Ⅵ]

^a마우스는, 12 주 동안 칼레빈 A 없이 또는 칼레빈 A로(0.25 및 1 %) 보충된 HFD를 제공되었다. 각각의 그룹의 마우스는 12 주의 말에 희생되었다; 상기 간, 비장, 및 신장은 제거되고, 사진 찍히고, 중량 측정되고, 기록되었다. 데이터는 평균 ± SE로서 나타내었다(n = 그룹 당 8). 상기 상대적인 장기 중량은, 체중의 퍼센트로서 나타내었다(간 중량/체중 × 100). ND, 정상 식단 및 HFD, 고-지방 식단.

동물 실험-연구 2-비만 포유동물 모델에서 체중 손실의 설명(DEMONSTRATION OF BODY WEIGHT LOSS IN OBESE MAMMALIAN MODELS)

상세한 테스트 시스템(Test System details)

테스트 성능(Test Performance)

A. 관리(Husbandry)

a. 조건 : 상기 동물은, 12 시간 낮 및 12 시간 밤 주기와 함께, 표준 실험 조건, 충분한 신선한 공기 공급(시간 당 공기 변화 12 내지 15)으로 공기-조절됨, 실온 22 ± 3 ℃, 상대습도 30 내지 70 % 하에 키워졌다(housed). 상기 온도 및 상대 습도는 매일 한 번 기록되었다.

b. 하우징(Housing): 개별적인 동물은, 스테인리스강 빨대 관이 설치된 물병에서 마시는 물 및 알갱이 사료(pellet feed)를 보유하기 위한 시설을 갖는 스테인리스강 메쉬 톱 그릴(stainless steel mesh top grill)을 갖는 표준 폴리프로필렌 케이지(크기 : L 290 x B 140 x H 140 mm)에서 키워졌다. 깨끗한 멸균된 벼의 겉껍질이 잠자리 물질(bedding material)로서 제공되었다.

c. 적응(Acclimatization) : 상기 동물은 실험실 조건에 5 일 동안 적응되었고, 매일의 임상적인 징후에 대해 관찰되었다.

d. 식단 : 상기 동물은, 상기 적응을 통해 Pranav Agro Industries Limited, Sangli, Maharastra에서 제조된 AMRUT 실험실 동물 사료와 함께 임의로 제공되었다. Research Diet Inc, USA procured from Indus Marketing, Hyderabad, Andhra Pradesh, INDIA에서 제조된, 오픈 소스 식단 D12450B 식단(Open Source Diet D_12450B diet)(10 kcal% 지방과 함께) 및 오픈 소스 식단 D12492 고지방 식단(60 kcal% 지방과 함께)은 비만 및 주요한 연구의 유도를 위해 사용되었다.

e. 물 : 깨끗한 마시는 물은, 상기 적응 및 비만 유도 기간 동안 임의로 제공되었다. 역 삼투 유닛(reverse osmosis unit)을 통해 통과된 깊은 구멍-벽 물(Deep bore-well water)은 스테인리스 강 빨대 관을 가지는 플라스틱 물병에서 제공되었다.

B. 그룹화(Grouping)

동물의 그룹화는, 체중 무작위 추출 및 계층화 방법(stratification method)에 의해 적응의 마지막 날에 실행되었다. 동물의 체중의 변화가 각각의 그룹의 평균 체중의 ±20 %를 초과하지 않게, 동물의 그룹화가 진행되었다.

C. 연구 계획

상기 동물은, 각각의 동물 10 마리(5 마리의 수컷 및 5 마리의 암컷)으로 이루어진 5 개의 그룹, 즉 그룹 1, 2, 3, 4 및 5로 나눠졌다. 각 그룹의 동물의 상기 그룹의 세부사항, 투여량 및 수/성별은 표 Ⅶ에 기재되어 있다.

[표 Ⅶ]

D. 동물 처리(Animal treatment)

a. 투여량 부피(Dose Volume): 투여량 부피/동물 = 상기 연구 기간을 통해 모든 동물에 대한 10 ml/kg 체중

b. 비만 유도 : 상기 G1 대조군 동물은, 10 kcal% 지방을 포함하는 D12450B가 제공된 정상 대조군 식단으로 공급되었고, 상기 G2 내지 G5 그룹의 동물은, 비만의 유도 동안에 및 주요한 연구 동안에 60 kcal% 지방을 포함하는 D12492가 제공된 고지방 식단으로 공급되었다.

c. 주요한 연구 : 상기 주요한 연구는 비만의 유도 후에 시작되었다. 칼레빈 A의 3 번의 투여는, 28 일의 기간 동안 연속하여 29 일(Day 29)로부터 동물에 투여되었다. 식단의 공급(feeding)은, 비만의 유도에서 실행된 바와 같이 유사한 방식으로 상기 주요한 연구에서 지속되었다. 상기 G1 대조군 및 G2 고지방 식단 대조군 동물은 0.5 % CMC(카르복시 메틸 셀룰로오스)로 투여된 반면에, 다른 그룹의 동물은 연구의 기간의 29 일 내지 56 일 동안 테스트 항목(test item)을 제공하였다. 투여의 투여량 부피는 개별적인 동물의 매주의 체중에 따라 유지되었다. 상기 연구의 전체 지속 기간은 61 일(5 일의 적응 기간 + 28일의 비만의 유도 + 28일의 주요한 연구)이었다.

통계 분석 : 본 연구로부터 수득된 미가공 데이터는, 컴퓨터 통계 처리(computer statistical processing)를 받았다. 상기 데이터의 컴퓨터 프린트아웃(computer printout)[부록의 형태로(in the form of appendix)]은 원래의 미가공 데이터와 확인되었다. 확인 후에, 상기 데이터는, GraphPad Prism version 5.01, GraphPad 소프트웨어를 사용한, 체중, 혈액학(hematology) 및 임상적인 화학 파라미터, 기관 무게(organ weights)에서 상기 데이터를 위한 두네트의 포스트 테스트(Dunnett's post test)와 함께, 일원 ANOVA(One-way ANOVA)(분산분석)을 하였다. 모든 분석 및 비교는, 하기에 기재된 바와 같은 보고를 통해 G1이 G3, G4, G5, 및 G6와 비교한 경우 ^a의 윗첨자 및 G2가 G3, G4, G5, 및 G6와 비교한 경우 ^b의 윗 첨자로 지정된 것에 의해 나타낸, 95 % 레벨의 신뢰(confidence)(P<0.05)로 평가되었다 : ^*: 어디든 적용가능한 통계학적으로 중요함(P<0.05)[Statistically significant (P<0.05) wherever applicable].

상기 데이터는 하기와 비교됨에 의해 일원 - ANOVA 통계적인 분석을 받았다(The data were subjected to One way - ANOVA statistical analysis by comparing the following) :

하기에 나타낸 바와 같이, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% 지방)} 대(to) G3 그룹{칼레빈 A 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A-10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)} 및 G5 그룹{칼레빈 A-20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}:

하기에 나타낸 바와 같이, G2 - 고지방 식단 대조군(with 60 kcal% Fat) 대(to) G3 그룹{칼레빈 A 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A-10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)} 및 G5 그룹{칼레빈 A 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}:

결과

체중 : 개별적인 동물 체중은, 상기 연구 기간 동안 Day 1 및 그 후에 매주(±1 일)에 처방(receipt)의 날에 기록되어 있다.

수컷 및 암컷 동물의 매주 체중의 요약은 각각 표 Ⅷ(a)/Ⅷ(b) 및 Ⅸ(a)/Ⅸ(b)에 기재되어 있다.

[표 Ⅷ(a)]

[표 Ⅷ(b)]

[표 Ⅸ(a)]

[표 Ⅸ(b)]

수컷 동물에서, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% Fat)}과 비교된 G5 그룹{칼레빈 A - 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 15에 평균 매주 체중 수치에서 통계학적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 먹이의 지방 함량에서의 차이와 관련된 것으로 고려되었다.

수컷 동물에서, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A - 10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G5 그룹{칼레빈 A - 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 22 및 Day 29에서의 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 먹이의 지방 함량에서의 차이로 인한 것으로 고려되었다.

수컷 동물에서, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 36에 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 먹이의 지방 함량에서의 차이로 인한 것으로 고려되었다.

수컷 동물에서, G2 그룹{고지방 식단 대조군(with 60 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A - 10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 36에서의 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 감소가 있었다. 이러한 변화는 테스트 항목 칼레빈 A의 투여의 효과와 관련된 것으로 고려되었다.

수컷 동물에서, G2 그룹{고지방 식단 대조군(with 60 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A - 10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G5 그룹{칼레빈 A - 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 43, 50 및 Day 56에서의 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 감소가 있었다. 이러한 변화는 테스트 항목 칼레빈 A의 투여의 효과와 관련된 것으로 고려되었다.

암컷 동물에서, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% 지방)}과 비교된 G5 그룹{칼레빈 A - 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 15 및 Day 22에 평균 매주 체중 수치에서 통계학적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 먹이의 지방 함량에서의 차이와 관련된 것으로 고려되었다.

암컷 동물에서, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A - 10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G5 그룹{칼레빈 A - 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 29 및 Day 36에서의 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 먹이의 지방 함량에서의 차이로 인한 것으로 고려되었다.

암컷 동물에서, G1 그룹{대조군(with 10 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A - 10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 43에서의 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 먹이의 지방 함량에서의 차이로 인한 것으로 고려되었다.

암컷 동물에서, G2 그룹{고지방 식단 대조군(with 60 kcal% 지방)}과 비교된 G3 그룹{칼레빈 A - 5 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G4 그룹{칼레빈 A - 10 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}, G5 그룹{칼레빈 A - 20 mg/kg + 고지방 식단(with 60 kcal% 지방)}에서 Day 43, 50 및 Day 56에서의 평균 매주 체중 수치에서의 통계학적으로 중요한 감소가 있었다. 이러한 변화는 테스트 항목 칼레빈 A의 투여의 효과와 관련된 것으로 고려되었다.

따라서, 칼레빈 A가, 5, 10 및 20 mg/kg 체중의 테스트 농도에서 고지방 식단 유도된 비만 수컷 및 암컷 C57 동물의 체중을 감소시키는 효과를 가지는 것으로 결론을 내릴 수 있었다.

게다가, 상기 연구 기간(Day 57)의 완료 후에, 상기 동물은 가스 챔버에서 과량의 CO₂에 노출됨으로써 인도적으로 희생되었고, 장기 중량에 주목되었다. 모든 동물로부터의 뇌, 흉선, 간, 부신(adrenals), 신장(한 쌍), 비장, 심장 및 난소/고환(한 쌍)은, 건조되는 것을 피하기 위해 가능한 한 적절한 및 계량된 습기로서, 어떠한 점착성 조직을 다듬어 없앴다. 일반적으로, 수컷 및 암컷에서 장기 중량에서 통계학적으로 중요한 차이점도 없지만, 수컷 그룹에서 예를 들어 간의 중량에서 장기 특이적인 개선이 관찰될 수 있었다(표 X를 참고하라). 이러한 결과는 간에 대한 표 Ⅵ에서와 같은 것들과 제공한다. Behnke, A. R. 1953. Lean body mass. A.M.A. Arch. Int. Med. 91, 585에서는 무지방 신체 질량 촉진의 지수(index of lean body mass promotion)로서 간을 나타내고, H.F.Kraybill et al, J ANIM SCI 1954, 13:548-555에서는, 다른 내장 장기가 무지방 신체 질량 촉진과 또한 동등하게 예측될 수도 있음을 나타냄을 주목할 수도 있다. 독성의 표시 없이 장기 중량에서 지속가능한 증가에 관하여 통계적 유의도가 확장된 테스트 기간을 초과하여, 보다 큰 샘플 크기(보다 많은 테스트된 동물)로 달성될 수도 있는 가능성이 크다. 표 Ⅵ 및 표 Ⅹ의 결과는, 지방 생성을 저해하고, 체중을 감소시킬 뿐만 아니라, 무지방 신체질량을 촉진하는 칼레빈 A의 가능성의 예비 표시(preliminary indication)로서 해석될 수도 있다.

[표 Ⅹ]

게다가, 상기 연구 기간의 완성에서, 혈액 샘플은, 렙틴 및 아디포넥틴의 전신성 발현의 평가를 위한 포타슘 에틸렌 디-아미드 테트라 아세트산(K2-EDTA) 항응고제를 함유하는 튜브에 모든 동물로부터 수집되었다. 혈액 샘플은, 미세한 모세관의 도움으로 가벼운 에테르 마취 하에서 눈 뒷쪽 망 천공 방법(retro-orbital plexus puncture method)으로부터 인도적으로 수집되었다. 항응고제 없이 튜브에서 수집된 혈액 샘플은, 렙틴 및 아디포넥틴의 평가를 위한 ELISA 기술을 받아, 혈청을 수득하기 위해 10 분 동안 3000 rpm에서 원심분리되었다. 비만에서의 바이오마커로서 렙틴 및 아디포넥틴 발현의 중요성은, 단락 [0050] 및 [0051]에 잘 기재되어 있다. 칼레빈 A 는 비만 동물의 혈청에서 렙티의 발현의 저해에서의 현저한 효과를 나타내었고(도 11), 비만 동물의 혈청 레벨에서 아디포넥틴 발현을 높이는데 있어서 중요한 효과를 나타내었다(도 12). 낮은 전신성 아디포넥틴 레벨은, 제2형 당뇨병과 같은 질병 상태의 진행에서 예측 인자(predictive factors)로서 인용되고 있다(Chamukuttan Snehalatha et al, "Plasma Adiponectin Is an Independent Predictor of Type 2 Diabetes in Asian Indians", Diabetes Care December 2003 vol. 26 no. 12 3226-3229). 비만의 포유동물 모델에서, 전신성 아디포넥틴의 레벨을 현저하게 증진시키기 위한 칼레빈 A의 능력은, 상기 포유동물에서 제2형 당뇨병의 발병을 예방하는데 있어서 도움을 주기 위한 이의 능력을 나타낸다.

지방 분해 및 지방세포 크기(lipocyte size)에서의 칼레빈 A 및 이의 효과

단락 [0067] 및 [0068]에서 서술된 절차상의 단계에 기재된 바와 같이, 칼레빈 A로 미리 처리되지 않는 완전하게 분화된 지방세포(8 일)는, 5 내지 30 μM의 농도에서 칼레빈 A로 처리되었다. 지방 분해는, 상기 세포 배양 배지 내로 방출하고 이의 검출하는 글리세롤로의 지질의 분해와 연결되어 있다. 5 내지 20 μM의 농도에서 칼레빈 A가 배지 내로 글리세롤의 방출을 야기하지 않는 것으로 관찰되었다. 글리세롤은, 30 μM의 농도로 칼레빈 A가 지방 세포를 처리하는데 사용된 경우에 검출되었다. 따라서, 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 지방세포에서 지방 분해를 유도하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은, 상기 지방세포에서 투여량 의존적인 지방분해의 효과를 유발하도록, 칼레빈 A의 다양한 농도로 포유동물 지방세포를 처리하는 단계를 포함한다. 상기 본원에 단락 [0073] 및 [0074]와 관련하여, 12 주의 기간 동안 HFD로 처리하고, 일반적인 지방 결합 조직에서 또는 정소상체 지방(epididymal fat)(지방세포)의 조직학적 절편을 평가함으로써 수컷 C57BL/6J 마우스에서 비만의 유도는, 크기에서 지방세포의 현저한 확장을 나타내었다. 정소상체 지방체(Epididymal fat pads)는 절개되고, 적어도 24 시간 동안 10 % 완충된 포르말린에서 고정된 다음에, 일련의 에탄올 용액으로 건조되고, 파라핀에 끼워넣기 위해 가공처리되었다. 두께에서 5 내지 6 μm의 절편이 잘리고, 탈-파라핀화되고(de-paraffinized), 다시 수화되고, 헤마톡실린 & 에오신(H&E)로 염색되고, 현미경 사진 평가를 받았다. 지방 세포 크기는, 절편 당 10 임의적인 필드(10 random fields per section)에서 200 X 확대로 접안 마이크로미터가 갖춰진, Nikon 광학현미경(일본)을 사용하여 측정되었다. 상기 HFD 마우스는 0.25 % 및 1 %의 농도로 칼레빈 A로 처리된 경우에, 지방세포의 크기에서 현저한 감소가 관찰되었고, 지방세포는 정상 형태를 나타내었다(도 13). 따라서, 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 비만 포유동물의 지방 조직에서 지방세포 크기를 복원(restoring)하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은, 지방 조직에서 정상 지방세포 크기의 복원의 효과를 달성하도록, (a) 고지방 식이요법에 기인하는 확장된 포유동물 지방세포 및 (b) 칼레빈-A의 유효 농도의 경구 투여를 통해 유도된 칼레빈 A를 상기 포유동물에 접촉시키는 단계를 포함한다(the present invention relates to a method of restoring adipocyte size in the fat tissue of obese mammals, said method comprising step of bringing into contact (a) enlarged mammalian adipocytes wherein enlargement resulting from a high fat diet regime, and (b) Calebin A derived through the oral administration of effective concentrations of Calebin A to said mammals, to achieve the effect of restoration of normal adipocyte size in fat tissue).

칼레빈 A 및 고지방 식단으로 제공된 마우스에서 유도된 간 지방증에서 이의 효과(도 14).

12 주의 기간 동안 HFD 제공된 C57BL/6J 마우스는, GOT 및 GTP의 혈청 레벨에 대해 평가되었다. 결과는, ND 그룹과 비교된 경우에, 높아진 혈청 GOT 및 GTP 를 나타내었다(표 XI).

[표 XI]

데이터는 평균 ± SE(n = 그룹 당 8)로서 나타내었다. 상이한 레벨(a,b,c)을 가지는 각각의 컬럼 내의 평균 수치는, 일원 - ANOVA 및 던컨의 다중 검정(one-way ANOVA and Duncan's Multiple Range Test)에 의해 현저하게 상이하다(p<0.05). ND: 정상 식단; HFD: 고지방 식단.

상기 ND 그룹과 비교된, 상기 HFD 그룹의 간은, 비대한 형태론적 관찰(gross morphological observation)에서 나타낸 바와 같이 현저하게 확장되었다(HFD 유도된 간 손상-간 지방증). 상이한 그룹에서 간의 일부는 해부되었고, 적어도 24 시간 동안 10 % 완충된 포르말린에서 고정된 다음에, 일련의 에탄올 용액으로 건조되고, 파라핀에 끼워넣기 위해 가공처리되었다. 두께에서 5 내지 6 μm의 절편이 잘리고, 탈-파라핀화되고(de-paraffinized), 다시 수화되고, 헤마톡실린 & 에오신(H&E)로 염색되고, 현미경 사진 평가를 받았다. 간 조직병리학은, Kleiner, D.E., Brunt, E.M., Van, N.M., Behling, C. et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005, 41, 1313-1321에 서술된 NAFLD 시스템에 따라 평가되었다. 간세포 풍선(hepatocellular ballooning)의 점수는, H&E 염색된 절편에서, x200 배율에서 필드 당 풍선 세포(balloon cell)의 수를 기초로 0 내지 2로 등급이 나눠졌다(등급 : 0 = 어떠한 풍선 세포도 없음; 1 = 많지 않은 풍선 세포; 2 = 현저한 풍선 세포). 침윤성 면역 세포(infiltrating immune cells)의 수는 다섯 개의 상이한 영역에서 200x 배율에서 계산되었다. 상기 HFD 그룹에서, 현저한 염증성 변성, 간세포의 풍선 변성 및 트리글리세리드 축적을 나타내었다. 정량 분석은, ND 그룹과 비교된 것과 증진된 간의 트리글리세리드 레벨을 나타내었다. 0.25 % 및 1 %의 농도에서의 칼레빈 A의 투여는, 투여량 의존적인 방식으로, HFD 유도된 트리글리세리드, 간세포의 풍선 변형 및 염증성 침윤을 약화시킨다. 이에 따라서, 다른 대부분 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 포유동물에서 고지방 식단(HFD) 유도된 간 지방증을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은, 투여량 의존적인 방식으로, 간 지방증의 감소의 효과를 유발하도록, 칼레빈 A의 유효 농도를, 상기 포유동물에게 경구적으로 투여하는 것으로부터 유도된 칼레빈-A를, 염증성 침윤, 간세포의 풍선 변성 및 높은 트리글리세리드 레벨에 의해 표시된 HFD 영향받은 간 세포에 접촉시키는 단계를 포함한다(the present invention relates to a method of treating high fat diet (HFD) induced hepatic steatosis in mammals, said method comprising step of bringing into contact HFD affected hepatic cells marked by inflammatory infiltration, hepatocellular ballooning degeneration and high triglyceride levels with Calebin A derived from orally administering to said mammals effective concentrations of Calebin A to bring about the effect of attenuation of hepatic steatosis in a dose dependant manner). 대안적으로, 다른 대부분 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 또한, 포유동물에서 고지방 식단(HFD) 유도된 간 지방증을 치료하기 위한 칼레빈 A에 관한 것이다.

본 발명은 바람직한 실시형태에 관해 기재되어 있으며, 본 발명이 이로 제한되지 않음을 본 분야의 통상의 기술자에 의해 명확하게 이해될 것이다. 다만, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구의 범위와 함께 해석될 것이다.

Claims (4)

1. 간의 지방세포에서 투여량 의존적인 지방분해(dose dependant lipolysis)의 효과를 유발하도록, 칼레빈-A의 농도 변화로(with varying concentrations of Calebin-A) 비 알코올성 간 지방증(non-alcoholic hepatic steatosis)을 갖는 인간을 제외한 포유동물에서의 간의 지방세포(adipocytes)를 치료하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서의 간의 지방세포에서 지방분해를 유도하여 비 알코올성 간 지방증을 치료하기 위한 방법.
   
2. 간의 지방 조직에서 정상 지방세포 크기의 복원의 효과를 달성하도록, (a) 고지방 식이요법에 기인하는 비 알코올성 간 지방증을 갖는 인간을 제외한 포유동물에서의 확장된 간의 지방세포, 및 (b) 칼레빈-A의 유효 농도의 경구 투여를 통해 유도된 칼레빈 A를 상기 포유동물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 인간을 제외한 포유동물에서의 간의 지방 조직에서 지방세포의 크기를 복원시켜 비 알코올성 간 지방증을 치료하기 위한 방법.
   
3. 투여량 의존적인 방식으로, 비 알코올성 간 지방증(non alcoholic hepatosteatosis)의 증상을 가지는 간 지방증(hepatic steatosis)의 감소의 효과를 유발하도록, 칼레빈-A의 유효 농도를, 인간을 제외한 포유동물에게 경구적으로 투여하는 것으로부터 유도된 칼레빈-A를 염증성 침윤(inflammatory infiltration), 간세포의 풍선 변성(hepatocellular ballooning degeneration) 및 높은 트리글리세리드 레벨에 의해 표시된 고지방 식단(HFD) 영향받은 간 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 비 알코올성 간 지방증의 증상을 가지는 고지방 식단(HFD) 유도된 간 지방증을 치료하는 방법.
   
4. 칼레빈 A의 유효량을 포함하는, 비 알코올성 간 지방증의 증상을 가지는 간 지방증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
   

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