RU2528251C2 - FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA - Google Patents

FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA

Info

Publication number
RU2528251C2
RU2528251C2 RU2012152609A RU2012152609A RU2528251C2 RU 2528251 C2 RU2528251 C2 RU 2528251C2 RU 2012152609 A RU2012152609 A RU 2012152609A RU 2012152609 A RU2012152609 A RU 2012152609A RU 2528251 C2 RU2528251 C2 RU 2528251C2
Authority
RU
Grant status
Grant
Patent type
Prior art keywords
protein
fused protein
fusion protein
inf4
plasmid dna
Prior art date
Application number
RU2012152609A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2012152609A (en )
Inventor
Иван Иванович Воробьев
Надежда Александровна Орлова
Владимир Николаевич Колядко
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Гематологическая Корпорация" (ООО "ГемаКор")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Grant date

Links

Images

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: inventions refer to biotechnology and concern a fused protein for the specific inhibition of blood coagulation, an expression plasmid DNA coding this fused protein, a bacterium of the genus Escherichia transformed by this DNA, and to a method for preparing the fused protein. The presented fused protein contains thioredoxin I E.coli and infestine-4 and is characterised by the sequence SEQ ID NO:2. The plasmid DNA contains the sequence SEQ ID NO:1 coding the presented fused protein and controlled by a promoter functioning in a bacterial cell. The method for preparing the above fused protein involves culturing the above bacteria in a nutrient medium, breaking the bacterial cells and purifying the above fused protein with using a metal chelate chromatography and an anion-exchange chromatography.
EFFECT: characterised solutions enables preparing the protein providing the above specificity to be used in blocking the contact activation of blood coagulation by inhibition of the XIIa factor and the absence of inhibition of the Xa factor.
4 cl, 10 dwg, 7 ex

Description

Область техники TECHNICAL FIELD

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии. The invention relates to biotechnology namely to a technology for biologically active substances (BAS) by genetic engineering.

Предшествующий уровень техники. BACKGROUND.

Биологические жидкости и ткани животных и растений содержат большое число ингибиторов протеаз. Body fluids and tissues of animals and plants contain a large number of protease inhibitors. Большая часть хорошо изученных в настоящее время белковых ингибиторов содержит 60-70 аминокислотных остатков. Most of the well-studied currently protein inhibitors contain 60-70 amino acid residues. Наряду с ингибиторами широкого спектра действия, такими, как альфа-2 макроглобулин, большая часть ингибиторов проявляет определенную групповую специфичность. Along with the broad spectrum inhibitors, such as alpha-2 macroglobulin, a large part of the inhibitor group exhibits a certain specificity. Особенно распространены ингибиторы сериновых протеиназ. Inhibitors of serine proteases particularly common. Их предложено классифицировать, как минимум, на 10 семейств. They were asked to classify at least 10 families. Сюда входят ингибиторы семейства панкреатического трипсинового ингибитора Куница, семейства панкреатического секреторного ингибитора (Казаля). These include inhibitors of the pancreatic trypsin inhibitor Marten, the family of pancreatic secretory inhibitor (Casale).

Семейство ингибиторов Казаля принадлежит к семейству ингибиторов I1, клан IA по классификации публичной базы данных MEROPS [Rawlings, Tolle and Barrett, Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem J, v.378, p.705-16 (2004)]. Casale family inhibitors belongs to the family of inhibitors I1, IA clan classification public MEROPS database [Rawlings, Tolle and Barrett, Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem J, v.378, p.705-16 (2004)]. Ингибиторы Казаля воздействуют на сериновые пептидазы семейства S1, например на трипсин и эластазу. Casale inhibitors act on the serine peptidase family S1, such as trypsin and elastase. Ингибиторы Казаля в основном встречаются у многоклеточных животных, типичные представители семейства - овомукоид птиц, ингибитор акрозина и ингибитор эластазы. Casale inhibitors mainly found in multicellular animals, the typical representatives of the family - ovomucoid birds acrosin inhibitor and elastase inhibitor. Известные ингибиторы этого семейства включают от одного до семи "доменов Казаля" или "повторов Казаля" [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984), Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Known inhibitors of this family include from one to seven "Casale domain" or "repeats Casale" [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984), Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al, Ovomucoid third domains from 100 avian species:. isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Структура домена Казаля включает значительную долю несвернутой полипептидной цепи, две короткие альфа-спирали и один бета-слой, состоящий из трех антипараллельных цепей [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984)]. Domain Structure Casale comprises a significant proportion of the unfolded polypeptide chain, the two short alpha-helices and one beta-layer consisting of three antiparallel chains [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984)]. В установлении прямого межмолекулярного контакта домена Казаля и ингибируемого фермента вовлечено 11 аминокислотных остатков, при этом 8 из них являются гипервариабельными [Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. In establishing direct intermolecular contact domain Casale and inhibitable enzyme involved 11 amino acid residues, 8 of which are hypervariable [Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains 100 from avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Варьирование аминокислот, участвующих в образовании контактов с ингибируемым ферментом, изменяет как константу ингибирования, так и специфичность ингибитора [Empie and Laskowski, Thermodynamics and kinetics of single residue replacements in avian ovomucoid third domains: effect on inhibitor interactions with serine proteinases // Biochemistry, v.21, p.2274-84 (1982)]. Variation of amino acids involved in the formation of contacts with the enzyme inhibited, inhibition constant changes both, and the specificity of the inhibitor [Empie and Laskowski, Thermodynamics and kinetics of single residue replacements in avian ovomucoid third domains: effect on inhibitor interactions with serine proteinases // Biochemistry, v .21, p.2274-84 (1982)].

Известен домен Казаля в составе белка инфестин из желудка кровососущего клопа Triatoma infestans, специфично блокирующий активированный фактор свертывания крови XII (фактор Хагемана, фXIIa) [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)]. Known domain Casale composed protein infestin of gastric blood-sucking bug Triatoma infestans, specifically blocking the activated blood coagulation factor XII (Hageman factor fXIIa) [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)]. Домен, блокирующий фХIIa, имеет порядковый номер 4, остальные домены Казаля в составе инфестина специфически ингибируют другие факторы свертывания крови. Domain blocking fHIIa, has a serial number 4, the remaining domains in the composition of Casale infestina specifically inhibit other coagulation factors. Аминокислотная последовательность инфестина и границы доменов приведены в публичной базе данных UniProt (http://www.uniprot.org/), номер записи Q95P16. The amino acid sequence infestina and domain boundaries are listed in a public data base UniProt (http://www.uniprot.org/), Q95P16 record number. Для изолированного рекомбинантного домена 4 инфестина был получен кристалл комплекса с фХIIa [Campos, Guimaraes, Medrano, Tanaka and Barbosa, Crystallization, data collection and phasing of infestin 4, a factor XIIa inhibitor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.60, p.2051-3 (2004)] и определена пространственная структура комплекса. For an isolated recombinant domain infestina 4 was obtained crystal complex fHIIa [Campos, Guimaraes, Medrano, Tanaka and Barbosa, Crystallization, data collection and phasing of infestin 4, a factor XIIa inhibitor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.60, p .2051-3 (2004)] and defines the spatial structure of the complex.

Свойство инфестина-4 ингибировать фХIIa делает его перспективным ингибитором контактной активации свертывания крови для применения в гемостазиологии, в том числе, в качестве лекарственного препарата для лечения и профилактики тромбозов и других заболеваний, связанных с гиперкоагуляционным состоянием системы свертывания крови. The property of inhibiting infestina-4 fHIIa makes it a promising inhibitor of contact activation of blood coagulation for use in Hemostasis, including, as a medicament for the treatment and prevention of thrombosis and other diseases associated with hypercoagulable states coagulation. Из источника [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, р.512-6 (2004)] известна способность инфестина-4 ингибировать другой фактор системы свертывания, фХа, с константой ингибирования 53 нМ. From a source [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, r.512-6 (2004)] known ability infestina-4 inhibit other coagulation factor, fHa with inhibition constant 53 nM. Данное неспецифическое действие серьезно ограничивает возможность применения инфестина-4, поскольку фХа является одним из главных ферментов каскада свертывания. This nonspecific action severely limits the possibility of applying infestina-4 because fHa is one of the major enzymes of the clotting cascade. Ингибирование данного фактора может приводить к серьезным гемостатическим осложнениям, например кровотечениям [Koscielny J, Beyer-Westendorf J, von Heymann С, Braun J, Klamroth R, Lindhoff-Last E, Tiede A, Spannagl M., Risk of bleeding and haemorrhagic complication with rivaroxaban - Periprocedural management of haemostasis // Hamostaseologie; The inhibition of this factor can cause serious hemostatic complications such bleeding [Koscielny J, Beyer-Westendorf J, von Heymann C., Braun J, Klamroth R, Lindhoff-Last E, Tiede A, Spannagl M., Risk of bleeding and haemorrhagic complication with rivaroxaban - periprocedural management of haemostasis // Hamostaseologie; 32(4):287-93 (2012), Esmon CT, What did we learn from new oral anticoagulant treatment? 32 (4): 287-93 (2012), Esmon CT, What did we learn from new oral anticoagulant treatment? // Thromb Res. // Thromb Res. Suppl 1:S41-3 (2012)]. Suppl 1: S41-3 (2012)].

Известны два метода получения рекомбинантного инфестина-4: в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris с дополнительным С-концевым пептидом и в составе слитого белка с сывороточным альбумином человека. There are two methods of producing recombinant infestina-4 in methylotrophic yeast Pichia pastoris with an additional C-terminal peptide and the fused protein with human serum albumin. Оба метода описаны в работе [Hagedorn, Schmidbauer, Pleines, Kleinschnitz, Kronthaler, Stoll, Dickneite and Nieswandt, Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding // Circulation, v.121, p.1510-7 (2010)]. Both methods are described in [Hagedorn, Schmidbauer, Pleines, Kleinschnitz, Kronthaler, Stoll, Dickneite and Nieswandt, Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding // Circulation, v.121, p.1510 -7 (2010)]. Продуктивность дрожжевой системы экспрессии инфестина-4 составляет 4 мг/л культуры, продуктивность системы экспрессии слитого белка альбумина и инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих неизвестна. Productivity-4 infestina yeast expression system is 4 mg / L culture, the productivity of the albumin fusion protein expression system and infestina-4 in cultured mammalian cells is unknown.

Указанные системы экспрессии инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих не могут быть использованы из-за высокой стоимости культивирования, а известная система экспрессии инфестина-4 в дрожжах обладает слишком низкой продуктивностью. These expression systems infestina-4 in cultured mammalian cells can not be used because of the high cost of cultivation, and known expression system infestina-4 in yeast has very low productivity. При этом указанные системы экспрессии инфестина-4 не могут быть использованы из-за неспецифического ингибирования фХа продуцируемым белком. Wherein said expression system infestina-4 can not be used due to non-specific inhibition fHa produced protein. Известен способ получения целевых белков в активной и растворимой форме с высокой продуктивностью (патент US 5270181, Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules, выдан 14.12.1993), который заключается в экспрессии целевого гетерологического белка, слитого с белком тиоредоксином или тиоредоксинподобным белком, в клетках хозяина. A method of producing target proteins in soluble and active form with high productivity (US Patent No. 5,270,181, Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules, issued 14.12.1993), which is the expression of the desired heterologous protein, thioredoxin fusion protein or tioredoksinpodobnym protein in host cells. Однако описанный способ получения целевого белка не предполагает изменения функциональной активности целевого белка при экспрессии в виде слитого белка с тиоредоксином. However, the described method for producing a target protein does not imply a change in functional activity of the target protein when expressed as a fusion protein with thioredoxin.

Краткое изложение изобретения SUMMARY OF THE INVENTION

Технический результат, который может быть получен при реализации данного изобретения, заключается в эффективном и специфичном блокировании контактной активации свертывания за счет ингибирования фактора ХIIa и отсутствия ингибирования фактора Ха с упрощенной технологией получения белка, обеспечивающего указанную специфичность. The technical result that can be obtained by implementing the present invention is to efficiently and specifically blocking the contact activation of the coagulation by inhibition of factor HIIa and lack of inhibition of factor Xa with a simplified technology of producing a protein, providing said specificity.

Указанный технический результат обеспечивается за счет получения слитого белка, включающего тиоредоксин I Е.coli и инфестин-4, обладающего повышенной специфичностью ингибирования фХIIa и имеющего пониженную активность ингибирования фХа по сравнению с нативным инфестином-4. Said technical result is ensured by producing a fusion protein comprising E. coli thioredoxin and infestin I-4, which has a higher specificity for inhibiting fHIIa and having reduced fHa inhibition activity as compared to native infestinom-4.

А также за счет получения экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей упомянутый слитый белок и находящейся под контролем промотера, функционирующего в бактериальной клетке. Also, by obtaining an expression plasmid DNA encoding said fusion protein and under the control of a promoter functioning in a bacterial cell.

А также за счет получения бактерии-продуцента упомянутого слитого белка, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной указанной плазмидной ДНК. And by getting-producing bacteria of said fusion protein belonging to the genus Escherichia transformed with the indicated plasmid DNA.

А также за счет создания способа получения упомянутого слитого белка, включающего культивирование упомянутой бактерии в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку указанного слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии. Also, by creating a method for producing said fusion protein comprising culturing said bacterium in a nutrient medium, destruction of the bacterial cells and purifying said fusion protein using metal chelate chromatography and anion exchange chromatography.

Существо заявляемого решения Being inventive solutions

В основе заявляемого решения лежат разработанные авторами, в частности, плазмидная ДНК pET32a-Inf4 длиной 6106 п.о., кодирующая расщепляемый слитый белок, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера, линкерный участок, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и расположенный на С-конце молекулы полипептид домена 4 инфестина Т. Infestans. The basis of the inventive solutions are developed by the authors, in particular, the plasmid DNA pET32a-Inf4 length of 6106 bp, encoding a cleavable fusion protein comprising thioredoxin I E.coli, 2 oligogistidinovyh cluster linker site specific endoproteinase recognition sequence and located on C -terminal domain polypeptide molecule 4 infestina T. Infestans. Открытая рамка считывания указанного домена инфестина содержит оптимальные для E.coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. The open reading frame infestina specified domain comprises for optimal E.coli codons allowing to increase heterologous protein expression level due to efficient translation of the polypeptide of amino acids. Наличие белка-партнера обеспечивает поддержание слитого белка в растворимой форме в цитоплазме E.coli, правильное замыкание дисульфидных связей, позволяет проводить очистку слитого белка с помощью металлохелатного сорбента, что приводит к значительному увеличению выхода очищенного слитого белка, а также упрощению процедур выделения и очистки продукта. Availability partner protein maintains the fusion protein in a soluble form in the cytoplasm of E.coli, correct closure of disulfide bonds, allows for purification of the fusion protein via metal chelate adsorbent, which leads to a significant increase in the yield of the purified fusion protein as well as simplification of the product recovery and purification procedures .

В процессе получения указанного белка авторами неожиданно было установлено, что инфестин-4 в бактериях E.coli в форме белка-предшественника или слитого белка с тиоредоксином существенно увеличивает специфичность целевого белка по отношению к фХIIa, понижая активность ингибирования фXa, а также может быть достигнута высокая продуктивность системы экспрессии инфестина-4. During the preparation of said protein authors have unexpectedly found that 4-infestin in E.coli bacteria in the form of a precursor protein or a fusion protein with thioredoxin significantly increases the specificity of the target protein with respect to fHIIa lowering fXa inhibiting activity, and also can be achieved a high productivity expression system infestina-4.

Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее гена, например, такие как промотор, терминатор. The term "expression plasmid" means a plasmid DNA containing the necessary genetic elements for expression of a gene embedded therein, such as a promoter, terminator. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7. A specific example of the genetic elements required for expression of a fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina composed expression cassette according to the present invention is, but not limited to, the promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7.

Фрагментом ДНК, кодирующим рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans в составе слитого белка, включающего последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий, в свою очередь, тиоредоксин I E.coli, олигогистидиновые кластеры, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и домен 4 инфестина T.infestans. DNA fragment encoding the recombinant domain 4 infestina T.infestans according to the present invention is, for example, a synthetic gene encoding the recombinant domain 4 infestina T.infestans as part of a fusion protein comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal partner protein comprising, in its turn thioredoxin I E.coli, oligogistidinovye clusters specific endoproteinase recognition sequence and domain 4 infestina T.infestans. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Said DNA fragment may be obtained by PCR (see. Example 1 1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077. Also said DNA fragment can be obtained by using Sloning BioTechnology firm cloning technology described in PCT WO 2005071077.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в Е.coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей слитый белок и в особенности рекомбинантный домен 4 инфестина Т.infestans, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися в генах Е.coli кодонами. To ensure efficient translation of the cloned gene in E. coli, it is preferable that a sequence encoding the fusion protein and particularly the recombinant domain 4 infestina T.infestans, all the rare codons are replaced by synonymous frequent codons in E. coli genes. Последовательность гена Trx-Inf4, кодирующего домен 4 инфестина Т.infestans в составе слитого белка согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1. gene sequence Trx-Inf4, encoding domain 4 infestina T.infestans as part of a fusion protein according to the present invention is represented in the list of sequences under the number SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность слитого белка, включающего домен 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence of the fusion protein comprising a domain infestina T.infestans 4 according to the present invention is represented in the list of sequences under the number SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность интактного рекомбинантного домена 4 инфестина Т.infestans представляет собой последовательность под номером SEQ ID NO: 2 без 182 первых аминокислот (т.е. аминокислоты 183 - 238). The amino acid sequence of intact recombinant domain infestina T.infestans 4 is a sequence under the number SEQ ID NO: 2 without the first 182 amino acids (i.e., amino acids 183 - 238).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1), кодирующего слитый белок, включающий домен 4 инфестина Т.infestans, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. The DNA fragments which encode substantially the same protein may be obtained, e.g., by modifying the nucleotide sequence of the DNA fragment (SEQ ID NO: 1) encoding a fusion protein comprising a domain infestina T.infestans 4, for example by the method of site-directed mutagenesis, so that one or more amino acid residues in a particular site will be deleted, substituted, inserted or added. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. DNA fragments were modified as described above may be prepared by conventional processing techniques to produce a mutation. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке. The DNA fragments which encode substantially the same protein may be prepared by expressing DNA fragments having the mutation as described above in an appropriate cell.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами ингибитора фактора ХIIа, определяются по его способности ингибировать свертывание крови, инициированное по "внутреннему" пути. Indicators of functional activity at which it is considered that the resulting protein has Factor XIIa inhibitor properties, are characterized by their ability to inhibit blood clotting initiated by "internal" path. Так, например, активность домена 4 инфестина Triatoma infestans можно детектировать в коагулометрическом тесте "каолиновое время", как описано в Примере 6. Считается, что вариант белка обладает свойствами домена 4 инфестина Т.infestans при условии, что указанный вариант увеличивает время свертывания плазмы крови не менее чем на 30% при концентрации не выше чем 5 мкМ. For example, Triatoma infestans infestina domain 4 activity can be detected in the test koagulometricheskom "kaolin time" as described in Example 6. It is believed that the variant protein has a domain properties infestina T.infestans 4 with the proviso that said variant increases the clotting time of blood plasma not less than 30% at a concentration not higher than 5 .mu.M.

Термин «специфичность ингибирования фХIIа» означает свойства ингибитора фХIIa, заключающиеся в ингибировании фХIIa с высокой эффективностью (константой ингибирования порядка 1 нМ или ниже) и отсутствии заметного ингибирования (константа ингибирования намного больше 1 нМ, предпочтительно больше 1 мкМ) других протеаз свертывания, таких как факторы XIa, IXa, Ха, IIa (он же тромбин), и VIIa. The term "specificity of inhibition fHIIa" means properties fHIIa inhibitor consisting in inhibiting fHIIa with high efficiency (inhibition constant of about 1 nM or less), and no significant inhibition (inhibition constant much greater than 1 nM, preferably greater than 1 uM) of other proteases of coagulation, such as factors XIa, IXa, Xa, IIa (also known as thrombin), and VIIa. Нативный инфестин-4 ингибирует фХIIa с константой 0,1 нМ, при этом белок ингибирует фХa с константой 53 нМ. Native infestin-4 inhibits fHIIa with a constant 0.1 nM, and the protein inhibits fHa with constant 53 nM. Слитый белок тиоредоксина и инфестина-4 обладает такой же константой ингибирования фХIIa, как и нативный ингибитор, но константа ингибирования фХa составляет 2,5 мкМ, т.е. The fusion protein of thioredoxin and infestina-4 has a similar inhibition constant fHIIa as the native inhibitor, but fHa inhibition constant of 2.5 mM, i.e., в 50 раз выше. 50 times higher. Таким образом, полученный слитый белок обладает повышенной специфичностью к фХIIa по сравнению с нативным белком. Thus, the resulting fusion protein has improved specificity for fHIIa compared to the native protein.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, содержащий домен 4 инфестина Т.Infestans и включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера (6 и 10 гистидинов), 2 последовательности узнавания специфической эндопротеиназой (DDDDK) и расположенный на С-конце слитого белка непосредственно за последним сайтом узнавания DDDDK домен 4 инфестина Т.infestans, под контролем промотора, функционирующего в бактериаль The expression plasmid according to the present invention comprises a DNA fragment encoding a fusion protein comprising a domain 4 infestina T.Infestans and comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal partner protein comprising thioredoxin I E.coli, 2 oligogistidinovyh cluster (6 and 10 histidines) 2 specific endoproteinase recognition sequence (DDDDK) and located at the C-terminus of the fusion protein directly behind the last recognition site DDDDK domain 4 infestina T.infestans under the control of a promoter functioning in of bacterial ой клетке. th cell. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, рЕТ32а, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими. As the recombinant plasmid according to the present invention may be used various plasmids having ability of expressing a recipient cell, such as plasmids pBR322, pMW119, pUC19, pET32a, pET28b and the like, but the list is not limited to plasmids.

Одним из вариантов реализации настоящего изобретения является плазмида pET32a-Inf4 размером 6106 п.о., которая состоит из: One embodiment of the present invention is the plasmid pET32a-Inf4 size of 6106 bp, which comprises:

1) фрагмента HindIII-NheI (1-204) длиной 204 п.о., содержащего участок, кодирующий домен 4 инфестина Т.infestans и слитую с ним в рамке последовательность FLAG-эпитопа, включающую в себя сайт узнавания энтерокиназы 1) fragment HindIII-NheI (1-204) 204 bp in length containing a region encoding domain 4 infestina T.infestans and fused in frame with it FLAG-epitope sequence including a recognition site of enterokinase

2) фрагмента NheI-NcoI (205-245)-длиной 41 п.о., содержащего участок, кодирующий пептид SAGHHHHHHHHHHG, содержащий декагистидиновый кластер 2) fragment NheI-NcoI (205-245) is the length of 41 bp comprising a region encoding a peptide SAGHHHHHHHHHHG, cluster containing dekagistidinovy

3) фрагмента NcoI-HindIII (246-6106) вектора рЕТ32а(+) длиной 5861 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую бета-лактамазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; 3) a fragment of NcoI-HindIII (246-6106) vector pET32a (+) of length 5861 bp, containing the origin of replication of plasmid pBR322, gene RNA organizing Rop protein, the replication initiation region of bacteriophage f1, the sequence encoding beta-lactamase, promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; участок терминации транскрипции; a transcriptional termination region; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона; sequence coding for the repressor of the lactose operon; последовательность, кодирующую тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновый таг и сайт расщепления энтерокиназой. sequence encoding thioredoxin I E.coli, hexa-histidine tag and an enterokinase cleavage site. Указанная плазмида содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: HindIII (1), NheI (205), NcoI (246), XbaI (736), PciI (3656), PvuI (4919). This plasmid contains unique recognition sites for restriction endonucleases: HindIII (1), NheI (205), NcoI (246), XbaI (736), PciI (3656), PvuI (4919).

Структура плазмиды pET32a-Inf4 приведена на Фиг.3 и в SEQ ID 3. The structure of the plasmid pET32a-Inf4 shown in Figure 3 and SEQ ID 3.

При помощи созданной плазмиды можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию рода Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Using the constructed plasmid can be transformed bacterial cell, preferably a bacterium of genus Escherichia, susceptible to such transformation with the indicated plasmid. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. Selection of a particular cell is not critical, since transformation methodology and techniques well known to those skilled in the art. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии слитого белка, содержащего домен 4 инфестина Т.infestans, может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента. Although depending on the type of cells and culture conditions of the transformant obtained fusion protein expression level containing domain 4 infestina T.infestans may vary, the target protein expression fact will take place, provided successful transformation of cells - the recipient.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. "Transformation of cells with plasmid" means introduction of plasmid into a cell by methods well known to those skilled in the art. Трансформация этой плазмидой необходима для экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Transformation with this plasmid necessary for the expression of the gene encoding the protein of present invention and the protein synthesis in the bacterial cell. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac А. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) //Humana Press; Methods of transformation include any of the standard methods known to those skilled in the art, such as the method described in Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995). 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. According to the present invention, "bacterial cell - producing a fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina T.infestans" means a bacterial cell which has an ability to produce and accumulate the fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina T.infestans when bacterial cell according to the present invention is cultured in the nutrient environment. Используемый здесь термин «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» также означает клетку, которая способна накапливать слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans в количестве не менее чем 2 мг/л культуры, более предпочтительно, не менее чем 20 мг/л культуры. As used herein, the term "bacterial cell - producing a fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina T.infestans" also means a cell which is able to accumulate a fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina T.infestans in an amount of not less than 2 mg / liter culture, more preferably not less than 20 mg / l culture. Указанный слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans накапливается в указанной клетке предпочтительно в цитоплазме в растворимой форме. Said fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina T.infestans accumulates within said cell, preferably into the cytoplasm in soluble form.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans. Preferably, a bacterium belonging to the genus Escherichia, for transforming a recombinant plasmid containing the DNA fragment encoding the fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina T.infestans.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. The term "a bacterium belonging to the genus Escherichia» can mean that the bacterium belongs to the genus Escherichia according to the classification known to a person skilled in the art of microbiology. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli). As an example, a microorganism belonging to the genus Escherichia, Escherichia coli (E. coli) can be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, FC et al. The bacterium belonging to the genus Escherichia is not limited in any way, but, for example, bacteria described in the book Neidhardt, FC et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, Table 1) can be given as examples.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3]. A specific example of a recipient strain for producing thioredoxin fusion protein and domain 4 infestina T.infestans according to the present invention include, but are not limited to, a strain Escherichia coli BL21 [DE3].

Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками. The strain Escherichia coli BL21 [DE3] characterized by the following cultural-morphological, physiological and biochemical traits and genetic traits.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки, образуют нити; Cultural-morphological characteristics of the strain: Gram negative rods form a yarn; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. on an agar medium - large whitish colonies with a rough edge. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. activity of the strain is determined by densitometry electrophoretogram. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. The strain is stored at the following conditions: Wednesday Lurie-Bertrand, 1% glucose, 10% glycerol. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, ампициллина 50 мкг/мл. Strain propagated under the following conditions - Wednesday Lurie-Bertrand, 1% glucose, 50 ug ampicillin / ml.

Генетические особенности штамма. Genetic features strain. Генотип штамма - F - ompT gal dcm lon hsdS B (r B - m B + ) λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]). Strain Genotype - F - ompT gal dcm lon hsdS B (r B - m B +) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).

Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидой pET32a-Inf4 приводит к получению штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, который обеспечивает синтез рекомбинантного слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) Т.infestans в количестве более 5% от суммарного содержания белка клеток. Transformation of the strain Escherichia coli BL21 [DE3] plasmid pET32a-Inf4 results in a producer strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4, which provides the synthesis of a recombinant fusion protein of thioredoxin and domain 4 infestina (Trx-Inf4) T.infestans in an amount greater than 5 % of the total protein content of the cells.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4 кодирует слитый белок Trx-Inf4, состоящий из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера (тиоредоксина E.coli), содержащего сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой домена 4 инфестина Т.infestans. The strain Escherichia coli BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 encodes a fusion protein Trx-Inf4, consisting of the amino acid sequences of domain 4 infestina T.infestans and fused to them in frame partner protein (thioredoxin E.coli), containing an enterokinase cleavage site located immediately before the first amino acid domain 4 infestina T.infestans.

Способ получения слитого белка Trx-Inf4, состоящего из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера тиоредоксина I E.coli согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, индукцию промотора гена слитого белка Trx-Inf4, сбор биомассы клеток, их разрушение, отделение нерастворимых белков и дебриса, очистку слитого белка Trx-Inf4 металлохелатной хроматографией в нативных условиях и по A method of producing a fusion protein Trx-Inf4, consisting of the amino acid sequences of domain 4 infestina T.infestans and fused with it partner protein I E.coli thioredoxin frame according to the present invention comprises culturing the bacterium as described above in a nutrient medium suitable for growing the said prokaryotic cells , induction of the promoter of the gene of the fusion protein Trx-Inf4, cells were harvested biomass, destruction, separation of insoluble proteins and cell debris, cleaning Trx-Inf4 fusion protein metal chelate chromatography under native conditions and следующей анионообменной хроматографией. following anion exchange chromatography.

Особенности плазмиды и результаты практического применения приведены на следующих фигурах. Features of plasmid and practical application of the results are shown in the following figures.

Краткое описание фигур: Brief description of the figures:

На Фиг.1 показана схема сборки синтетического гена домена 4 инфестина Triatoma infestans из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионных плазмид p10E- Inf4 и pET32a-Inf4. 1 shows a synthetic gene assembly domain scheme 4 infestina Triatoma infestans of oligonucleotide primers and receiving circuit p10E- Inf4 expression plasmids and the pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения: The following symbols are used:

Inf4 - домен 4 инфестина Triatoma infestans, соответствующий домену 4 типа Казаль. Inf4 - domain 4 infestina Triatoma infestans, the appropriate domain type 4 Casal. В скобках указаны первая и последняя аминокислоты фрагментов. In parentheses are the first and last amino acid fragments. Пунктирная линия обозначает полимеразную цепную реакцию, сплошная - рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК. The dashed line represents the polymerase chain reaction, a solid - restriction and ligation of DNA fragments.

На Фиг.2 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-Inf4. Figure 2 shows a map of expression plasmid p10E-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322» - точка начала репликации плазмиды pBR322; The following symbols: «pBR322» - the origin of replication of pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop, контролирующего копийность плазмиды; «ROP» - RNA gene organizing Rop protein, controlling the copy number of the plasmid; «fl ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «Fl ori» - site replication origin of bacteriophage f1; «KanR2» - ген устойчивости к канамицину; «KanR2» - kanamycin resistance gene; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; "T7 prom» - the promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; «Т7 term» - участок терминации транскрипции целевого гена; "T7 term» - termination region of the target gene transcription; «lacI» - ген репрессора лактозного оперона; «LacI» - gene operon repressor of the lactose; Inf4 - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида домена 4 инфестина Triatoma infestans; Inf4 - open reading frame (ORF) 4 polypeptide domain infestina Triatoma infestans; "FLAG" - эпитоп моноклонального антитела FLAG; "FLAG" - the epitope of the monoclonal antibody FLAG; "EK-PRO" - сайт узнавания энтерокиназы, "10Е tag" - отделяемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер, эпитоп FLAG и сайт узнавания энтерокиназы; "EK-PRO" - enterokinase recognition site, "10E tag" - detachable N-terminal peptide comprising dekagistidinovy ​​cluster FLAG epitope and the enterokinase recognition site; «stop» - блок стоп-кодонов. «Stop» - block stop codons. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. The arrows indicate the direction of gene transcription in parentheses indicates the number of first and last nucleotide fragments. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания. Italics recognition sites for restriction endonucleases in parentheses indicates the number of nucleotides in the cutting points.

На Фиг.3 показана карта экспрессионной плазмиды pET32a-Inf4. Figure 3 shows a map of expression plasmid pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322 origin» - область начала репликации плазмиды pBR322; We use the following symbols: «pBR322 origin» - the origin of replication of pBR322; «f1 origin» - участок инициации репликации бактериофага f1; «F1 origin» - site replication origin of bacteriophage f1; «BIa (AmpR)» - последовательность, обеспечивающую устойчивость бактерий к ампициллину; «BIa (AmpR)» - sequence enabling the bacteria to ampicillin resistance; «Т7 promoter» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; "T7 promoter» - the promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; «Т7 terminator» - участок терминации транскрипции; "T7 terminator» - a transcriptional termination region; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «LacI» - a sequence coding for a repressor of the lactose operon; «Trx-Inf4» - ОРС слитого белка; «Trx-Inf4» - ORF fusion protein; «Inf4» - ОРС домена 4 инфестина Triatoma infestans; «Inf4» - Domain ORF 4 infestina Triatoma infestans; «Trx» - ОРС тиоредоксина I E.coli; «Trx» - OPC thioredoxin I E.coli; «10xHis» - декагистидиновый кластер; «10xHis» - dekagistidinovy ​​cluster; «6xHis» - гексагистидиновый кластер; «6xHis» - hexa-histidine cluster; «ЕК-PRO» - участок, кодирующий сайт узнавания энтерокиназой; "EC-PRO» - a region encoding the enterokinase recognition site; «FLAG» - эпитоп моноклонального антитела FLAG; «FLAG» - the epitope of the monoclonal antibody FLAG; «stop» - блок стоп-кодонов. «Stop» - block stop codons. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. The arrows indicate the direction of gene transcription in parentheses indicates the number of first and last nucleotide fragments. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания. Italics recognition sites for restriction endonucleases in parentheses indicates the number of nucleotides in the cutting points.

На Фиг.4 показана электрофореграмма тотального белка из клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4 (4 колонии) и контрольного штамма BL21 [DE3]/pET32a при индукции ИПТГ. 4 shows the electrophoretogram of the total protein-producing cells of the strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 (4 colonies) and a control strain BL21 [DE3] / pET32a under IPTG induction.

Индукция 1 мМ ИПТГ, 30°C; Induction with 1 mM IPTG, 30 ° C; 0,4 и 16 ч. Обозначения: Inf cl. . 0.4 and 16 hours Legend: Inf cl. - соответствующая колония штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, Trx (К-) - колония контрольного штамма BL21[DE3]/pET32a, 0h - 16h - время индукции, ч; - corresponding colony-producing strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4, Trx (K) - colony control strain BL21 [DE3] / pET32a, 0h - 16h - induction time, h; М - маркер молекулярных масс. M - molecular weight marker. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. The molecular weight marker bands are indicated in kDa. Положение целевого белка и контрольного белка-партнера указано стрелками. The position of the target protein and the reference protein partner is indicated by arrows. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Reducing conditions, colloidal Coomassie blue stain. Вычисленная продуктивность для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4: 20-40 мг/л, доля целевого белка: >5% (по денситометрии геля). Calculated productivity for strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4: 20-40 mg / l, the proportion of the target protein:> 5% (by gel densitometry).

На Фиг.5 приведены электрофореграммы белковых фракций, полученных при выделении и одностадийной хроматографической очистке слитого белка Trx-Inf4 и контрольного белка-партнера Trx. Figure 5 shows the electrophoretogram of the protein fractions obtained by one-step isolation and chromatographic purification of the fusion protein Trx-Inf4 and controlling partner protein Trx.

Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; Legend: "M" - molecular weight markers, molecular weights bands are indicated in Figure 4; «IP» - тотальный белок после индукции, «IB» - нерастворимые белки, «SO» - растворимые белки, «7R» - осадок после термокоагуляции, «7S» - супернатант после термокоагуляции, «AS» - супернатант при осаждении сульфатом аммония, «IM» - перерастворенный осадок после осаждения сульфатом аммония, «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии, «100», «200», «500» - фракции элюатов с металлохелатной колонки соответствующими концентрациями имидазола, «Е» - фракция элюции ЭДТА-Na, «NA» - фракция элюции при регенерации колонки NaOH. «IP» - total protein after induction, «IB» - insoluble proteins, «SO» - soluble proteins, «7R» - precipitate after thermocoagulation, «7S» - supernatant after thermocoagulation, «AS» - supernatant in the precipitation of ammonium sulphate, " IM »- the resolubilized precipitate after ammonium sulfate precipitation,« FF »- fraction slip when metal chelate chromatography," 100 "," 200 "," 500 "- fraction eluates with metal chelate column appropriate concentrations of antifungals," E "- fraction elution EDTA-Na , «NA» - fraction NaOH elution column regeneration. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Non-reducing conditions, the color of the colloidal Coomassie blue. Положение целевого белка Trx-Inf4 указано стрелкой. Regulation Trx-Inf4 target protein indicated by an arrow.

На Фиг.6 показана электрофореграмма белковых фракций, полученных при градиентной элюции слитого белка Trx-Inf4 с сорбента Capto Q. Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; 6 shows the electrophoretogram of the protein fractions obtained by gradient elution of the fusion protein Trx-Inf4 sorbent with Capto Q. Symbols "M" - molecular weight markers, molecular weights bands are indicated in Figure 4; «200» - полуочищенный Trx-Inf4 перед нанесением; "200" - semi-purified Trx-Inf4 before application; «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии; «FF» - slip fraction with metal chelate chromatography; «F1»-«F8» - соответствующие собранные фракции элюата. «F1» - «F8» - the corresponding eluate fractions collected. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Non-reducing conditions, the color of the colloidal Coomassie blue. Положение целевого белка указано стрелкой. The position of the target protein indicated by an arrow.

На Фиг.7 показана хроматограмма ОФ-ВЭЖХ анализа очищенного слитого белка Trx-Inf4 и результаты интеграции пиков. 7 shows the chromatogram of RP-HPLC analysis of purified fusion protein Trx-Inf4 and integration of the peaks. Канал детекции 280 нм, чистота белка 99,06%. Channel detection 280 nm, 99.06% protein purity.

На Фиг.8 показана электрофореграмма дорожки с очищенным Trx-Inf4 и результаты ее денситометрии. 8 shows the electrophoretogram track with purified Trx-Inf4 and its results densitometry. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим, чистота белка 99,48%. Reducing conditions colloidal Coomassie blue stain, the protein purity of 99.48%.

На Фиг.9 приведен график зависимости времени свертывания плазмы крови в "каолиновом тесте" от концентрации в плазме Trx-Inf4. Figure 9 shows a plot of plasma clotting time of blood in "kaolin test" of the concentration in Trx-Inf4 plasma.

На Фиг.10 приведен график зависимости активности фХа, определяемой по скорости расщепления хромогенного субстрата, от концентрации Trx-Inf4. Figure 10 is a plot of activity fHa determined by splitting of chromogenic substrate speed, the concentration of Trx-Inf4.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие, не ограничивающие настоящее изобретение, примеры. The present invention will be described in more detail below with reference to the following, not limiting the present invention, examples.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-Inf4 Example 1. Preparation of DNA plasmid pAL-Inf4

Для аминокислотной последовательности, включающей 56 аминокислот домена 4 инфестина Triatoma infestans (аминокислоты 167-222 из записи Q95P16 публичной базы данных UniprotKB, расположенной по адресу http://www.uniprot.org/uniprot/Q95P16) с добавленным аминокислотным N-концевым пептидом (SEQ ID NO: 4, ASDYKDDDDK), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. For amino acid sequence consisting of 56 4 infestina Triatoma infestans domain of amino acids (amino acids 167-222 of recording Q95P16 public database UniprotKB, situated http://www.uniprot.org/uniprot/Q95P16) with added amino acid N-terminal peptide ( SEQ ID NO: 4, ASDYKDDDDK), containing an enterokinase recognition sequence, was carried out in the sequence reverse translation of DNA nucleotides. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в Е.coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов. Thus optimization of the gene structure of mRNA secondary structure, GC composition, provided that no unwanted regulatory elements (e.g., absence of internal ribosome binding sites) were used codons optimal for expression of the gene in E. coli class B, as was also performed, and the lack of long repeats, palindromes. В последовательность ДНК также были включены стоп-кодоны и сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. The DNA sequence also included the stop codons and restriction endonuclease recognition sites. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:5. The resulting nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5. Физический фрагмент EKsite-Kaz-4 (SEQ ID NO:5) собирали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из перекрывающихся олигонуклеотидных праймеров AS-KAZ-1F AS-KAZ-2R AS-KAZ-3F AS-KAZ-4R AS-KAZ-5R, приведенных в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, соответственно. Physical fragment EKsite-Kaz-4 (SEQ ID NO: 5) was collected by polymerase chain reaction (PCR) of overlapping oligonucleotide primers AS-KAZ-1F AS-KAZ-2R AS-KAZ-3F AS-KAZ-4R AS-KAZ- 5R, shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, respectively.

ПЦР проводили на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). PCR was performed on Tertsik MC2 ( "DNA Technology", Russia). Препаративные реакции проводили в объеме 50 мкл. Preparative reactions were performed in a volume of 50 microliters. Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; Incubation mixture was prepared of the following composition: 1x buffer for a thermostable DNA polymerase; 10 пмоль каждого праймерного олигонуклеотида; 10 pmol of each oligonucleotide primer; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 2 mM of each deoxyribonucleotide triphosphate; 2 ед. 2 units. термостабильной ДНК-полимеразы. thermostable DNA polymerase. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация 94°C, 3 мин; On top of the mixture overlaid with 50 l mineral oil and amplification conducted following scheme: 1 cycle - denature 94 ° C, 3 min; 25 циклов - денатурация 94°C, 30 сек, отжиг 62°C, 30 сек, достройка 72°C, 120 сек; 25 cycles - denature 94 ° C, 30 sec, annealing 62 ° C, 30 sec, completion of 72 ° C, 120 sec; 1 цикл - достройка 72°C, 10 мин. 1 cycle - completion of 72 ° C, 10 min. Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего дотировали в Т-вектор pAL-TA («Евроген», РФ) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r k- , m k+ ) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженн The PCR products were isolated from a 1% agarose gel dial "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» ( «Promega», USA) according to the manufacturer's protocol, then ligated into the T vector pAL-TA ( «Evrogen", Russia) with DNA ligase and T4 standard buffer ( «Fermentas», Lithuania). Ligation was conducted in a volume of 10 l at a molar ratio of vector and insert 1:10, for 2-20 hours at room temperature. The obtained ligation mixture was transformed cells E. coli strain DH5, with genotype F- φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r k-, m k +) phoA supE44 λ- thi- 1 gyrA96 relA1. to this end, 200 .mu.l of frozen ой суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°C на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут. Затем добавляли 800 мкл питательного бульона LB и инкубировали при 37°C 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара и помещали в термостат на 37°C 18 часов. th cell suspension of E. coli added 5 l of the ligation mixture was incubated on ice for 20 minutes sorption plasmid DNA was heated to 42 ° C for 45 seconds and incubated on ice for 5 minutes. Then it was added 800 l of LB broth and incubated at 37 ° C 60 minutes. After incubation, the suspension was transferred to a Petri dish with a solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 ug / 1 ml of the agar and placed in an incubator at 37 ° C for 18 hours. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды: M13dir (SEQ ID NO:11) и M13rev (SEQ ID NO:12). E. coli colonies, were selected as a result of blue-white screening, were analyzed by PCR clones using primers to sequences recipient plasmid: M13dir (SEQ ID NO: 11) and M13rev (SEQ ID NO: 12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона LB и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность конструкции верифицировали методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и SP6 (SEQ ID NO:14). Selected clones are built up in 5 ml of nutrient broth LB and performed selection plasmid DNA reagent kit «Wizard Plus SV Minipreps» ( «Promega», USA) according to the manufacturer's protocol, the primary nucleotide sequence structure was verified by PCR sequencing using primers T7prom (SEQ ID NO : 13) and SP6 (SEQ ID NO: 14).

Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК p10E-Inf4. Example 2. Preparation of an expression plasmid DNA p10E-Inf4.

Реципиентную плазмиду p10E рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. P10E recipient plasmid was digested sequentially each of endonucleases NheI and HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. First, an aliquot of the plasmid was incubated 2 hours at 37 ° C with each of the restriction enzymes was monitored by agarose gel electrophoresis complete linearization of the plasmids was then added a second restriction enzyme and incubated for another 2 hr. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°C в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. The samples were then combined, the enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes and was performed dephosphorylation with alkaline phosphatase ( «Fermentas», Lithuania) according to manufacturer's protocol. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°C в течение 20 минут. Alkaline phosphatase was inactivated by heating to 85 ° C for 20 minutes. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10 -2 мкг/мкл. Digested and dephosphorylated plasmid reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for about 10 minutes / min 13200 at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water and used for the ligation reaction in setting a working concentration of 10 -2 g / l. Реакцию лигирования очищенного фрагмента NheIHindIII плазмиды pAL-Inf4, соответствующего минигену домена 4 инфестина и реципиентной плазмиды, проводили, как описано в примере 1. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5 альфа, как описано выше. The ligation reaction was purified fragment NheIHindIII plasmid pAL-Inf4, corresponding minigenome infestina domain 4 and the recipient plasmid was performed as described in Example 1. This was followed by transformation of E. coli cells strain DH5 alpha as described above. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и T7term (SEQ ID NO:15). E. coli colonies were analyzed by PCR with primers clones T7prom (SEQ ID NO: 13) and T7term (SEQ ID NO: 15).

Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT с канамицином, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США). Selected clones are built up in 5 ml of 2xYT medium with kanamycin, the plasmid DNA isolation was performed with a set of «Wizard Plus SV Minipreps» ( «Promega», USA). При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-Inf4 определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom и T7term. Using PCR sequencing to design p10E-Inf4 determined nucleotide sequence of DNA complementary to both circuits for field insert using primers T7prom and T7term. В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена домена 4 инфестина. Sequencing determined that the obtained plasmid preparation does not contain a mutation at the insertion area, i.e. the correct sequence encoded domain infestina 4 gene. Карта экспрессионной конструкции приведена на Фиг.2 и в SEQ ID NO:16, аминокислотная последовательность продукта экспрессии приведена в SEQ ID NO:17. Map of the expression construct is shown in Figure 2 and in SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence of the expression product is shown in SEQ ID NO: 17.

Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pET32a-Inf4. Example 3. Preparation of an expression plasmid DNA pET32a-Inf4.

Реципиентную плазмиду рЕТ32а (+) (Novagen, США) рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и HindIII, как описано в примере 2. Донорную плазмиду p10E-Inf4 рестрицировали NcoI и HindIII и очищали из 1,5% агарозного геля набором «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США). The recipient plasmid pET32a (+) (Novagen, USA) was digested sequentially each of endonucleases NcoI and HindIII, as described in Example 2. The donor plasmid p10E-Inf4 digested with NcoI and HindIII and purified from a 1.5% agarose gel dial «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System »(« Promega », USA). Выделенные фрагменты лигировали, трансформировали лигаты в Е.coli штамма DH5-альфа и производили селекцию клонов, как описано в примере 2. Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT-Amp, выделяли плазмидную ДНК набором «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» и определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7term. The isolated fragments were ligated, transformed into E. coli Ligate strain DH5-alpha and selecting clones was performed as described in Example 2. Selected clones built up in 5 ml of 2xYT-Amp, plasmid DNA was isolated dial «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» and the nucleotide sequence DNA sequencing PCR with primer T7term. Карта конструкции приведена на Фиг.3, последовательность в SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность целевого белка приведена в SEQ ID NO:2. Map construction shown in Figure 3, the sequence in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of the target protein is shown in SEQ ID NO: 2.

Пример 4. Получение штаммов-продуцентов Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4 и Е.coli BL21[DE3]/pET32a-Inf4, оценка продуктивности штаммов-продуцентов и локализация целевого белка. Example 4. Preparation of strains of E. coli BL21 [DE3] / p10E-Inf4 and E. coli BL21 [DE3] / pET32a-Inf4, productivity assessment producer strains and localization of the target protein.

Для получения штаммов-продуцентов слитого белка тиоредоксина E.coli, линкерного участка и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) и белка-предшественника 10Е-Inf4 конструкции, полученные по примерам 2 и 3, использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) (с генотипом F- oтpT hsdS B (rm-) gal dcm (DE3)). For producing strains thioredoxin fusion protein E.coli, linker, and domain portion 4 infestina (Trx-Inf4) and precursor protein 10E-Inf4 structures obtained in Examples 2 and 3 was used to transform competent cells of Escherichia coli BL21 (DE3) (genotype F- otpT hsdS B (rm-) gal dcm ( DE3)).

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4-продуцента белка-предшественника домена 4 инфестина Triatoma infestans в составе клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой p10E-Inf4. For the E. coli strain BL21 [DE3] / p10E-Inf4-producing precursor protein domain 4 infestina Triatoma infestans consisting of E. coli strain BL21 cells [DE3] were transformed with expression plasmid p10E-Inf4.

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4-продуцента слитого белка Trx-Inf4 клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET32a-Inf4. For the E. coli strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4-producing fusion protein Trx-Inf4 cells of strain E. coli BL21 [DE3] were transformed with expression plasmid pET32a-Inf4.

Аналогично получали контрольный штамм Е.coli BL21[DE3]/pET32a-продуцент тиоредоксина I E.coli (Trx), трансформируя клетки Е.coli BL21[DE3] плазмидой рЕТ32а. Similarly prepared are the control E. coli strain BL21 [DE3] / pET32a-producing thioredoxin I E.coli (Trx), transforming E. coli cells BL21 [DE3] plasmid pET32a.

Трансформанты Е.coli высевали на агаризованную среду 2xYT с добавлением глюкозы до 2% и селективных антибиотиков - 30 мкг/мл канамицина для BL21[DE3]/p10E-Inf4 или 50 мкг/мл ампициллина для BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и BL21[DE3]/pET32a; E. coli transformants were plated on 2xYT agar medium supplemented with glucose 2% and selective antibiotics - 30 ug / ml kanamycin for BL21 [DE3] / p10E-Inf4 or 50 .mu.g / ml ampicillin for BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 and BL21 [DE3] / pET32a; проводили индукцию экспрессии целевых белков для четырех случайно выбранных колоний с типичным фенотипом. target protein expression was carried out for the induction of four randomly selected colonies with the typical phenotype. Колонии подращивали в питательном бульоне с добавлением соответствующего антибиотика и раствора глюкозы до 2% в течение 14 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 1-1,5 О.Е., индуцировали изопропилтио-р-D-галактозидом и культивировали еще 16 ч, отобрав аликвоты суспензии после 4 ч индукции. Colonies were grown in nutrient broth supplemented with appropriate antibiotics and glucose solution to 2% for 14 hours was inoculated nutrient medium new batch in the ratio of 1: 100, were grown culture until the optical density of 1-1.5 OE, induced with isopropylthio p-D-galactoside, and cultured for a further 16 hours, selecting aliquot suspension after 4 h of induction. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. After completion of cultivation precipitate was separated by centrifugation of cells, resuspended the cells in a solution of 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA-Na, 0.1% Triton-X100, 10 / ml lysozyme in the ratio 10 ml solution per 1 g of cell paste was heated slurry 30 min on ice and cell disruption was performed until disappearance ultrasonic disperser apparent viscosity of the slurry. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Samples were taken for electrophoretic analysis, they were separated into soluble and insoluble protein fraction by centrifugation in a microfuge, resuspended precipitate was added in the same solution and pelleted by centrifugation. Результаты электрофоретического анализа тотального белка для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4 приведены на Фиг.4. The results of electrophoretic analysis of total protein for strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 shown in Figure 4. Электрофоретическая подвижность целевого белка соответствует расчетным значениям. The electrophoretic mobility of the target protein corresponds to the calculated values. По данным гель-электрофореза белковых фракций (Фиг.5) целевой белок Trx-Inf4 и контрольный белок-партнер Trx практически полностью были локализованы в растворимой фракции белков. According gel electrophoresis of the protein fractions (5) target protein Trx-Inf4 and controlling partner protein Trx were almost entirely localized in the soluble fraction of proteins. В случае штамма BL21[DE3]/p10E-Inf4 электрофоретический анализ показал отсутствие видимого продукта экспрессии. In the case of strain BL21 [DE3] / p10E-Inf4 electrophoretic analysis showed no visible expression product.

Пример 5. Выделение и очистка слитого белка Trx-Inf4 Example 5. Isolation and purification of the fusion protein Trx-Inf4

Штамм-продуцент BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и контрольный штамм BL21[DE3]/pET32a высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 1% глюкозы, растили 14 часов при +37°C. Producing strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 and control strain BL21 [DE3] / pET32a seeded museum loop debilitating streaked on a Petri dish with agar medium LB, containing 30 ug / ml kanamycin and 1% glucose, were grown 14 hours at + 37 ° C. Одну отдельную колонию каждого штамма переносили в 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы и растили на качалке 14 часов при +37°C. One single colony of each strain was transferred to a 5 ml liquid medium 2xYT, containing 100 ug / ml ampicillin and 1% glucose and grown with shaking for 14 hours at + 37 ° C. Содержимым инокулировали 2 колбы, содержащие по 250 мл среды Terrific broth, дополнительно содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, растили на качалке 3,5 часа при +37°C, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 4 ч при +30°C. Contents inoculated with 2 flasks containing 250 ml of medium Terrific broth, additionally containing 100 .mu.g / ml ampicillin and 0.1% glucose, were grown on a shaker for 3.5 hours at + 37 ° C, samples of the bacterial suspension was taken for analysis, IPTG was added to final concentration of 1 mM and grown an additional 4 hours at + 30 ° C. Осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис pH 7,4, 2 мМ ЭДТА), добавили лизоцим до 0,1 мг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. The cell pellet was separated by centrifugation, resuspended in 20 ml of solution A (50 mM Tris pH 7,4, 2 mM EDTA) was added lysozyme to 0.1 mg / mL and Triton X100 to 0.1%, incubated for 30 min on ice. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Cell destruction was conducted and the genomic DNA using an ultrasonic disperser for 10 s pulses until the disappearance of high viscosity suspension. Отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Separate the precipitate by centrifugation 10 minutes at 20000 rev / min. Проводили термокоагуляцию примесных белков в полученном осветленном лизате инкубацией при температуре +70°C (максимально возможная для Trx-Inf4) в течение 10 мин. Thermocoagulation performed contaminating proteins in the resulting clarified lysate by incubation at + 70 ° C (the maximum possible for Trx-Inf4) for 10 min. Отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин. Separate the precipitate by centrifugation for 10 min at 5000 rev / min. Осаждали целевые белки добавлением равного объема насыщенного раствора сульфата аммония, выдерживали 30 мин на льду, центрифугировали 20 мин на 5000 об/мин, супернатант отбрасывали. Target proteins precipitated by adding an equal volume of saturated ammonium sulfate solution, maintained for 30 min on ice, centrifuged 20 min at 5000 rev / min, the supernatant was discarded. Осадок суспендировали в 10 мл раствора В (50 мM Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7,4), отделяли денатурированные белки центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин. The precipitate was suspended in 10 ml of solution B (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4) was separated denatured proteins by centrifugation for 20 min at 5000 rev / min. Супернатант фильтровали через дисковый фильтр с порами 0,45 мкм и наносили на 1 мл колонку с сорбентом Chelating Sepharose Fast Flow («GE Healthcare», США), содержащим хелатированные ионы никеля, и уравновешенным раствором В. Нанесение вели на скорости 0,5 мл/мин. The supernatant was filtered through a disc filter with pores of 0.45 microns and 1 ml was applied on a column of sorbent Chelating Sepharose Fast Flow ( «GE Healthcare», USA) containing a chelated nickel ions and equilibrated solution B. Application conducted at a speed of 0.5 ml / min. Проскок собирали для дальнейшего анализа. Breakthrough was collected for further analysis. Проводили ступенчатую элюцию адсорбированных белков раствором В с концентрацией имидазола 100, 200, 500 мМ на скорости потока 1 мл/мин. Carried out stepwise elution of the adsorbed protein with a solution of imidazole in a concentration of 100, 200, 500 mM at a flow rate of 1 ml / min. Удаляли иммобилизованные ионы никеля раствором B+50 мМ ЭДТА-Na, рН 8,0. Was removed by immobilized nickel ions solution B + 50 mM EDTA-Na, pH 8.0. Регенерировали колонку 10 мл раствора 0,1 М гидроксида натрия. Column was regenerated with 10 ml of 0.1 M sodium hydroxide solution. Элюат при промывке гидроксидом натрия немедленно нейтрализовали 1,2 моль-эквивалента уксусной кислоты. The eluate by washing with sodium hydroxide immediately neutralized with 1.2 mole equivalents of acetic acid. Аликвоты всех полученных белковых фракций анализировали при помощи ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (Фиг.5). Aliquots of the obtained protein fractions were analyzed by SDS-PAGE under nonreducing conditions (Figure 5).

Окончательную очистку целевого белка проводили при помощи анионообменной хроматографии с использованием декстранового сорбента Capto Q («GE Healthcare», США). The final purification of the target protein was carried out using anion exchange chromatography using dextran sorbent Capto Q ( «GE Healthcare», USA). Колонку объемом 1 мл уравновешивали раствором A (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,4), промывали 5 объемами раствора В (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, рН=7,4) и повторно промывали 5 объемами раствора А. Раствор полуочищенного Trx-Inf4 после металлохелатной хроматографии разбавляли водой, очищенной в 10 раз, и наносили на уравновешенную колонку Capto Q на скорости 3 мл/мин. The column was equilibrated with 1 ml solution A (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4), washed with 5 volumes of solution B (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.4) and re-washed 5 volumes of solution A. a solution of semi-purified Trx-Inf4 after the metal chelate chromatography is diluted with water, purified 10-fold, and loaded onto equilibrated Capto Q column at a rate of 3 ml / min. Колонку промывали 10 объемами раствора A и проводили градиентную элюцию от 0 до 100% раствора B за 20 мин при скорости потока 1 мл/мин. The column was washed with 10 volumes of solution A and gradient elution was carried out from 0 to 100% B solution for 20 min at a flow of 1 ml / min. Собирали фракции, содержащие белок по данным УФ-детектора, и анализировали их при помощи ДСН-ПААГ (Фиг.6). Fractions containing protein by UV-detector and analyzed by SDS-PAGE (Figure 6).

Фракции, содержащие только целевой белок, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией при помощи одноразовой ячейки Vivaspin 6 PES 5 kDa (Sartorius Stedim, Германия) до конечного объема 1,5 мл. Fractions containing only the desired protein were pooled and concentrated by ultrafiltration using Vivaspin 6 disposable cell PES 5 kDa (Sartorius Stedim, Germany) to a final volume of 1.5 ml. Концентрированный раствор переносили в микропробирку, добавляли консервант тимеросаль (Sigma, США) до конечной концентрации 0,02%, разделяли на аликвоты по 200 мкл и переносили на хранение на минус 20°C. The concentrated solution was transferred to a microtube added preservative thimerosal (Sigma, USA) to a final concentration of 0.02%, was separated into aliquots of 200 ul and transferred to storage at -20 ° C.

Пример 6. Анализ очищенного слитого белка Trx-Inf4 Example 6. Analysis of the purified fusion protein Trx-Inf4

В полученном растворе очищенного Trx-Inf4 измеряли концентрацию основного вещества и долю полипептидных примесей при помощи обращеннофазовой хроматографии. The resultant solution of purified Trx-Inf4 measured concentration of the basic substance and the proportion of polypeptide contaminants using reverse phase chromatography. Использовали колонку SOURCE RPC 4.6 ST («GE Healthcare», США) подвижные фазы A - 5% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты в воде; The column SOURCE RPC 4.6 ST ( «GE Healthcare», USA) mobile phase A - 5% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid in water; B - 80% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты в воде, программа градиента - 5 мин 100% раствора A, от 0 до 100% раствора B за 40 мин, 3 мин 100% раствора B, от 100 до 0% раствора B за 1 мин, 3 мин 100% раствора A, скорость 1 мл/мин, температура колонки +40°C. B - 80% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid in water gradient program - 5 min 100% solution A, from 0 to 100% solution B over 40 min, 3 min 100% B solution, from 100 to 0% of solution B for 1 min, 3 min 100% solution A, flow 1 ml / min, column temperature + 40 ° C. Объем вводимой пробы - 15 мкл, пробоподготовка - добавление ацетонитрила до 10% и труфторуксусной кислоты до 1%, разбавление пробы 1,11 раза. Injection volume - 15 .mu.l, sample preparation - adding acetonitrile to 10% truftoruksusnoy acid and up to 1%, 1.11 times the dilution of the sample. Детекцию вели на длинах волн 280 и 214 нм. Detection was conducted at wavelengths of 280 and 214 nm.

Чистота основного вещества была сходной при анализе данных обоих каналов детекции и составила более 98%. Cleanliness of the basic substance was similar both in the analysis and detection of channel data was more than 98%. Хроматограмма для канала 280 нм приведена на Фиг.7. The chromatogram for the 280 nm channel is shown in Figure 7.

При обработке биомассы, полученной из 500 мл бактериальной суспензии, было получено 24 мг очищенного белка Trx-Inf4 (по данным ОФ-ВЭЖХ, в предположении 80% элюции основного вещества при анализе), что соответствует продуктивности разработанной системы 48 мг слитого белка с одного литра бактериальной культуры при выращивании в колбах. In processing of biomass obtained from 500 ml of bacterial suspension was prepared 24 mg of purified protein Trx-Inf4 (according to RP-HPLC, assuming 80% of the elution of the basic substance in the analysis), corresponding to the productivity of the developed system 48 mg fusion protein per liter bacterial culture when grown in flasks.

Для выявления родственных примесей, которые могли коэлюировать с пиком основного вещества при ОФ-ВЭЖХ, провели электрофоретический анализ полученного очищенного Trx-Inf4 в восстанавливающих условиях с последующей денситометрией электрофореграммы. For detection of related impurities which could koelyuirovat basic substance with a peak at a RP-HPLC analysis of the resulting spent electrophoretic purified Trx-Inf4 under reducing conditions followed by densitometry electrophoretogram. Была детектирована одна полоса примеси с объемом денситометрированного пика около 0,5% от объема денситометрированного пика основного вещества (Фиг.8). One band was detected with a volume densitometrirovannogo impurity peak around 0.5% of the peak densitometrirovannogo basic substance (8).

Функциональную активность Trx-Inf4, т.е. The functional activity of Trx-Inf4, i.e. способность замедлять свертывание плазмы крови по "внутреннему" пути вследствие ингибирования фактора ХIIa, исследовали при помощи "каолинового теста". ability to inhibit the plasma coagulation by "internal" path due to inhibition of factor HIIa were examined using the "kaolin test." Использовали суспензию каолина и лиофилизованную нормальную плазму производства НПО Ренам (Россия); A suspension of kaolin and lyophilized normal plasma NGOs Renamo production (Russia); измерения проводили на полуавтоматическом коагулометре ThromboScreen 400 (Pacific Hemostasis, США) по инструкциям производителей прибора и реагента. measurements were performed on a semi-automatic coagulometer ThromboScreen 400 (Pacific Hemostasis, USA) according to instructions of the instrument manufacturer and reagent. Исследуемый образец Trx-Inf4 вносили в плазму за 1 мин до внесения суспензии каолина в объеме не более 10 мкл. The test sample Trx-Inf4 introduced into the plasma for 1 min prior to making kaolin suspension in a volume of no more than 10 microliters. При внесении Trx-Inf4 в плазму в конечной концентрации 0,4 мг/мл (7,5 мкМ) время свертывания составило 192 с, для контрольного белка Trx в конечной концентрации 0,4 мг/мл - 65 с, для интактной плазмы - 57 с. When making Trx-Inf4 the plasma at a final concentration of 0.4 mg / ml (7.5 pM) clotting time was 192 s, for Trx control protein in a final concentration of 0.4 mg / ml - 65 to intact plasma - 57 from. Таким образом, было установлено, что слитый белок Trx-Inf4 в высокой концентрации способен замедлить время свертывания плазмы в каолиновом тесте в 3 раза. Thus, it was found that the fusion protein Trx-Inf4 at a high concentration capable of slow plasma clotting time in the kaolin test 3 times. Для установления практически применимой при коагулометрической диагностике рабочей концентрации Trx-Inf4 провели измерения каолинового времени для различных концентраций внесенного Trx-Inf4 (Фиг.9). To establish a practicable at koagulometricheskoy diagnosis working concentration Trx-Inf4 spent kaolin measurement time for different concentrations introduced Trx-Inf4 (9). Время свертывания плазмы быстро увеличивается при возрастании концентрации Trx-Inf4 от 150 до 300 нМ и при дальнейшем увеличении концентрации ингибитора меняется слабо, что соответствует полному блокированию активированного на поверхности частиц каолина фактора XII и последующему неспецифическому ингибированию других трипсиноподобных факторов свертывания крови. Plasma clotting time increases rapidly with increasing concentration of Trx-Inf4 from 150 to 300 nM, and with further increase in inhibitor concentration varies slightly, which corresponds to a complete blockage on the surface of activated factor XII kaolin particles and subsequent nonspecific inhibition of other trypsin blood clotting factors.

Пример 7. Определение анти-фХа активности белка Trx-Inf4. Example 7. Determination of activity of anti-fHa protein Trx-Inf4.

Для определения ингибирующей активности Trx-Inf4 по отношению к фактору Ха (фХа) использовали реакцию расщепления фХа (Hematologic Technologies Inc., США) специфичного хромогенного субстрата S-2765 (Chromogenix, Швеция). To determine the inhibitory activity of Trx-Inf4 for Factor Xa (fHa) was used fHa cleavage reaction (Hematologic Technologies Inc., USA) specific chromogenic substrate S-2765 (Chromogenix, Sweden). В ячейки планшета последовательно помещали 50 мкл раствора фХа (финальная концентрация 0,5 нМ) в буфере С (50 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl и 0,5% БСА, рН 8,3), 50 мкл раствора Trx-Inf4 в буфере C или растворителя (0,3 М Hepes, рН 7,4). The cell plate was placed 50 ul sequentially fHa solution (final concentration 0.5 nM) in buffer C (50 mM Tris-HCl, 130 mM NaCl and 0.5% BSA, pH 8.3), 50 .mu.l of Trx-Inf4 solution C of the solvent or buffer (0.3 M Hepes, pH 7.4). Перед началом реакции смесь инкубировали 15 минут при 37°C, после чего добавляли 100 мкл раствора хромогенного субстрата (финальная концентрация S-2765 500 мкМ). Before beginning the reaction mixture was incubated for 15 minutes at 37 ° C, followed by addition of 100 ul of chromogenic substrate solution (final concentration of S-2765 500 uM). Начальную скорость гидролиза субстрата измеряли спектрофотометрически на длине волны 405 нм. The initial velocity of substrate hydrolysis was measured spectrophotometrically at a wavelength of 405 nm. Определяли процент ингибирования скорости гидролиза в присутствии различных концентраций Trx-Inf4 (относительно скорости в пробе без ингибитора) и величину концентрации Trx-Inf4, снижающую скорость гидролиза на 50% (IC50). The percentage of inhibition rate of hydrolysis in the presence of various concentrations of Trx-Inf4 (relative velocity in the sample without inhibitor) and the value of the concentration of Trx-Inf4, reducing the rate of hydrolysis at 50% (IC50). IC50 составило 7,5 мкМ. IC50 was 7.5 uM. Константа ингибирования KI по отношению к фХа может быть вычислена по уравнению Ченга-Прусоффа (KI = IC50/(1+S/Km)), в котором S - концентрация субстрата, Km - константа Михаэлиса-Ментен субстрата по отношению к фХа, составляющая 250 мкМ. The inhibition constant KI towards fHa can be calculated from the Cheng-Prusoff equation (KI = IC50 / (1 + S / Km)), where S - substrate concentration, Km - Michaelis-Menten constant of the substrate relative to fHa constituting 250 uM. KI для Trx-Inf4 по отношению к фХа составила 2,5 мкМ, т.е. KI for Trx-Inf4 towards fHa was 2.5 uM, i.e. примерно в 50 раз выше, чем известно для нативного инфестина-4, и примерно в 10 раз выше рабочей концентрации, практически применимой при коагулометрической диагностике. about 50 times higher than that known for native infestina-4 and about 10 times the working concentration, practicable at koagulometricheskoy diagnosis. Таким образом, слитый белок Trx-Inf4, по сравнению с нативным инфестином-4, является более специфичным ингибитором фХIIа. Thus, the fusion protein Trx-Inf4, as compared to native infestinom-4 is a more specific inhibitor fHIIa.

Приведенные результаты показали, что включение в последовательность получаемого полипептида N-концевого белка-партнера тиоредоксина в сочетании с синтетическим геном домена 4 инфестина, кодируемого оптимальными для Е.coli кодонами, сохраняет функциональные свойства домена 4 инфестина, заключающиеся в ингибировании фХIIa и контактной активации свертывания, и значительно увеличивает уровень экспрессии, обеспечивает корректный фолдинг гетерологичного белкового домена в бактериальной цитоплазме. These results showed that the inclusion of the sequence of the resulting polypeptide N-terminal partner protein thioredoxin in combination with synthetic gene 4 infestina domain encoded by codon optimized for E. coli, retains the functional properties of the domain 4 infestina consisting in inhibiting and fHIIa coagulation contact activation, and greatly increase the level of expression provides correct heterologous protein folding in the bacterial cytoplasm domain.

Преимуществом данного изобретения является повышение специфичности полученного ингибитора Trx-Inf4 к фХIIa по сравнению с нативным инфестином-4, которая заключается в том, что Trx-Inf4 ингибирует фХа в 50 раз слабее. The advantage of this invention is to increase the specificity of the inhibitor obtained Trx-Inf4 to fHIIa compared to native infestinom-4, which consists in that Trx-Inf4 inhibits fHa 50 times weaker. Это позволяет предполагать, что при применении слитого белка тиоредоксина и инфестина-4 в диапазоне рабочих концентраций, при которых эффективно ингибируется контактная активация, не будет проявляться нежелательный эффект неспецифического ингибирования других протеаз свертывания, кроме фХIIа. This suggests that when using the fusion protein of thioredoxin and infestina-4 in the range of working concentrations at which effectively inhibited by contact activation, would not manifest the undesirable effect of non-specific inhibition of other coagulation proteases except fHIIa.

Преимущества предлагаемого штамма E.coli BL21[DE3] заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OтpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного полипептида и контаминации выделяемого белка наиболее активными протеазами Е.coli. The advantages of the strain of E.coli BL21 [DE3] bacteria are in use with a phenotype Lon OtpT that eliminates the possibility of proteolytic cleavage of the synthesized de novo recombinant polypeptide and protein contamination emitted most active proteases of E. coli. Встроенный в геном штамма-реципиента ген РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем lacUV5 промотора при использовании Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмидах приводит к быстрой и эффективной продукции белка. Integrated into the genome of the recipient strain RNA polymerase gene under the control of bacteriophage T7 promoter, lacUV5 using the T7-lac promoter and T7 terminator into the plasmid leads to rapid and efficient protein production.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. While the invention has been described in detail with reference to Examples, to one skilled in the art that may be made various changes and equivalent replacements are made and such modifications and substitutions without departing from the scope of the present invention.

Claims (4)

  1. 1. Слитый белок для специфического ингибирования свертывания крови, включающий тиоредоксин I Е.coli и инфестин-4, характеризующийся последовательностью SEQ ID NO: 2, при этом он обладает повышенной специфичностью ингибирования фХIIа и имеет пониженную ингибирующую активность к фХа по сравнению с нативным инфестином-4. 1. A fusion protein for specific inhibition of blood coagulation, comprising the E. coli thioredoxin and infestin I-4, characterized by the sequence SEQ ID NO: 2, while it has a high specificity for inhibiting fHIIa and has a reduced inhibitory activity to fHa compared to native infestinom- 4.
  2. 2. Экспрессионная плазмидная ДНК, 2. An expression plasmid DNA
    содержащая последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую слитый белок по п.1 и находящуюся под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке, преимущественно промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, причем она содержит один или несколько из указанных участков: область начала репликации плазмиды, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую бета-лактамазу, участок терминации транскрипции, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона, последовательн sequence comprising SEQ ID NO: 1 encoding a fusion protein according to claim 1 and which is under control of a promoter functioning in a bacterial cell, preferably the promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7, wherein it contains one or more of these sites: the origin of replication of a plasmid gene RNA organizing Rop protein, the replication initiation region of bacteriophage f1, the sequence encoding beta-lactamase, a transcriptional termination region, the sequence coding for the repressor of the lactose operon, consequently сть, кодирующую тиоредоксин I E.coli, последовательность, кодирующую полигистидиновый таг. st encoding thioredoxin I E.coli, the sequence encoding a polyhistidine tag.
  3. 3. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная плазмидной ДНК по п.2, для продуцирования слитого белка по п.1. 3. A bacterium belonging to the genus Escherichia transformed with plasmid DNA according to claim 2, for the production of the fusion protein of claim 1.
  4. 4. Способ получения слитого белка по п.1, включающий культивирование бактерий по п.3 в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии. 4. A method of producing a fusion protein according to claim 1, comprising culturing bacteria of claim 3 in a culture medium, destruction of the bacterial cells and purification of fusion protein using metal chelate chromatography and anion exchange chromatography.
RU2012152609A 2012-12-07 2012-12-07 FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA RU2528251C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012152609A RU2528251C2 (en) 2012-12-07 2012-12-07 FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012152609A RU2528251C2 (en) 2012-12-07 2012-12-07 FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012152609A true RU2012152609A (en) 2014-06-20
RU2528251C2 true RU2528251C2 (en) 2014-09-10

Family

ID=51213385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012152609A RU2528251C2 (en) 2012-12-07 2012-12-07 FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2528251C2 (en)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1769299A (en) * 2005-07-22 2006-05-10 彭隽 Novel fusion protein production and uses
RU2360926C1 (en) * 2008-03-17 2009-07-10 Всеволод Иванович Киселев Hybrid protein cfp10-esat6, inducing reaction of hypersensitivity of delayed type with respect to m tuberculosis, coding it chimeric nucleic acid and recombinant plasmid expression vector, containing it, method of obtaining hybrid protein and based on it dosed medicinal form for intracutaneous injection
US7638323B2 (en) * 2002-08-09 2009-12-29 Recopharma Ab Fusion proteins and methods of producing same
CN101899460A (en) * 2010-02-24 2010-12-01 浙江大学 Method for preparing fusion protein capable of lowering food allergen reaction
RU2413769C1 (en) * 2009-12-24 2011-03-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН RECOMBINANT PLASMID DNA pET-32a, CODING GEN LIGNAD-BINDING DOMAIN OF RECEPTOR II TYPE OF HUMAN TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β (TβRII), STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli - PRODUCENT OF FUSION PROTEIN THIOREDOXIN/TβRII AND METHOD OF RENATURATION AND PURIFICATION OF TARGET PROTEIN TβRII
CN102477098A (en) * 2010-11-29 2012-05-30 清华大学深圳研究生院 Fusion protein and application thereof in preparation of human leukemia inhibitory factor

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7638323B2 (en) * 2002-08-09 2009-12-29 Recopharma Ab Fusion proteins and methods of producing same
CN1769299A (en) * 2005-07-22 2006-05-10 彭隽 Novel fusion protein production and uses
RU2360926C1 (en) * 2008-03-17 2009-07-10 Всеволод Иванович Киселев Hybrid protein cfp10-esat6, inducing reaction of hypersensitivity of delayed type with respect to m tuberculosis, coding it chimeric nucleic acid and recombinant plasmid expression vector, containing it, method of obtaining hybrid protein and based on it dosed medicinal form for intracutaneous injection
RU2413769C1 (en) * 2009-12-24 2011-03-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН RECOMBINANT PLASMID DNA pET-32a, CODING GEN LIGNAD-BINDING DOMAIN OF RECEPTOR II TYPE OF HUMAN TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β (TβRII), STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli - PRODUCENT OF FUSION PROTEIN THIOREDOXIN/TβRII AND METHOD OF RENATURATION AND PURIFICATION OF TARGET PROTEIN TβRII
CN101899460A (en) * 2010-02-24 2010-12-01 浙江大学 Method for preparing fusion protein capable of lowering food allergen reaction
CN102477098A (en) * 2010-11-29 2012-05-30 清华大学深圳研究生院 Fusion protein and application thereof in preparation of human leukemia inhibitory factor

Also Published As

Publication number Publication date Type
RU2012152609A (en) 2014-06-20 application

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thumm et al. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus
US5532142A (en) Method of isolation and purification of fusion polypeptides
Carrió et al. Protein aggregation as bacterial inclusion bodies is reversible
Murby et al. Upstream strategies to minimize proteolytic degradation upon recombinant production inEscherichia coli
Georgiou et al. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects
Blommel et al. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease
Collins-Racie et al. Production of recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the novel secretory fusion partner DsbA
Shanklin et al. The stroma of higher plant plastids contain ClpP and ClpC, functional homologs of Escherichia coli ClpP and ClpA: an archetypal two-component ATP-dependent protease.
Artsimovitch et al. Co-overexpression of E. coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions
US6083715A (en) Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
WO1988009811A1 (en) Proteins and derivatives thereof
Hardie et al. In vitro activation of Escherichia coli prohaemolysin to the mature membrane‐targeted toxin requires HlyC and a low molecular‐weight cytosolic polypeptide
US7067298B2 (en) Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US5888775A (en) Peptide synthesis and purification by fusion to penI protein or precipitation effective portion thereof
US5814506A (en) Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion
US5804410A (en) Nucleic acid sequence encoding trypsin-like enzyme and process for producing the enzyme
WO1997028272A1 (en) Protein expression system
WO1998049326A1 (en) Method for cleavage of fusion proteins
WO2000059537A1 (en) System for efficient secretion of recombinant proteins
Moynihan et al. O-acetylation of peptidoglycan in gram-negative bacteria: identification and characterization of peptidoglycan O-acetyltransferase in Neisseria gonorrhoeae
WO1991017245A1 (en) Ubiquitin-specific protease
US20030207402A1 (en) Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use
Hsu et al. Structure of the cyclomodulin Cif from pathogenic Escherichia coli
Mangel et al. Specific interactions of the adenovirus proteinase with the viral DNA, an 11-amino-acid viral peptide, and the cellular protein actin
US20060205041A1 (en) Recombinant bovine thrombin