RU2621279C2 - Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов - Google Patents

Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов Download PDF

Info

Publication number
RU2621279C2
RU2621279C2 RU2015147710A RU2015147710A RU2621279C2 RU 2621279 C2 RU2621279 C2 RU 2621279C2 RU 2015147710 A RU2015147710 A RU 2015147710A RU 2015147710 A RU2015147710 A RU 2015147710A RU 2621279 C2 RU2621279 C2 RU 2621279C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
strain
recipient
design
aspergillus awamori
vkpm
Prior art date
Application number
RU2015147710A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015147710A (ru
Inventor
Юрий Александрович Рыбаков
Иван Александрович Лаптев
Татьяна Валентиновна Артюшкина
Сергей Павлович Синеокий
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика")
Priority to RU2015147710A priority Critical patent/RU2621279C2/ru
Publication of RU2015147710A publication Critical patent/RU2015147710A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2621279C2 publication Critical patent/RU2621279C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/665—Aspergillus awamori

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к применению штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов. Настоящее изобретение позволяет конструировать продуцентов рекомбинантных целевых ферментов, в том числе продуцентов ксиланаз и маннаназ. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности и касается применения штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148.
В настоящее время в мировой практике для повышения уровня биосинтеза целевых ферментов грибными продуцентами широко применяют технологии рекомбинантных ДНК. При создании продуцентов гемицеллюлаз мицелиальные грибы не только служат источником генов ферментов с технологически важными свойствами, но и часто используются в качестве реципиентов. В последние годы создан целый ряд рекомбинантных штаммов на основе аспергиллов, эффективно экспрессирующих гомологичные и гетерологичные гены, в частности гены гемицеллюлаз. Имеется ряд примеров успешного клонирования генов ксиланазы аспергиллов в клетках аспергиллов того же или другого вида: экспрессия гена ксиланазы A. niger, в результате которой были получены стабильные трансформанты с продукцией ксиланазы 625 ед./мл [1]; экспрессия гена маннаназы man1 Aspergillus aculeatus в клетках A. niger, где был достигнут выход фермента 1000 ед./мл [2], использование системы клонирования A. niger для наработки ксиланазы A. tubigensis [ЕР 0463706], экспрессия гена маннаназы A. aculeatus в A. oryzae [US 5795764]. На основе рекомбинантных штаммов A. niger - CBS 109.713 и DSM 18404 - создан двухкомпонентный ферментный препарат Natugrain TS с активностью ксиланазы и β-глюканазы 5600 ед./г и 2500 ед./г соответственно [3].
Известны также штаммы-продуценты гемицеллюлаз, полученные путем гетерологичной экспрессии генов из различных других грибов в системе клонирования Aspergillus. Множественная интеграция гена xemA термостабильной ксиланазы Talaromyces emersonii в клетках Aspergillus niger привела к получению рекомбинантного фермента, на основе которого создан препарат Natugrain Wheat TS [4]. Препарат Ronozyme WX, созданный в компании DSM, содержит термостабильную ксиланазу мицелиального гриба Т. lanuginosus DSM 4109, клонированную в генно-модифицированном штамме A. oryzae [5]. Введение гена ксиланазы Penicillum canescens в клетки продуцента глюкоамилазы A. awamori позволило получить штамм с высокими уровнями продукции обоих ферментов, при этом уровень активности ксиланазы составляет 150-200% относительно исходного штамма [6].
Возможность использования конкретного штамма в качестве реципиента определяют как его способностью экспрессировать чужеродную ДНК (трансформируемость), так и наличием у него низкого уровня продукции секреторных протеаз, что обеспечивает стабильность синтезируемого рекомбинантного фермента. К дополнительным преимуществам видов рода Aspergillus в качестве реципиентов относят такие технологически значимые признаки, как способность расти на простых по составу питательных средах в достаточно широких диапазонах температур и рН, способность эффективно секретировать ферменты в среду.
Технической задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала мицелиальных грибов, пригодных для конструирования на их основе штаммов-продуцентов, способных экспрессировать целевой белок.
Задача решена путем применения штамма Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве реципиента для конструирования на его основе штаммов, способных экспрессировать целевые ферменты.
Штамм отобран в ходе скрининга коллекции аспергиллов ВКПМ для выявления наиболее активных продуцентов гемицеллюлаз. Ранее он был депонирован в ВКПМ как продуцент α-галактозидазы [7], регистрационный номер ВКПМ F-148.
Культурально-морфологические признаки штамма A. awamori ВКПМ F-148
Макроскопические характеристики: после 7 суток роста колонии на агаре Чапека имеют диаметр 35-40 мм, темно-серые с тонким ободком белого мицелия (1-2 мм), радиально-складчатые, реверс по центру светло-желтый, сильноскладчатый.
На агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 25°С диаметр колонии 60 мм; колонии темно-серые с широким ободком белого мицелия, хлопьевидно опушенные, слегка радиально-бороздчатые, реверс по центру светло-коричневый, сильноскладчатый (складки в виде лучей).
Диаметр колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом при 37°С равен 50-60 мм; колонии темно-серые с коричневым оттенком, складчатые (в центре неупорядоченно, на периферии радиально) с белым ободком; реверс коричневый по центру, мелкоскладчатый, радиально-волнистый.
Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S) при 25°С имеют диаметр 45-50 мм, темно-серые с широким белым ободком вегетативного мицелия, реверс по центру желтовато-светлокоричневый, сильноскладчатый (лучами и произвольно).
Колонии на Мальт-агаре (МЕА) 60 мм в диаметре, серые с ободком белого мицелия, плоские, рыхлые, реверс чуть темнее среды, складчатый (складки в виде тонких лучей).
Микроскопические характеристики: конидиальные головки шаровидные, затем рыхлорадиальные, распадающиеся на отдельные колонки, конидиеносцы слабо окрашенные в верней части, гладкостенные, длиной 600-1000 мкм и толщиной 6-12 мкм, везикулы шаровидные 20-45 мкм в диаметре, покрытые метулами по большей части поверхности. Штамм бисериатный, метулы 15-20×4-7 мкм, фиалиды 5-8×2-4 мкм. Конидии шаровидные, 3-6 мкм, гладкие, серые.
Физиолого-биохимические свойства штамма: хорошо утилизирует глюкозу, сахарозу, арабинозу, рамнозу, слабо - лактозу, галактозу, сорбозу и креатин.
Штамм ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты.
Для таксономической характеристики штамма F-148, наряду с морфологическими и биохимическими тестами, проведена молекулярно-генетическая идентификация по следующим маркерам: нуклеотидная последовательность домена D1/D2 28S субъединицы рибосомальной РНК, нуклеотидная последовательность внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS4 гена 5.8S рРНК. Результаты идентификации подтверждают принадлежность штамма ВКПМ F-148 к виду Aspergillus awamori.
При исследовании спектра секретируемых ферментов штамма A. awamori ВКПМ F-148 и их активностей продуцент выращивали на ферментационной среде следующего состава (масс. %): отруби пшеничные - 2,0; свекловичный жом - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaNO3 - 0,6; КН2РO4 - 0,15; КСl - 0,05; MgSO4 × 7Н2O - 0,05; смесь микроэлементов - 0,2 мл; рН 6,0. Состав смеси микроэлементов (масс. %): ЭДТА - 1,0; ZnSO4 × 7Н2O - 0,44; MnCl2 × 4Н2O - 0,1; СоСl2 × 6Н2O - 0,032; CuSO4 × 5Н2O - 0,0315; (NH4)6Mo7O24 × 4Н2O - 0,022; СаСl2 × 2Н2O - 0,147; FeSO4 × 7Н2O - 0,1, вода дистиллированная - остальное, рН 6,2. Измерение активности проводили колориметрическим методом с 3,5-динитросалициловой кислотой (ДНС) [8]. Получены следующие результаты: ксиланаза - 76,3 ед./мл, маннаназа - 16,5 ед./мл, β-глюканаза - 3,8 ед./мл, пектиназа - 1,8 ед./мл. Температурные оптимумы ферментов в основном составляют 50°С, а рН-оптимумы находятся в интервале рН 4,0-6,0. Показатели термостабильности ферментов не выходят за пределы 60°С, а рН-стабильность наиболее выражена в диапазоне рН 4,0-7,0, при этом ферменты обнаруживают высокую устойчивость к протеолизу панкреатическими ферментами.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг. 1. Генетическая карта плазмиды pGTexp.
Фиг. 2. Генетическая карта плазмиды pGT-xyn1.
Фиг. 3. Генетическая карта плазмиды pGT-man1.
Пример 1. Получение продуцента ксиланазы с использованием в качестве реципиента штамма Aspergillus awamori ВКПМ F-148
Конструирование плазмид для экспрессии гена ксиланазы
Конструируют базовый экспрессионный вектор pGTexp, на основе которого получают плазмиду pGT-xyn1, предназначенную для множественной интеграции в геном Aspergillus awamori ВКПМ F-148.
Базовая плазмида pGTexp представляет собой стандартный вектор pUC19, между сайтами BamHI и XbaI которого находятся промотор gpdA, кодон ATG, интрон гена gpdA, а также терминатор trpC. Промотор gpdA, интрон гена gpdA, а также терминатор trpC получают с помощью ПЦР, в качестве матрицы используют плазмиду рМЕ2891 (FGSC 645 = ВКПМ В-10715) [9], а также пар праймеров: gpdA -F 5'-ggggatcctaatacagcccctacaacgacc-3' - gpdA -R 5'-cttcccgtacgcgaagacagcatggtgatgtctgctcaagcg-3' и trpC-F 5'-cttcgcgtacgggaagactggcgcctgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacg-3', - trpC-R 5'-cgactctagaaagaaggattacctctaaacaagtgtacc-3' соответственно. После наработки полученные фрагменты сшивают друг с другом методом ПЦР при использовании пары праймеров gpdA-F 5'-ggggatcctaatacagcccctacaacgacc-3' - trpC-R 5'-cgactctagaaagaaggattacctctaaacaagtgtacc-3' и затем клонируют между сайтами BamHI и XbaI вектора pUC 19.
Ген xyn1 синтезируют методом ПЦР, в качестве матрицы используют геномную ДНК Trichoderma reesei Rut С-30 (ВКПМ F-1093). Кодирующие области гена xyn1, включая сигнальную последовательность, амплифицируют с помощью двух пар праймеров:
Xyn1-1-F 5'-gtgaagacttcatggtctccttcacctccctcc-3' - Xyn1-1-R 5'-gttgatgaccttgttcttggtgccgggctgcc-3' и Xyn1-2-F 5'-ccaagaacaaggtcatcaacttctcgggcagc-3' - Xyn1-2-R 5'-tgaagactggcgccttagctgacggtgatggaagcagagcc-3'. После наработки полученные фрагменты сшивают друг с другом методом ПЦР при использовании пары праймеров Xyn1-1-F 5'-gtgaagacttcatggtctccttcacctccctcc-3' - Xyn1-2-R 5'-tgaagactggcgccttagctgacggtgatggaagcagagcc-3' с образованием ПЦР-фрагмента - гена xyn1, не содержащего интроны. Полученный фрагмент обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BpiI и клонируют в вектор pGTexp, обработанный сходным образом, в результате чего получают плазмиду pGT-xyn1.
Трансформация и культивирование
Штамм A. awamori ВКПМ F-148 трансформируют методом котрансформации плазмидой pGT-xyn1 в смеси со вспомогательной плазмидой p3SR2 (FGSC 66), полученной из коллекции Fungal Genetics Stock Center (США) и депонированной в ВКПМ (В-10724). Трансформацию проводят с использованием протопластов согласно стандартным методикам [10; 11]. Трансформационная смесь содержит около 107 протопластов в 100 мкл суспензии и 1-2 мкг плазмидной ДНК. Аликвоты трансформационной смеси переносят на поверхность чашки Петри с селективно-регенерационной средой, содержащей (масс. %) сорбит - 18,2, дрожжевой экстракт - 0,5, казаминовые кислоты - 0,2, хлорид цезия - 0,25, селективный агент - ацетамид - 0,059, смесь микроэлементов - 0,2 мл, вода дистиллированная - остальное [12]. Чашки инкубируют при 28°С в течение 5 дней, после чего выросшие трансформанты очищают двумя пассажами на чашках Петри с аналогичной средой.
Выход трансформантов в описанных условиях составляет 100-150 клонов/мкг ДНК.
Оценка уровня активности ксиланазы у полученных трансформантов
Исходный штамм и трансформанты выращивают в течение 5 дней при 28°С в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл модельной среды 2хММ с 10% глюкозы [12].
Биомассу отделяют фильтрованием через фильтровальную бумагу Ватман №1, а затем надосадочную жидкость осветляют центрифугированием 15 мин при 5000 об/мин. Активность ксиланазы в полученном центрифугате оценивают по способности гидролизовать субстрат, в качестве которого используют 2,0% раствор ксилана из древесины бука (Sigma) в 0,05 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,5.
Из приведенных в табл. 1 данных видно, что активность ксиланазы у трансформантов намного превышает активность родительского штамма, максимальная ксиланазная активность составила 297 ед./мл.
Figure 00000001
Пример 2. Получение продуцента маннаназы с использованием в качестве реципиента штамма Aspergillus awamori ВКПМ F-148
Конструирование плазмиды для экспрессии гена маннаназы
На основе базового экспрессионного вектора pGTexp конструируют плазмиду pGT-man1, предназначенную для множественной интеграции в геном Aspergillus awamori F-148. Для экспрессии гена, кодирующего маннаназу гриба Aspergillus aculeatus, ген man1 синтезируют методом ПЦР, в качестве матрицы используют геномную ДНК Aspergillus aculeatus ВКПМ F-1086. Кодирующие области гена man1, включая сигнальную последовательность, амплифицируют с помощью трех пар праймеров:
Man1-1-F 5'-gtgaagacttcatgaagctttctcacatgctcc-3' - Man1-1-R 5'-gaagccctcatcgccaatcgtgaccaggtgc-3',
Man1-2-F 5'-gattggcgatgagggcttcggtctcgacgtcgactcc-3' - Man1-2-R 5'-ggtgccccagctatcggggtacagatgc-3' и
Man1-3-F 5'-cgatagctggggcacctcctacgactgg-3' - Man1-3-R 5'-tgaagactggcgccttacttcgactgcgcattgatgg-3'. После наработки полученные фрагменты сшивают друг с другом методом ПЦР при использовании пары праймеров Man1-1-F 5'-gtgaagacttcatgaagctttctcacatgctcc-3'- Man1-3-R 5'-tgaagactggcgccttacttcgactgcgcattgatgg-3' с образованием ПЦР-фрагмента - гена man1, не содержащего интроны. Полученный фрагмент обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BpiI и клонируют в вектор pGTexp, обработанный сходным образом, в результате чего получают плазмиду pGT-man1.
Трансформация и культивирование
Штамм A. awamori ВКПМ F-148 трансформируют плазмидой pGT-man1, в смеси с вспомогательной плазмидой p3SR2. Трансформацию и культивирование трансформантов проводят, как описано в Примере 1.
Оценка уровня активности маннаназы
Активность маннаназы определяют по методике, аналогичной определению активности ксиланазы, в качестве субстрата используют 1,0% раствор галактоманнана (камеди плодов рожкового дерева, Sigma) в 0,05 М натрий-цитратном буфере рН 4,8.
Из приведенных в таблице 2 данных видно, что активность маннаназы из культуральной жидкости штаммов, трансформированных плазмидой pGT-man1, намного превышает активность родительского штамма, при этом наибольшая маннаназная активность составила 319 ед./мл.
Таким образом, подтверждено эффективное применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве штамма-реципиента для конструирования продуцентов, способных синтезировать целевой белок, в частности ксиланазу и маннаназу.
Дополнительным преимуществом штамма Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве перспективного реципиента для клонирования генов грибов, в частности генов гемицеллюлаз, является низкий уровень секретируемых протеаз на всех средах, что уменьшает опасность протеолиза рекомбинантных полипептидов и тем самым повышает их стабильность.
Figure 00000002
Очень важным является также то, что штаммы вида Aspergillus awamori непатогенны и имеют длительную историю безопасного применения, а многие препараты на их основе получили за рубежом статус GRAS (Generally recognized as safe), т.е. признаны безопасными для использования в различных отраслях промышленности, в частности в пищевой и кормопроизводстве. Это дает возможность использовать штамм A. awamori F-148 для конструирования штаммов-продуцентов ферментов для использования в промышленности.
Литература
1. Levasseur A., Asther М., Record Е. // Canadian Journal of Microbiology. - 2005. - V. 51. - P. 177-183.
2. van Zyl P.J, Moodley V., Rose S.H., Roth R.L., van Zyl W.H. // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 2009. - V. 36. P. 611-617.
3. EFSA Journal. - 2013. - V. 11. - P. 3385-2294.
4. WO 02/24926.
5. WO 2003062409.
6. RU 2457246.
7. A.C. СССР 958503.
8. Miller C.L. Analytical Chemistry. - 1959. - V. 31. - P. 436-428.
9. Krappmann S., Bayram O., Braus G.H. // Eukaryotic Cell. - 2005. - V. 4. - P. 1298-1307.
10. He Z. - M., Price M.S., O'Brian G.R., Georgianna D.R., Payne G.A. // BMC Microbiology. - 2007. - V. 7: 104. - 11 P.
11. De Bekker C., Wiebenga A., Aguilar G., Wosten H.A.B. - Journal of Microbiological methods. - 2009. - V. 76. - №3. - P. 305-306.
12. Rose S.H., van Zyl W.H. // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2002. - V. 58. - P. 461-468.

Claims (1)

  1. Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori ВКПМ F-148 в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов.
RU2015147710A 2015-11-06 2015-11-06 Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов RU2621279C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147710A RU2621279C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147710A RU2621279C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015147710A RU2015147710A (ru) 2017-05-16
RU2621279C2 true RU2621279C2 (ru) 2017-06-01

Family

ID=58715408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015147710A RU2621279C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2621279C2 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU958503A1 (ru) * 1980-10-24 1982-09-15 Всесоюзный Научно-Исследовательский Биотехнический Институт Штамм плесневого гриба aSpeRGILLUS аWамоRI-10-3-продуцент @ -галактозидазы
WO2014088934A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 Danisco Us Inc. Compositions and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU958503A1 (ru) * 1980-10-24 1982-09-15 Всесоюзный Научно-Исследовательский Биотехнический Институт Штамм плесневого гриба aSpeRGILLUS аWамоRI-10-3-продуцент @ -галактозидазы
WO2014088934A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 Danisco Us Inc. Compositions and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
РОЖКОВА И ДР, Создание системы экспрессии гетерологичных генов на основе штамма гриба Aspergillus awamori, ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015147710A (ru) 2017-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100903780B1 (ko) 사상균 크리소스포리움 분야에서의 발현 조절 서열 및발현 생성물
KR100618495B1 (ko) 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
EP2322630B1 (en) Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
US7332341B2 (en) Methods for producing heterologous polypeptides in trichothecene-deficient filamentous fungal mutant cells
DE69734936T2 (de) Wirtszellen und methoden für die produktion von proteinen
US9255275B2 (en) Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of Fusarium venenatum
CN105992821A (zh) 真菌基因文库的双分裂标记物整合
DE69636899T2 (de) Wirtszelle, die reduzierte mengen einer metalloprotease exprimiert und methoden zur verwendung dieser wirtszelle zur proteinproduktion
US20210032637A1 (en) Expression of phytase in aspergillus niger
US11613745B2 (en) Recombinant oxalate decarboxylase expressed in filamentous fungi
RU2621279C2 (ru) Применение штамма мицелиального гриба Aspergillus awamori в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевых ферментов
US7001751B1 (en) PyrF gene and the utilization thereof
KR100581318B1 (ko) 페니실리움 옥살리쿰 유래의 신규 파이테즈 유전자 및파이테즈를 생산하는 형질전환 피치아 파스토리스 균주
RU2646132C1 (ru) Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования
DE60037181T2 (de) Verfahren zur herstellung von polypeptiden in cyclohexadepsipeptid-defizienten zellen
JP2016154483A (ja) プロテインキナーゼ遺伝子変異株を利用した酵素類の製造方法
US20230407273A1 (en) Glycosyltransferase variants for improved protein production
JP2009296958A (ja) 高発現プロモーター
US20060240509A1 (en) Myrothecium sp transformation and expression system
KR20020057951A (ko) 사상균에서 기능하는 제어서열 및 발현계
CN116583534A (zh) 前导肽和编码其的多核苷酸
MXPA01003462A (en) Transformation system in the field of filamentous fungal hosts

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant
PD4A Correction of name of patent owner