RU2817891C1 - ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE PRODUCER AND EXPRESSION PLASMID pET28a-AsnSYN CODING L-ASPARAGINASE - Google Patents
ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE PRODUCER AND EXPRESSION PLASMID pET28a-AsnSYN CODING L-ASPARAGINASE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817891C1 RU2817891C1 RU2023116912A RU2023116912A RU2817891C1 RU 2817891 C1 RU2817891 C1 RU 2817891C1 RU 2023116912 A RU2023116912 A RU 2023116912A RU 2023116912 A RU2023116912 A RU 2023116912A RU 2817891 C1 RU2817891 C1 RU 2817891C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- asparaginase
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- coli
- Prior art date
Links
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 title claims abstract description 149
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 85
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 56
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 15
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 abstract description 72
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 72
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 91
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 25
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 3
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 241001187100 Dickeya dadantii Species 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 2
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000011362 Thioredoxin domains Human genes 0.000 description 2
- 108050001669 Thioredoxin domains Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 241001248479 Pseudomonadales Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 101000848007 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Thioredoxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 101150082095 ansB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150057409 asnB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012471 diafiltration solution Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150057627 trxB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения L-аспарагиназы для использования в производстве лекарственных препаратов для терапии лимфобластных лейкозов.The invention relates to the field of biotechnology, namely to the technology for producing biologically active substances (BAS) using genetic engineering methods, more precisely to methods for producing L-asparaginase for use in the production of drugs for the treatment of lymphoblastic leukemia.
Предшествующий уровень техники.Prior art.
L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1, L-аспарагинамидогидролаза) - это фермент класса гидролаз, который катализирует гидролиз L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и иона аммония. Аспарагиназа применяется как противоопухолевое цитостатическое средство в терапии ряда лейкозов, а также при обработке пищевого сырья. Терапевтическое действие аспарагиназы основано на снижении уровня аспарагина в системной циркуляции и невозможности его интернализации опухолевыми клетками лимфоидного и миелоидного происхождения, которые, в отличие от остальных типов клеток человека, не способны синтезировать аспарагин.L-asparaginase (EC 3.5.1.1, L-asparaginamidohydrolase) is an enzyme of the hydrolase class that catalyzes the hydrolysis of L-asparagine to form L-aspartic acid and ammonium ion. Asparaginase is used as an antitumor cytostatic agent in the treatment of a number of leukemias, as well as in the processing of food raw materials. The therapeutic effect of asparaginase is based on reducing the level of asparagine in the systemic circulation and the impossibility of its internalization by tumor cells of lymphoid and myeloid origin, which, unlike other types of human cells, are not able to synthesize asparagine.
Существует два типа бактериальных аспарагиназ. Аспарагиназы I типа - конститутивно экспрессируются в цитоплазме, обладают высоким сродством к L-аспарагину, но активны также по отношению к глутамину. Аспарагиназы II типа (asnB) локализованы в периплазматическом пространстве бактерий, экспрессируются в ответ на стресс. Их сродство к аспарагину ниже, чем у аспарагиназ I типа, но и глутаминазная активность очень низка. Только аспарагиназы II типа могут использоваться в качестве терапевтических средств, так как существенная глутаминазная активность приводила бы к постоянной интоксикации пациента ионами аммония.There are two types of bacterial asparaginases. Type I asparaginases are constitutively expressed in the cytoplasm, have a high affinity for L-asparagine, but are also active towards glutamine. Type II asparaginases (asnB) are localized in the periplasmic space of bacteria and are expressed in response to stress. Their affinity for asparagine is lower than that of type I asparaginases, but their glutaminase activity is very low. Only type II asparaginases can be used as therapeutic agents, since significant glutaminase activity would lead to permanent intoxication of the patient with ammonium ions.
В терапии в настоящее время используется аспарагиназа Escherichia coli, ее ПЭГ-производные и аспарагиназа из Dickeya dadantii (историческое название Erwinia chrysanthemi). Среди изоферментов L-аспарагиназы E. coli в качестве противоопухолевого средства используют только изоформу ЕсА2, кодируемую геном ansB (UniProtKB P00805).Therapy currently uses Escherichia coli asparaginase, its PEG derivatives, and asparaginase from Dickeya dadantii (historical name Erwinia chrysanthemi ). Among the L-asparaginase isoenzymes of E. coli, only the EcA2 isoform, encoded by the ansB gene (UniProtKB P00805), is used as an antitumor agent.
Биологически активной формой аспарагиназы тип II является гомотетрамер, с молекулярной массой около 140 килодальтон, состоящий из двух более плотно взаимодействующих гомодимеров. Каждый димер содержит два активных центра, составленных из аминокислотных остатков двух разных мономеров, таким образом, димерная форма аспарагиназы способна проявлять гидролитическую активность, а мономерная форма - нет. Каждый мономер с молекулярной массой 36 кДа (около 330 аминокислотных остатков) имеет 40 β-слоев и 8 α-спиралей, уложенных в N-терминальный домен и меньший по размеру С-концевой домен. Четыре активных каталитических центра находятся между N- и С-концевыми доменами примыкающих мономеров.The biologically active form of type II asparaginase is a homotetramer, with a molecular weight of about 140 kilodaltons, consisting of two more tightly interacting homodimers. Each dimer contains two active centers, composed of amino acid residues of two different monomers, thus, the dimeric form of asparaginase is capable of exhibiting hydrolytic activity, but the monomeric form is not. Each monomer with a molecular weight of 36 kDa (about 330 amino acid residues) has 40 β-sheets and 8 α-helices arranged in an N-terminal domain and a smaller C-terminal domain. The four active catalytic sites are located between the N- and C-terminal domains of the adjacent monomers.
Известно техническое решение по получению рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia cartovora в E.coli - рекомбинантная плазмидная ДНК pBADLANS и штамм E. coli TCAR-LANS ((Патент РФ № 2221868, МПК C12N, опубл. 2004). В патенте заявляется продуктивность созданного штамма как 26 единиц активности аспрагиназы на 1 мл на 6 часах индукции при плотности культуры 4,38 О.Е. Удельная активность фермента при культивации описана как 55 ЕД/мг белка через 4 часа культивации, доля целевого белка среди всех белков E.coli описана как 8-10%. Методика измерения активности аспарагиназы, определение единицы активности и результаты измерения активности для контрольного образца высокоочищенной аспарагиназы E. cartovora в патенте не приводятся. Известно, что удельная активность высокоочищенной аспарагиназы E. cartovora составляет около 90 ЕД/мг, в таком случае описанный в патенте штамм-продуцент накопил бы 288 мг/л целевого белка. Обычная культура E.coli содержит около 180 мг/л общего белка при плотности культуры 1 О.Е., в таком случае общее содержание белка в культуре с плотностью 4,38 О.Е. будет составлять около 800 мг/л, доля аспарагиназы на уровне продукции 288 мг/л составила бы 36%, что явно не соответствует указанному авторами патента значению 8-10%. Количество накопленной аспарагиназы в данной работе, исходя из заявленного содержания 8-10% от общего белка, составило бы около 65-80 мг/л, или 14-18 мг/(л*О.Е.), что представляется более реалистичной оценкой. Таким образом, недостатком данного решения является невысокое удельное и общее количество вырабатываемой штаммом аспарагиназы, а также наличие в плазмиде гена бета-лактамазы.A technical solution for obtaining recombinant L-asparaginase Erwinia cartovora in E. coli is known - recombinant plasmid DNA pBADLANS and E. coli strain TCAR-LANS ((RF Patent No. 2221868, IPC C12N, publ. 2004). The patent states the productivity of the created strain as 26 units of aspraginase activity per 1 ml at 6 hours of induction at a culture density of 4.38 O.U. The specific activity of the enzyme during cultivation is described as 55 U/mg protein after 4 hours of cultivation, the proportion of the target protein among all E. coli proteins is described as 8 -10% The method for measuring asparaginase activity, determining the activity unit and the results of measuring activity for a control sample of highly purified E. cartovora asparaginase are not given in the patent. It is known that the specific activity of highly purified E. cartovora asparaginase is about 90 U/mg, in which case it is described. in the patent, the producer strain would accumulate 288 mg/l of the target protein. A typical E. coli culture contains about 180 mg/l of total protein at a culture density of 1 O.U., in which case the total protein content in a culture with a density of 4.38 O. .E. would be about 800 mg/l, the share of asparaginase at a production level of 288 mg/l would be 36%, which clearly does not correspond to the value of 8-10% indicated by the authors of the patent. The amount of accumulated asparaginase in this work, based on the stated content of 8-10% of total protein, would be about 65-80 mg/l, or 14-18 mg/(l*O.E.), which seems to be a more realistic estimate. Thus, the disadvantage of this solution is the low specific and total amount of asparaginase produced by the strain, as well as the presence of a beta-lactamase gene in the plasmid.
Известно техническое решение, включающие создание штамма-продуцента штамма E. coli на основе рекомбинантной плазмидной ДНК pACYCLANS, содержащей ген L-аспарагиназы Erwina carotovora (Патент РФ № 2224797, МПК C12N, опубл. 2004 г.) и ген устойчивости к канамицину (фосфотрансферазу). Недостатком этого метода является низкое содержание рекомбинантной L-аспарагиназы - не более 8-12% от общего клеточного белка, что составляет 14-22 мг/(л*О.Е.).A known technical solution includes the creation of a producer strain of E. coli based on recombinant plasmid DNA pACYCLANS containing the Erwina carotovora L-asparaginase gene (RF Patent No. 2224797, IPC C12N, published 2004) and the kanamycin resistance gene (phosphotransferase) . The disadvantage of this method is the low content of recombinant L-asparaginase - no more than 8-12% of the total cellular protein, which is 14-22 mg/(l*O.E.).
Аспарагиназа E.coli может быть получена оверэкспрессией в составе слитного белка с доменом тиоредоксина I (ген trxB) E.coli, в патенте CN103436513A заявлен уровень ферментативной активности 27980 ЕД/л. Удельная активность очищенной аспарагиназы E.coli составляет около 250 МЕ/мг, в таком случае содержание активной аспарагиназы в составе слитного белка составляло около 110 мг/л при неизвестной плотности культуры, выращенной в ферментере. Данный способ получения аспарагиназы предполагает выделение слитного белка из лизата клеток, протеолитическое отделение домена тиоредоксина и полное удаление непроцессированного слитного белка и отделенного домена тиоредоксина. В патенте не описывается такой процессинг и контроль чистоты получаемой аспарагиназы, в большинстве случаев такая обработка целевого белка многократно удорожает процесс его выделения и очистки и применяется при производстве лекарственных средств в очень редких случаях. Данный способ получения аспарагиназы также обладает недостатками - низким уровнем экспрессии целевого белка и усложненным процессом получения продукта. E. coli asparaginase can be overexpressed as part of a fusion protein with the E. coli thioredoxin I domain (trxB gene), patent CN103436513A claims a level of enzymatic activity of 27980 U/L. The specific activity of purified E. coli asparaginase is about 250 IU/mg, in which case the content of active asparaginase in the fusion protein was about 110 mg/l at an unknown density of the culture grown in the fermenter. This method of producing asparaginase involves isolating the fusion protein from a cell lysate, proteolytically separating the thioredoxin domain, and completely removing the full-length fusion protein and the separated thioredoxin domain. The patent does not describe such processing and control of the purity of the resulting asparaginase; in most cases, such processing of the target protein greatly increases the cost of the process of its isolation and purification and is used in the production of medicines in very rare cases. This method of producing asparaginase also has disadvantages - a low level of expression of the target protein and a complicated process for obtaining the product.
Описано получение аспарагиназы E.coli в системе Pseudomonas, изложенное в патенте US20190127743A1. Были использованы синтетический ген аспарагиназы E.coli, удаление собственного гена аспарагиназы II типа бактерии-хозяина, подбор лидерного пептида, удаление гена протеазы lon и изменение системы фолдинга у бактерии-хозяина. Содержание аспарагиназы, измеренное при помощи капиллярного электрофореза в денатурирующих условиях, составило до 3000 мг/л для наиболее продуктивного штамма, однако концентрация ферментативно активной аспарагиназы не превышала 300 мг/л за 24 ч индукции, т.е. 9/10 целевого белка накапливалось в растворимом, но ферментативно неактивном виде. Основные недостатки данного способа получения аспарагиназы - наработка очень больших количеств трудноотделяемой ферментативно неактивной аспарагиназы, а также использование потенциально патогенного микроорганизма-хозяина.The production of E. coli asparaginase in the Pseudomonas system is described, set out in patent US20190127743A1. A synthetic E. coli asparaginase gene, deletion of the host bacterium's own type II asparaginase gene, selection of a leader peptide, deletion of the lon protease gene, and modification of the folding system of the host bacterium were used. The asparaginase content, measured using capillary electrophoresis under denaturing conditions, was up to 3000 mg/l for the most productive strain, but the concentration of enzymatically active asparaginase did not exceed 300 mg/l after 24 hours of induction, i.e. 9/10 of the target protein accumulated in a soluble but enzymatically inactive form. The main disadvantages of this method of producing asparaginase are the production of very large quantities of difficult-to-separate enzymatically inactive asparaginase, as well as the use of a potentially pathogenic host microorganism.
Одним из основных недостатков микроорганизмов из порядка Pseudomonadales при использовании в качестве основы для создания штаммов продуцентов терапевтических белков является патогенность многих его представителей, например, упоминаемый в патенте US20190127743A1 вид Pseudomonas aeruginosa - оппортунистические болезнетворные микроорганизмы, которые часто вызывают внутрибольничные инфекции, усугубляемые множественной лекарственной устойчивостью возбудителей. В организме человека P. aeruginosa является наиболее распространенным патогеном, но заражение может произойти и от P. putida, P. fluorescens или P. аcidovorans также упомянутых в US20190127743A1. Способность P. aeruginosa и родственных видов быстро приобретать устойчивость к антибиотикам является актуальной медицинской проблемой. При промышленной культивации данных видов существует риск контаминации и инфицирования. Наконец, Pseudomonas представляет собой относительно малоизученный микроорганизм, что затрудняет оптимизацию условий экспрессии, выделения и очистки продукта.One of the main disadvantages of microorganisms from the order Pseudomonadales when used as a basis for creating strains of producers of therapeutic proteins is the pathogenicity of many of its representatives, for example, the species Pseudomonas aeruginosa mentioned in the patent US20190127743A1 - opportunistic pathogens that often cause nosocomial infections, aggravated by multidrug resistance of pathogens . In humans, P. aeruginosa is the most common pathogen, but infection can also occur from P. putida , P. fluorescens or P. acidovorans , also mentioned in US20190127743A1. The ability of P. aeruginosa and related species to rapidly acquire antibiotic resistance is a pressing medical problem. When industrially cultivating these species, there is a risk of contamination and infection. Finally, Pseudomonas is a relatively poorly understood microorganism, making optimization of expression conditions, isolation, and product purification challenging.
Описано так же получение аспарагиназы E.coli в дрожжах Pichia pastoris SuperMan5 (his-), трансформированных плазмидой pJAG-s1 (Glycosylation of L-asparaginase from E. coli through yeast expression and site-directed mutagenesis, Biochemical Engineering Journal, Volume 156, 15 April 2020, 107516, Lima et al. https://doi.org/10.1016/j.bej.2020.107516). Аспарагиназа секретируется в культуральную среду в гликозилированном состоянии, что может сильно повышать ее иммуногенность и вызывать немеделенную воспалительную реакцию при инъекциях вследствие того, что дрожжи интенсивно N-гликозилируют секретируемые белки и вносят иммуногенные олигоманнозные олигосахаридные группы в такие белки.The production of E. coli asparaginase in the yeast Pichia pastoris SuperMan5 (his-), transformed with the pJAG-s1 plasmid (Glycosylation of L-asparaginase from E. coli through yeast expression and site-directed mutagenesis, Biochemical Engineering Journal , Volume 156, 15) is also described April 2020, 107516, Lima et al. Asparaginase is secreted into the culture medium in a glycosylated state, which can greatly increase its immunogenicity and cause an immediate inflammatory reaction upon injection due to the fact that the yeast intensively N-glycosylates the secreted proteins and introduces immunogenic oligomannose oligosaccharide groups into such proteins.
Наиболее близкий известный способ получения рекомбинантной L-аспарагиназы (прототип изобретения) включает создание рекомбинантной плазмидной ДНК pL-ASP-08 и нового штамма бактерий Escherichia coli XL1-blue/pL-ASP-08, содержащего данную плазмиду (Патент РФ № 2397248, МПК C12N, опубл. 2010 г.). Продуктивность штамма описана как 165 мг/л суммарной внутриклеточной аспарагиназы II типа по данным электрофореза при неизвестной оптической плотности клеток, 33% от общего растворимого белка по данным денситометрии электрофореграммы. Общая ферментативная активность секретированной и внутриклеточной аспарагиназы составила 42 МЕ/мл, что соответствует общей концентрации активной аспарагиназы 168 мг/л. Среди недостатков данного решения - неоптимизированный ген, получаемый в ходе амплификации геномной ДНК E. coli, использование векторной плазмиды pQE-30, кодирующей бета-лактамазу, вызывающую аллергические реакции у пациентов при инъекции даже незначительных количеств этого белка, как примеси в лекарственном средстве, и относительно невысокий уровень продуктивности, а также использование бактерий XL-1Blue в качестве клеток-хозяев и вызываемое этим загрязнение целевого варианта аспарагиназы II типа белком, кодируемым хромосомой клеток класса K12 и отличающимся от целевого варианта белка несколькими аминокислотными остатками.The closest known method for producing recombinant L-asparaginase (prototype of the invention) involves the creation of recombinant plasmid DNA pL-ASP-08 and a new strain of Escherichia coli bacteria XL1-blue/pL-ASP-08 containing this plasmid (RF Patent No. 2397248, IPC C12N , publ. 2010). The productivity of the strain is described as 165 mg/l of total intracellular type II asparaginase according to electrophoresis at an unknown optical density of cells, 33% of the total soluble protein according to electropherogram densitometry. The total enzymatic activity of secreted and intracellular asparaginase was 42 IU/ml, which corresponds to a total active asparaginase concentration of 168 mg/l. Disadvantages of this solution include an unoptimized gene obtained during amplification of E. coli genomic DNA, the use of a vector plasmid pQE-30 encoding a beta-lactamase that causes allergic reactions in patients when even small amounts of this protein are injected as an impurity in a drug, and a relatively low level of productivity, as well as the use of XL-1Blue bacteria as host cells and the resulting contamination of the target variant of type II asparaginase with a protein encoded by the chromosome of class K12 cells and differing from the target protein variant in several amino acid residues.
Было предположено, что продуктивность системы экспрессии может быть существенно увеличена при получении аспарагиназы с использованием оптимизированного синтетического гена и векторной плазмиды с канамициновой селекцией.It was suggested that the productivity of the expression system could be significantly increased by producing asparaginase using an optimized synthetic gene and a kanamycin selection vector plasmid.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Целями настоящего изобретения являются:The objectives of the present invention are:
1) предоставление экспрессионной плазмиды pET28a-AsnSYN, содержащей синтетический фрагмент ДНК, кодирующий L-аспарагиназу Escherichia coli II типа, в частности, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке, например, под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, либо другого индуцируемого или конститутивного промотора, например, tac-промотора, или trp-промотора, или rha-промотора, либо иного промотора.1) provision of an expression plasmid pET28a-AsnSYN containing a synthetic DNA fragment encoding Escherichia coli type II L-asparaginase, in particular, under the control of a promoter functioning in a bacterial cell, for example, under the control of the promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7, or another inducible or a constitutive promoter, for example a tac promoter, or a trp promoter, or a rha promoter, or another promoter.
2) предоставление бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной описанной выше плазмидой, - продуцента L-аспарагиназы Escherichia coli II типа,2) provision of a bacterium belonging to the genus Escherichia , transformed with the plasmid described above, a producer of Escherichia coli type II L-asparaginase,
3) предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия представлена штаммом Escherichia coli BL21[DE3]/ pET28a-AsnSYN,3) providing the bacterium described above, where said bacterium is represented by the Escherichia coli strain BL21[DE3]/ pET28a-AsnSYN,
4) получение рекомбинантной L-аспарагиназы Escherichia coli II типа с использованием указанной выше бактерии и/или бактерий.4) obtaining recombinant L-asparaginase Escherichia coli type II using the above bacterium and/or bacteria.
Технической проблемой, решаемой авторами, является создание изобретения, лишенного недостатков уровня техники, в частности, прототипа, а именно, создание технологии получения L-аспарагиназы Escherichia coli II типа с увеличением количества аспарагиназы на единицу объема ферментера и на килограмм биомассы E.coli, вследствие чего количество готового продукта тоже пропорционально возрастает, с возможностью высокого выхода и хорошей чистоты.The technical problem solved by the authors is the creation of an invention devoid of the disadvantages of the prior art, in particular the prototype, namely, the creation of a technology for the production of Escherichia coli type II L-asparaginase with an increase in the amount of asparaginase per unit volume of the fermenter and per kilogram of E. coli biomass, due to whereby the quantity of the finished product also increases proportionally, with the possibility of high yield and good purity.
Техническим результатом, который обеспечивает настоящее изобретение, является улучшенная продуктивность, увеличение количества аспарагиназы на единицу объема ферментера и на килограмм биомассы E.coli, вследствие чего количество готового продукта тоже пропорционально возрастает, с возможностью высокого выхода. Также достигается хорошая чистота, и, как следствие, - потенциальное снижение частоты побочных эффектов у пациентов. Кроме того, изобретение позволяет расширить арсенал известных технических решений, направленных на продуцирование аспарагиназы.The technical result that the present invention provides is improved productivity, an increase in the amount of asparaginase per unit volume of the fermenter and per kilogram of E. coli biomass, as a result of which the amount of the finished product also increases proportionally, with the possibility of high yield. Good purity is also achieved and, as a result, a potential reduction in the incidence of side effects in patients. In addition, the invention allows us to expand the arsenal of known technical solutions aimed at producing asparaginase.
Технический результат достигается путем создания технологии, включающей в себя новую экспрессионную плазмидную ДНК pET28a-AsnSYN, кодирующую L-аспарагиназу E. coli II типа, создание штамма продуцента E. coli на ее основе.The technical result is achieved by creating a technology that includes a new expression plasmid DNA pET28a-AsnSYN, encoding L-asparaginaseE. coliType II, creation of a producer strainE. coli based on it.
В основе данного решения лежит разработанная авторами плазмидная ДНК pET28a-AsnSYN длиной 6298 п.о., кодирующая L-аспарагиназу E. coli II типа. Открытая рамка считывания указанного белка L-аспарагиназы E. coli II типа содержит оптимальный для процесса трансляции набор и последовательность кодонов, позволяющие увеличить уровень экспрессии белка за счет как эффективной трансляции всех аминокислот полипептида, так и снижения количества элементов вторичной структуры РНК, что приводит к значительному увеличению выхода целевого белка.This solution is based on the plasmid DNA pET28a-AsnSYN, 6298 bp long, developed by the authors, encoding E. coli type II L-asparaginase. The open reading frame of the specified E. coli type II L-asparaginase protein contains an optimal set and sequence of codons for the translation process, which makes it possible to increase the level of protein expression due to both efficient translation of all amino acids of the polypeptide and a decrease in the number of elements of the secondary structure of RNA, which leads to a significant increasing the yield of the target protein.
В частности, при культивировании в колбах в культуральной среде Terrific Broth бактерий BL21[DE3]/ pET28a-AsnSYN уровень внутриклеточной аспарагиназы E.coli II типа достиг 291 мг/л за 21 ч индукции, что практически в два раза превосходит лучшие ранее достигнутые в Патенте РФ № 2397248, МПК C12N, опубл. 2010 г. результаты для E.coli -168 мг/л.In particular, when BL21[DE3]/ pET28a-AsnSYN bacteria were cultivated in flasks in Terrific Broth culture medium, the level of intracellular asparaginase E. coli type II reached 291 mg/l after 21 hours of induction, which is almost twice as high as the best previously achieved in the Patent RF No. 2397248, IPC C12N, publ. 2010 results for E. coli -168 mg/l.
Признак «AsnSYN» указывает на код, который обозначает синтетический вариант гена аспарагиназы, где Asn - обозначение аспарагиназы, SYN - синтетический. Данный вариант гена используется с вектором pET28а (+), итоговая конструкция обозначается как «pET28a-AsnSYN».The “AsnSYN” sign indicates a code that denotes a synthetic variant of the asparaginase gene, where Asn is the designation of asparaginase, SYN is synthetic. This gene variant is used with the pET28a (+) vector, the final construct is designated “pET28a-AsnSYN”.
Признак «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее гена, например, такие как промотор и терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии L-аспарагиназы E. coli II типа в составе экспрессионной кассеты, согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7. The feature “expression plasmid” means plasmid DNA containing all the necessary genetic elements for the expression of the gene embedded in it, for example, such as a promoter and terminator. A specific example of the genetic elements required for expression of E. coli type II L-asparaginase within an expression cassette of the present invention is, but is not limited to, the bacteriophage T7 RNA polymerase promoter .
Фрагментом ДНК, кодирующим рекомбинантную L-аспарагиназу E. coli II типа, согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий L-аспарагиназу E. coli II типа. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР или с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.The DNA fragment encoding the recombinant E. coli type II L-asparaginase according to the present invention is, for example, a synthetic gene encoding E. coli type II L-asparaginase. The specified DNA fragment can be obtained by PCR or using cloning technology from Sloning BioTechnology, described in PCT application WO2005071077.
Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в E. coli предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей L-аспарагиназу E. coli, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися в генах E. coli кодонами, а также расчетная вторичная структура РНК не содержала стабильных шпилек.To ensure efficient translation of the cloned gene into E. coli , it is preferable that in the sequence encoding E. coli L-asparaginase, all rare codons are replaced by synonymous codons that are common in E. coli genes, and that the calculated RNA secondary structure does not contain stable hairpins.
Последовательность гена, кодирующего L-аспарагиназу E. coli II типа, согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.The sequence of the gene encoding E. coli type II L-asparaginase according to the present invention is presented in the Sequence Listing under SEQ ID NO:1.
Аминокислотная последовательность белка L-аспарагиназы E. coli II типа, согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.The amino acid sequence of the E. coli type II L-asparaginase protein according to the present invention is presented in the Sequence Listing under SEQ ID NO: 2.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1), кодирующего L-аспарагиназу E. coli II типа, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы (удалены), заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке.DNA fragments that encode substantially the same protein can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of the DNA fragment (SEQ ID NO: 1) encoding E. coli type II L-asparaginase , for example, by site-directed mutagenesis, so that one or more amino acid residues at a particular site will be deleted (removed), replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be produced using traditional processing methods to produce mutations. DNA fragments that encode substantially the same protein can be produced by expressing DNA fragments having the mutation described above in a suitable cell.
Синтетический ген L-аспарагиназы E. coli II типа, приведенный в настоящем изобретении, может быть изменен, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1), кодирующего L-аспарагиназу E. coli II типа, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что все аминокислотные остатки белка будут сохранены, но один или несколько кодонов будут заменены на синонимичные. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют тот же белок и представляют собой по существу ту же последовательность кодонов с незначительными заменами кодонов на синонимичные им, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутации, описанные выше, в соответствующей клетке.The synthetic E. coli type II L-asparaginase gene provided in the present invention can be changed, for example, by modifying the nucleotide sequence of the DNA fragment (SEQ ID NO: 1) encoding E. coli type II L-asparaginase , for example, by the method site-directed mutagenesis, so that all amino acid residues of the protein will be preserved, but one or more codons will be replaced with synonymous ones. DNA fragments modified as described above can be produced using traditional processing methods to produce mutations. DNA fragments that encode the same protein and represent essentially the same sequence of codons with minor substitutions of synonymous codons can be obtained by expressing DNA fragments having the mutations described above in the appropriate cell.
Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами L-аспарагиназы E. сoli II типа, определяются по его способности гидролизовать L-аспарагин. Так, например, активность L-аспарагиназы Escherichia coli II типа можно детектировать с реактивом Несслера, как описано в Примере 3. Считается, что вариант белка обладает свойствами L-аспарангиназы E. coli II типа при условии, что указанный вариант обладает активностью не менее 5 международных единиц на 1 мг белка, предпочтительно не менее 10 международных единиц на мг белка.Indicators of functional activity, at which it is believed that the resulting protein has the properties of E. coli type II L-asparaginase , are determined by its ability to hydrolyze L-asparagine. For example, the activity of Escherichia coli L-asparaginase type II can be detected with Nessler's reagent, as described in Example 3. A protein variant is considered to have the properties of E. coli L-asparaginase type II, provided that the variant has an activity of at least 5 international units per mg protein, preferably at least 10 international units per mg protein.
Экспрессионная плазмида, согласно настоящему изобретению, содержит фрагмент ДНК, кодирующий L-аспарагиназу E. coli II типа, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды, согласно настоящему изобретению, могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, pET32a, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.The expression plasmid according to the present invention contains a DNA fragment encoding E. coli type II L-asparaginase under the control of a promoter functioning in the bacterial cell. As the recombinant plasmid according to the present invention, various plasmids capable of expression in the recipient cell can be used, such as plasmids pBR322, pMW119, pUC19, pET32a, pET28b and the like, but the list of plasmids is not limited to them.
Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения является плазмида pET28a-AsnSYN, размером 6298 п.о. которая состоит из:A specific embodiment of the present invention is the 6298 bp plasmid pET28a-AsnSYN. which consists of:
1) фрагмента HindIII-NcoI (1-1053)-длиной 1052 п.о., содержащего участок, кодирующий синтетический ген аспарагиназы (12-1055).1) fragment HindIII-NcoI (1-1053) - 1052 bp long, containing a region encoding the synthetic asparaginase gene (12-1055).
2) фрагмента NcoI-HindIII (1053-6298) вектора pET28a(+) длиной 5246 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона.2) fragment NcoI-HindIII (1053-6298) of the pET28a(+) vector, 5246 bp long, containing the region of the origin of replication of the plasmid pBR322, the gene of the RNA organizing protein Rop, the origin of replication of the f1 bacteriophage, the sequence encoding aminoglycoside-3' -phosphotransferase, promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; transcription termination site; sequence encoding the repressor of the lactose operon.
Указанная плазмида содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: HindIII (1), NcoI (1053), FspAI (2962), BstZ17I (3752), XmaI (5055).This plasmid contains unique restriction endonuclease recognition sites: HindIII (1), NcoI (1053), FspAI (2962), BstZ17I (3752), XmaI (5055).
Структуры плазмиды pET28a-AsnSYN приведена на Фиг. 7 и в SEQ ID 3.The structure of plasmid pET28a-AsnSYN is shown in Fig. 7 and SEQ ID 3.
При помощи созданной плазмиды можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию рода Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. Хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии L-аспарагиназы E. coli II типа может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.Using the created plasmid, it is possible to transform a bacterial cell, preferably a bacterium of the genus Escherichia , susceptible to such transformation by the specified plasmid. The choice of a particular cell is not critical, since the transformation methodology and techniques are well known to one skilled in the art. Although the level of expression of E. coli type II L-asparaginase may vary depending on the type of cell and the cultivation conditions of the resulting transformant, the expression of the target protein will occur provided that the recipient cell is successfully transformed.
«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники, например, кальциевым методом, химическим методом или с помощью электропорации. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995)."Transforming a cell with a plasmid" means introducing a plasmid into a cell using methods well known to one skilled in the art, such as the calcium method, chemical method, or electroporation. Transformation with this plasmid results in expression of the gene encoding the protein of the present invention and protein synthesis in the bacterial cell. Transformation methods include any standard methods known to one skilled in the art, for example the method described in Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).
Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка - продуцент L-аспарангиназы E. coli II типа» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению L-аспарангиназы E. coli II типа, согласно настоящему изобретению, когда бактериальная клетка, согласно настоящему изобретению, выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь признак «бактериальная клетка - продуцент L-аспарангиназы E. coli II типа» также означает клетку, которая способна накапливать L-аспарагиназу E. coli II типа в количестве не менее чем 2 мг/л культуры, более предпочтительно, не менее чем 20 мг/л культуры. Указанный белок L-аспарангиназа E. coli II типа накапливается в указанной клетке предпочтительно в периплазме в растворимой форме.According to the present invention, “ E. coli L-asparanginase type II producing bacterial cell” means a bacterial cell having the ability to produce and accumulate E. coli L-asparanginase type II according to the present invention when the bacterial cell according to the present invention is grown in the specified nutrient medium. As used herein, the attribute “bacterial cell producing E. coli type II L-asparaginase” also means a cell that is capable of accumulating E. coli type II L-asparaginase in an amount of not less than 2 mg/l of culture, more preferably not less than 20 mg/l of culture. The specified protein L-asparanginase E. coli type II accumulates in the specified cell, preferably in the periplasm in a soluble form.
Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий L-аспарагиназу E. coli II типа.It is preferable to use a bacterium belonging to the genus Escherichia for transformation with a recombinant plasmid containing a DNA fragment encoding E. coli type II L-asparaginase.
Признак «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E. coli).The feature “bacterium belonging to the genus Escherichia ” may mean that the bacterium belongs to the genus Escherichia according to a classification known to one skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia , the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in the book by Neidhardt, FC et al. ( Escherichia coli and Salmonella typhimurium , American Society for Microbiology, Washington DC, 1208, Table 1) may be given as examples.
Конкретным примером штамма - реципиента для получения продуцента L-аспарагиназы E. coli II типа, согласно настоящему изобретению, является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].A specific example of a recipient strain for producing an E. coli type II L-asparaginase producer according to the present invention is, but is not limited to, Escherichia coli strain BL21[DE3].
Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками. Escherichia coli strain BL21[DE3] is characterized by the following cultural-morphological, physiological-biochemical characteristics and genetic characteristics.
Культурально-морфологические особенности штамма: грамм-отрицательные палочки, образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы.Cultural and morphological characteristics of the strain: gram-negative rods, form threads; on agar medium - whitish large colonies with an uneven edge. The activity of the strain is determined by electropherogram densitometry. The strain is stored under the following conditions: Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, 10% glycerol. The strain reproduces under the following conditions - Lurie-Bertrand medium, 1% glucose.
Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F - ompT gal dcm lon hsdS B (r B - m B -) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).Genetic characteristics of the strain. The genotype of the strain is F - ompT gal dcm lon hsdS B ( r B - m B - ) λ (DE3 [ lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5 ]).
Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидой pET28a-AsnSYN приводит к получению штамма-продуцента BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN, который обеспечивает синтез рекомбинантной L-аспарагиназы E. coli II типа в количестве 5-20% от суммарного содержания белка клеток.Transformation of the Escherichia coli strain BL21[DE3] with the plasmid pET28a-AsnSYN leads to the production of the producer strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN, which provides the synthesis of recombinant L-asparaginase E. coli type II in an amount of 5-20% of the total protein content of the cells .
Таким образом, сущность настоящего изобретения заключается в следующем:Thus, the essence of the present invention is as follows:
- Экспрессионная плазмида pET28a-AsnSYN, предназначенная для синтеза L- аспарагиназы, содержащая фрагмент ДНК с последовательностью SEQ ID NO:3, кодирующий L-аспарагиназу Escherichia coli II типа.- Expression plasmid pET28a-AsnSYN, intended for the synthesis of L-asparaginase, containing a DNA fragment with the sequence SEQ ID NO:3, encoding Escherichia coli type II L-asparaginase.
- Бактерия, принадлежащая к виду Escherichia coli, трансформированная указанной плазмидой, предназначенная для синтеза L-аспарагиназы Escherichia coli II типа.- A bacterium belonging to the species Escherichia coli , transformed with the specified plasmid, intended for the synthesis of Escherichia coli type II L-asparaginase.
- Бактерия, которая относится к штамму Escherichia coli BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN.- A bacterium that belongs to the Escherichia coli strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN.
- Способ получения L-аспарагиназы, включающий культивирование штамма Escherichia coli BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN, выделение L-аспарагиназы и ее очистку.- A method for producing L-asparaginase, including cultivating the Escherichia coli strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN, isolating L-asparaginase and purifying it.
Особенности плазмиды и результаты их практического применения приведены на следующих Фигурах.Features of the plasmid and the results of their practical application are shown in the following Figures.
Краткое описание Фигур:Brief Description of the Figures:
На Фиг. 1 показана схема получения экспрессионных плазмид pET28a-AsnWT и pET28a-AsnSYN. Используются следующие обозначения: гДНК - геномная ДНК штамма E. coli BL21 [DE3]. Пунктирная линия обозначает полимеразную цепную реакцию, сплошная - рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК, курсивом приведены названия эндонуклеаз рестрикции, использованных для клонирования, прямым шрифтом - названия плазмид.In FIG. Figure 1 shows a scheme for obtaining expression plasmids pET28a-AsnWT and pET28a-AsnSYN. The following designations are used: gDNA - genomic DNA of E. coli strain BL21 [DE3]. The dotted line indicates the polymerase chain reaction, the solid line indicates restriction and ligation of DNA fragments, the names of restriction endonucleases used for cloning are in italics, and the names of plasmids are in bold font.
На Фиг. 2 показана диаграмма распределения кодонов природного и синтетического гена аспарагиназы по децилям индекса предпочтительности. Обозначения: WT - природный ген аспарагиназы; SYN - синтетический ген аспарагиназы.In FIG. Figure 2 shows a diagram of the distribution of codons of the natural and synthetic asparaginase gene by deciles of the preference index. Designations: WT - natural asparaginase gene; SYN - synthetic asparaginase gene.
На Фиг. 3 показано центроидное состояние ансамбля структур 5’-концевой области мРНК для природного гена аспарагиназы. Сайт связывания рибосомы и старт-кодон выделены жирным шрифтом.In FIG. Figure 3 shows the centroid state of the ensemble of structures of the 5’-terminal region of the mRNA for the natural asparaginase gene. The ribosome binding site and start codon are shown in bold.
На Фиг. 4 показано центроидное состояние ансамбля структур 5’-концевой области мРНК для синтетического гена аспарагиназы. Сайт связывания рибосомы и старт-кодон выделены жирным шрифтом.In FIG. Figure 4 shows the centroid state of the ensemble of structures of the 5'-terminal region of mRNA for the synthetic asparaginase gene. The ribosome binding site and start codon are shown in bold.
На Фиг. 5 показано распределение индекса GC состава ДНК для природного и синтетического гена аспрагиназы. Природный ген - сплошная линия, синтетический ген - пунктирная линия, доли GC пар приведены для сегментов по 5 пар оснований.In FIG. Figure 5 shows the distribution of the GC index of DNA composition for the natural and synthetic aspraginase gene. Natural gene - solid line, synthetic gene - dotted line, shares of GC pairs are given for segments of 5 base pairs.
На Фиг. 6 показана карта экспрессионной плазмиды pET28a-AsnWT. Используются следующие обозначения: «pBR322 ori» - область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop, контролирующего копийность плазмиды; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - ген устойчивости к канамицину; «T7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7 term» - участок терминации транскрипции целевого гена; «lacI» - ген репрессора лактозного оперона; asparaginase ws - природная ОРС полипептида L-аспарагиназы Escherichia coli II типа; «2 stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.In FIG. Figure 6 shows a map of the pET28a-AsnWT expression plasmid. The following designations are used: “pBR322 ori” - the region of the origin of replication of the plasmid pBR322; “ROP” - the gene for the RNA organizing protein Rop, which controls the copy number of the plasmid; “f1 ori” - site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" - kanamycin resistance gene; “T7 prom” - promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; “T7 term” - transcription termination site of the target gene; "lacI" - lactose operon repressor gene; asparaginase ws - natural ORF of Escherichia coli type II L-asparaginase polypeptide; “2 stop” - block of stop codons. The arrows indicate the directions of gene transcription; the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. Restriction endonuclease recognition sites are shown in italics; nucleotide numbers at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фиг. 7 показана карта экспрессионной плазмиды pET28a-AsnSYN. Используются следующие обозначения: «pBR322 ori» - область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop, контролирующего копийность плазмиды; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - ген устойчивости к канамицину; «T7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7 term» - участок терминации транскрипции целевого гена; «lacI» - ген репрессора лактозного оперона; asparaginase syn - синтетическая оптимизированная ОРС полипептида L-аспарагиназы Escherichia coli II типа; «2 stop» - блок стоп-кодонов. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.In FIG. 7 shows a map of the expression plasmid pET28a-AsnSYN. The following designations are used: “pBR322 ori” - the region of the origin of replication of the plasmid pBR322; “ROP” - the gene for the RNA organizing protein Rop, which controls the copy number of the plasmid; “f1 ori” - site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" - kanamycin resistance gene; “T7 prom” - promoter of RNA polymerase of bacteriophage T7; “T7 term” - transcription termination site of the target gene; "lacI" - lactose operon repressor gene; asparaginase syn - synthetic optimized ORF of Escherichia coli type II L-asparaginase polypeptide; “2 stop” - block of stop codons. The arrows indicate the directions of gene transcription; the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. Restriction endonuclease recognition sites are shown in italics; nucleotide numbers at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фиг. 8 показана диаграмма накопления внутриклеточной аспарагиназы при индукции штаммов-продуцентов BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN и BL21[DE3]/pET28a-AsnWT при индукции 1 мМ ИПТГ в среде Terrific broth при температуре 30°C. Обозначения: WT - штамм BL21[DE3]/pET28a-AsnWT; SYN - штамм BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN.In FIG. Figure 8 shows a diagram of intracellular asparaginase accumulation upon induction of producer strains BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN and BL21[DE3]/pET28a-AsnWT upon induction with 1 mM IPTG in Terrific broth medium at 30°C. Designations: WT - strain BL21[DE3]/pET28a-AsnWT; SYN - strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN.
На Фиг. 9 показана электрофореграмма тотального белка, растворимых белков и нерастворимых белков из клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN при индукции 1 мМ ИПТГ в среде Terrific broth при температуре 30°C.In FIG. Figure 9 shows an electropherogram of total protein, soluble proteins and insoluble proteins from cells of the producer strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN upon induction with 1 mM IPTG in Terrific broth medium at 30°C.
Индукция 1 мМ ИПТГ, 37°C; 0, 3 и 21 ч. Обозначения: «0 h» - тотальный клеточный белок до внесения индуктора, «3 h SOL» - растворимые внутриклеточные белки, 3 ч индукции, «21 h SOL» - растворимые внутриклеточные белки, 21 ч индукции, «3 h RES» - нерастворимые белки, 3 ч индукции; «21 h RES» - нерастворимые белки, 21 ч индукции; «WT» - природный ген аспарагиназы, «SYN» - синтетический ген аспарагиназы; «М» - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. На все дорожки нанесены белки, полученные из 120 мкл культуры. Положение целевого белка указано стрелкой. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим.Induction 1 mM IPTG, 37°C; 0, 3 and 21 hours. Designations: “ 0 h” - total cellular protein before adding the inducer, “ 3 h SOL” - soluble intracellular proteins, 3 hours of induction, “ 21 h SOL” - soluble intracellular proteins, 21 hours of induction, “ 3 h RES” - insoluble proteins, 3 h induction; “ 21 h RES” - insoluble proteins, 21 h induction; "WT" - natural asparaginase gene, "SYN" - synthetic asparaginase gene; "M" is a molecular weight marker. Molecular masses of marker bands are indicated in kDa. All lanes contain proteins obtained from 120 μl of culture. The position of the target protein is indicated by an arrow. Reducing conditions, stained with colloidal Coomassie blue.
На Фиг. 10 приведены электрофореграммы белковых фракций, полученных при выделении и хроматографической очистке аспарагиназы. In FIG. Figure 10 shows electropherograms of protein fractions obtained from the isolation and chromatographic purification of asparaginase.
Обозначения: «SOL» - растворимые белки, «NaOAc» - супернатант после закисления лизата, «UF/DF» - концентрат после ультрафильтрации и диафильтрации, «CS» - элюат катионообменной хроматографии, «DEAE» - элюат анионообменной хроматографии, «PHE» - фракция проскока гидрофобной хроматографии, «HA» - элюат хроматографии на керамическом гидроксилапатите, «М» - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка указано стрелкой. Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Designations: "SOL" - soluble proteins, "NaOAc" - supernatant after acidification of the lysate, "UF/DF" - concentrate after ultrafiltration and diafiltration, "CS" - cation exchange chromatography eluate, "DEAE" - anion exchange chromatography eluate, " PHE " - breakthrough fraction of hydrophobic chromatography, “ HA ” - eluate of chromatography on ceramic hydroxyapatite, “ M” - molecular weight marker. Molecular masses of marker bands are indicated in kDa. The position of the target protein is indicated by an arrow. Reducing conditions, stained with colloidal Coomassie blue.
На Фиг. 11 показана хроматограмма гель-фильтрационного анализа очищенной аспарагиназы и результаты интеграции пиков. Канал детекции 280 нм. In FIG. 11 shows a chromatogram of a gel filtration analysis of purified asparaginase and peak integration results. Detection channel 280 nm.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры. The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-AsnWTExample 1. Preparation of plasmid DNA pAL-AsnWT
Для гена аспарагиназы были подобраны адапторные праймеры AD-Asp-NcoF (SEQ ID NO:4) и AD-Asp-HindR (SEQ ID NO:5), позволяющие амплифицировать ОРС целевого бека с адапторными последовательностями, включающими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции NcoI и HindIII, для последующего клонирования. В последовательность ДНК также были включены дополнительные стоп-кодоны. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:6.Adapter primers AD-Asp-NcoF (SEQ ID NO:4) and AD-Asp-HindR (SEQ ID NO:5) were selected for the asparaginase gene, allowing amplification of the target ORF with adapter sequences including recognition sites for restriction endonucleases NcoI and HindIII , for subsequent cloning. Additional stop codons were also included in the DNA sequence. The resulting nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO:6.
Из клеток E. coli штамма BL21 [DE3] выделяли геномную ДНК и использовали ее в качестве матрицы при проведении ПЦР-амплификации с праймерами AD-Asp-NcoF (SEQ ID NO:4) и AD-Asp-HindR (SEQ ID NO:5). Амплификацию ДНК проводили с помощью набора Tersus Plus PCR kit и Encyclo Plus PCR kit, содержащими смеси высокоточных полимераз. Режим ПЦР: предварительная денатурация - 95оС, 2 минуты, далее 35 циклов: денатурация 95оС, 15 сек, отжиг праймеров 55оС, 15 сек, элонгация 72оС, 1,5 минуты, затем финальная элонгация 72оС, 2 минуты, 10оС - охлаждение. Продукт ПЦР выделяли из 1% агарозного геля и лигировали в вектор pAL2T («Евроген», Россия). Полученными лигазными смесями трансформировали клетки E. coli штамма Top10. Колонии E. coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды pAL2 М13dir (SEQ ID NO:7), M13rev (SEQ ID NO:8). 5 отобранных клонов наращивали в 5 мл 2хYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК. Для полученных плазмид pAL2-AsnWT определяли нуклеотидную последовательность области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием стандартных праймеров к последовательности вектора М13dir (SEQ ID NO:7), M13rev (SEQ ID NO:8).Genomic DNA was isolated from E. coli strain BL21 [DE3] cells and used as a template for PCR amplification with primers AD-Asp-NcoF (SEQ ID NO:4) and AD-Asp-HindR (SEQ ID NO:5 ). DNA amplification was carried out using the Tersus Plus PCR kit and Encyclo Plus PCR kit containing mixtures of high-precision polymerases. PCR mode: preliminary denaturation - 95 o C, 2 minutes, then 35 cycles: denaturation 95 o C, 15 sec, primer annealing 55 o C, 15 sec, elongation 72 o C, 1.5 minutes, then final elongation 72 o C , 2 minutes, 10 o C - cooling. The PCR product was isolated from a 1% agarose gel and ligated into the pAL2T vector (Evrogen, Russia). The resulting ligase mixtures were used to transform E. coli strain Top10 cells. Colonies of E. coli selected as a result of white-blue screening were analyzed by PCR from clones using primers to the sequences of the recipient plasmid pAL2 M13dir (SEQ ID NO:7), M13rev (SEQ ID NO:8). 5 selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp and plasmid DNA was isolated. For the resulting plasmids pAL2-AsnWT, the nucleotide sequence of the insertion region was determined by PCR sequencing using standard primers to the vector sequence M13dir (SEQ ID NO:7), M13rev (SEQ ID NO:8).
Для создания экспрессионных плазмид использовали вектор pET28а(+) и его производные. Вектор pET28а(+) является деривативом вектора pBR322, включающим в себя фрагмент области начала репликации природной плазмиды ColE1, ген РНК-организующего белка; участок инициации репликации бактериофага f1; последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, промотор и последовательность, кодирующую lac-репрессор (lacI), а также ориентированные в противоположную сторону последовательности: 1) сильного индуцибельного промотора бактериофага Т7 и 2) lac-оператора, составляющие гибридный Т7lac промотор, позволяющий строго контролировать базальный уровень экспрессии целевого гена в штаммах E. coli, лизогенизированных по фагу λ-DE3. Реципиентную плазмиду pET28a разрезали ферментами NcoI и HindIII, дефосфорилировали, переосаждали спиртом и лигировали с очищенным фрагментом NcoI - HindIII плазмиды pAL-AsnWT, соответствующим минигену аспарагиназы. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки E. coli штамма TOP10. Колонии E. coli анализировали методом ПЦР с клонов с помощью праймеров T7prom (SEQ ID NO:9) и T7t (SEQ ID NO:10). Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2хYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК, секвенировали области вставки с праймеров T7prom (SEQ ID NO:9) и T7t (SEQ ID NO:10). В результате секвенирования отобрали плазмиды без мутаций в области вставки, то есть кодирующие корректную последовательность гена аспарагиназы. Карта экспрессионной конструкции pET28a-AsnWT приведена на Фиг. 6 и в SEQ ID NO:11, аминокислотная последовательность продукта экспрессии приведена в SEQ ID NO:2.To create expression plasmids, the pET28a(+) vector and its derivatives were used. The pET28a(+) vector is a derivative of the pBR322 vector, including a fragment of the origin of replication region of the natural ColE1 plasmid, the RNA organizing protein gene; bacteriophage f1 replication initiation site; the sequence encoding the aminoglycoside 3'-phosphotransferase, the promoter and the sequence encoding the lac repressor (lacI), as well as the sequences oriented in the opposite direction: 1) the strong inducible promoter of the bacteriophage T7 and 2) the lac operator, constituting the hybrid T7lac promoter, allowing strictly control the basal level of target gene expression in E. coli strains lysogenized by the λ-DE3 phage. The recipient plasmid pET28a was cut with NcoI and HindIII enzymes, dephosphorylated, reprecipitated with alcohol, and ligated with the purified NcoI - HindIII fragment of the pAL-AsnWT plasmid, corresponding to the asparaginase minigene. The resulting ligase mixtures were used to transform E. coli strain TOP10 cells. E. coli colonies were analyzed by PCR from clones using primers T7prom (SEQ ID NO:9) and T7t (SEQ ID NO:10). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan medium, plasmid DNA was isolated, and the insertion regions from primers T7prom (SEQ ID NO:9) and T7t (SEQ ID NO:10) were sequenced. As a result of sequencing, plasmids without mutations in the insertion region were selected, that is, encoding the correct sequence of the asparaginase gene. The expression map of pET28a-AsnWT is shown in Fig. 6 and SEQ ID NO:11, the amino acid sequence of the expression product is shown in SEQ ID NO:2.
Пример 2. Получение экспрессионной плазмидной ДНК pET28a-AsnSYNExample 2. Preparation of expression plasmid DNA pET28a-AsnSYN
Для аминокислотной последовательности L-аспарагиназы Escherichia coli II типа была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в E. coli, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК и GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов, а также отсутствие протяженных повторов и палиндромов. В последовательность ДНК были включены стоп-кодоны и сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:12.For the amino acid sequence of L-asparaginaseEscherichia coli Type II was reverse translated into a DNA nucleotide sequence. The codons used were,optimal for the expression of this gene in E. coli, and the gene structure was optimized for the secondary structure of mRNA and GC composition, ensuring the absence of undesirable regulatory elements, as well as the absence of extended repeats and palindromes. Stop codons and restriction endonuclease recognition sites were included in the DNA sequence. The resulting nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO:12.
При оптимизации кодонной структуры гена была использована метрика RSCU - relative synonymous codon usage (относительная частота использования синонимичных кодонов), то есть отношение наблюдаемой частоты использования кодонов к ожидаемой частоте в предположении одинаковой частоты использования всех возможных кодонов.When optimizing the codon structure of the gene, the RSCU metric was used - relative synonymous codon usage (relative frequency of use of synonymous codons), that is, the ratio of the observed frequency of codon usage to the expected frequency, assuming the same frequency of use of all possible codons.
Анализ кодонной структуры рассчитанной последовательности синтетического гена был проведен как ранжирование использованных кодонов против известного набора частотности (предпочтительности) кодонов в E.coli B, вычисленного, как указано в (https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-017-1793-7).Analysis of the codon structure of the calculated synthetic gene sequence was carried out as a ranking of the used codons against the known set of frequencies (preferences) of codons in E. coli B, calculated as indicated in (https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-017 -1793-7).
Использованные в природном и синтетическом генах кодоны были разделены на децильные группы по частотности, результаты приведены на Фиг. 2. Установлено, что в синтетическом гене увеличена доля кодонов с высокой предпочтительностью, от 80 до 100, за счет падения доли кодонов со средней предпочтительностью - от 40 до 60, при этом доли слабопредпочтительных кодонов, от 20 до 40, одинаковы для обоих вариантов гена, а кодоны с очень низкой предпочтительностью полностью отсутствуют в обоих вариантах гена.The codons used in natural and synthetic genes were divided into decile groups according to frequency; the results are shown in Fig. 2. It has been established that in the synthetic gene the proportion of codons with high preference has increased, from 80 to 100, due to a decrease in the proportion of codons with average preference - from 40 to 60, while the proportions of weakly preferred codons, from 20 to 40, are the same for both gene variants , and codons with very low preference are completely absent in both gene variants.
Моделирование возможных вторичных структур РНК для природного и синтетического гена проводили при помощи сервиса RNAfold, расположенного на сервере http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi.Modeling of possible secondary RNA structures for natural and synthetic genes was carried out using the RNAfold service located on the server http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi.
Находящуюся непосредственно на 5`-конце мРНК шпильку со значительной энергией образования, одинаковую для природного и синтетического генов, исключали из анализа, для этого вели расчет вторичных структур для 5’-концевой области мРНК, начиная с позиции +30. Для получения релевантной модели вторичных структур использовали участок мРНК 30-300. Для него в случае природного гена было предсказано практически полное сворачивание в шпилечную структуру с вероятностью образования большинства двуспиральных участков более 80% и общей энергией образования ансамбля структур -70 ккал/моль. В случае синтетического гена после варьирования кодонного состава для центроидной структуры РНК было предсказано только два двуспиральных участка с вероятностью образования около 60% и общей энергией образования ансамбля -47 ккал/моль. Сайт связывания рибосом (последовательность Шайн-Дальгарно) и старт-кодон в случае природного гена были вовлечены в образование двуспиральных структур, но с небольшой вероятностью образования, а в случае синтетического гена - находились вне участков спиралеобразования, что предпочтительно для эффективной трансляции данной мРНК. Образование шпилечной структуры мРНК вблизи старт-кодона может негативно влиять на трансляцию, такие структуры мРНК могут использоваться бактерией для метаболической регуляции работы гена аспарагиназы на уровне контроля трансляции. При оверэкспрессии гена аспарагиназы данные эффекты нежелательны, целевой ген должен обеспечивать эффективную трансляцию полипептида аспарагиназы вне зависимости от режима метаболизма бактерий.A hairpin located directly at the 5'-end of the mRNA with a significant formation energy, identical for natural and synthetic genes, was excluded from the analysis; for this purpose, secondary structures were calculated for the 5'-terminal region of the mRNA, starting from position +30. To obtain a relevant model of secondary structures, the 30-300 region of mRNA was used. For it, in the case of a natural gene, almost complete folding into a hairpin structure was predicted with a probability of formation of the majority of double-helical regions of more than 80% and a total energy of formation of an ensemble of structures of -70 kcal/mol. In the case of a synthetic gene, after varying the codon composition for the centroid structure of the RNA, only two double-stranded regions were predicted with a probability of formation of about 60% and a total ensemble formation energy of -47 kcal/mol. The ribosome binding site (Shine-Dalgarno sequence) and the start codon in the case of a natural gene were involved in the formation of double-stranded structures, but with a low probability of formation, and in the case of a synthetic gene, they were located outside the helix formation sites, which is preferable for the efficient translation of this mRNA. The formation of a hairpin structure of mRNA near the start codon can negatively affect translation; such mRNA structures can be used by bacteria for metabolic regulation of the asparaginase gene at the level of translation control. When overexpressing the asparaginase gene, these effects are undesirable; the target gene must ensure efficient translation of the asparaginase polypeptide, regardless of the bacterial metabolic regime.
При расчете синтетического гена также контролировали отсутствие областей с сильно увеличенным или сильно уменьшенным GC-составом для предотвращения появления участков торможения транскрипции, отклонения GC-состава от среднего значения для синтетического гена на всей длине гена не превышали отклонения GC-состава для природного гена и приведены на Фиг. 5.When calculating the synthetic gene, we also controlled for the absence of areas with a strongly increased or greatly decreased GC composition to prevent the appearance of areas of transcription inhibition; deviations of the GC composition from the average value for the synthetic gene along the entire length of the gene did not exceed the deviations of the GC composition for the natural gene and are shown in Fig. 5.
Синтетический ген аспарагиназы с последовательностями для клонирования (SEQ ID NO:5) был физически получен компанией SYNBIO (КНР) и клонирован в плазмиду pUC57. Данной плазмидой трансформировали клетки E. coli штамма Top10 (ThermoFischer Scientific, США). Колонии E. coli наращивали в 5 мл 2хYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК pUC57-AsnSYN. Для полученных плазмид pUC57-AsnSYN определяли нуклеотидную последовательность области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием стандартных праймеров к последовательности вектора М13dir (SEQ ID NO:7), M13rev (SEQ ID NO:8) и специфического праймера SQ-SYNASN-R (SEQ ID NO:13).The synthetic asparaginase gene with cloning sequences (SEQ ID NO:5) was physically obtained by SYNBIO (China) and cloned into the pUC57 plasmid. This plasmid was used to transform E. coli strain Top10 cells (ThermoFischer Scientific, USA). E. coli colonies were grown in 5 ml of 2xYT-Amp and plasmid DNA pUC57-AsnSYN was isolated. For the resulting pUC57-AsnSYN plasmids, the nucleotide sequence of the insertion region was determined by PCR sequencing using standard primers to the vector sequence M13dir (SEQ ID NO:7), M13rev (SEQ ID NO:8) and the specific primer SQ-SYNASN-R (SEQ ID NO:13).
Реципиентную плазмиду pET28a гидролизовали с помощью NcoI и HindIII, дефосфорилировали, переосаждали спиртом и лигировали с очищенным фрагментом NcoI - HindIII плазмиды pUC57-AsnSYN WT, соответствующим минигену аспарагиназы. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки E. coli штамма TOP10. Колонии E. coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:9) и специфического праймера SQ-SYNASN-R (SEQ ID NO:13). Отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2хYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК, секвенировали области вставки с праймеров T7prom (SEQ ID NO:9), T7t (SEQ ID NO:10) и SQ-SYNASN-R (SEQ ID NO:13). В результате секвенирования отобрали плазмиды без мутаций в области вставки, то есть кодирующие корректную последовательность гена аспарагиназы. Карта экспрессионной конструкции pET28a-AsnSYN приведена на Фиг. 7 и в SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность продукта экспрессии приведена в SEQ ID NO:2.The recipient plasmid pET28a was digested with NcoI and HindIII, dephosphorylated, reprecipitated with alcohol, and ligated with the purified NcoI - HindIII fragment of the pUC57-AsnSYN WT plasmid, corresponding to the asparaginase minigene. The resulting ligase mixtures were used to transform E. coli strain TOP10 cells. E. coli colonies were analyzed by PCR from clones with primers T7prom (SEQ ID NO:9) and specific primer SQ-SYNASN-R (SEQ ID NO:13). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan medium, plasmid DNA was isolated, and insertion regions were sequenced using primers T7prom (SEQ ID NO:9), T7t (SEQ ID NO:10) and SQ-SYNASN-R (SEQ ID NO:13 ). As a result of sequencing, plasmids without mutations in the insertion region were selected, that is, encoding the correct sequence of the asparaginase gene. The expression map of pET28a-AsnSYN is shown in Fig. 7 and SEQ ID NO:3, the amino acid sequence of the expression product is shown in SEQ ID NO:2.
Пример 3. Метод измерения ферментативной активности L-аспарагиназы Example 3 Method for measuring the enzymatic activity of L-asparaginase Escherichia coliEscherichia coli II типа Type II
Метод Несслера позволяет количественно определить концентрацию ионов аммония, выделяющихся после превращения аспарагина в аспарагиновую кислоту и вступающих в реакцию с реагентом Несслера - тетрайодомеркуратом дикалия(II). Единица активности аспарагиназы (ME) соответствует 1 мкмоль ионов аммония NH4 +, образующихся в минуту при рН 7,3 и 37°C.The Nessler method allows you to quantify the concentration of ammonium ions released after the conversion of asparagine to aspartic acid and reacting with Nessler's reagent - dipotassium(II) tetraiodomercurate. A unit of asparaginase activity (ME) corresponds to 1 µmol of ammonium ions NH 4 + formed per minute at pH 7.3 and 37°C.
Водные растворы аспарагиназы и референтного препарата разводили в дистиллированной воде до концентрации 0,02-0,1 мг/мл. Для определения активности готовили реакционную смесь: к 180 мкл 0,5 М трис-буфера, рН 7,3 добавляли 20 мкл 0,094 мМ раствора L-аспарагина и 20 мкл раствора аспарагиназы, и перемешивали на вортексе. После инкубации при 37°C в течение 10 мин при контролируемой температуре, реакцию останавливали добавлением 80 мкл раствора трихлоруксусной кислоты (1,5 М). Реакционную смесь перемешивали на вортексе, выдерживали при 4°C в течение 10 мин, центрифугировали белковый осадок на 15 тыс. об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость использовали для определения аспарагиназной активности, перед нанесением на 96-луночный планшет образцы разводили в 5 раз дистиллированной водой.Aqueous solutions of asparaginase and the reference drug were diluted in distilled water to a concentration of 0.02-0.1 mg/ml. To determine the activity, a reaction mixture was prepared: 20 μl of a 0.094 mM L-asparagine solution and 20 μl of asparaginase solution were added to 180 μl of 0.5 M Tris buffer, pH 7.3, and mixed by vortex. After incubation at 37°C for 10 min at a controlled temperature, the reaction was stopped by adding 80 μl of trichloroacetic acid solution (1.5 M). The reaction mixture was stirred by vortex, kept at 4°C for 10 minutes, and the protein sediment was centrifuged at 15 thousand rpm for 5 minutes. The supernatant was used to determine asparaginase activity; before application to a 96-well plate, the samples were diluted 5 times with distilled water.
Калибровочные растворы готовили путем многократного разведения исходного раствора хлорида аммония (NH4Cl, 5 мМ) в следующем диапазоне концентраций: от 0,5 до 5 мкмоль/мл NH4 +.Calibration solutions were prepared by repeated dilution of the stock solution of ammonium chloride (NH 4 Cl, 5 mM) in the following concentration range: from 0.5 to 5 μmol/ml NH 4 + .
В 96-луночный планшет вносили по 50 мкл калибровочных растворов и предварительно разведенных образцов. Затем добавляли по 50 мкл реактива Несслера, разведенного в 5 раз дистиллированной водой непосредственно перед анализом. Выдерживали 2 минуты при комнатной температуре. Концентрацию NH4 + определяли в каждом растворе методом абсорбционной спектроскопии (λmax = 450 нм) с использованием планшетного считывателя.50 μl of calibration solutions and pre-diluted samples were added to a 96-well plate. Then, 50 μl of Nessler's reagent, diluted 5 times with distilled water, was added immediately before analysis. Kept for 2 minutes at room temperature. The NH 4 + concentration was determined in each solution by absorption spectroscopy (λmax = 450 nm) using a plate reader.
Калибровочную кривую строили в программе Excel, где по оси абсцисс (х) откладывали значения оптической плотности, а по оси ординат (y) - значения концентраций ионов аммония. Для определения концентрации NH4 + в мкмоль/мл реакционной смеси (Х) в образцах использовали уравнение калибровочной кривой.The calibration curve was plotted in Excel, where the optical density values were plotted along the abscissa (x) axis, and the concentrations of ammonium ions were plotted along the ordinate (y) axis. To determine the concentration of NH 4 + in μmol/ml of the reaction mixture (X) in the samples, the calibration curve equation was used.
Для определения концентрации NH4 + в мкмоль/мин*мл (МЕ/мл) фермента (С МЕ/мл) в образцах использовали уравнение:To determine the concentration of NH 4 + in µmol/min*ml (IU/ml) of the enzyme (C IU/ml) in the samples, the equation was used:
С МЕ/мл = Х*А*50*15/T, гдеC IU/ml = X*A*50*15/T, where
Х - концентрация NH4 + в мкмоль/мл реакционной смеси;X is the concentration of NH 4 + in µmol/ml of the reaction mixture;
А - коэффициент, учитывающий предварительное разведение фермента до концентрации 0,02-0,1 мг/мл;A is a coefficient that takes into account the preliminary dilution of the enzyme to a concentration of 0.02-0.1 mg/ml;
50 - коэффициент пересчета на 1 мл фермента;50 - conversion factor per 1 ml of enzyme;
15 - коэффициент, учитывающий разведение фермента реакционной смесью;15 - coefficient taking into account the dilution of the enzyme by the reaction mixture;
Т - время инкубации при 37°C.T - incubation time at 37°C.
Для определения концентрации NH4 + в мкмоль/мин*мг (МЕ/мг) фермента (С МЕ/мг) использовали уравнение:To determine the concentration of NH 4 + in µmol/min*mg (IU/mg) of the enzyme (C IU/mg), the equation was used:
С МЕ/мг = С МЕ/мг /Сб, гдеC IU/mg = C IU/mg /Sb, where
С МЕ/мг - концентрации NH4 + в мкмоль/мин*мл (МЕ/мл) фермента,C IU/mg - concentration of NH 4 + in µmol/min*ml (IU/ml) of the enzyme,
Сб - концентрация белка (аспарагиназы) в мг/мл.Sat - protein concentration (asparaginase) in mg/ml.
Пример 4. Получение штаммов-продуцентов Example 4. Obtaining producer strains E. coliE. coli BL21[DE3]/pET28a-AsnWT и BL21[DE3]/pET28a-AsnWT and E. coliE. coli BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN, локализация целевого белка BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN, target protein localization
Для получения штаммов-продуцентов L-аспарагиназы Escherichia coli II типа, конструкции, полученные по примерам 1 и 2, использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21[DE3] (с генотипом F- ompT hsdSB (r-m-) gal dcm [DE3]).To obtain L-asparaginase producing strains of Escherichia coli type II, the constructs obtained in examples 1 and 2 were used to transform competent Escherichia coli cells BL21[DE3] (with genotype F- ompT h sdS B (rm-) gal dcm [DE3 ]).
Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28a-AsnWT - клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28a-AsnWT.To obtain the E. coli strain BL21[DE3]/pET28a-AsnWT , cells of the E. coli strain BL21[DE3] were transformed with the expression plasmid pET28a-AsnWT .
Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN - клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28a-AsnSYN с помощью метода химической трансформации. На 100 мкл замороженной суспензии компетентных клеток E. coli использовали 10 мкл лигазной смеси или 100 нг плазмиды, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, затем проводили тепловой шок, нагревая пробирки с бактериями при 42°С в течение 45 секунд, после пробирки охлаждали на льду 5 минут. После добавления 1 мл стерильной среды SOВ пробирки с трансформированными бактериями инкубировали 1 час при 37°С. Трансформированные клетки переносили на чашку Петри с твердой селективной агаризованной средой и инкубировали их в термостате при 37°С в течении ночи.To obtain a strainE. coli BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN - strain cellsE. coli BL21[DE3] was transformed with an expression plasmidpET28a-AsnSYNby using chemical transformation method. Per 100 µl of frozen competent cell suspensionE. coli 10 μl of the ligase mixture or 100 ng of plasmid were used, incubated on ice for 30 minutes to sorption of plasmid DNA, then a heat shock was performed, heating the tubes with bacteria at 42°C for 45 seconds, after which the tubes were cooled on ice for 5 minutes. After adding 1 ml of sterile SOB medium, the tubes with transformed bacteria were incubated for 1 hour at 37°C. The transformed cells were transferred to a Petri dish with a solid selective agar medium and incubated in a thermostat at 37°C overnight.
Трансформанты E. coli высевали на агаризованную среду 2хYT с добавлением глюкозы до 1% и селективного антибиотика - 50 мкг/мл канамицина. Отдельные колонии с типичным фенотипом подращивали в питательном бульоне 2xYT с 50 мкг/мл канамицина в течение 14 часов при температуре 37°C, инокулировали новую порцию питательной среды Terrific broth с 50 мкг/мл канамицина в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 1-1,2 O.E., уменьшали температуру культивации до 30°C, индуцировали изопропилтио-p-D-галактозидом 1 мМ и культивировали еще 21 ч, отобрав аликвоты суспензии после 3 ч индукции. Осадок клеток отделяли от среды центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в 1/10 от исходного объема суспензии, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа и измерения ферментативной активности аспарагиназы, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка и белковых фракций для штамма BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN приведены на Фиг. 9. Электрофоретическая подвижность целевого белка соответствует расчетным значениям. По данным гель-электрофореза белковых фракций целевой белок практически полностью локализован в растворимой фракции белков для обоих вариантов штамма. E. coli transformants were sown on 2xYT agar medium with the addition of glucose up to 1% and a selective antibiotic - 50 μg/ml kanamycin. Individual colonies with a typical phenotype were grown in 2xYT nutrient broth with 50 μg/ml kanamycin for 14 hours at a temperature of 37°C, a new portion of the Terrific broth nutrient medium with 50 μg/ml kanamycin was inoculated in a ratio of 1:100, and the culture was grown until optical density 1-1.2 OE, reduced the cultivation temperature to 30°C, induced isopropylthio-pD-galactoside 1 mM and cultivated for another 21 hours, taking aliquots of the suspension after 3 hours of induction. The cell sediment was separated from the medium by centrifugation, the cells were resuspended in a solution of 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA-Na, 0.1% Triton-X100, 10 μg/ml lysozyme in 1/10 of the original volume of the suspension, the suspension was kept for 30 min on ice and Cells were destroyed with an ultrasonic dispersant until the visible viscosity of the suspension disappeared. Samples were taken for electrophoretic analysis and measurement of the enzymatic activity of asparaginase, the soluble and insoluble protein fractions in them were separated by centrifugation in a microcentrifuge, the sediment was additionally resuspended in the same solution and precipitated by centrifugation. The results of electrophoretic analysis of total protein and protein fractions for strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN are shown in Fig. 9. The electrophoretic mobility of the target protein corresponds to the calculated values. According to gel electrophoresis of protein fractions, the target protein is almost completely localized in the soluble protein fraction for both strain variants.
Содержание ферментативно активной аспарагиназы было достоверно выше в случае штамма BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN на 3 ч индукции и несколько выше на 21 ч индукции, данные приведены на Фиг. 8. Конечное содержание ферментативно активной аспарагиназы для штамма BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN составляло 291±9 мг/л. Удельное содержание ферментативно активной аспарагиназы для штамма BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN составляло 34,2 мг/(л*ОЕ) для 3 ч индукции; 44,5±2,6 мг/(л*ОЕ) для 21 ч индукции. В случае штамма BL21[DE3]/pET28a-AsnWT удельное содержание ферментативно активной аспарагиназы составляло 15,7 мг/(л*ОЕ) для 3 ч индукции и 38,4±1,6 мг/(л*ОЕ) для 3 и 21 ч индукции, что на 46% ниже, чем для синтетического гена на 3 ч индукции и на 14% меньше на 21 ч индукции.The content of enzymatically active asparaginase was significantly higher in the case of strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN at 3 hours of induction and slightly higher at 21 hours of induction, the data are shown in Fig. 8. The final content of enzymatically active asparaginase for strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN was 291±9 mg/l. The specific content of enzymatically active asparaginase for strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN was 34.2 mg/(l*FU) for 3 h of induction; 44.5±2.6 mg/(l*FU) for 21 hours of induction. In the case of strain BL21[DE3]/pET28a-AsnWT, the specific content of enzymatically active asparaginase was 15.7 mg/(l*FU) for 3 hours of induction and 38.4±1.6 mg/(l*FU) for 3 and 21 h of induction, which is 46% lower than for the synthetic gene at 3 h of induction and 14% less at 21 h of induction.
Пример 5. Выделение и очистка L-аспарагиназы Example 5: Isolation and Purification of L-Asparaginase Escherichia coli Escherichia coli II типаType II
Культивировали штамм-продуцент BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN и проводили лизис клеток, как указано в Примере 4. К осветленному лизату добавляли раствор ацетата натрия, pH=4,5, до конечной концентрации 20 мМ, доводили pH уксусной кислотой до 4,5, инкубировали суспензию при перемешивании 30 мин при комнатной температуре и отделяли выпавший осадок балластного белка центрифугированием. Доводили pH супернатанта до 7,5 при помощи раствора гидроксида натрия, концентрировали раствор нейтрализованного супернатанта ультрафильтрацией до 1:40 от исходного объема культуры, используя мембрану с порогом отсечения 30 кДа из полиэфирсульфона (ПЭС). Затем проводили диафильтрацию при помощи воды очищенной до падения проводимости фильтрата ниже 0,5 мС/см.The producer strain BL21[DE3]/pET28a-AsnSYN was cultivated and cell lysis was carried out as described in Example 4. A solution of sodium acetate, pH = 4.5, was added to the clarified lysate to a final concentration of 20 mM, the pH was adjusted with acetic acid to 4, 5, the suspension was incubated with stirring for 30 minutes at room temperature and the precipitated ballast protein was separated by centrifugation. The pH of the supernatant was adjusted to 7.5 using sodium hydroxide solution, and the neutralized supernatant solution was concentrated by ultrafiltration to 1:40 of the original culture volume using a polyethersulfone (PES) membrane with a cutoff threshold of 30 kDa. Then diafiltration was carried out using purified water until the conductivity of the filtrate dropped below 0.5 mS/cm.
К полученному раствору добавляли ацетат натрия, pH=4,5, до 10 мМ, доводили pH раствора до 4,5 уксусной кислотой, отделяли выпавший осадок центрифугированием. Осветленный концентрат наносили на колонку с сорбентом Capto S (Cytiva, США), уравновешенную раствором 20 мМ ацетата натрия, pH=4,5. Промывали колонку раствором 20 мМ ацетата натрия pH=4,5 до стабилизации базовой линии и элюировали аспрагиназу раствором 100 мМ NaCl, 20 мМ ацетата натрия, pH=4,5.Sodium acetate, pH=4.5, was added to the resulting solution to 10 mM, the pH of the solution was adjusted to 4.5 with acetic acid, and the precipitate that formed was separated by centrifugation. The clarified concentrate was applied to a column with Capto S sorbent (Cytiva, USA), equilibrated with a solution of 20 mM sodium acetate, pH=4.5. The column was washed with a solution of 20 mM sodium acetate, pH = 4.5, until the baseline was stabilized, and aspraginase was eluted with a solution of 100 mM NaCl, 20 mM sodium acetate, pH = 4.5.
Обессоливали раствор полуочищенной аспарагиназы диафильтрацией, используя ПЭС мембрану с порогом отсечения 30 кДа и диафильтрующий раствор 20 мМ трис-HCl, pH=8,5. Обессоленный раствор наносили на колонку Capto DEAE (Cytiva), уравновешенную тем же раствором, после нанесения колонку промывали раствором 20 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH=8,5. Элюировали аспарагиназу раствором 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl pH=8,5.A solution of semi-purified asparaginase was desalted by diafiltration using a PES membrane with a cutoff threshold of 30 kDa and a diafiltration solution of 20 mM Tris-HCl, pH = 8.5. The desalted solution was applied to a Capto DEAE column (Cytiva), equilibrated with the same solution; after application, the column was washed with a solution of 20 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH = 8.5. Asparaginase was eluted with a solution of 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH=8.5.
К полученному элюату добавляли сухой сульфат магния до конечной концентрации 250 мМ. Пропускали полученный раствор через колонку с сорбентом Phenyl Sepharose high substitution (Cytiva), уравновешенную раствором 20 мМ трис-HCl, pH=7,5, 250 мМ MgSO4. Собирали фракцию не связавшихся с сорбентом белков (проскок), вносили фосфат калия pH=7,5 до 1 мМ и наносили на колонку с сорбентом Ceramic hydroxyapatite type I (Bio-Rad, США), уравновешенную раствором 100 мМ NaCl, 5 мМ фосфата калия, pH=7,5. После нанесения промывали колонку раствором 100 мМ NaCl, 5 мМ фосфата калия, pH=7,5, до стабилизации базовой линии и элюируют аспарагиназу раствором 100 мМ NaCl, 50 мМ фосфата калия, pH=7,5.Dry magnesium sulfate was added to the resulting eluate to a final concentration of 250 mM. The resulting solution was passed through a column with Phenyl Sepharose high substitution sorbent (Cytiva), equilibrated with a solution of 20 mM Tris-HCl, pH=7.5, 250 mM MgSO 4 . The fraction of proteins not bound to the sorbent (slippage) was collected, potassium phosphate pH=7.5 was added to 1 mM and applied to a column with Ceramic hydroxyapatite type I sorbent (Bio-Rad, USA), equilibrated with a solution of 100 mM NaCl, 5 mM potassium phosphate , pH=7.5. After application, the column was washed with a solution of 100 mM NaCl, 5 mM potassium phosphate, pH=7.5, until the baseline was stabilized, and asparaginase was eluted with a solution of 100 mM NaCl, 50 mM potassium phosphate, pH=7.5.
Выход очищенной таким способом аспарагиназы составлял не менее 25% по данным измерения ферментативной активности, удельная активность составляла более 250 МЕ/мг. Полученный препарат аспарагиназы не содержал видимых белковых примесей по данным ДСН-ПААГ (Фиг. 10). Препарат содержал менее 1% примеси мономерной аспарагиназы и менее 3% примеси мультимера аспарагиназы по данным гель-фильтрации (Фиг. 11).The yield of asparaginase purified in this way was at least 25% according to the measurement of enzymatic activity, the specific activity was more than 250 IU/mg. The resulting asparaginase preparation did not contain visible protein impurities according to SDS-PAGE (Fig. 10). The preparation contained less than 1% impurity of monomeric asparaginase and less than 3% impurity of multimer asparaginase according to gel filtration data (Fig. 11).
Пример 6. Получение готовой лекарственной формы аспарагиназы Example 6. Preparation of the finished dosage form of asparaginase E. coliE. coli
Полученный по условиям примера 5 раствор очищенной аспарагиназы обессоливали диафильтрацией на ПЭС мембране с порогом отсечения 30 кДа при помощи 14 диафильтрующих объемов воды для инъекций, концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации 15-20 мг/мл, формулировали внесением сахарозы до 100 г/л, доводили до концентрации аспарагиназы 10 мг/мл при помощи раствора 100 г/л сахарозы в воде для инъекций, проводили стерильную фильтрацию полученного готового раствора, стерильно разливали раствор в стеклянные лиофилизационные флаконы вместимостью 25 мл по 4 мл и проводили лиофилизацию до достижения постоянной массы лиофилизата. Флаконы закрывали резиновыми пробками и укупоривали алюминиевыми колпачками.The solution of purified asparaginase obtained according to the conditions of example 5 was desalted by diafiltration on a PES membrane with a cutoff threshold of 30 kDa using 14 diafiltration volumes of water for injection, concentrated by ultrafiltration to a final concentration of 15-20 mg/ml, formulated by adding sucrose to 100 g/l, adjusted to concentration of asparaginase 10 mg/ml using a solution of 100 g/l sucrose in water for injection, sterile filtration of the resulting finished solution was carried out, the solution was sterilely poured into 4 ml glass lyophilization bottles with a capacity of 25 ml and lyophilization was carried out until a constant weight of the lyophilisate was achieved. The vials were closed with rubber stoppers and sealed with aluminum caps.
Приведенные результаты показали, что использование синтетического гена, кодируемого оптимальными для E. coli кодонами, существенно увеличивает уровень экспрессии аспарагиназы II типа в E. coli BL21[DE3] по сравнению с природным геном, при этом накопление целевого белка в нерастворимой форме, как с непроцессированным лидерным пептидом, так и после отделения лидерного пептида, практически не происходит.The presented results showed that the use of a synthetic gene encoded by codons optimal for E. coli significantly increases the level of expression of type II asparaginase in E. coli BL21[DE3] compared to the natural gene, while the accumulation of the target protein in an insoluble form, as with unprocessed the leader peptide, and after separation of the leader peptide, practically does not occur.
Дополнительно, преимущества предлагаемого штамма бактерии-реципиента E. coli BL21[DE3] заключаются, но не ограничиваются, использованием бактерий с фенотипом Lon OmpT, кодирующих в своей хромосоме такой же вариант аспарагиназы II типа, что и предлагаемая плазмида pET28a-AsnSYN, а также оригинальные лекарственные препараты аспарагиназы. Отсутствие протеаз lon и ompT в цитоплазме и периплазме E. coli может дополнительно уменьшить протеолитический распад целевого белка в процессе биосинтеза и выделения, а присутствие в бактериях собственной аспарагиназы II типа с такой же последовательностью, что и у кодируемой плазмидой аспарагиназы, дополнительно может позволить избежать появления в препарате очищенной аспарагиназы трудноотделяемой родственной примеси собственной аспарагиназы бактерии-реципиента с измененной относительно целевого белка аминокислотной последовательностью. Встроенный в геном штамма-реципиента ген РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем lacUV5 промотора при использовании T7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмидах приводит к быстрой и эффективной продукции белка. При использовании другого индуцибельного промотора, например, tac-промотора, присутствия гена РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем lacUV5 промотора в геноме клеток-реципиентов не требуется, что не будет влиять на уровень биосинтеза L-аспарагиназы E.coli II типа.Additionally, the advantages of the proposed recipient strain of E. coli BL21[DE3] bacteria include, but are not limited to, the use of bacteria with the Lon OmpT phenotype, encoding in their chromosome the same type II asparaginase variant as the proposed pET28a-AsnSYN plasmid, as well as the original asparaginase drugs. The absence of proteases lon and ompT in the cytoplasm and periplasm of E. coli can further reduce the proteolytic degradation of the target protein during biosynthesis and isolation, and the presence in bacteria of their own type II asparaginase with the same sequence as that of the plasmid-encoded asparaginase can additionally avoid the appearance of in the preparation of purified asparaginase there is a difficult-to-separate related impurity of the recipient bacterium’s own asparaginase with a modified amino acid sequence relative to the target protein. The bacteriophage T7 RNA polymerase gene integrated into the genome of the recipient strain under the control of the lacUV5 promoter when using the T7-lac promoter and T7 terminator in plasmids leads to rapid and efficient protein production. When using another inducible promoter, for example, the tac promoter, the presence of the bacteriophage T7 RNA polymerase gene under the control of the lacUV5 promoter in the genome of recipient cells is not required, which will not affect the level of biosynthesis of E. coli type II L-asparaginase.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to one skilled in the art that various changes and equivalent substitutions may be made and such changes and substitutions are within the scope of the present invention.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"
fileName="Asparaginase_seq.xml" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Asparaginase_seq.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-06-27">softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-06-27">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>-</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>-</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-06-27</FilingDate> <FilingDate>2023-06-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>asparaginase_seq</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>asparaginase_seq</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГУП "Московский эндокринный <ApplicantName languageCode="ru">FSUE "Moscow Endocrine"
завод"</ApplicantName>plant"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FGUP "Moskovskij endokrinnyj <ApplicantNameLatin>FGUP "Moskovskij endokrinnyj
zavod"</ApplicantNameLatin>zavod"</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Габидова Альфия Эркиновна <InventorName languageCode="ru">Gabidova Alfiya Erkinovna
</InventorName></InventorName>
<InventorNameLatin>Gabidova Alfiya Erkinovna</InventorNameLatin> <InventorNameLatin>Gabidova Alfiya Erkinovna</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">ПРОДУЦЕНТ L-АСПАРАГИНАЗЫ E. COLI И <InventionTitle languageCode="en">L-ASPARAGINASE PRODUCER E. COLI AND
ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДА PET28A-ASNSYN, КОДИРУЮЩАЯ EXPRESSION PLASMIDS PET28A-ASNSYN, ENCODING
L-АСПАРАГИНАЗУ</InventionTitle>L-ASPARAGINASE</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>13</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>13</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>1047</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1047</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1047</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1047</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggaatttttcaaaaagacagcactagctgcgctggttatgggtttct <INSDSeq_sequence>atggaatttttcaaaaagacagcactagctgcgctggttatgggtttct
ctggtgcagcattggcccttcccaacattaccatcctggcgacgggtggcaccattgcgggtggcggtgactggtgcagcattggcccttcccaacattaccatcctggcgacgggtggcaccattgcgggtggcggtga
tagcgcgaccaagtccaattacaccgcggggaaagtcggcgtggagaacctcgtcaacgcggtgccacagtagcgcgaccaagtccaattacaccgcggggaaagtcggcgtggagaacctcgtcaacgcggtgccacag
ctgaaagacatcgcgaacgtgaagggtgaacaggttgtgaacattggtagccaggacatgaatgacgacgctgaaagacatcgcgaacgtgaagggtgaacaggttgtgaacattggtagccaggacatgaatgacgacg
tgtggctcaccctggcgaagaaaatcaacacggactgtgataagaccgacggctttgtgattacccacggtgtggctcaccctggcgaagaaaatcaacacggactgtgataagaccgacggctttgtgattacccacgg
tactgacacgatggaagagacagcgtatttcctggacctgaccgttaagtgcgataagccggttgttatgtactgacacgatggaagagacagcgtatttcctggacctgaccgttaagtgcgataagccggttgttatg
gttggtgctatgcgtccgagcaccagcatgagcgcggatggtccgttcaacctgtataacgcggttgtcagttggtgctatgcgtccgagcaccagcatgagcgcggatggtccgttcaacctgtataacgcggttgtca
ccgcggcagataaagcaagcgccaaccgcggtgttctggtggttatgaacgataccgtgctggacggccgccgcggcagataaagcaagcgccaaccgcggtgttctggtggttatgaacgataccgtgctggacggccg
tgatgttaccaagactaataccaccgacgtggccacatttaaatccgttaactacggtccgctgggttactgatgttaccaagactaataccaccgacgtggccacatttaaatccgttaactacggtccgctgggttac
atccacaacggcaaaattgattatcagcgtaccccggctcgcaaacacacctctgacaccccgttcgacgatccacaacggcaaaattgattatcagcgtaccccggctcgcaaacacacctctgacaccccgttcgacg
ttagcaaactgaacgagctgccgaaagtgggcatcgtgtataattacgcaaatgcgtccgacctgccggcttagcaaactgaacgagctgccgaaagtgggcatcgtgtataattacgcaaatgcgtccgacctgccggc
aaaggcgttggttgacgcgggctatgatggcattgtgtcagccggcgttggtaatggcaacttatacaaaaaaggcgttggttgacgcgggctatgatggcattgtgtcagccggcgttggtaatggcaacttatacaaa
accgtgtttgataccttggcgacggcggctaagaacggtacggctgtggttcgttctagccgtgtcccgaaccgtgtttgataccttggcgacggcggctaagaacggtacggctgtggttcgttctagccgtgtcccga
ccggtgccactacgcaagatgccgaagttgatgacgctaagtacggcttcgtggcatcgggcaccttgaaccggtgccactacgcaagatgccgaagttgatgacgctaagtacggcttcgtggcatcgggcaccttgaa
tccgcaaaaagcgcgcgtactgctgcagttggctctgacgcagaccaaggatccgcaacaaatccaacaatccgcaaaaagcgcgcgtactgctgcagttggctctgacgcagaccaaggatccgcaacaaatccaacaa
atctttaatcagtactaa</INSDSeq_sequence>atctttaatcagtactaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>348</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>348</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..348</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..348</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MEFFKKTALAALVMGFSGAALALPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTA <INSDSeq_sequence>MEFFKKTALAALVMGFSGAALALPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTA
GKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVVNIGSQDMNDDVWLTLAKKINTDCDKTDGFVITHGTDTMEETAYGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVVNIGSQDMNDDVWLTLAKKINTDCDKTDGFVITHGTDTMEETAY
FLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNAVVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDVTKTNTTDFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNAVVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDVTKTNTTD
VATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPKVGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPKVGIVYNYANASDLPAKALVDAGYD
GIVSAGVGNGNLYKTVFDTLATAAKNGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFVASGTLNPQKARVLLQGIVSAGVGNGNLYKTVFDTLATAAKNGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFVASGTLNPQKARVLLQ
LALTQTKDPQQIQQIFNQY</INSDSeq_sequence>LALTQTKDPQQIQQIFNQY</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>6298</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>6298</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6298</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..6298</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agcttctattagtactgattaaagatttgttggatttgttgcggatcct <INSDSeq_sequence>agcttctattagtactgattaaagatttgttggatttgttgcggatcct
tggtctgcgtcagagccaactgcagcagtacgcgcgctttttgcggattcaaggtgcccgatgccacgaatggtctgcgtcagagccaactgcagcagtacgcgcgctttttgcggattcaaggtgcccgatgccacgaa
gccgtacttagcgtcatcaacttcggcatcttgcgtagtggcaccggtcgggacacggctagaacgaaccgccgtacttagcgtcatcaacttcggcatcttgcgtagtggcaccggtcgggacacggctagaacgaacc
acagccgtaccgttcttagccgccgtcgccaaggtatcaaacacggttttgtataagttgccattaccaaacagccgtaccgttcttagccgccgtcgccaaggtatcaaacacggttttgtataagttgccattaccaa
cgccggctgacacaatgccatcatagcccgcgtcaaccaacgcctttgccggcaggtcggacgcatttgccgccggctgacacaatgccatcatagcccgcgtcaaccaacgcctttgccggcaggtcggacgcatttgc
gtaattatacacgatgcccactttcggcagctcgttcagtttgctaacgtcgaacggggtgtcagaggtggtaattataacacgatgcccactttcggcagctcgttcagtttgctaacgtcgaacggggtgtcagaggtg
tgtttgcgagccggggtacgctgataatcaattttgccgttgtggatgtaacccagcggaccgtagttaatgtttgcgagccggggtacgctgataatcaattttgccgttgtggatgtaacccagcggaccgtagttaa
cggatttaaatgtggccacgtcggtggtattagtcttggtaacatcacggccgtccagcacggtatcgttcggatttaaatgtggccacgtcggtggtattagtcttggtaacatcacggccgtccagcacggtatcgtt
cataaccaccagaacaccgcggttggcgcttgctttatctgccgcggtgacaaccgcgttatacaggttgcataaccaccagaacaccgcggttggcgcttgctttatctgccgcggtgacaaccgcgttatacaggttg
aacggaccatccgcgctcatgctggtgctcggacgcatagcaccaaccataacaaccggcttatcgcactaacggaccatccgcgctcatgctggtgctcggacgcatagcaccaaccataacaaccggcttatcgcact
taacggtcaggtccaggaaatacgctgtctcttccatcgtgtcagtaccgtgggtaatcacaaagccgtctaacggtcaggtccaggaaatacgctgtctcttccatcgtgtcagtaccgtgggtaatcacaaagccgtc
ggtcttatcacagtccgtgttgattttcttcgccagggtgagccacacgtcgtcattcatgtcctggctaggtcttatcacagtccgtgttgattttcttcgccagggtgagccacacgtcgtcattcatgtcctggcta
ccaatgttcacaacctgttcacccttcacgttcgcgatgtctttcagctgtggcaccgcgttgacgaggtccaatgttcacaacctgttcacccttcacgttcgcgatgtctttcagctgtggcaccgcgttgacgaggt
tctccacgccgactttccccgcggtgtaattggacttggtcgcgctatcaccgccacccgcaatggtgcctctccacgccgactttccccgcggtgtaattggacttggtcgcgctatcaccgccacccgcaatggtgcc
acccgtcgccaggatggtaatgttgggaagggccaatgctgcaccagagaaacccataaccagcgcagctacccgtcgccaggatggtaatgttgggaagggccaatgctgcaccagagaaacccataaccagcgcagct
agtgctgtctttttgaaaaattccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagggagtgctgtctttttgaaaaattccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggg
gaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctgaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcct
ctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgac
atcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtgg
caggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgct
caacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatccccaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatccc
ggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcaggggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagg
gtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttgtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgttt
cccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggacccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcgga
gctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccgctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgcc
acctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactggacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgg
gtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatctgtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatct
tctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaatctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaa
gctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattatttgctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattt
tctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgcttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgct
gttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgc
aatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgc
aaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaataaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaat
gcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagcgcgccattaccgagtccggggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaa
gacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcggacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcg
tggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggttggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggt
gaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatggaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatg
cagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctccagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctc
actcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtggg
cgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcccgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcc
ggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgctt
gcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcggcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcg
agaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggac
ccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagc
gactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaa
gtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctgtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggct
accctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtccaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcc
cgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaa
cccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacaccccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacac
ggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacatta
acgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgacc
acgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcaacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgca
gctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtca
gcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggctgcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggct
taactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagattaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagat
gcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgtgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgt
tcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataactcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataac
gcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgt
ttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaaccc
gacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctggacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctg
ccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgta
ggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccga
ccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggca
gcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcgcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggc
ctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaactaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcag
cagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt
ggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaataggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaata
caaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatgga
tgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattg
tatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacag
atgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtacatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtac
tcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatattcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatat
cctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgttt
gtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggttt
ggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcatggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcat
aaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgaaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttg
acgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgcacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc
catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattcatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtatt
gataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatggataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatg
agcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaag
tgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcatttgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcatt
ttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagt
gttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccggttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccg
tctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaatctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaa
agcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcg
agaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcg
taaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccaatccggatatagtttaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccaatccggatatagtt
cctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcag
cggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtgcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtg
gtgctcgagtgcggccgca</INSDSeq_sequence>gtgctcgagtgcggccgca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accatggagtttttcaaaaagacggcactt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>accatggagtttttcaaaaagacggcactt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taagcttctattagtactgattgaagatctgctgg</INSDSeq_sequ <INSDSeq_sequence>taagcttctattagtactgattgaagatctgctgg</INSDSeq_sequ
ence>ence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>1061</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1061</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1061</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1061</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accatggagtttttcaaaaagacggcacttgccgcactggttatgggtt <INSDSeq_sequence>accatggagtttttcaaaaagacggcacttgccgcactggttatgggtt
ttagtggtgcagcattggcattacccaatatcaccattttagcaaccggcgggaccattgccggtggtggttagtggtgcagcattggcattacccaatatcaccattttagcaaccggcgggaccattgccggtggtgg
tgactccgcaaccaaatctaactacacagcgggtaaagttggcgtagaaaatctggttaatgcggtgccgtgactccgcaaccaaatctaactacacagcgggtaaagttggcgtagaaaatctggttaatgcggtgccg
caactgaaggacattgcgaacgttaaaggcgagcaggtagtgaatattggctcccaggacatgaacgatgcaactgaaggacattgcgaacgttaaaggcgagcaggtagtgaatattggctcccaggacatgaacgatg
atgtctggctgacactggcgaaaaaaattaacaccgactgcgataaaactgacggcttcgtcattacccaatgtctggctgacactggcgaaaaaaattaacaccgactgcgataaaactgacggcttcgtcattaccca
cggtaccgacacgatggaagaaaccgcttacttcctcgacctgacggtgaaatgcgacaaaccggtggtgcggtaccgacacgatggaagaaaccgcttacttcctcgacctgacggtgaaatgcgacaaaccggtggtg
atggtcggtgcaatgcgtccgtccacgtctatgagcgcagacggtccattcaacctgtataacgcggtagatggtcggtgcaatgcgtccgtccacgtctatgagcgcagacggtccattcaacctgtataacgcggtag
tgactgcagctgataaagcctccgctaatcgtggcgtactggtagtgatgaacgacaccgtgcttgatggtgactgcagctgataaagcctccgctaatcgtggcgtactggtagtgatgaacgacaccgtgcttgatgg
ccgtgatgtcaccaaaaccaacaccaccgatgtagcgaccttcaagtctgttaactacggtcctctgggtccgtgatgtcaccaaaaccaacaccaccgatgtagcgaccttcaagtctgttaactacggtcctctgggt
tacattcacaacggtaagattgactaccaacgtaccccggcacgtaagcacaccagcgacacgccgttcgtacattcacaacggtaagattgactaccaacgtaccccggcacgtaagcacaccagcgacacgccgttcg
atgtctctaagctgaatgaactgccgaaagtcggcattgtttataactacgctaacgcatccgatcttccatgtctctaagctgaatgaactgccgaaagtcggcattgtttataactacgctaacgcatccgatcttcc
ggctaaagcactggtagatgcgggctatgatggcatcgttagcgctggcgtgggtaacggcaacctgtatggctaaagcactggtagatgcgggctatgatggcatcgttagcgctggcgtgggtaacggcaacctgtat
aaaaccgtatttgacacccttgcaaccgctgcgaaaaacggcactgcagtagtgcgttcttcccgcgtacaaaaccgtatttgacacccttgcaaccgctgcgaaaaacggcactgcagtagtgcgttcttcccgcgtac
cgacgggcgctaccactcaggatgccgaagtggatgatgcgaaatacggcttcgtcgcctctggcacgttcgacgggcgctaccactcaggatgccgaagtggatgatgcgaaatacggcttcgtcgcctctggcacgtt
gaacccgcaaaaagcgcgcgttctgctgcaactggctctgacgcaaactaaagatccgcagcagatccaggaacccgcaaaaagcgcgcgttctgctgcaactggctctgacgcaaactaaagatccgcagcagatccag
cagatcttcaatcagtactaatagaagcttac</INSDSeq_sequence>cagatcttcaatcagtactaatagaagcttac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttgtaaacgacggccagtg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gttgtaaacgacggccagtg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"> <INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggaaacagctatgac</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>caggaaacagctatgac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20"> <INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taatacgactcactataggg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>taatacgactcactataggg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"> <SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22"> <INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctagttattgctcagcgg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gctagttattgctcagcgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"> <SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>6298</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>6298</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6298</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..6298</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24"> <INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agcttctattagtactgattgaagatctgctggatctgctgcggatctt <INSDSeq_sequence>agcttctattagtactgattgaagatctgctggatctgctgcggatctt
tagtttgcgtcagagccagttgcagcagaacgcgcgctttttgcgggttcaacgtgccagaggcgacgaatagtttgcgtcagagccagttgcagcagaacgcgcgctttttgcgggttcaacgtgccagaggcgacgaa
gccgtatttcgcatcatccacttcggcatcctgagtggtagcgcccgtcggtacgcgggaagaacgcactgccgtatttcgcatcatccacttcggcatcctgagtggtagcgcccgtcggtacgcgggaagaacgcact
actgcagtgccgtttttcgcagcggttgcaagggtgtcaaatacggttttatacaggttgccgttacccaactgcagtgccgtttttcgcagcggttgcaagggtgtcaaatacggttttatacaggttgccgttaccca
cgccagcgctaacgatgccatcatagcccgcatctaccagtgctttagccggaagatcggatgcgttagccgccagcgctaacgatgccatcatagcccgcatctaccagtgctttagccggaagatcggatgcgttagc
gtagttataaacaatgccgactttcggcagttcattcagcttagagacatcgaacggcgtgtcgctggtggtagttataaacaatgccgactttcggcagttcattcagcttagagacatcgaacggcgtgtcgctggtg
tgcttacgtgccggggtacgttggtagtcaatcttaccgttgtgaatgtaacccagaggaccgtagttaatgcttacgtgccggggtacgttggtagtcaatcttaccgttgtgaatgtaacccagaggaccgtagttaa
cagacttgaaggtcgctacatcggtggtgttggttttggtgacatcacggccatcaagcacggtgtcgttcagacttgaaggtcgctacatcggtggtgttggttttggtgacatcacggccatcaagcacggtgtcgtt
catcactaccagtacgccacgattagcggaggctttatcagctgcagtcactaccgcgttatacaggttgcatcactaccagtacgccacgattagcggaggctttatcagctgcagtcactaccgcgttatacaggttg
aatggaccgtctgcgctcatagacgtggacggacgcattgcaccgaccatcaccaccggtttgtcgcattaatggaccgtctgcgctcatagacgtggacggacgcattgcaccgaccatcaccaccggtttgtcgcatt
tcaccgtcaggtcgaggaagtaagcggtttcttccatcgtgtcggtaccgtgggtaatgacgaagccgtctcaccgtcaggtcgaggaagtaagcggtttcttccatcgtgtcggtaccgtgggtaatgacgaagccgtc
agttttatcgcagtcggtgttaatttttttcgccagtgtcagccagacatcatcgttcatgtcctgggagagttttatcgcagtcggtgttaatttttttcgccagtgtcagccagacatcatcgttcatgtcctgggag
ccaatattcactacctgctcgcctttaacgttcgcaatgtccttcagttgcggcaccgcattaaccagatccaatattcactacctgctcgcctttaacgttcgcaatgtccttcagttgcggcaccgcattaaccagat
tttctacgccaactttacccgctgtgtagttagatttggttgcggagtcaccaccaccggcaatggtccctttctacgccaactttacccgctgtgtagttagatttggttgcggagtcaccaccaccggcaatggtccc
gccggttgctaaaatggtgatattgggtaatgccaatgctgcaccactaaaacccataaccagtgcggcagccggttgctaaaatggtgatattgggtaatgccaatgctgcaccactaaaacccataaccagtgcggca
agtgccgtctttttgaaaaactccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagagggagtgccgtctttttgaaaaactccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggg
gaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctgaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcct
ctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgac
atcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtgg
caggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgct
caacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatccccaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatccc
ggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcaggggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagg
gtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttgtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgttt
cccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggacccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcgga
gctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccgctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgcc
acctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactggacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgg
gtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatctgtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatct
tctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaatctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaa
gctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattatttgctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattt
tctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgcttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgct
gttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgc
aatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgc
aaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaataaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaat
gcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagcgcgccattaccgagtccggggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaa
gacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcggacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcg
tggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggttggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggt
gaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatggaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatg
cagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctccagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctc
actcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtggg
cgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcccgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcc
ggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgctt
gcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcggcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcg
agaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggac
ccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagc
gactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaa
gtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctgtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggct
accctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtccaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcc
cgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaa
cccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacaccccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacac
ggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacatta
acgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgacc
acgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcaacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgca
gctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtca
gcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggctgcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggct
taactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagattaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagat
gcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgtgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgt
tcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataactcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataac
gcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgt
ttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaaccc
gacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctggacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctg
ccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgta
ggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccga
ccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggca
gcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcgcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggc
ctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaactaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa
aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcag
cagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt
ggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaataggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaata
caaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatgga
tgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattg
tatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacag
atgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtacatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtac
tcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatattcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatat
cctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgttt
gtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggttt
ggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcatggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcat
aaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgaaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttg
acgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgcacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgc
catcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattcatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtatt
gataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatggataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatg
agcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaag
tgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcatttgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcatt
ttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagt
gttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccggttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccg
tctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaatctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaa
agcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcg
agaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcg
taaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccaatccggatatagtttaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccaatccggatatagtt
cctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcag
cggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtgcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtg
gtgctcgagtgcggccgca</INSDSeq_sequence>gtgctcgagtgcggccgca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"> <SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>1060</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1060</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1060</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1060</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26"> <INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>accatggaatttttcaaaaagacagcactagctgcgctggttatgggtt <INSDSeq_sequence>accatggaatttttcaaaaagacagcactagctgcgctggttatgggtt
tctctggtgcagcattggcccttcccaacattaccatcctggcgacgggtggcaccattgcgggtggcggtctctggtgcagcattggcccttcccaacattaccatcctggcgacgggtggcaccattgcgggtggcgg
tgatagcgcgaccaagtccaattacaccgcggggaaagtcggcgtggagaacctcgtcaacgcggtgccatgatagcgcgaccaagtccaattacaccgcggggaaagtcggcgtggagaacctcgtcaacgcggtgcca
cagctgaaagacatcgcgaacgtgaagggtgaacaggttgtgaacattggtagccaggacatgaatgacgcagctgaaagacatcgcgaacgtgaagggtgaacaggttgtgaacattggtagccaggacatgaatgacg
acgtgtggctcaccctggcgaagaaaatcaacacggactgtgataagaccgacggctttgtgattacccaacgtgtggctcaccctggcgaagaaaatcaacacggactgtgataagaccgacggctttgtgattaccca
cggtactgacacgatggaagagacagcgtatttcctggacctgaccgttaagtgcgataagccggttgttcggtactgacacgatggaagagacagcgtatttcctggacctgaccgttaagtgcgataagccggttgtt
atggttggtgctatgcgtccgagcaccagcatgagcgcggatggtccgttcaacctgtataacgcggttgatggttggtgctatgcgtccgagcaccagcatgagcgcggatggtccgttcaacctgtataacgcggttg
tcaccgcggcagataaagcaagcgccaaccgcggtgttctggtggttatgaacgataccgtgctggacggtcaccgcggcagataaagcaagcgccaaccgcggtgttctggtggttatgaacgataccgtgctggacgg
ccgtgatgttaccaagactaataccaccgacgtggccacatttaaatccgttaactacggtccgctgggtccgtgatgttaccaagactaataccaccgacgtggccacatttaaatccgttaactacggtccgctgggt
tacatccacaacggcaaaattgattatcagcgtaccccggctcgcaaacacacctctgacaccccgttcgtacatccacaacggcaaaattgattatcagcgtaccccggctcgcaaacacacctctgacaccccgttcg
acgttagcaaactgaacgagctgccgaaagtgggcatcgtgtataattacgcaaatgcgtccgacctgccacgttagcaaactgaacgagctgccgaaagtgggcatcgtgtataattacgcaaatgcgtccgacctgcc
ggcaaaggcgttggttgacgcgggctatgatggcattgtgtcagccggcgttggtaatggcaacttatacggcaaaggcgttggttgacgcgggctatgatggcattgtgtcagccggcgttggtaatggcaacttatac
aaaaccgtgtttgataccttggcgacggcggctaagaacggtacggctgtggttcgttctagccgtgtccaaaaccgtgtttgataccttggcgacggcggctaagaacggtacggctgtggttcgttctagccgtgtcc
cgaccggtgccactacgcaagatgccgaagttgatgacgctaagtacggcttcgtggcatcgggcaccttcgaccggtgccactacgcaagatgccgaagttgatgacgctaagtacggcttcgtggcatcgggcacctt
gaatccgcaaaaagcgcgcgtactgctgcagttggctctgacgcagaccaaggatccgcaacaaatccaagaatccgcaaaaagcgcgcgtactgctgcagttggctctgacgcagaccaaggatccgcaacaaatccaa
caaatctttaatcagtactaatagaagctta</INSDSeq_sequence>caaatctttaatcagtactaatagaagctta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13"> <SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28"> <INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtccagcacggtatcgttcat</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cgtccagcacggtatcgttcat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (3)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817891C1 true RU2817891C1 (en) | 2024-04-22 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2224797C2 (en) * | 2002-04-04 | 2004-02-27 | Эльдаров Михаил Анатольевич | Recombinant plasmid dna pacyclans for transfer and expression gene encoding erwinia carotovora (ecar-lans) l-asparaginase in escherichia coli cells and method for preparing recombinant ecar-lans from biomass of escherichia coli producer strains |
| RU2397248C1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармбиотех" | RECOMBINANT PLASMID DNA pL-ASP-08 AND Escherichia coli XL1-blue/pL-ASP-08 BACTERIA STRAIN - L-ASPARAGINASE PRODUCER |
| US20160348085A1 (en) * | 2014-01-10 | 2016-12-01 | Coppe/Ufrj, Instituto Alberto Luiz Coimbra De Pós- Graduação E Pesquisa De Engenharria | Recombinant l-asparaginase from zymomonas |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2224797C2 (en) * | 2002-04-04 | 2004-02-27 | Эльдаров Михаил Анатольевич | Recombinant plasmid dna pacyclans for transfer and expression gene encoding erwinia carotovora (ecar-lans) l-asparaginase in escherichia coli cells and method for preparing recombinant ecar-lans from biomass of escherichia coli producer strains |
| RU2397248C1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Фармбиотех" | RECOMBINANT PLASMID DNA pL-ASP-08 AND Escherichia coli XL1-blue/pL-ASP-08 BACTERIA STRAIN - L-ASPARAGINASE PRODUCER |
| US20160348085A1 (en) * | 2014-01-10 | 2016-12-01 | Coppe/Ufrj, Instituto Alberto Luiz Coimbra De Pós- Graduação E Pesquisa De Engenharria | Recombinant l-asparaginase from zymomonas |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Synthetic construct L-asparaginase II gene, complete cds. Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/KU939135.1?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=NT20P9D1013 Дата обращения 21.11.2023. * |
| база данных GenBank: * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090186380A1 (en) | Method of secretory expression of lysostaphin in escherichia coli at high level | |
| KR20160128362A (en) | Enhanced production of recombinant crm197 in e. coli | |
| JP2009502125A5 (en) | ||
| Szpirer et al. | Separate-component-stabilization system for protein and DNA production without the use of antibiotics | |
| JP5794985B2 (en) | Vector containing mannose promoter and mannose promoter | |
| Gao et al. | Three novel Escherichia coli vectors for convenient and efficient molecular biological manipulations | |
| CN116555233A (en) | Thermostable beta-xylosidase mutant E179GD182G and application thereof | |
| Malekian et al. | High-yield production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in E. coli BL21 (DE3) by an auto-induction strategy | |
| Alishah et al. | Utilizing intein-mediated protein cleaving for purification of uricase, a multimeric enzyme | |
| JP3696247B2 (en) | Process for producing recombinant proteins, plasmids and modified cells | |
| RU2817891C1 (en) | ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE PRODUCER AND EXPRESSION PLASMID pET28a-AsnSYN CODING L-ASPARAGINASE | |
| US11098312B2 (en) | Method of producing a recombinant protein | |
| US20240076705A1 (en) | Lambda-carrageenase mutant ouc-cgla-dpqq and application thereof | |
| KR102546461B1 (en) | Novel bacterial lpp mutants and their use for secretory production of recombinant proteins | |
| JP2010512168A (en) | Improved expression system for recombinant human arginase I | |
| JP2013501511A (en) | Fermentation method | |
| KR20190001934A (en) | Production for functional sweetener | |
| RU2502803C2 (en) | PLASMID FOR EXPRESSION IN CELLS OF BACTERIUM BELONGING TO Escherichia CLASS, NON-ACTIVE PREDECESSOR OF DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEINS; BACTERIUM BELONGING TO Escherichia CLASS, - PRODUCER OF NON-ACTIVE PREDECESSOR OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; PREDECESSOR OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; METHOD FOR OBTAINING RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; METHOD FOR OBTAINING CONJUGATES OF POLYETHYLENE GLYCOL AND RECOMBINANT MUTEIN OF HUMAN DNase I, FERMENTATIVE ACTIVE CONJUGATE OF MUTEIN OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN | |
| RU2697375C2 (en) | Plasmid vector prh15a for producing methionine-free interferon alpha-2b, bacterial strain escherichia coli bl21 de3 - producer of methionine-free interferon alpha-2b and method for producing methionine-free interferon alpha-2b | |
| KR101778878B1 (en) | Highly active GABA-producing glutamate decarboxylase from Bacteroides sp. and use thereof | |
| US20110212508A1 (en) | Novel Synthetic Expression Vehicle | |
| RU2441916C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pACYC-LANS(KM), STRAINS OF Escherichia coli BL21(DE3), TRANSFORMED RECOMBINANT DNA pACYC-LANS(KM) AND METHOD FOR PRODUCING A SUBSTANCE OF THE RECOMBINANT L-ASPARAGINASE FROM Erwinia carotovora | |
| US20240132923A1 (en) | Recombinant microorganism and a method for itaconic acid production | |
| RU2803949C1 (en) | Method for crm197 protein expression | |
| RU2496877C2 (en) | PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN |