RU2528251C2

RU2528251C2 - FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA

Info

Publication number: RU2528251C2
Application number: RU2012152609/10A
Authority: RU
Inventors: Иван Иванович Воробьев; Надежда Александровна Орлова; Владимир Николаевич Колядко
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Гематологическая Корпорация" (ООО "ГемаКор")
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-09-10
Also published as: RU2012152609A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: inventions refer to biotechnology and concern a fused protein for the specific inhibition of blood coagulation, an expression plasmid DNA coding this fused protein, a bacterium of the genus Escherichia transformed by this DNA, and to a method for preparing the fused protein. The presented fused protein contains thioredoxin I E.coli and infestine-4 and is characterised by the sequence SEQ ID NO:2. The plasmid DNA contains the sequence SEQ ID NO:1 coding the presented fused protein and controlled by a promoter functioning in a bacterial cell. The method for preparing the above fused protein involves culturing the above bacteria in a nutrient medium, breaking the bacterial cells and purifying the above fused protein with using a metal chelate chromatography and an anion-exchange chromatography.

EFFECT: characterised solutions enables preparing the protein providing the above specificity to be used in blocking the contact activation of blood coagulation by inhibition of the XIIa factor and the absence of inhibition of the Xa factor.

4 cl, 10 dwg, 7 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a technology for the production of biologically active substances (BAS) by genetic engineering.

Предшествующий уровень техники.The prior art.

Биологические жидкости и ткани животных и растений содержат большое число ингибиторов протеаз. Большая часть хорошо изученных в настоящее время белковых ингибиторов содержит 60-70 аминокислотных остатков. Наряду с ингибиторами широкого спектра действия, такими, как альфа-2 макроглобулин, большая часть ингибиторов проявляет определенную групповую специфичность. Особенно распространены ингибиторы сериновых протеиназ. Их предложено классифицировать, как минимум, на 10 семейств. Сюда входят ингибиторы семейства панкреатического трипсинового ингибитора Куница, семейства панкреатического секреторного ингибитора (Казаля).Biological fluids and tissues of animals and plants contain a large number of protease inhibitors. Most of the currently well-studied protein inhibitors contain 60-70 amino acid residues. Along with broad-spectrum inhibitors, such as alpha-2 macroglobulin, most inhibitors exhibit a certain group specificity. Serine proteinase inhibitors are especially common. They are proposed to be classified into at least 10 families. This includes inhibitors of the Pancreatic trypsin inhibitor family Kunits, a family of pancreatic secretory inhibitor (Casal).

Семейство ингибиторов Казаля принадлежит к семейству ингибиторов I1, клан IA по классификации публичной базы данных MEROPS [Rawlings, Tolle and Barrett, Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem J, v.378, p.705-16 (2004)]. Ингибиторы Казаля воздействуют на сериновые пептидазы семейства S1, например на трипсин и эластазу. Ингибиторы Казаля в основном встречаются у многоклеточных животных, типичные представители семейства - овомукоид птиц, ингибитор акрозина и ингибитор эластазы. Известные ингибиторы этого семейства включают от одного до семи "доменов Казаля" или "повторов Казаля" [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984), Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Структура домена Казаля включает значительную долю несвернутой полипептидной цепи, две короткие альфа-спирали и один бета-слой, состоящий из трех антипараллельных цепей [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v.173, p.341-59 (1984)]. В установлении прямого межмолекулярного контакта домена Казаля и ингибируемого фермента вовлечено 11 аминокислотных остатков, при этом 8 из них являются гипервариабельными [Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. Варьирование аминокислот, участвующих в образовании контактов с ингибируемым ферментом, изменяет как константу ингибирования, так и специфичность ингибитора [Empie and Laskowski, Thermodynamics and kinetics of single residue replacements in avian ovomucoid third domains: effect on inhibitor interactions with serine proteinases // Biochemistry, v.21, p.2274-84 (1982)].The Casal family of inhibitors belongs to the I1 family of inhibitors, clan IA, according to the classification of the public MEROPS database [Rawlings, Tolle and Barrett, Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem J, v.378, p.705-16 (2004)]. Casal inhibitors act on serine peptidases of the S1 family, for example, trypsin and elastase. Casal inhibitors are mainly found in multicellular animals, typical members of the family are bird ovomukoid, acrosin inhibitor and elastase inhibitor. Known inhibitors of this family include one to seven “Casal domains” or “Casal repeats” [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v. 173, p. 341-59 (1984), Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. The Casal domain structure includes a significant fraction of the unfolded polypeptide chain, two short alpha helices and one beta layer consisting of three antiparallel chains [Williamson, Marion and Wuthrich, Secondary structure in the solution conformation of the proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by nuclear magnetic resonance // J Mol Biol, v. 173, p. 341-59 (1984)]. 11 amino acid residues are involved in the establishment of direct intermolecular contact between the Casal domain and the inhibited enzyme, 8 of which are hypervariable [Laskowski, Kato, Ardelt, Cook, Denton, Empie, Kohr, Park, Parks, Schatzley and et al., Ovomucoid third domains from 100 avian species: isolation, sequences, and hypervariability of enzyme-inhibitor contact residues // Biochemistry, v.26, p.202-21 (1987)]. The variation of amino acids involved in the formation of contacts with an inhibitory enzyme changes both the inhibition constant and the specificity of the inhibitor [Empie and Laskowski, Thermodynamics and kinetics of single residue replacements in avian ovomucoid third domains: effect on inhibitor interactions with serine proteinases // Biochemistry, v .21, p. 2274-84 (1982)].

Известен домен Казаля в составе белка инфестин из желудка кровососущего клопа Triatoma infestans, специфично блокирующий активированный фактор свертывания крови XII (фактор Хагемана, фXIIa) [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)]. Домен, блокирующий фХIIa, имеет порядковый номер 4, остальные домены Казаля в составе инфестина специфически ингибируют другие факторы свертывания крови. Аминокислотная последовательность инфестина и границы доменов приведены в публичной базе данных UniProt (http://www.uniprot.org/), номер записи Q95P16. Для изолированного рекомбинантного домена 4 инфестина был получен кристалл комплекса с фХIIa [Campos, Guimaraes, Medrano, Tanaka and Barbosa, Crystallization, data collection and phasing of infestin 4, a factor XIIa inhibitor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.60, p.2051-3 (2004)] и определена пространственная структура комплекса.The Casal domain is known as the infestin protein from the stomach of the blood-sucking bug Triatoma infestans, specifically blocking activated blood coagulation factor XII (Hageman factor, phxIIa) [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)]. The blocking domain of pXIIa is numbered 4, the other Casal domains in infestin specifically inhibit other blood coagulation factors. The amino acid sequence of infestin and domain boundaries is given in the UniProt public database (http://www.uniprot.org/), record number Q95P16. For the isolated recombinant domain 4 of infestin, a crystal of a complex with phIIa was obtained [Campos, Guimaraes, Medrano, Tanaka and Barbosa, Crystallization, data collection and phasing of infestin 4, a factor XIIa inhibitor // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.60, p .2051-3 (2004)] and the spatial structure of the complex is determined.

Свойство инфестина-4 ингибировать фХIIa делает его перспективным ингибитором контактной активации свертывания крови для применения в гемостазиологии, в том числе, в качестве лекарственного препарата для лечения и профилактики тромбозов и других заболеваний, связанных с гиперкоагуляционным состоянием системы свертывания крови. Из источника [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, р.512-6 (2004)] известна способность инфестина-4 ингибировать другой фактор системы свертывания, фХа, с константой ингибирования 53 нМ. Данное неспецифическое действие серьезно ограничивает возможность применения инфестина-4, поскольку фХа является одним из главных ферментов каскада свертывания. Ингибирование данного фактора может приводить к серьезным гемостатическим осложнениям, например кровотечениям [Koscielny J, Beyer-Westendorf J, von Heymann С, Braun J, Klamroth R, Lindhoff-Last E, Tiede A, Spannagl M., Risk of bleeding and haemorrhagic complication with rivaroxaban - Periprocedural management of haemostasis // Hamostaseologie; 32(4):287-93 (2012), Esmon CT, What did we learn from new oral anticoagulant treatment? // Thromb Res. Suppl 1:S41-3 (2012)].The property of infestin-4 to inhibit pXIIa makes it a promising inhibitor of contact activation of blood coagulation for use in hemostasiology, including as a drug for the treatment and prevention of thrombosis and other diseases associated with the hypercoagulable state of the blood coagulation system. From the source [Campos, Tanaka-Azevedo and Tanaka, Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) // FEBS Lett, v.577, p.512-6 (2004)] infestin-4 is known to inhibit another coagulation factor, fXa, with an inhibition constant of 53 nM. This nonspecific effect severely limits the possibility of using infestin-4, since pha is one of the main enzymes of the coagulation cascade. Inhibition of this factor can lead to serious hemostatic complications, such as bleeding [Koscielny J, Beyer-Westendorf J, von Heymann C, Braun J, Klamroth R, Lindhoff-Last E, Tiede A, Spannagl M., Risk of bleeding and haemorrhagic complication with rivaroxaban - Periprocedural management of haemostasis // Hamostaseologie; 32 (4): 287-93 (2012), Esmon CT, What did we learn from new oral anticoagulant treatment? // Thromb Res. Suppl 1: S41-3 (2012)].

Известны два метода получения рекомбинантного инфестина-4: в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris с дополнительным С-концевым пептидом и в составе слитого белка с сывороточным альбумином человека. Оба метода описаны в работе [Hagedorn, Schmidbauer, Pleines, Kleinschnitz, Kronthaler, Stoll, Dickneite and Nieswandt, Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding // Circulation, v.121, p.1510-7 (2010)]. Продуктивность дрожжевой системы экспрессии инфестина-4 составляет 4 мг/л культуры, продуктивность системы экспрессии слитого белка альбумина и инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих неизвестна.Two methods for producing recombinant infestin-4 are known: in methylotrophic yeast Pichia pastoris with an additional C-terminal peptide and as part of a fusion protein with human serum albumin. Both methods are described in [Hagedorn, Schmidbauer, Pleines, Kleinschnitz, Kronthaler, Stoll, Dickneite and Nieswandt, Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding // Circulation, v.121, p.1510 -7 (2010)]. The productivity of the yeast system of expression of infestin-4 is 4 mg / l of culture, the productivity of the expression system of the albumin and infestin-4 fusion protein in cultured mammalian cells is unknown.

Указанные системы экспрессии инфестина-4 в культивируемых клетках млекопитающих не могут быть использованы из-за высокой стоимости культивирования, а известная система экспрессии инфестина-4 в дрожжах обладает слишком низкой продуктивностью. При этом указанные системы экспрессии инфестина-4 не могут быть использованы из-за неспецифического ингибирования фХа продуцируемым белком. Известен способ получения целевых белков в активной и растворимой форме с высокой продуктивностью (патент US 5270181, Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules, выдан 14.12.1993), который заключается в экспрессии целевого гетерологического белка, слитого с белком тиоредоксином или тиоредоксинподобным белком, в клетках хозяина. Однако описанный способ получения целевого белка не предполагает изменения функциональной активности целевого белка при экспрессии в виде слитого белка с тиоредоксином.The indicated expression systems of infestin-4 in cultured mammalian cells cannot be used due to the high cost of cultivation, and the known expression system of infestin-4 in yeast has too low productivity. Moreover, the indicated systems of expression of infestin-4 cannot be used due to nonspecific inhibition of fXa by the produced protein. A known method for producing target proteins in active and soluble form with high productivity (US patent 5270181, Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules, issued 12/14/1993), which consists in the expression of the target heterologous protein, fused with a protein thioredoxin or thioredoxin-like protein in the host cells. However, the described method for producing the target protein does not imply a change in the functional activity of the target protein when expressed as a fusion protein with thioredoxin.

Краткое изложение изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Технический результат, который может быть получен при реализации данного изобретения, заключается в эффективном и специфичном блокировании контактной активации свертывания за счет ингибирования фактора ХIIa и отсутствия ингибирования фактора Ха с упрощенной технологией получения белка, обеспечивающего указанную специфичность.The technical result that can be obtained by implementing the present invention is the effective and specific blocking of the contact activation of coagulation due to inhibition of factor XIIa and the absence of inhibition of factor Xa with a simplified technology for the production of protein providing this specificity.

Указанный технический результат обеспечивается за счет получения слитого белка, включающего тиоредоксин I Е.coli и инфестин-4, обладающего повышенной специфичностью ингибирования фХIIa и имеющего пониженную активность ингибирования фХа по сравнению с нативным инфестином-4.The specified technical result is achieved by obtaining a fusion protein comprising E. coli thioredoxin I and infestin-4, which has an increased specificity of inhibition of pXIIa and has a reduced activity of inhibition of pXa in comparison with native infestin-4.

А также за счет получения экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей упомянутый слитый белок и находящейся под контролем промотера, функционирующего в бактериальной клетке.And also by obtaining an expression plasmid DNA encoding the aforementioned fusion protein and under the control of a promoter that functions in a bacterial cell.

А также за счет получения бактерии-продуцента упомянутого слитого белка, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной указанной плазмидной ДНК.And also by obtaining a bacterium producer of said fusion protein belonging to the genus Escherichia transformed with said plasmid DNA.

А также за счет создания способа получения упомянутого слитого белка, включающего культивирование упомянутой бактерии в питательной среде, разрушение бактериальных клеток и очистку указанного слитого белка с использованием металлохелатной хроматографии и анионообменной хроматографии.And also by creating a method for producing said fusion protein, comprising culturing said bacterium in a nutrient medium, destroying bacterial cells and purifying said fusion protein using metal chelate chromatography and anion exchange chromatography.

Существо заявляемого решенияThe essence of the proposed decision

В основе заявляемого решения лежат разработанные авторами, в частности, плазмидная ДНК pET32a-Inf4 длиной 6106 п.о., кодирующая расщепляемый слитый белок, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера, линкерный участок, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и расположенный на С-конце молекулы полипептид домена 4 инфестина Т. Infestans. Открытая рамка считывания указанного домена инфестина содержит оптимальные для E.coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. Наличие белка-партнера обеспечивает поддержание слитого белка в растворимой форме в цитоплазме E.coli, правильное замыкание дисульфидных связей, позволяет проводить очистку слитого белка с помощью металлохелатного сорбента, что приводит к значительному увеличению выхода очищенного слитого белка, а также упрощению процедур выделения и очистки продукта.The basis of the proposed solution is developed by the authors, in particular, plasmid DNA pET32a-Inf4 6106 bp in length, encoding a cleavable fusion protein, including E. coli thioredoxin I, 2 oligohistidine clusters, a linker region, a recognition sequence for a specific endoproteinase and located on C -terminal endometin domain 4 polypeptide T. Infestans. The open reading frame of the indicated infestin domain contains codons optimal for E. coli, which allow increasing the expression level of the heterologous protein due to the efficient translation of all amino acids of the polypeptide. The presence of a partner protein ensures the maintenance of the fusion protein in a soluble form in the E. coli cytoplasm, the correct closure of disulfide bonds, allows the fusion protein to be purified using a metal chelate sorbent, which leads to a significant increase in the yield of purified fusion protein, as well as simplification of the isolation and purification of the product .

В процессе получения указанного белка авторами неожиданно было установлено, что инфестин-4 в бактериях E.coli в форме белка-предшественника или слитого белка с тиоредоксином существенно увеличивает специфичность целевого белка по отношению к фХIIa, понижая активность ингибирования фXa, а также может быть достигнута высокая продуктивность системы экспрессии инфестина-4.In the process of obtaining this protein, the authors unexpectedly found that infestin-4 in E. coli bacteria in the form of a precursor protein or fusion protein with thioredoxin significantly increases the specificity of the target protein with respect to fXIIa, decreasing the activity of inhibiting fXa, and a high productivity of the infestin-4 expression system.

Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее гена, например, такие как промотор, терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.The term "expression plasmid" means plasmid DNA containing all the necessary genetic elements for the expression of a gene embedded in it, for example, such as a promoter, terminator. A specific example of the genetic elements necessary for the expression of the thioredoxin fusion protein and infestin domain 4 in the expression cassette of the present invention is, but is not limited to, the T7 bacteriophage RNA polymerase promoter.

Фрагментом ДНК, кодирующим рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий рекомбинантный домен 4 инфестина T.infestans в составе слитого белка, включающего последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий, в свою очередь, тиоредоксин I E.coli, олигогистидиновые кластеры, последовательность узнавания специфической эндопротеиназой и домен 4 инфестина T.infestans. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077.A DNA fragment encoding the T.infestans infestin recombinant domain 4 according to the present invention is, for example, a synthetic gene encoding the T.infestans infestin recombinant domain 4 as part of a fusion protein comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal protein partner, including in turn, E. coli thioredoxin I, oligohistidine clusters, recognition sequence with specific endoproteinase, and infestin domain 4 of T.infestans. The specified DNA fragment can be obtained by PCR (see Example 1, Figure 1). Also, the indicated DNA fragment can be obtained using the cloning technology of Sloning BioTechnology, described in PCT application WO 2005071077.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в Е.coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей слитый белок и в особенности рекомбинантный домен 4 инфестина Т.infestans, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися в генах Е.coli кодонами. Последовательность гена Trx-Inf4, кодирующего домен 4 инфестина Т.infestans в составе слитого белка согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.In order to ensure efficient translation of the cloned gene into E. coli, it is preferable that in the sequence encoding the fusion protein and especially the recombinant domain 4 of T. infestans infestin, all rare codons are replaced by synonymous codons that are often found in E. coli genes. The sequence of the Trx-Inf4 gene encoding the T. infestans infestin domain 4 in the fusion protein of the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность слитого белка, включающего домен 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.The amino acid sequence of a fusion protein comprising T. infestans infestin domain 4 according to the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность интактного рекомбинантного домена 4 инфестина Т.infestans представляет собой последовательность под номером SEQ ID NO: 2 без 182 первых аминокислот (т.е. аминокислоты 183 - 238).The amino acid sequence of the intact recombinant domain 4 of T. infestin infestin is the sequence under the number SEQ ID NO: 2 without the first 182 amino acids (i.e., amino acids 183 - 238).

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1), кодирующего слитый белок, включающий домен 4 инфестина Т.infestans, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке.DNA fragments that encode essentially the same protein can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment (SEQ ID NO: 1) encoding a fusion protein comprising T. infestans infestin domain 4, for example, using the site-directed method mutagenesis, so that one or more amino acid residues at a particular site will be deleted, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations. DNA fragments that encode essentially the same protein can be obtained by expression of DNA fragments having the mutation described above in the corresponding cell.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами ингибитора фактора ХIIа, определяются по его способности ингибировать свертывание крови, инициированное по "внутреннему" пути. Так, например, активность домена 4 инфестина Triatoma infestans можно детектировать в коагулометрическом тесте "каолиновое время", как описано в Примере 6. Считается, что вариант белка обладает свойствами домена 4 инфестина Т.infestans при условии, что указанный вариант увеличивает время свертывания плазмы крови не менее чем на 30% при концентрации не выше чем 5 мкМ.Indicators of functional activity, in which it is believed that the obtained protein has the properties of a factor XIIa inhibitor, are determined by its ability to inhibit blood coagulation initiated by the "internal" pathway. For example, the activity of domain 4 of the infestin Triatoma infestans can be detected in the kaolin time coagulometric test, as described in Example 6. It is believed that the protein variant has the properties of domain 4 of T. infestans infestin, provided that this variant increases the coagulation time of blood plasma not less than 30% at a concentration of no higher than 5 μM.

Термин «специфичность ингибирования фХIIа» означает свойства ингибитора фХIIa, заключающиеся в ингибировании фХIIa с высокой эффективностью (константой ингибирования порядка 1 нМ или ниже) и отсутствии заметного ингибирования (константа ингибирования намного больше 1 нМ, предпочтительно больше 1 мкМ) других протеаз свертывания, таких как факторы XIa, IXa, Ха, IIa (он же тромбин), и VIIa. Нативный инфестин-4 ингибирует фХIIa с константой 0,1 нМ, при этом белок ингибирует фХa с константой 53 нМ. Слитый белок тиоредоксина и инфестина-4 обладает такой же константой ингибирования фХIIa, как и нативный ингибитор, но константа ингибирования фХa составляет 2,5 мкМ, т.е. в 50 раз выше. Таким образом, полученный слитый белок обладает повышенной специфичностью к фХIIa по сравнению с нативным белком.The term “specificity of inhibition of pXIIa” means the properties of an inhibitor of pXIIa in that it inhibits pXIIa with high efficiency (an inhibition constant of the order of 1 nM or lower) and no noticeable inhibition (the inhibition constant is much greater than 1 nM, preferably greater than 1 μM) of other coagulation proteases such factors XIa, IXa, Xa, IIa (aka thrombin), and VIIa. Native infestin-4 inhibits pXIIa with a constant of 0.1 nM, while the protein inhibits pXa with a constant of 53 nM. The thioredoxin and infestin-4 fusion protein has the same inhibition constant fXIIa as the native inhibitor, but the inhibition constant fxa is 2.5 μM, i.e. 50 times higher. Thus, the obtained fusion protein has increased specificity for pXIIa compared to the native protein.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок, содержащий домен 4 инфестина Т.Infestans и включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой белковый партнер, включающий тиоредоксин I E.coli, 2 олигогистидиновых кластера (6 и 10 гистидинов), 2 последовательности узнавания специфической эндопротеиназой (DDDDK) и расположенный на С-конце слитого белка непосредственно за последним сайтом узнавания DDDDK домен 4 инфестина Т.infestans, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, рЕТ32а, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.The expression plasmid according to the present invention contains a DNA fragment encoding a fusion protein containing T. infestans domain 4 of infestin and comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal protein partner comprising E. coli thioredoxin I, 2 oligohistidine clusters (6 and 10 histidines), 2 specific endoproteinase recognition sequence (DDDDK) and located at the C-terminus of the fusion protein immediately after the last DDDDK recognition site of T. infestans infestin domain 4, under the control of a promoter that functions in the bacterial th cell. As the recombinant plasmid of the present invention, various plasmids capable of expression in the recipient cell can be used, such as plasmids pBR322, pMW119, pUC19, pET32a, pET28b and the like, but the list of plasmids is not limited to them.

Одним из вариантов реализации настоящего изобретения является плазмида pET32a-Inf4 размером 6106 п.о., которая состоит из:One embodiment of the present invention is a 6106 bp plasmid pET32a-Inf4, which consists of:

1) фрагмента HindIII-NheI (1-204) длиной 204 п.о., содержащего участок, кодирующий домен 4 инфестина Т.infestans и слитую с ним в рамке последовательность FLAG-эпитопа, включающую в себя сайт узнавания энтерокиназы1) a 204 bp HindIII-NheI fragment (1-204) containing a region encoding the T. infestans infestin domain 4 and the FLAG epitope sequence fused to it including an enterokinase recognition site

2) фрагмента NheI-NcoI (205-245)-длиной 41 п.о., содержащего участок, кодирующий пептид SAGHHHHHHHHHHG, содержащий декагистидиновый кластер2) a NheI-NcoI fragment (205-245) with a length of 41 bp containing a region encoding a SAGHHHHHHHHHHG peptide containing a decahystidine cluster

3) фрагмента NcoI-HindIII (246-6106) вектора рЕТ32а(+) длиной 5861 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую бета-лактамазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона; последовательность, кодирующую тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновый таг и сайт расщепления энтерокиназой. Указанная плазмида содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: HindIII (1), NheI (205), NcoI (246), XbaI (736), PciI (3656), PvuI (4919).3) a fragment of NcoI-HindIII (246-6106) of the vector pET32a (+) 5861 bp long, containing the region of the beginning of replication of plasmid pBR322, the Rop-organizing protein Rop gene, the bacteriophage replication initiation site f1, the sequence encoding beta-lactamase, promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; transcription termination site; a sequence encoding a repressor of a lactose operon; E. coli thioredoxin I coding sequence, hexahistidine tag and enterokinase cleavage site. The indicated plasmid contains unique recognition sites for restriction endonucleases: HindIII (1), NheI (205), NcoI (246), XbaI (736), PciI (3656), PvuI (4919).

Структура плазмиды pET32a-Inf4 приведена на Фиг.3 и в SEQ ID 3.The structure of the plasmid pET32a-Inf4 shown in Fig.3 and in SEQ ID 3.

При помощи созданной плазмиды можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию рода Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии слитого белка, содержащего домен 4 инфестина Т.infestans, может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.Using the created plasmid, it is possible to transform a bacterial cell, preferably a bacterium of the genus Escherichia, susceptible to such transformation by the indicated plasmid. The choice of a particular cell is not critical, since the methodology and methods of transformation are well known to those skilled in the art. Although the expression level of a fusion protein containing T. infestans domain 4 of infestin 4 may vary depending on the type of cell and culturing conditions of the obtained transformant, the fact of expression of the target protein will take place subject to successful transformation of the recipient cell.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой необходима для экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac А. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) //Humana Press; 1st edition (August 15, 1995)."Transformation of a cell with a plasmid" means the introduction of a plasmid into a cell using methods well known to those skilled in the art. Transformation with this plasmid is necessary for the expression of the gene encoding the protein of the present invention and for the synthesis of the protein in the bacterial cell. Transformation methods include any standard methods known to those skilled in the art, for example, the method described in Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка - продуцент слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans» также означает клетку, которая способна накапливать слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans в количестве не менее чем 2 мг/л культуры, более предпочтительно, не менее чем 20 мг/л культуры. Указанный слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans накапливается в указанной клетке предпочтительно в цитоплазме в растворимой форме.According to the present invention, “a bacterial cell producing a thioredoxin fusion protein and T. infestans infestin domain 4” means a bacterial cell having the ability to produce and accumulate a thioredoxin fusion protein and T. infestans infestin domain 4 when the bacterial cell of the present invention is grown in said nutrient environment. As used herein, the term “bacterial cell producing a thioredoxin fusion protein and T. infestans infestin domain 4” also means a cell that is capable of accumulating at least 2 mg / L culture thioredoxin and T. infestans fusion protein fusion protein, more preferably not less than 20 mg / l of culture. The specified protein thioredoxin and domain 4 of infestin T.infestans accumulate in the specified cell, preferably in the cytoplasm in soluble form.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans.It is preferable to use a bacterium belonging to the genus Escherichia for transformation with a recombinant plasmid containing a DNA fragment encoding a thioredoxin fusion protein and T. infestans infestin domain 4.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" may mean that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be given as examples.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина Т.infestans согласно настоящему изобретению является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].A specific example of a recipient strain for producing a producer of the thioredoxin fusion protein and the T. infestans infestin domain 4 of the present invention is, but is not limited to, Escherichia coli strain BL21 [DE3].

Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] is characterized by the following cultural, morphological, physiological and biochemical characters and genetic characters.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки, образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, ампициллина 50 мкг/мл.Cultural and morphological features of the strain: gram-negative rods, form threads; on an agar medium — whitish large colonies with an uneven edge. The activity of the strain is determined by the method of densitometry electrophoregram. The strain is stored under the following conditions: Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, 10% glycerol. The strain propagates under the following conditions - Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, ampicillin 50 μg / ml.

Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F^-ompT gal dcm lon hsdS_B(r_B ^-m_B ⁺) λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).Genetic features of the strain. The strain genotype is F ^- ompT gal dcm lon hsdS _B (r _B ^- m _B ⁺ ) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).

Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидой pET32a-Inf4 приводит к получению штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, который обеспечивает синтез рекомбинантного слитого белка тиоредоксина и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) Т.infestans в количестве более 5% от суммарного содержания белка клеток.Transformation of the Escherichia coli strain BL21 [DE3] with the plasmid pET32a-Inf4 leads to the production of the producer strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4, which provides the synthesis of the recombinant thioredoxin fusion protein and T. infestans domain 4 (Trx-Inf4) 4 in number more than 5 % of the total protein content of cells.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4 кодирует слитый белок Trx-Inf4, состоящий из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера (тиоредоксина E.coli), содержащего сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой домена 4 инфестина Т.infestans.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 encodes a Trx-Inf4 fusion protein consisting of the amino acid sequence of T. infestans infestin domain 4 and a fusion protein partner (thioredoxin E. coli) containing the enterokinase cleavage site immediately before the first amino acid of T. infestans infestin domain 4.

Способ получения слитого белка Trx-Inf4, состоящего из аминокислотной последовательности домена 4 инфестина Т.infestans и слитого с ним в рамке белка-партнера тиоредоксина I E.coli согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, индукцию промотора гена слитого белка Trx-Inf4, сбор биомассы клеток, их разрушение, отделение нерастворимых белков и дебриса, очистку слитого белка Trx-Inf4 металлохелатной хроматографией в нативных условиях и последующей анионообменной хроматографией.A method for producing a Trx-Inf4 fusion protein consisting of the amino acid sequence of domain 4 of infestin T. infestans and fused with it in the framework of the partner protein of thioredoxin I E. coli according to the present invention includes culturing the above bacteria in a nutrient medium suitable for growing these prokaryotic cells induction of the Trx-Inf4 fusion protein gene promoter, cell biomass collection, cell destruction, separation of insoluble proteins and debris, purification of the Trx-Inf4 fusion protein by metal chelate chromatography under native conditions and following anion exchange chromatography.

Особенности плазмиды и результаты практического применения приведены на следующих фигурах.Features of the plasmid and the results of practical application are shown in the following figures.

Краткое описание фигур:Brief description of the figures:

На Фиг.1 показана схема сборки синтетического гена домена 4 инфестина Triatoma infestans из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионных плазмид p10E- Inf4 и pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения:Figure 1 shows the assembly diagram of the synthetic gene of domain 4 of the infestin Triatoma infestans oligonucleotide primers and the scheme for obtaining expression plasmids p10E-Inf4 and pET32a-Inf4. The following notation is used:

Inf4 - домен 4 инфестина Triatoma infestans, соответствующий домену 4 типа Казаль. В скобках указаны первая и последняя аминокислоты фрагментов. Пунктирная линия обозначает полимеразную цепную реакцию, сплошная - рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК.Inf4 is the Triatoma infestans infestin domain 4, corresponding to the Casal type 4 domain. The first and last amino acid fragments are indicated in parentheses. The dashed line indicates the polymerase chain reaction, the solid line indicates the restriction and ligation of DNA fragments.

На Фиг.2 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322» - точка начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop, контролирующего копийность плазмиды; «fl ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - ген устойчивости к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «Т7 term» - участок терминации транскрипции целевого гена; «lacI» - ген репрессора лактозного оперона; Inf4 - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида домена 4 инфестина Triatoma infestans; "FLAG" - эпитоп моноклонального антитела FLAG; "EK-PRO" - сайт узнавания энтерокиназы, "10Е tag" - отделяемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер, эпитоп FLAG и сайт узнавания энтерокиназы; «stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 2 shows a map of the expression plasmid p10E-Inf4. The following notation is used: "pBR322" - the origin of replication of plasmid pBR322; "ROP" - the gene of the RNA-organizing protein Rop, controlling the copy number of the plasmid; "Fl ori" is the site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" - kanamycin resistance gene; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7 term" is the transcription termination site of the target gene; "LacI" - lactose operon repressor gene; Inf4 — open reading frame (OPC) of the Triatoma infestans infestins domain 4 polypeptide; "FLAG" is an epitope of the monoclonal antibody FLAG; "EK-PRO" is the enterokinase recognition site, "10E tag" is a detachable N-terminal peptide comprising the decagystidine cluster, the FLAG epitope and the enterokinase recognition site; “Stop” is a block of stop codons. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.

На Фиг.3 показана карта экспрессионной плазмиды pET32a-Inf4. Используются следующие обозначения: «pBR322 origin» - область начала репликации плазмиды pBR322; «f1 origin» - участок инициации репликации бактериофага f1; «BIa (AmpR)» - последовательность, обеспечивающую устойчивость бактерий к ампициллину; «Т7 promoter» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «Т7 terminator» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «Trx-Inf4» - ОРС слитого белка; «Inf4» - ОРС домена 4 инфестина Triatoma infestans; «Trx» - ОРС тиоредоксина I E.coli; «10xHis» - декагистидиновый кластер; «6xHis» - гексагистидиновый кластер; «ЕК-PRO» - участок, кодирующий сайт узнавания энтерокиназой; «FLAG» - эпитоп моноклонального антитела FLAG; «stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 3 shows a map of the expression plasmid pET32a-Inf4. The following notation is used: "pBR322 origin" - the region of origin of replication of plasmid pBR322; "F1 origin" is the site of initiation of replication of bacteriophage f1; "BIa (AmpR)" - a sequence that ensures the resistance of bacteria to ampicillin; "T7 promoter" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; “T7 terminator” - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "Trx-Inf4" - ORS fusion protein; "Inf4" - OPC domain 4 of the infestin Triatoma infestans; "Trx" - ORS of thioredoxin I of E. coli; "10xHis" is a decagystidine cluster; "6xHis" - hexahistidine cluster; "ЕК-PRO" - a site encoding an enterokinase recognition site; "FLAG" is an epitope of the monoclonal antibody FLAG; “Stop” is a block of stop codons. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.

На Фиг.4 показана электрофореграмма тотального белка из клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4 (4 колонии) и контрольного штамма BL21 [DE3]/pET32a при индукции ИПТГ.Figure 4 shows the electrophoregram of the total protein from the cells of the producer strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 (4 colonies) and the control strain BL21 [DE3] / pET32a upon induction of IPTG.

Индукция 1 мМ ИПТГ, 30°C; 0,4 и 16 ч. Обозначения: Inf cl. - соответствующая колония штамма-продуцента BL21[DE3]/pET32a-Inf4, Trx (К-) - колония контрольного штамма BL21[DE3]/pET32a, 0h - 16h - время индукции, ч; М - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка и контрольного белка-партнера указано стрелками. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Вычисленная продуктивность для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4: 20-40 мг/л, доля целевого белка: >5% (по денситометрии геля).Induction of 1 mM IPTG, 30 ° C; 0.4 and 16 hours. Designations: Inf cl. - the corresponding colony of the producer strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4, Trx (K-) - the colony of the control strain BL21 [DE3] / pET32a, 0h - 16h - induction time, h; M is a molecular weight marker. The molecular weights of the marker bands are indicated in kDa. The position of the target protein and the control partner protein is indicated by arrows. Restorative conditions, colloidal Coomassie blue. The calculated productivity for strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4: 20-40 mg / l, the proportion of the target protein:> 5% (by densitometry of the gel).

На Фиг.5 приведены электрофореграммы белковых фракций, полученных при выделении и одностадийной хроматографической очистке слитого белка Trx-Inf4 и контрольного белка-партнера Trx.Figure 5 shows the electrophoregrams of protein fractions obtained by isolation and one-step chromatographic purification of the Trx-Inf4 fusion protein and the control Trx partner protein.

Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; «IP» - тотальный белок после индукции, «IB» - нерастворимые белки, «SO» - растворимые белки, «7R» - осадок после термокоагуляции, «7S» - супернатант после термокоагуляции, «AS» - супернатант при осаждении сульфатом аммония, «IM» - перерастворенный осадок после осаждения сульфатом аммония, «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии, «100», «200», «500» - фракции элюатов с металлохелатной колонки соответствующими концентрациями имидазола, «Е» - фракция элюции ЭДТА-Na, «NA» - фракция элюции при регенерации колонки NaOH. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Положение целевого белка Trx-Inf4 указано стрелкой. Designations: "M" is a marker of molecular weights, the molecular weights of the bands are indicated in Figure 4; “IP” - total protein after induction, “IB” - insoluble proteins, “SO” - soluble proteins, “7R” - precipitate after thermocoagulation, “7S” - supernatant after thermocoagulation, “AS” - supernatant upon precipitation with ammonium sulfate, “ IM "is the re-dissolved precipitate after precipitation with ammonium sulfate," FF "is the breakthrough fraction in metal chelate chromatography," 100 "," 200 "," 500 "are the fractions of the eluates from the metal chelate column with the corresponding concentrations of imidazole," E "is the elution fraction of EDTA-Na , "NA" is the elution fraction during regeneration of the NaOH column. Non-reducing conditions, colloidal Coomassie blue. The position of the target Trx-Inf4 protein is indicated by the arrow.

На Фиг.6 показана электрофореграмма белковых фракций, полученных при градиентной элюции слитого белка Trx-Inf4 с сорбента Capto Q. Обозначения: «М» - маркер молекулярных масс, молекулярные массы полос указаны на Фиг.4; «200» - полуочищенный Trx-Inf4 перед нанесением; «FF» - фракция проскока при металлохелатной хроматографии; «F1»-«F8» - соответствующие собранные фракции элюата. Невосстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Положение целевого белка указано стрелкой. Figure 6 shows the electrophoregram of protein fractions obtained by gradient elution of Trx-Inf4 fusion protein from Capto Q sorbent. Designations: "M" is a molecular weight marker, the molecular weights of the bands are shown in Figure 4; “200” - semi-cleaned Trx-Inf4 before application; "FF" is the breakthrough fraction in metal chelate chromatography; "F1" - "F8" - the corresponding collected fractions of the eluate. Non-reducing conditions, colloidal Coomassie blue. The position of the target protein is indicated by the arrow.

На Фиг.7 показана хроматограмма ОФ-ВЭЖХ анализа очищенного слитого белка Trx-Inf4 и результаты интеграции пиков. Канал детекции 280 нм, чистота белка 99,06%.7 shows an RP-HPLC chromatogram of purified Trx-Inf4 fusion protein and peak integration results. 280 nm detection channel, 99.06% protein purity.

На Фиг.8 показана электрофореграмма дорожки с очищенным Trx-Inf4 и результаты ее денситометрии. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим, чистота белка 99,48%.On Fig shows the electrophoregram track with purified Trx-Inf4 and the results of its densitometry. Reducing conditions, colloidal Coomassie blue staining, protein purity 99.48%.

На Фиг.9 приведен график зависимости времени свертывания плазмы крови в "каолиновом тесте" от концентрации в плазме Trx-Inf4.Figure 9 shows a graph of the dependence of the coagulation time of blood plasma in the "kaolin test" on the concentration in plasma Trx-Inf4.

На Фиг.10 приведен график зависимости активности фХа, определяемой по скорости расщепления хромогенного субстрата, от концентрации Trx-Inf4.Figure 10 shows a graph of the dependence of the activity of pXa, determined by the rate of cleavage of the chromogenic substrate, on the concentration of Trx-Inf4.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие, не ограничивающие настоящее изобретение, примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting examples of the invention.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-Inf4Example 1. Obtaining plasmid DNA pAL-Inf4

Для аминокислотной последовательности, включающей 56 аминокислот домена 4 инфестина Triatoma infestans (аминокислоты 167-222 из записи Q95P16 публичной базы данных UniprotKB, расположенной по адресу http://www.uniprot.org/uniprot/Q95P16) с добавленным аминокислотным N-концевым пептидом (SEQ ID NO: 4, ASDYKDDDDK), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в Е.coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов. В последовательность ДНК также были включены стоп-кодоны и сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:5. Физический фрагмент EKsite-Kaz-4 (SEQ ID NO:5) собирали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из перекрывающихся олигонуклеотидных праймеров AS-KAZ-1F AS-KAZ-2R AS-KAZ-3F AS-KAZ-4R AS-KAZ-5R, приведенных в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, соответственно.For an amino acid sequence comprising 56 amino acids of Triatoma infestans infestin domain 4 (amino acids 167-222 from the Q95P16 entry of the UniprotKB public database located at http://www.uniprot.org/uniprot/Q95P16) with the added amino acid N-terminal peptide ( SEQ ID NO: 4, ASDYKDDDDK) containing the enterokinase recognition sequence was reverse translated to the DNA nucleotide sequence. In this case, codons optimal for the expression of this gene in E. coli class B were used, and the structure of the gene was optimized for the secondary structure of mRNA, GC composition, and the absence of undesirable regulatory elements (for example, the absence of internal ribosome binding sites) was provided, as well lack of extended repetitions, palindromes. Stop codons and restriction endonuclease recognition sites were also included in the DNA sequence. The obtained nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5. The EKsite-Kaz-4 physical fragment (SEQ ID NO: 5) was assembled by polymerase chain reaction (PCR) from overlapping oligonucleotide primers AS-KAZ-1F AS-KAZ-2R AS-KAZ-3F AS-KAZ-4R AS-KAZ- 5R shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, respectively.

ПЦР проводили на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Препаративные реакции проводили в объеме 50 мкл. Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пмоль каждого праймерного олигонуклеотида; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация 94°C, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°C, 30 сек, отжиг 62°C, 30 сек, достройка 72°C, 120 сек; 1 цикл - достройка 72°C, 10 мин. Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего дотировали в Т-вектор pAL-TA («Евроген», РФ) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r_k-, m_k+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°C на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут. Затем добавляли 800 мкл питательного бульона LB и инкубировали при 37°C 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара и помещали в термостат на 37°C 18 часов. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды: M13dir (SEQ ID NO:11) и M13rev (SEQ ID NO:12). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона LB и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность конструкции верифицировали методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и SP6 (SEQ ID NO:14).PCR was performed on a Tertsik MS2 instrument (DNA Technology, Russia). Preparative reactions were carried out in a volume of 50 μl. An incubation mixture of the following composition was prepared: 1x buffer for thermostable DNA polymerase; 10 pmol of each primer oligonucleotide; 2 mM each deoxyribonucleotide triphosphate; 2 units thermostable DNA polymerase. 50 μl of mineral oil was layered on top of this mixture and amplified according to the scheme: 1 cycle — denaturation 94 ° C, 3 min; 25 cycles - denaturation 94 ° C, 30 sec, annealing 62 ° C, 30 sec, completion 72 ° C, 120 sec; 1 cycle - completion 72 ° C, 10 min. PCR products were isolated from 1% agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol, after which they were donated to the pAL-TA T-vector (Eurogen, RF) using Phage T4 DNA ligase and standard buffer solution (Fermentas, Lithuania). Ligation was carried out in a volume of 10 μl at a molar ratio of vector to insert of 1:10 for 2-20 hours at room temperature. The E. ligands were transformed with the obtained ligase mixtures. coli strain DH5, with the genotype F- φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r _k- , m _{k +} ) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. For this, 200 μl is frozen In the E. coli cell suspension, 5 μl of the ligase mixture was added, incubated on ice for 20 minutes to adsorb plasmid DNA, heated to 42 ° C for 45 seconds and incubated on ice for 5 minutes, then 800 μl of LB nutrient broth was added and incubated at 37 ° C 60 minutes After the incubation, the suspension was transferred to a Petri dish with solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / 1 ml of agar and placed in a thermostat at 37 ° C for 18 hours. E. coli colonies selected by blue-white screening were analyzed by clone PCR using primers for the recipient plasmid sequences: M13dir (SEQ ID NO: 11) and M13rev (SEQ ID NO: 12). Selected clones were grown in 5 ml of LB nutrient broth and plasmid DNA was isolated using the Wizard Plus SV Minipreps reagent kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol, the primary nucleotide sequence of the construct was verified by PCR sequencing using T7prom primers (SEQ ID NO : 13) and SP6 (SEQ ID NO: 14).

Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК p10E-Inf4.Example 2. Obtaining expression plasmid DNA p10E-Inf4.

Реципиентную плазмиду p10E рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°C в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°C в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10^-2мкг/мкл. Реакцию лигирования очищенного фрагмента NheIHindIII плазмиды pAL-Inf4, соответствующего минигену домена 4 инфестина и реципиентной плазмиды, проводили, как описано в примере 1. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5 альфа, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:13) и T7term (SEQ ID NO:15).The recipient plasmid p10E was sequentially digested with each of the NheI and HindIII endonucleases. First aliquots of the plasmid were incubated for 2 hours at 37 ° C with each of the restriction enzymes, the linearization of the plasmids was monitored by agarose gel electrophoresis, then a second restriction enzyme was added and incubated for another 2 hours. Then the samples were combined, the enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes, and alkaline phosphatase dephosphorylation (Fermentas, Lithuania) was performed according to the manufacturer's protocol. Alkaline phosphatase was inactivated by heating to 85 ° C for 20 minutes. Restricted and dephosphorylated plasmid was reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for 10 minutes at a speed of 13200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water and used to set up a ligation reaction at a working concentration of 10 ^-2 μg / μl. The ligation reaction of the purified NheIHindIII fragment of the pAL-Inf4 plasmid corresponding to the infestin domain 4 minigene and the recipient plasmid was carried out as described in Example 1. Then, E. coli cells of strain DH5 alpha were transformed, as described above. E. coli colonies were analyzed by PCR from clones from primers T7prom (SEQ ID NO: 13) and T7term (SEQ ID NO: 15).

Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT с канамицином, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США). При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-Inf4 определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom и T7term. В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена домена 4 инфестина. Карта экспрессионной конструкции приведена на Фиг.2 и в SEQ ID NO:16, аминокислотная последовательность продукта экспрессии приведена в SEQ ID NO:17.Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT medium with kanamycin, plasmid DNA was isolated with the Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega, USA). Using PCR sequencing for the p10E-Inf4 construct, the nucleotide sequence of both complementary DNA strands for the insertion region was determined using T7prom and T7term primers. As a result of sequencing, it was found that the obtained plasmid preparation does not contain mutations in the insertion region, i.e., the correct sequence of the infestin domain 4 gene is encoded. The expression construct map is shown in FIG. 2 and in SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence of the expression product is shown in SEQ ID NO: 17.

Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pET32a-Inf4.Example 3. Obtaining expression plasmid DNA pET32a-Inf4.

Реципиентную плазмиду рЕТ32а (+) (Novagen, США) рестрицировали последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и HindIII, как описано в примере 2. Донорную плазмиду p10E-Inf4 рестрицировали NcoI и HindIII и очищали из 1,5% агарозного геля набором «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США). Выделенные фрагменты лигировали, трансформировали лигаты в Е.coli штамма DH5-альфа и производили селекцию клонов, как описано в примере 2. Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT-Amp, выделяли плазмидную ДНК набором «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» и определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7term. Карта конструкции приведена на Фиг.3, последовательность в SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность целевого белка приведена в SEQ ID NO:2.The recipient plasmid pET32a (+) (Novagen, USA) was sequentially restricted with each of the NcoI and HindIII endonucleases as described in Example 2. The donor plasmid p10E-Inf4 was restricted with NcoI and HindIII and purified from a 1.5% agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System ”(Promega, USA). The isolated fragments were ligated, the ligates were transformed into E. coli strain DH5-alpha and the clones were selected as described in Example 2. Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp medium, plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit and the nucleotide sequence was determined DNA by PCR sequencing with T7term primer. The design map is shown in Figure 3, the sequence in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of the target protein is shown in SEQ ID NO: 2.

Пример 4. Получение штаммов-продуцентов Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4 и Е.coli BL21[DE3]/pET32a-Inf4, оценка продуктивности штаммов-продуцентов и локализация целевого белка.Example 4. Obtaining producer strains of E. coli BL21 [DE3] / p10E-Inf4 and E. coli BL21 [DE3] / pET32a-Inf4, evaluating the productivity of producer strains and localization of the target protein.

Для получения штаммов-продуцентов слитого белка тиоредоксина E.coli, линкерного участка и домена 4 инфестина (Trx-Inf4) и белка-предшественника 10Е-Inf4 конструкции, полученные по примерам 2 и 3, использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) (с генотипом F- oтpT hsdS_B (r-m-) gal dcm (DE3)).To obtain the producer strains of the E.coli thioredoxin fusion protein, linker region and domain 4 of infestin (Trx-Inf4) and the 10E-Inf4 precursor protein, the constructs obtained in Examples 2 and 3 were used to transform competent cells of Escherichia coli BL21 (DE3) (with the genotype F- otpT hsdS _B (rm-) gal dcm (DE3)).

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/p10E-Inf4-продуцента белка-предшественника домена 4 инфестина Triatoma infestans в составе клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой p10E-Inf4.To obtain the E. coli strain BL21 [DE3] / p10E-Inf4 producer of the precursor protein of domain 4 of the infestin Triatoma infestans, the cells of the E. coli strain BL21 [DE3] were transformed with the expression plasmid p10E-Inf4.

Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/ pET32a-Inf4-продуцента слитого белка Trx-Inf4 клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET32a-Inf4.To obtain the E. coli strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 producer of the Trx-Inf4 fusion protein, cells of the E. coli strain BL21 [DE3] were transformed with the expression plasmid pET32a-Inf4.

Аналогично получали контрольный штамм Е.coli BL21[DE3]/pET32a-продуцент тиоредоксина I E.coli (Trx), трансформируя клетки Е.coli BL21[DE3] плазмидой рЕТ32а.The control E. coli BL21 [DE3] / pET32a-producing thioredoxin I producer E. coli (Trx) was similarly obtained by transforming E. coli BL21 [DE3] cells with the pET32a plasmid.

Трансформанты Е.coli высевали на агаризованную среду 2xYT с добавлением глюкозы до 2% и селективных антибиотиков - 30 мкг/мл канамицина для BL21[DE3]/p10E-Inf4 или 50 мкг/мл ампициллина для BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и BL21[DE3]/pET32a; проводили индукцию экспрессии целевых белков для четырех случайно выбранных колоний с типичным фенотипом. Колонии подращивали в питательном бульоне с добавлением соответствующего антибиотика и раствора глюкозы до 2% в течение 14 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 1-1,5 О.Е., индуцировали изопропилтио-р-D-галактозидом и культивировали еще 16 ч, отобрав аликвоты суспензии после 4 ч индукции. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка для штамма BL21[DE3]/pET32a-Inf4 приведены на Фиг.4. Электрофоретическая подвижность целевого белка соответствует расчетным значениям. По данным гель-электрофореза белковых фракций (Фиг.5) целевой белок Trx-Inf4 и контрольный белок-партнер Trx практически полностью были локализованы в растворимой фракции белков. В случае штамма BL21[DE3]/p10E-Inf4 электрофоретический анализ показал отсутствие видимого продукта экспрессии.E. coli transformants were plated on 2xYT agar medium supplemented with glucose up to 2% and selective antibiotics 30 μg / ml kanamycin for BL21 [DE3] / p10E-Inf4 or 50 μg / ml ampicillin for BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 and BL21 [DE3] / pET32a; the expression of the target proteins was induced for four randomly selected colonies with a typical phenotype. Colonies were grown in nutrient broth with the addition of the corresponding antibiotic and glucose solution up to 2% for 14 hours, a new portion of the nutrient medium was inoculated in a ratio of 1: 100, the culture was grown until the optical density reached 1-1.5 O.E., isopropylthio was induced p-D-galactoside and cultured for another 16 hours, taking aliquots of the suspension after 4 hours of induction. After cultivation, the cell pellet was separated by centrifugation, the cells were resuspended in a solution of 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA-Na, 0.1% Triton-X100, 10 μg / ml lysozyme in the ratio of 10 ml of solution per 1 g of cell paste, the suspension was kept for 30 min on ice and the cells were destroyed by ultrasonic dispersant until the apparent viscosity of the suspension disappeared. Samples were taken for electrophoretic analysis, the soluble and insoluble fraction of proteins was separated by centrifugation in a microcentrifuge, the precipitate was additionally resuspended in the same solution, and precipitated by centrifugation. The results of electrophoretic analysis of the total protein for strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 are shown in Figure 4. Electrophoretic mobility of the target protein corresponds to the calculated values. According to gel electrophoresis of protein fractions (Figure 5), the target Trx-Inf4 protein and the control Trx partner protein were almost completely localized in the soluble protein fraction. In the case of strain BL21 [DE3] / p10E-Inf4, electrophoretic analysis showed the absence of a visible expression product.

Пример 5. Выделение и очистка слитого белка Trx-Inf4Example 5. Isolation and purification of the Trx-Inf4 fusion protein

Штамм-продуцент BL21[DE3]/pET32a-Inf4 и контрольный штамм BL21[DE3]/pET32a высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 1% глюкозы, растили 14 часов при +37°C. Одну отдельную колонию каждого штамма переносили в 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы и растили на качалке 14 часов при +37°C. Содержимым инокулировали 2 колбы, содержащие по 250 мл среды Terrific broth, дополнительно содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, растили на качалке 3,5 часа при +37°C, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 4 ч при +30°C. Осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис pH 7,4, 2 мМ ЭДТА), добавили лизоцим до 0,1 мг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Проводили термокоагуляцию примесных белков в полученном осветленном лизате инкубацией при температуре +70°C (максимально возможная для Trx-Inf4) в течение 10 мин. Отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин. Осаждали целевые белки добавлением равного объема насыщенного раствора сульфата аммония, выдерживали 30 мин на льду, центрифугировали 20 мин на 5000 об/мин, супернатант отбрасывали. Осадок суспендировали в 10 мл раствора В (50 мM Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7,4), отделяли денатурированные белки центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин. Супернатант фильтровали через дисковый фильтр с порами 0,45 мкм и наносили на 1 мл колонку с сорбентом Chelating Sepharose Fast Flow («GE Healthcare», США), содержащим хелатированные ионы никеля, и уравновешенным раствором В. Нанесение вели на скорости 0,5 мл/мин. Проскок собирали для дальнейшего анализа. Проводили ступенчатую элюцию адсорбированных белков раствором В с концентрацией имидазола 100, 200, 500 мМ на скорости потока 1 мл/мин. Удаляли иммобилизованные ионы никеля раствором B+50 мМ ЭДТА-Na, рН 8,0. Регенерировали колонку 10 мл раствора 0,1 М гидроксида натрия. Элюат при промывке гидроксидом натрия немедленно нейтрализовали 1,2 моль-эквивалента уксусной кислоты. Аликвоты всех полученных белковых фракций анализировали при помощи ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях (Фиг.5).The producer strain BL21 [DE3] / pET32a-Inf4 and the control strain BL21 [DE3] / pET32a were seeded from the museum with a loop by a draining stroke on a Petri dish with agarized LB medium containing 30 μg / ml kanamycin and 1% glucose, grown for 14 hours at + 37 ° C. One single colony of each strain was transferred to 5 ml of 2xYT liquid medium containing 100 μg / ml ampicillin and 1% glucose and grown on a rocking chair for 14 hours at + 37 ° C. The contents were inoculated with 2 flasks containing 250 ml of Terrific broth medium, additionally containing 100 μg / ml ampicillin and 0.1% glucose, grown on a shaker for 3.5 hours at + 37 ° C, bacterial suspension samples were taken for analysis, IPTG was added until final concentration of 1 mm and grew for another 4 hours at + 30 ° C. The cell pellet was separated by centrifugation, resuspended in 20 ml of solution A (50 mM Tris pH 7.4, 2 mM EDTA), lysozyme up to 0.1 mg / ml and Triton X100 up to 0.1% were added, incubated for 30 min on ice. Cells and genomic DNA were destroyed using an ultrasonic disperser in 10 s pulses until the increased viscosity of the suspension disappeared. The precipitate was separated by centrifugation for 10 minutes at 20,000 rpm. The impurity proteins in the obtained clarified lysate were thermocoagulated by incubation at a temperature of + 70 ° C (maximum possible for Trx-Inf4) for 10 min. The precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 5000 rpm. Target proteins were precipitated by adding an equal volume of a saturated solution of ammonium sulfate, kept for 30 minutes on ice, centrifuged for 20 minutes at 5000 rpm, the supernatant was discarded. The precipitate was suspended in 10 ml of solution B (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4), and the denatured proteins were separated by centrifugation for 20 min at 5000 rpm. The supernatant was filtered through a 0.45 μm disk filter and applied to a 1 ml column with a Chelating Sepharose Fast Flow sorbent (GE Healthcare, USA) containing chelated nickel ions and balanced solution B. Application was carried out at a rate of 0.5 ml / min The slip was collected for further analysis. Stepwise elution of the adsorbed proteins with solution B was carried out with an imidazole concentration of 100, 200, 500 mM at a flow rate of 1 ml / min. The immobilized nickel ions were removed with a solution of B + 50 mM EDTA-Na, pH 8.0. A 10 ml column of a 0.1 M sodium hydroxide solution was regenerated. The eluate, when washed with sodium hydroxide, was immediately neutralized with 1.2 mol equivalents of acetic acid. Aliquots of all obtained protein fractions were analyzed using SDS-PAGE under non-reducing conditions (Figure 5).

Окончательную очистку целевого белка проводили при помощи анионообменной хроматографии с использованием декстранового сорбента Capto Q («GE Healthcare», США). Колонку объемом 1 мл уравновешивали раствором A (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,4), промывали 5 объемами раствора В (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, рН=7,4) и повторно промывали 5 объемами раствора А. Раствор полуочищенного Trx-Inf4 после металлохелатной хроматографии разбавляли водой, очищенной в 10 раз, и наносили на уравновешенную колонку Capto Q на скорости 3 мл/мин. Колонку промывали 10 объемами раствора A и проводили градиентную элюцию от 0 до 100% раствора B за 20 мин при скорости потока 1 мл/мин. Собирали фракции, содержащие белок по данным УФ-детектора, и анализировали их при помощи ДСН-ПААГ (Фиг.6).The final purification of the target protein was carried out using anion exchange chromatography using a Capto Q dextran sorbent (GE Healthcare, USA). A 1 ml column was equilibrated with solution A (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.4), washed with 5 volumes of solution B (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH = 7.4) and re-washed with 5 volumes of solution A. The solution of semi-purified Trx-Inf4 after metal chelate chromatography was diluted with 10 times purified water and applied to a balanced Capto Q column at a rate of 3 ml / min. The column was washed with 10 volumes of solution A and gradient elution was performed from 0 to 100% solution B for 20 min at a flow rate of 1 ml / min. The fractions containing the protein were collected according to the UV detector, and analyzed using SDS-PAGE (Figure 6).

Фракции, содержащие только целевой белок, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией при помощи одноразовой ячейки Vivaspin 6 PES 5 kDa (Sartorius Stedim, Германия) до конечного объема 1,5 мл. Концентрированный раствор переносили в микропробирку, добавляли консервант тимеросаль (Sigma, США) до конечной концентрации 0,02%, разделяли на аликвоты по 200 мкл и переносили на хранение на минус 20°C.Fractions containing only the target protein were pooled and concentrated by ultrafiltration using a single-use cell Vivaspin 6 PES 5 kDa (Sartorius Stedim, Germany) to a final volume of 1.5 ml. The concentrated solution was transferred to a microtube, thimerosal preservative (Sigma, USA) was added to a final concentration of 0.02%, aliquoted in 200 μl and transferred to storage at minus 20 ° C.

Пример 6. Анализ очищенного слитого белка Trx-Inf4Example 6. Analysis of purified Trx-Inf4 fusion protein

В полученном растворе очищенного Trx-Inf4 измеряли концентрацию основного вещества и долю полипептидных примесей при помощи обращеннофазовой хроматографии. Использовали колонку SOURCE RPC 4.6 ST («GE Healthcare», США) подвижные фазы A - 5% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты в воде; B - 80% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты в воде, программа градиента - 5 мин 100% раствора A, от 0 до 100% раствора B за 40 мин, 3 мин 100% раствора B, от 100 до 0% раствора B за 1 мин, 3 мин 100% раствора A, скорость 1 мл/мин, температура колонки +40°C. Объем вводимой пробы - 15 мкл, пробоподготовка - добавление ацетонитрила до 10% и труфторуксусной кислоты до 1%, разбавление пробы 1,11 раза. Детекцию вели на длинах волн 280 и 214 нм.In the resulting solution of purified Trx-Inf4, the concentration of the basic substance and the proportion of polypeptide impurities were measured using reverse phase chromatography. Used column SOURCE RPC 4.6 ST (GE Healthcare, USA) mobile phases A - 5% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid in water; B - 80% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid in water, gradient program - 5 min. 100% solution A, from 0 to 100% solution B in 40 minutes, 3 min. 100% solution B, from 100 to 0% solution B for 1 min, 3 min, 100% solution A, speed 1 ml / min, column temperature + 40 ° C. The volume of the injected sample is 15 μl, sample preparation - the addition of acetonitrile to 10% and trifluoroacetic acid to 1%, dilution of the sample 1.11 times. Detection was carried out at wavelengths of 280 and 214 nm.

Чистота основного вещества была сходной при анализе данных обоих каналов детекции и составила более 98%. Хроматограмма для канала 280 нм приведена на Фиг.7.The purity of the basic substance was similar when analyzing the data of both detection channels and amounted to more than 98%. The chromatogram for the channel 280 nm is shown in Fig.7.

При обработке биомассы, полученной из 500 мл бактериальной суспензии, было получено 24 мг очищенного белка Trx-Inf4 (по данным ОФ-ВЭЖХ, в предположении 80% элюции основного вещества при анализе), что соответствует продуктивности разработанной системы 48 мг слитого белка с одного литра бактериальной культуры при выращивании в колбах.When processing biomass obtained from a 500 ml bacterial suspension, 24 mg of purified Trx-Inf4 protein was obtained (according to RP-HPLC, assuming 80% elution of the main substance in the analysis), which corresponds to the productivity of the developed system of 48 mg of fusion protein per liter bacterial culture when grown in flasks.

Для выявления родственных примесей, которые могли коэлюировать с пиком основного вещества при ОФ-ВЭЖХ, провели электрофоретический анализ полученного очищенного Trx-Inf4 в восстанавливающих условиях с последующей денситометрией электрофореграммы. Была детектирована одна полоса примеси с объемом денситометрированного пика около 0,5% от объема денситометрированного пика основного вещества (Фиг.8).To identify related impurities that could coelute with a peak of the main substance by RP-HPLC, we performed an electrophoretic analysis of the obtained purified Trx-Inf4 under reducing conditions, followed by densitometry of the electrophoregram. A single impurity band was detected with a densitometer peak volume of about 0.5% of the densitometer peak volume of the basic substance (Fig. 8).

Функциональную активность Trx-Inf4, т.е. способность замедлять свертывание плазмы крови по "внутреннему" пути вследствие ингибирования фактора ХIIa, исследовали при помощи "каолинового теста". Использовали суспензию каолина и лиофилизованную нормальную плазму производства НПО Ренам (Россия); измерения проводили на полуавтоматическом коагулометре ThromboScreen 400 (Pacific Hemostasis, США) по инструкциям производителей прибора и реагента. Исследуемый образец Trx-Inf4 вносили в плазму за 1 мин до внесения суспензии каолина в объеме не более 10 мкл. При внесении Trx-Inf4 в плазму в конечной концентрации 0,4 мг/мл (7,5 мкМ) время свертывания составило 192 с, для контрольного белка Trx в конечной концентрации 0,4 мг/мл - 65 с, для интактной плазмы - 57 с. Таким образом, было установлено, что слитый белок Trx-Inf4 в высокой концентрации способен замедлить время свертывания плазмы в каолиновом тесте в 3 раза. Для установления практически применимой при коагулометрической диагностике рабочей концентрации Trx-Inf4 провели измерения каолинового времени для различных концентраций внесенного Trx-Inf4 (Фиг.9). Время свертывания плазмы быстро увеличивается при возрастании концентрации Trx-Inf4 от 150 до 300 нМ и при дальнейшем увеличении концентрации ингибитора меняется слабо, что соответствует полному блокированию активированного на поверхности частиц каолина фактора XII и последующему неспецифическому ингибированию других трипсиноподобных факторов свертывания крови.The functional activity of Trx-Inf4, i.e. the ability to slow down coagulation of blood plasma along the "internal" pathway due to inhibition of factor XIIa was investigated using the "kaolin test". Used a suspension of kaolin and lyophilized normal plasma produced by NPO Renam (Russia); measurements were performed on a ThromboScreen 400 semi-automatic coagulometer (Pacific Hemostasis, USA) according to the instructions of the device and reagent manufacturers. The Trx-Inf4 sample under study was introduced into the plasma 1 min before the introduction of a kaolin suspension in a volume of not more than 10 μl. When Trx-Inf4 was introduced into the plasma at a final concentration of 0.4 mg / ml (7.5 μM), the clotting time was 192 s, for the control Trx protein at a final concentration of 0.4 mg / ml - 65 s, for intact plasma - 57 from. Thus, it was found that the Trx-Inf4 fusion protein in high concentration is able to slow down the plasma clotting time in the kaolin test by 3 times. To establish the practical concentration of Trx-Inf4 that is practically applicable in coagulometric diagnostics, kaolin time measurements were carried out for various concentrations of introduced Trx-Inf4 (Fig. 9). Plasma clotting time rapidly increases with an increase in the concentration of Trx-Inf4 from 150 to 300 nM, and with a further increase in the inhibitor concentration changes slightly, which corresponds to the complete blocking of factor XII activated on the surface of the kaolin particles and subsequent non-specific inhibition of other trypsin-like coagulation factors.

Пример 7. Определение анти-фХа активности белка Trx-Inf4.Example 7. Determination of anti-phA activity of Trx-Inf4 protein.

Для определения ингибирующей активности Trx-Inf4 по отношению к фактору Ха (фХа) использовали реакцию расщепления фХа (Hematologic Technologies Inc., США) специфичного хромогенного субстрата S-2765 (Chromogenix, Швеция). В ячейки планшета последовательно помещали 50 мкл раствора фХа (финальная концентрация 0,5 нМ) в буфере С (50 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl и 0,5% БСА, рН 8,3), 50 мкл раствора Trx-Inf4 в буфере C или растворителя (0,3 М Hepes, рН 7,4). Перед началом реакции смесь инкубировали 15 минут при 37°C, после чего добавляли 100 мкл раствора хромогенного субстрата (финальная концентрация S-2765 500 мкМ). Начальную скорость гидролиза субстрата измеряли спектрофотометрически на длине волны 405 нм. Определяли процент ингибирования скорости гидролиза в присутствии различных концентраций Trx-Inf4 (относительно скорости в пробе без ингибитора) и величину концентрации Trx-Inf4, снижающую скорость гидролиза на 50% (IC50). IC50 составило 7,5 мкМ. Константа ингибирования KI по отношению к фХа может быть вычислена по уравнению Ченга-Прусоффа (KI = IC50/(1+S/Km)), в котором S - концентрация субстрата, Km - константа Михаэлиса-Ментен субстрата по отношению к фХа, составляющая 250 мкМ. KI для Trx-Inf4 по отношению к фХа составила 2,5 мкМ, т.е. примерно в 50 раз выше, чем известно для нативного инфестина-4, и примерно в 10 раз выше рабочей концентрации, практически применимой при коагулометрической диагностике. Таким образом, слитый белок Trx-Inf4, по сравнению с нативным инфестином-4, является более специфичным ингибитором фХIIа.To determine the inhibitory activity of Trx-Inf4 with respect to factor Xa (fXa), a fXa cleavage reaction (Hematologic Technologies Inc., USA) of a specific chromogenic substrate S-2765 (Chromogenix, Sweden) was used. 50 μl of a fXa solution (final concentration of 0.5 nM) in buffer C (50 mM Tris-HCl, 130 mM NaCl and 0.5% BSA, pH 8.3), 50 μl of Trx-Inf4 solution in buffer C or solvent (0.3 M Hepes, pH 7.4). Before the start of the reaction, the mixture was incubated for 15 minutes at 37 ° C, after which 100 μl of a solution of a chromogenic substrate was added (final concentration of S-2765 500 μM). The initial substrate hydrolysis rate was measured spectrophotometrically at a wavelength of 405 nm. The percent inhibition of hydrolysis rate in the presence of various concentrations of Trx-Inf4 (relative to the speed in the sample without inhibitor) and the concentration of Trx-Inf4, which reduces the hydrolysis rate by 50% (IC50), were determined. IC50 was 7.5 μM. The KI inhibition constant with respect to fXa can be calculated using the Cheng-Prussoff equation (KI = IC50 / (1 + S / Km)), in which S is the substrate concentration, Km is the Michaelis-Menten constant of the substrate with respect to fxa, which is 250 μm. The KI for Trx-Inf4 with respect to pha was 2.5 μM, i.e. about 50 times higher than is known for native infestin-4, and about 10 times higher than the working concentration, which is practically applicable for coagulometric diagnosis. Thus, the Trx-Inf4 fusion protein, in comparison with native infestin-4, is a more specific inhibitor of pXIIa.

Приведенные результаты показали, что включение в последовательность получаемого полипептида N-концевого белка-партнера тиоредоксина в сочетании с синтетическим геном домена 4 инфестина, кодируемого оптимальными для Е.coli кодонами, сохраняет функциональные свойства домена 4 инфестина, заключающиеся в ингибировании фХIIa и контактной активации свертывания, и значительно увеличивает уровень экспрессии, обеспечивает корректный фолдинг гетерологичного белкового домена в бактериальной цитоплазме.The results showed that the inclusion in the sequence of the obtained polypeptide of the N-terminal partner protein of thioredoxin in combination with the synthetic gene of domain 4 of infestin, encoded by codons optimal for E. coli, preserves the functional properties of domain 4 of infestin, namely, inhibition of pXIIa and contact activation of coagulation, and significantly increases the level of expression, ensures the correct folding of the heterologous protein domain in the bacterial cytoplasm.

Преимуществом данного изобретения является повышение специфичности полученного ингибитора Trx-Inf4 к фХIIa по сравнению с нативным инфестином-4, которая заключается в том, что Trx-Inf4 ингибирует фХа в 50 раз слабее. Это позволяет предполагать, что при применении слитого белка тиоредоксина и инфестина-4 в диапазоне рабочих концентраций, при которых эффективно ингибируется контактная активация, не будет проявляться нежелательный эффект неспецифического ингибирования других протеаз свертывания, кроме фХIIа.The advantage of this invention is to increase the specificity of the obtained Trx-Inf4 inhibitor to pXIIa compared to native infestin-4, which consists in the fact that Trx-Inf4 inhibits pXa 50 times weaker. This suggests that when using the thioredoxin and infestin-4 fusion protein in the range of working concentrations at which contact activation is effectively inhibited, the undesirable effect of nonspecific inhibition of other coagulation proteases, except for pXIIa, will not be manifested.

Преимущества предлагаемого штамма E.coli BL21[DE3] заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OтpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного полипептида и контаминации выделяемого белка наиболее активными протеазами Е.coli. Встроенный в геном штамма-реципиента ген РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем lacUV5 промотора при использовании Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмидах приводит к быстрой и эффективной продукции белка.The advantages of the proposed E. coli BL21 [DE3] strain are the use of bacteria with the Lon OtpT phenotype, which excludes the possibility of proteolytic cleavage of the synthesized de novo recombinant polypeptide and contamination of the secreted protein with the most active E. coli proteases. The T7 bacteriophage R7 polymerase RNA polymerase gene integrated in the genome of the recipient strain under the control of the lacUV5 promoter using the T7-lac promoter and T7 terminator in plasmids leads to fast and efficient protein production.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes may be made and equivalent replacements may be made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Claims

1. A fusion protein for specific inhibition of blood coagulation, including E. coli thioredoxin I and infestin-4, characterized by the sequence of SEQ ID NO: 2, while it has increased specificity of inhibition of pXIIa and has a reduced inhibitory activity to pXa compared to native infestin- four.

2. Expression plasmid DNA,
containing the sequence of SEQ ID NO: 1, encoding a fusion protein according to claim 1 and under the control of a promoter that functions in a bacterial cell, mainly a promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7, and it contains one or more of these sites: the region of origin of plasmid replication, gene Rop-organizing protein Rop, bacteriophage f1 replication initiation site, beta-lactamase coding sequence, transcription termination site, lactose operon repressor coding sequence, sequential st encoding thioredoxin I E.coli, the sequence encoding a polyhistidine tag.

3. A bacterium belonging to the genus Escherichia, transformed with the plasmid DNA according to claim 2, to produce a fusion protein according to claim 1.

4. The method of producing a fusion protein according to claim 1, comprising cultivating the bacteria according to claim 3 in a nutrient medium, destroying bacterial cells and purifying the fusion protein using metal chelate chromatography and anion exchange chromatography.