RU2496877C2 - PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN - Google Patents
PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN Download PDFInfo
- Publication number
- RU2496877C2 RU2496877C2 RU2011150908/10A RU2011150908A RU2496877C2 RU 2496877 C2 RU2496877 C2 RU 2496877C2 RU 2011150908/10 A RU2011150908/10 A RU 2011150908/10A RU 2011150908 A RU2011150908 A RU 2011150908A RU 2496877 C2 RU2496877 C2 RU 2496877C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- site
- gene
- recombinant protein
- vector
- proteinase
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область изобретения.The scope of the invention.
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой плазмидный вектор с увеличенной сегрегационной стабильностью для экспрессии рекомбинантных белков со слитым в рамке N-концевым лидерным пептидом.The invention relates to the field of biotechnology and genetic engineering and is a plasmid vector with increased segregation stability for the expression of recombinant proteins with a frame-fused N-terminal leader peptide.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Поскольку современные промышленные системы биосинтеза гетерологичных белков в бактериальных клетках предполагают использование сильных индуцируемых промоторов, существенным ограничением их продуктивности является недостаточная сегрегационная стабильность экспрессионных плазмид, то есть заметная вероятность потери бактериальной клеткой всех копий плазмиды при делении. Потеря частью клеток экспрессионной плазмиды и вызванное этим падение продуктивности системы экспрессии особенно заметно при проведении продолжительной индукции целевого гена и при культивации штамма-продуцента при недостаточной концентрации (или полного отсутствия) в среде селективного антибиотика.Since modern industrial systems for the biosynthesis of heterologous proteins in bacterial cells involve the use of strong inducible promoters, a significant limitation of their productivity is the insufficient segregation stability of expression plasmids, i.e., there is a noticeable probability of a bacterial cell losing all copies of the plasmid during division. The loss of the expression plasmid by a part of the cells and the resulting decrease in the productivity of the expression system is especially noticeable during prolonged induction of the target gene and during cultivation of the producer strain with insufficient concentration (or complete absence) in the selective antibiotic medium.
Для повышения сегрегационной стабильности плазмид Е.coli был разработан ряд векторов, включающих системы «позитивной селекции», основанные на нарушении образования цитотоксического продукта при встраивании целевого фрагмента - MCS в области SacB [Pierce, J. С., В. Sauer, et al. (1992). "A positive selection vector for cloning high molecular weight DNA by the bacteriophage P1 system: improved cloning efficacy." Proc Natl Acad Sci USA 89(6): 2056-2060], gpE фага ФХ174 [Henrich, B. and R. Plapp (1986). "Use of the lysis gene of bacteriophage phi X174 for the construction of a positive selection vector." Gene 42(3): 345-349], pKG2 плазмида, несущая расщепляющую геномную ДНК рестриктазу под контролем LacUV5 промотора [Kuhn, I., F. H. Stephenson, et al. (1986). "Positive-selection vectors utilizing lethality of the EcoRI endonuclease." Gene 42(3): 253-263], CcdB и Kid [Bernard, P. and M. Couturier (1991). "The 41 carboxy-terminal residues of the miniF plasmid CcdA protein are sufficient to antagonize the killer activity of the CcdB protein." Mol Gen Genet 226(1-2): 297-304; [Gabant, P., T. Van Reeth, et al. (2000). "New positive selection system based on the parD (kis/kid) system of the R1 plasmid." Biotechniques 28(4): 784-788; патенты США 6180407, 7176029, 5910438 (Universite Libre de Bruxelles)]. Такие системы не могут быть использованы в высококопийных плазмидах из-за невозможности полностью подавить образование токсического продукта. Кроме того, плазмидные векторы, содержащие вышеуказанные гены и генетические локусы, пригодны для трансформации только специальных, совместимых с ними, штаммов Е.coli и содержат протяженные участки активно транскрибируемой нецелевой ДНК, уменьшающие продуктивность системы биосинтеза гетерологичных белков.To increase the segregation stability of E. coli plasmids, a number of vectors have been developed, including “positive selection” systems based on the disruption of the formation of the cytotoxic product upon insertion of the target fragment — MCS in the SacB region [Pierce, J. C., B. Sauer, et al. (1992). "A positive selection vector for cloning high molecular weight DNA by the bacteriophage P1 system: improved cloning efficacy." Proc Natl Acad Sci USA 89 (6): 2056-2060], gpE phage ФХ174 [Henrich, B. and R. Plapp (1986). "Use of the lysis gene of bacteriophage phi X174 for the construction of a positive selection vector." Gene 42 (3): 345-349], a pKG2 plasmid carrying a genomic DNA digesting restriction enzyme under the control of the LacUV5 promoter [Kuhn, I., F. H. Stephenson, et al. (1986). "Positive-selection vectors utilizing lethality of the EcoRI endonuclease." Gene 42 (3): 253-263], CcdB and Kid [Bernard, P. and M. Couturier (1991). "The 41 carboxy-terminal residues of the miniF plasmid CcdA protein are sufficient to antagonize the killer activity of the CcdB protein." Mol Gen Genet 226 (1-2): 297-304; [Gabant, P., T. Van Reeth, et al. (2000). "New positive selection system based on the parD (kis / kid) system of the R1 plasmid." Biotechniques 28 (4): 784-788; U.S. Patents 6,180,407, 7,176,029, 5,910,438 (Universite Libre de Bruxelles)]. Such systems cannot be used in high-copy plasmids due to the inability to completely suppress the formation of a toxic product. In addition, plasmid vectors containing the above genes and genetic loci are suitable for transformation of only special, compatible with them, strains of E. coli and contain extended sections of actively transcribed non-targeted DNA, which reduce the productivity of the heterologous protein biosynthesis system.
Другой, более пригодный для промышленного использования, тип систем сегрегационной стабилизации плазмид представляет собой пару транскрибируемых генов, кодируемых плазмидой - ген токсичного для клетки белка со стабильной мРНК и ген специфического антитоксина с нестабильной мРНК. Общие сведения о таких системах "токсин-антитоксин" приведены в работе Cooper Т, Paixao Т, Heinemaim JA. (Within-host competition selects for plasmid-encoded toxin-antitoxin systems, Proc. R. Soc. В October 22, 2010 277:3149-3155).Another, more suitable for industrial use, type of segregation stabilization systems of plasmids is a pair of transcribed genes encoded by a plasmid - a gene of a cell-toxic protein with stable mRNA and a specific antitoxin gene with unstable mRNA. General information about such toxin-antitoxin systems is provided by Cooper T, Paixao T, Heinemaim JA. (Within-host competition selects for plasmid-encoded toxin-antitoxin systems, Proc. R. Soc. On October 22, 2010 277: 3149-3155).
Среди систем токсин-антитоксин наибольший практический интерес представляет генетический локус Hok/Sok (другое название - parB) природной плазмиды Е.coli R1.Among the toxin-antitoxin systems, the Hok / Sok genetic locus (also known as parB) of the natural E. coli R1 plasmid is of most practical interest.
Локус Hok/Sok, впервые описанный в работе (The parB (hok/sok) Locus of Plasmid R1: A General Purpose Plasmid Stabilization System. Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988)); состоит из гена hok, который кодирует 52 аминокислотный токсин, вызывающий диссипацию мембранного потенциала (механизм аналогичен действию белков лизиса бактериофагов - холинов (holin - от hole «дыра»), которые встраиваются в мембрану и образуют поры). Второй ген фрагмента - sok не имеет полипептидного продукта. Он кодирует лабильные антисмысловые РНК, препятствующие трансляции гена hok. Механизм процесса направленного блокирования работы гена hok описан в работе [Thisted Т, Sorensen NS, Gerdes K (1995). "Mechanism of post-segregational killing: secondary structure analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a fold-back structure that prevents translation and antisense RNA binding". J. Mol. Biol. 247 (5): 859-73. PMID 7536849].Hok / Sok locus first described in (The parB (hok / sok) Locus of Plasmid R1: A General Purpose Plasmid Stabilization System. Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988)); consists of the hok gene, which encodes a 52 amino acid toxin that causes dissipation of the membrane potential (the mechanism is similar to the action of bacteriophage lysis proteins - cholins (holin - from the hole “hole”), which are embedded in the membrane and form pores). The second gene of the fragment, sok, does not have a polypeptide product. It encodes labile antisense RNAs that inhibit hok gene translation. The mechanism of the process of directed blocking of the hok gene is described in [Thisted T, Sorensen NS, Gerdes K (1995). "Mechanism of post-segregational killing: secondary structure analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a fold-back structure that prevents translation and antisense RNA binding." J. Mol. Biol. 247 (5): 859-73. PMID 7536849].
При делении клеток Е.coli и потере дочерней клеткой всех копий несущей локус Hok/Sok плазмиды в нее переходит долгоживущий белковый токсин Hok и его РНК, а также короткоживущие антитоксические РНК Sok, которые быстро деградируют, после чего клетка погибает. Некоторые штаммы Е.coli могут быть более устойчивы к токсическому действию Hok, чем другие, из-за присутствия в их геноме локусов, гомологичных Hok/Sok (PMID: 10361310). Вероятность гибели клеток, потерявших плазмиду, также зависит от исходной копийности плазмиды с локусом Hok/Sok и может зависеть от положения и ориентации локуса Hok/Sok относительно других транскрипционно активных участков плазмиды.When E. coli cells divide and the daughter cell loses all copies of the Hok / Sok locus-bearing plasmid, the long-lived protein toxin Hok and its RNA, as well as short-lived Sok antitoxic RNAs, which quickly degrade, then die, and the cell dies. Some E. coli strains may be more resistant to the toxic effects of Hok than others, due to the presence of loci homologous to Hok / Sok in their genome (PMID: 10361310). The probability of death of cells that have lost the plasmid also depends on the initial copy number of the plasmid with the Hok / Sok locus and may depend on the position and orientation of the Hok / Sok locus relative to other transcriptionally active plasmid sites.
В ряде работ было описано применение локуса Hok/Sok для повышения сегрегационной стабильности плазмид, кодирующих гетерологичные белки, в том числе под сильным индуцируемым промотором (патент США 6413768), однако оптимальная копийность такой стабилизированной плазмиды и оптимальное положение локуса Hok/Sok относительно других участков векторной плазмиды, получаемой в ходе настоящей работы, оставалось неизвестным.A number of studies have described the use of the Hok / Sok locus to increase the segregation stability of plasmids encoding heterologous proteins, including under the strong inducible promoter (US patent 6413768), however, the optimal copy number of such a stabilized plasmid and the optimal position of the Hok / Sok locus relative to other parts of the vector the plasmid obtained in the course of this work remained unknown.
Важной стадией получения рекомбинантных белков является метод их очистки. Аффинная хроматография является одним из наиболее селективных методов очистки белков. Одна ступень аффинной очистки позволяет уменьшить уровень примесей в растворе целевого белка в тысячи раз. Стандартным методом аффинной очистки белков является применение сорбентов с ковалентно иммобилизованными антителами к очищаемому белку или искусственно добавленным к последовательности целевого белка специальным эпитопам антител - тэгам. Примерами таких эпитопов, к которым были получены коммерчески доступные моноклональные антитела, являются FLAG (Einhauer, A. and Jungbauer, A. (2001) The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. Biochem. Biophys. Methods 49, 455-465) и с-myc (Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cell Biol. 1985 Dec; 5(12):3610-6.).An important step in the preparation of recombinant proteins is the method of purification. Affinity chromatography is one of the most selective methods for protein purification. One step of affinity purification allows to reduce the level of impurities in the solution of the target protein in thousands of times. The standard method for the affinity purification of proteins is the use of sorbents with covalently immobilized antibodies to the protein to be purified or special antibody epitopes artificially added to the sequence of the target protein - tags. Examples of such epitopes to which commercially available monoclonal antibodies have been prepared are FLAG (Einhauer, A. and Jungbauer, A. (2001) The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. Biochem. Biophys.
Аффинная хроматография с использованием иммобилизованных антител или других иммобилизованных белков, способных образовывать прочные комплексы с белками-лигандами, имеет ряд существенных ограничений, препятствующих ее использованию при промышленном получении рекомбинантных белков в микробиологических системах экспрессии. Основным ограничением является высокая стоимость самих антител или других чистых белков и низкая стабильность полученных на их основе сорбентов. Также существенными ограничениями являются: невозможность регенерации и дезинфицирования сорбентов раствором гидроксида натрия, невозможность вести очистку денатурированных и восстановленных целевых белков, утечка иммуногенного лиганда, необходимость вести элюцию целевых белков кислыми или щелочными растворами.Affinity chromatography using immobilized antibodies or other immobilized proteins capable of forming strong complexes with ligand proteins has a number of significant limitations that impede its use in the industrial production of recombinant proteins in microbiological expression systems. The main limitation is the high cost of the antibodies themselves or other pure proteins and the low stability of the sorbents obtained on their basis. Significant limitations include: the inability to regenerate and disinfect sorbents with sodium hydroxide solution, the inability to purify denatured and reduced target proteins, the leak of an immunogenic ligand, the need to elute target proteins with acidic or alkaline solutions.
Некоторые недостатки обычных вариантов аффинной хроматографии могут быть преодолены путем дериватизации поверхности хроматографического сорбента малыми химическими молекулами - лигандами белков, которые, в свою очередь, являются частью слитного с целевым белка и отделяются от целевого белка после аффинной очистки обработкой сайт-специфическими протеиназами. Такие сорбенты во многих случаях недороги в производстве и выдерживают обработку раствором гидроксида натрия. Типичные примеры систем - белок, связывающий мальтозу (maltose binding protein, MBP), глютатион-S-трансфераза (GST), белок, связывающий кальмодулин (calmodulin binding protein, CBP), strep II (STR). Прямое сравнение применимости данных систем для очистки слитных белков приведено в работе (Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif. 2005 May; 41(1):98-105). Системы аффинной очистки из данной группы обладают двумя существенными и неустранимыми недостатками - неизбежным загрязнением целевого белка нерасщепленным слитным белком, содержащим иммуногенные белки-партнеры и падением продуктивности системы экспрессии из-за необходимости вести биосинтез больших количеств белка-партнера.Some of the drawbacks of conventional affinity chromatography options can be overcome by derivatizing the surface of the chromatographic sorbent with small chemical molecules - protein ligands, which, in turn, are part of the fusion protein with the target protein and are separated from the target protein after affinity purification by treatment with site-specific proteinases. In many cases, such sorbents are inexpensive to manufacture and can withstand treatment with sodium hydroxide solution. Typical examples of systems are maltose binding protein (MBP), glutathione S-transferase (GST), calmodulin binding protein (CBP), strep II (STR). A direct comparison of the applicability of these systems for purification of fusion proteins is given in (Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif. 2005 May; 41 (1): 98-105). Affinity purification systems from this group have two significant and irreparable disadvantages - the inevitable contamination of the target protein with an unsplit fusion protein containing immunogenic partner proteins and a decrease in the expression system productivity due to the need for biosynthesis of large amounts of the partner protein.
Единственным распространенным методом аффинной хроматографии, пригодным для разделения денатурированных белков, содержащих только короткий тэг, является металлохелатная хроматография. (металлоаффинная хроматография, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC), основанная на образовании координационных устойчивых комплексов между ионом переходного металла, координированного привитым к поверхности сорбента хелатирующим агентом, и двумя-тремя близкорасположенными остатками гистидина в составе очищаемого белка. (Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 1975 Dec 18; 258(5536):598-9; Gaberc-Porekar V, Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2001 Oct 30;49(1-3):335-60). При проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях сближение в пространстве остатков гистидина (или других аминокислот - доноров электронов), расположенных в различных местах полипептидной цепи, становится затруднительным и высокое сродство к сорбенту проявляют только белки, имеющие в своем составе искусственно созданные олигогистидиновые кластеры в составе тэгов.The only common affinity chromatography method suitable for separating denatured proteins containing only a short tag is metal chelate chromatography. (metal affinity chromatography, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC), based on the formation of coordination stable complexes between a transition metal ion coordinated by a chelating agent grafted to the surface of the sorbent and two or three closely spaced histidine residues in the composition of the protein to be purified. (Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 1975 Dec 18; 258 (5536): 598-9; Gaberc-Porekar V, Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2001 Oct 30; 49 (1-3): 335-60). When conducting metal chelate chromatography under denaturing conditions, the convergence in space of histidine residues (or other amino acids - electron donors) located in different places of the polypeptide chain becomes difficult and only proteins with artificially created oligohistidine clusters in the composition of the tags exhibit high affinity for the sorbent .
Стандартным лигандом для металлохелатной хроматографии является пептид 6xHis (гексагистидиновый кластер), описанный в патенте США 4,569,794. Наиболее распространенный тип сорбента для металлохелатной хроматографии представляет собой иммобилизованные на поверхности декстрановых сферических гранул химические группы иминодиуксусной кислоты (IDA), другие коммерчески доступные сорбенты используют группы нитрилотриуксусной кислоты (NTA) или карбоксиметиласпартата.The standard ligand for metal chelate chromatography is the 6xHis peptide (hexahistidine cluster) described in US Pat. No. 4,569,794. The most common type of sorbent for metal chelate chromatography is iminodiacetic acid (IDA) chemical groups immobilized on the surface of dextran spherical granules, other commercially available sorbents use nitrilotriacetic acid (NTA) or carboxymethylaspartate groups.
Поскольку сверхэкспрессия гетерологичных белков в клетках Е.coli в большинстве случаев приводит к накоплению целевого белка в цитоплазме бактерий в нерастворимой форме и присутствию в составе целевого белка по крайней мере одного дополнительного N-концевого аминокислотного остатка, унифицированный набор методов биосинтеза, выделения, первичной очистки и ферментативного процессинга рекомбинантных белков медицинского применения, минимально зависящих от природы целевого белка (так называемая технологическая платформа) представляет большой практический интерес.Since overexpression of heterologous proteins in E. coli cells in most cases leads to the accumulation of the target protein in the bacterial cytoplasm in an insoluble form and the presence of at least one additional N-terminal amino acid residue in the target protein, a unified set of methods for biosynthesis, isolation, primary purification and enzymatic processing of recombinant proteins of medical use, minimally dependent on the nature of the target protein (the so-called technological platform) is more shoy practical interest.
Предпочтительным вариантом реализации такой технологической платформы является применение короткого N-концевого тэга для аффинной очистки целевого белка в денатурирующих условиях и последующее отделение такого тэга от целевого белка при помощи рекомбинантной сайт-специфической протеиназы человека, то есть протеиназы, обладающей минимальной иммуногенностью. Примером такой протеиназы является фермент пищеварительного тракта энтерокиназа, а точнее ее легкая цепь, расщепляющая полипептидную цепь после сайта узнавания Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- и перед любым аминокислотным остатком, кроме остатка пролина. В то же время, расположение кластера отрицательно заряженных аминокислотных остатков сайта узнавания энтерокиназы вблизи олигогистидинового кластера приводит к ослаблению взаимодействия олигогистидинового кластера с металлохелатным сорбентом.The preferred embodiment of such a technological platform is the use of a short N-terminal tag for affinity purification of the target protein under denaturing conditions and the subsequent separation of such a tag from the target protein using recombinant human site-specific proteinase, i.e., a proteinase with minimal immunogenicity. An example of such a proteinase is the digestive tract enzyme enterokinase, or rather its light chain, which cleaves the polypeptide chain after the Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- recognition site and before any amino acid residue except the proline residue. At the same time, the location of the cluster of negatively charged amino acid residues of the enterokinase recognition site near the oligo-histidine cluster leads to a weakening of the interaction of the oligo-histidine cluster with the metal chelate sorbent.
В литературе описан ряд вариантов олигогистидиновых кластеров, обеспечивающих более плотное связывание очищаемых белков с поверхностью металлохелатного сорбента, чем первоначально описанный кластер 6xHis. В частности, относительно высокой аффинностью обладают кластеры, включающие 6-14 остатков гистидина, перемежающихся остатками заряженных или гидрофобных аминокислот и описанные в патентных заявках США 20100286070 и 20060030007. Существенным недостатком данных кластеров, а особенно их наиболее протяженных вариантов является появление в кодирующих эти кластеры плазмидных ДНК прямых повторов, уменьшающих стабильность плазмид. Другой известной альтернативой кластеру 6xHis является кластер MAT с последовательностью HNHRHKH, включающий положительно заряженные аминокислоты и описанный в патентной заявке США 20060257927, однако его аффинность к металлохелатным сорбентам при расположении вблизи кластера отрицательно заряженных аминокислот и проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях неизвестна.A number of variants of oligohistidine clusters are described in the literature, providing a more tight binding of the purified proteins to the surface of the metal chelate sorbent than the originally described 6xHis cluster. In particular, clusters comprising 6-14 histidine residues interspersed with charged or hydrophobic amino acid residues and described in US patent applications 20100286070 and 20060030007 have relatively high affinity. A significant drawback of these clusters, and especially their most extended variants, is the appearance of plasmid coding for these clusters DNA direct repeats that reduce plasmid stability. Another well-known alternative to the 6xHis cluster is the MAT cluster with the HNHRHKH sequence, including positively charged amino acids and described in US patent application 20060257927, however, its affinity for metal chelating sorbents when negatively charged amino acids are located near the cluster and metal chelate chromatography is carried out under denaturing conditions.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка высокоэффективного экспрессионного вектора, обеспечивающего повышенную по сравнению с традиционно используемой копийность вектора при одновременной повышенной сегрегационной устойчивости при продолжительной индукции, позволяющей увеличить уровень продукции целевого белка путем проведения продуктивной индукции целевого гена в течение большего времени и начала индукции при более высокой плотности культуры, чем в общепринятых системах.The technical problem solved by the authors of the present invention was the development of a highly efficient expression vector that provides increased copying of the vector compared to the traditionally used vector with simultaneous increased segregation resistance with prolonged induction, which allows to increase the level of production of the target protein by conducting productive induction of the target gene for a longer time and start induction at a higher density of culture than in conventional systems.
Другой технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлось использование указанного выше вектора для экспрессии рекомбинантных белков, слитых в рамке с коротким N-концевым пептидом, с последующим обеспечением высокой эффективности очистки слитного белка методом металлохелатной хроматографии и последующим контролируемым отделением всех аминокислот указанного пептида сайт-специфичной протеиназой.Another technical problem solved by the authors of the present invention was the use of the above vector for the expression of recombinant proteins fused in a frame with a short N-terminal peptide, followed by ensuring high efficiency of fusion protein purification by metal chelate chromatography and subsequent controlled separation of all amino acids of the indicated peptide specific proteinase.
Еще одной технической задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось определение минимальной длины олигогистидинового кластера, располагаемого в полипептидной цепи вблизи кластера отрицательно заряженных аминокислот и обладающего высокой аффинностью к металлохелатному сорбенту на основе хелатирующих групп иминодиуксусной кислоты при проведении хроматографии в денатурирующих условиях.Another technical problem to be solved within the framework of the present invention was to determine the minimum length of an oligohistidine cluster located in a polypeptide chain near a cluster of negatively charged amino acids and having high affinity for a metal chelate sorbent based on chelating iminodiacetic acid groups during chromatography under denaturing conditions.
Технический результат достигался за счет создания плазмидного вектора на основе плазмиды рЕТ28а, содержащего делецию области элемента ограничения копийности (ROP), замену области, кодирующей дополнительный N-концевой пептид на область, кодирующую более эффективный пептид 10Е, содержащий 10 остатков гистидина и сайт узнавания энтерокиназы, а также содержащий элемент сегрегационной стабильности Hok/Sok, расположенный по ходу транскрипции целевого гена после терминатора транскрипции целевого гена и ориентированный таким образом, что направление транскрипции гена sok совпадает с направлением транскрипции целевого гена.The technical result was achieved by creating a plasmid vector based on the pET28a plasmid containing a deletion of the region of the copying restriction element (ROP), replacing the region encoding the additional N-terminal peptide with a region encoding a more effective 10E peptide containing 10 histidine residues and an enterokinase recognition site, and also containing an element of segregation stability Hok / Sok located along the transcription of the target gene after the terminator of transcription of the target gene and oriented in such a way that it is directed e sok gene transcription coincides with the direction of transcription of the target gene.
Вектор содержит следующие элементы, перечисленные в порядке расположения:The vector contains the following elements listed in order:
pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды;pBR322 ori — plasmid replication initiation site;
lacI - ген репрессора лактозного оперона;lacI - lactose operon repressor gene;
промотор;promoter;
N-leader - область, кодирующая N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;N-leader is a region encoding an N-terminal leader peptide containing a decagystidine cluster and, optionally, a proteinase recognition site;
участок клонирования (полилинкер);cloning site (polylinker);
участок терминации транскрипции;transcription termination site;
фрагмент, кодирующий негеномную пару токсин-антитоксин - генетический элемент, обеспечивающий сегрегационную стабильность; иa fragment encoding a non-genomic toxin-antitoxin pair - a genetic element that provides segregation stability; and
ген, кодирующий маркер селекции.gene encoding a selection marker.
Элементы вектора перечислены в порядке их расположения. Порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы вектора.Elements of the vector are listed in the order of their arrangement. The arrangement of functional elements is essential for the effective operation of the vector.
Промотором может быть любой сильный конститутивный или индуцибельный промотор, функционирующий в бактериальной клетке, например промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, PL, Ptac, но не ограничивается ими. Промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 является предпочтительным.The promoter can be any strong constitutive or inducible promoter that functions in a bacterial cell, for example, but not limited to the promoter of the bacteriophage T7 RNA polymerase, P L , P tac . A bacteriophage T7 RNA polymerase promoter is preferred.
N-leader - это область, кодирующая N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой.An N-leader is a region encoding an N-terminal leader peptide containing a decagystidine cluster and, optionally, a proteinase recognition site.
Наличие декагистидинового кластера позволяет проводить металлохелатную хроматографию предшественника целевого рекомбинантного белка.The presence of a decahistidine cluster allows metallo-chelate chromatography of the precursor of the target recombinant protein.
Наличие сайта протеиназы в N-концевом лидерном пептиде предшественника целевого рекомбинантного белка является необходимым. Указанный сайт позволяет проводить отделение N-концевого лидерного пептида. Однако наличие фрагмента, кодирующего сайт узнавания протеиназой, в описанном выше векторе не является обязательным. Указанный фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, может быть внедрен в конструкцию для экспрессии предшественника целевого белка вместе с открытой рамкой считывания (ОРС) целевого белка. Для этого используют адапторные праймеры, один из которых содержит подходящий сайт рестрикции для клонирования, фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, расположенный в одной рамке считывания рядом с первой аминокислотой целевого белка, либо непосредственно перед ней, и участок, идентичный 5′-области ОРС целевого белка; а второй праймер содержит подходящий сайт рестрикции для клонирования, и участок, комплементарный 3′-области ОРС целевого белка. Фрагмент ДНК, содержащий фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, и ОРС целевого белка, может быть получен методом ПЦР с использованием описанных выше адапторных праймеров.The presence of a proteinase site in the N-terminal leader peptide of the target recombinant protein precursor is necessary. This site allows the separation of the N-terminal leader peptide. However, the presence of a fragment encoding a proteinase recognition site in the vector described above is not necessary. Said fragment encoding a proteinase recognition site can be incorporated into a construct for expressing a target protein precursor together with an open reading frame (OPC) of the target protein. For this, adapter primers are used, one of which contains a suitable restriction site for cloning, a fragment encoding a proteinase recognition site located in the same reading frame next to the first amino acid of the target protein, or directly in front of it, and a portion identical to the 5′-region of the OPC target squirrel; and the second primer contains a suitable restriction site for cloning, and a plot complementary to the 3′-region of the OPC of the target protein. A DNA fragment containing a fragment encoding a proteinase recognition site and an OPC of a target protein can be obtained by PCR using the adapter primers described above.
Дизайн таких адапторных праймеров для конкретного целевого гена является рутинной процедурой и специалист в данной области техники с легкостью может сконструировать и синтезировать подобные праймеры.The design of such adapter primers for a particular target gene is a routine procedure and one skilled in the art can easily design and synthesize such primers.
В случае, когда фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, находится в описанном выше векторе (в области N-leader), OPC целевого белка лигируют в указанный вектор так, чтобы N-leader и OPC были в одной рамке считывания. Экспрессия гена целевого белка в полученной плазмиде приводит к образованию предшественника, расщепление которого протеиназой приводит к образованию целевого белка, содержащего несколько дополнительных аминокислот на N-конце.In the case where the fragment encoding the proteinase recognition site is in the vector described above (in the N-leader region), the OPCs of the target protein are ligated into the indicated vector so that the N-leader and OPC are in the same reading frame. Gene expression of the target protein in the resulting plasmid leads to the formation of a precursor, cleavage of which by the proteinase leads to the formation of the target protein containing several additional amino acids at the N-terminus.
В случае, когда фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, расположенный непосредственно перед первой аминокислотой целевого белка, лигируют в составе фрагмента, содержащего OPC целевого белка и полученного с использованием адапторных праймеров как описано выше, экспрессия гена целевого белка в полученной плазмиде приводит к образованию предшественника, расщепление которого протеиназой приводит к образованию целевого белка, не содержащего никаких дополнительных аминокислот на N-конце. Подобный подход позволяет получать нативные целевые белки, которые могут быть использованы для терапевтических целей.In the case where the fragment encoding the proteinase recognition site located immediately before the first amino acid of the target protein is ligated in the fragment containing the OPC of the target protein and obtained using adapter primers as described above, expression of the target protein gene in the resulting plasmid leads to the formation of a precursor, cleavage of which by proteinase leads to the formation of the target protein that does not contain any additional amino acids at the N-terminus. This approach allows you to get native target proteins that can be used for therapeutic purposes.
В качестве специфической протеиназы, используемой для отщепления лидерного пептида от полученного гибридного белка после его очистки методом металлохелатной хроматографии, может быть использована энетерокиназа человека, энтерокиназа крупного рогатого скота, специфические протеиназы человека тромбин, фактор Ха, специфическая протеиназа вируса гравировки табака TEV, спцифическая протеиназа риновируса человека HRV3C (для продукции терапевтических белков предпочтительно использовать специфические протеиназы человека, так как примеси гетерологичных белков в терапевтическом белке будут иммуногенны). Однако специфические протеиназы не ограничиваются только указанными протеиназами.As a specific proteinase used for cleavage of the leader peptide from the obtained hybrid protein after its purification by metal chelate chromatography, human enterokinase, cattle enterokinase, human specific thrombin proteinases, factor XA, specific protein engraving of the TEV tobacco engraving virus, specific rhinovirus proteinase can be used. human HRV3C (for the production of therapeutic proteins, it is preferable to use specific human proteinases, since the theologous proteins in the therapeutic protein will be immunogenic). However, specific proteinases are not limited to these proteinases.
Участком терминации транскрипции может быть участок терминации транскрипции бактериофага Т7 (T7term), участки терминации транскрипции Е.coli rrnC, rrnBt1 и rrnBt2, последовательность вируса везикулярного стоматита VSV, гена препропаратиреоидного гормона человека (РТН)), но не ограничивается ими. Участок терминации транскрипции бактериофага Т7 (T7term) является предпочтительным.The transcription termination site may include the T7 bacteriophage transcription termination site (T7term), E. coli rrnC, rrnBt1 and rrnBt2 transcription termination sites, the sequence of the vesicular stomatitis virus VSV, the human preproparathyroid hormone (PTH) gene, but not limited to them. The T7 bacteriophage transcription termination site (T7term) is preferred.
Примерами негеномных пар токсин-антитоксин является система hok/sok стабилизирующая плазмиду R1 в Е.coli, система FlmA/FlmB, гомолог hok/sok, стабилизирующая плазмиду F в Е.coli, и подобные им. Система hok/sok является предпочтительной.Examples of non-genomic toxin-antitoxin pairs are the hok / sok system stabilizing the R1 plasmid in E. coli, the FlmA / FlmB system, the hok / sok homolog stabilizing the plasmid F in E. coli, and the like. A hok / sok system is preferred.
В качестве маркера селекции может использоваться ген устойчивости к антибиотику, например, канамицину, ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, но не ограничивается ими. Ген устойчивости к канамицину является предпочтительным.As a selection marker, an antibiotic resistance gene can be used, for example, but not limited to kanamycin, ampicillin, tetracycline, chloramphenicol. The kanamycin resistance gene is preferred.
Конкретным воплощением вектора согласно настоящему изобретению является вектор pHYP, в котором указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, участком терминации транскрипции является участок терминации транскрипции бактериофага Т7, сайт узнавания специфической протеиназы представляет собой сайт узнавания энтерокиназы, а геном, кодирующим селекционный маркер, является ген устойчивости к канамицину.A specific embodiment of the vector according to the present invention is a pHYP vector in which the promoter is a T7 bacteriophage RNA polymerase promoter, the transcription termination site is the T7 bacteriophage transcription termination site, the specific proteinase recognition site is an enterokinase recognition site, and the gene encoding the selection marker is kanamycin resistance gene.
Вектор состоит из 5151 по и содержит уникальные (то есть единственные) сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: XhoI (529), HindIII (544), NheI (602).The vector consists of 5151 po and contains unique (i.e. the only) recognition sites for restriction endonucleases: XhoI (529), HindIII (544), NheI (602).
Функциональная схема вектора с указанием координат функциональных элементов представлена на Фиг.9, а полная нуклеотидная последовательность этого вектора представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:40. Вектор был получен с использованием стандартных методов генной инженерии и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].The functional diagram of the vector indicating the coordinates of the functional elements is shown in Fig. 9, and the complete nucleotide sequence of this vector is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 40. The vector was obtained using standard genetic engineering methods and chemically synthesized oligonucleotides [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].
При помощи созданного вектора можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащей к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанным вектором. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники.Using the created vector, it is possible to transform a bacterial cell, preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia, susceptible to such a transformation by the specified vector. The choice of a particular cell is not critical, since the methodology and methods of transformation are well known to those skilled in the art.
«Трансформация клетки вектором» означает введение вектора в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995)."Transformation of a cell by a vector" means the introduction of a vector into a cell using methods well known to those skilled in the art. Transformation with this plasmid leads to the expression of the gene encoding the protein and to the synthesis of the protein in the bacterial cell. Transformation methods include any standard methods known to one skilled in the art, for example, the method described in Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).
Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка - продуцент предшественника рекомбинантного белка» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению предшественника рекомбинантного белка, содержащего декагистидиновый кластер и сайт узнавания энтерокиназы, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Указанный предшественник рекомбинантного белка может накапливаться в указанной клетке предпочтительно в виде телец включения.According to the present invention, “bacterial cell producing a recombinant protein precursor” means a bacterial cell having the ability to produce and accumulate a recombinant protein precursor containing a decagystidine cluster and an enterokinase recognition site when the bacterial cell of the present invention is grown in the specified nutrient medium. The specified recombinant protein precursor can accumulate in the specified cell, preferably in the form of inclusion bodies.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" may mean that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be given as examples.
Конкретным примером штамма - реципиента согласно настоящему изобретению является штамм Escherichia coli BL21[DE3], но круг подходящих штаммов не ограничивается им.A specific example of a recipient strain of the present invention is Escherichia coli strain BL21 [DE3], but the range of suitable strains is not limited thereto.
Способ согласно настоящему изобретению включает культивирование в подходящей питательной среде бактерии, содержащей описанный выше вектор, содержащий целевой ген, кодирующий целевой рекомбинантный белок, слитый с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой человека; очистку слитного белка методом металлохелатной хроматографии; и отделение пептида от целевого рекомбинантного белка с использованием сайт-специфичной протеиназы человека.The method according to the present invention includes cultivating in a suitable nutrient medium a bacterium containing the vector described above containing the target gene encoding the target recombinant protein fused to the N-terminal peptide containing the decagystidine cluster and a human proteinase recognition site; purification of fusion protein by metal chelate chromatography; and separating the peptide from the target recombinant protein using a site-specific human proteinase.
Особенности полученного вектора, экспрессионных плазмид на его основе, промежуточных плазмид и результаты их практического применения приведены на следующих Фигурах.Features of the obtained vector, expression plasmids based on it, intermediate plasmids and the results of their practical application are shown in the following Figures.
Краткое описание ФигурShort Description of Shapes
На Фигуре 1 показана схема получения плазмид р6Е, р8Е, рМЕ, p10E, p10E-HU, р10Е-HD, p10E-HDR, p10Erop-, p10E-HUrop-, pHYP, p10E-HDRrop-. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, эндонуклеазы рестрикции, использовавшиеся для клонирования указаны под названием плазмид, HS-PCR - продукт ПЦР, кодирующий участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli.The Figure 1 shows the scheme for obtaining plasmids p6E, p8E, pME, p10E, p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR, p10Erop - , p10E-HUrop - , pHYP, p10E-HDRrop - . Designations: the dashed line indicates the PCR stages, the solid line indicates the restriction-ligation stages, the restriction endonucleases used for cloning are indicated as plasmids, HS-PCR is the PCR product encoding the hok / sok (host killing / suppressor of killing) region of the natural plasmid R1 Escherichia coli.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды р10Е. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 2 shows a map of the expression plasmid p10E. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "ROP" - gene of the RNA-organizing protein Rop; "F1 ori" is the site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "N-leader" is an open reading frame (OPC) of the N-terminal leader containing a decahystidine cluster. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HU. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3′-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 3 shows a map of the expression plasmid p10E-HU. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "ROP" - gene of the RNA-organizing protein Rop; "F1 ori" is the site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3′-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "N-leader" is an open reading frame (OPC) of the N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HD. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 4 shows a map of the expression plasmid p10E-HD. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "ROP" - gene of the RNA-organizing protein Rop; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; “N-leader” is an open reading frame (OPC) of an N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HDR. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «laci»-последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 5 shows a map of the expression plasmid p10E-HDR. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "ROP" - gene of the RNA-organizing protein Rop; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "Laci" is a sequence encoding a repressor of a lactose operon; “N-leader” is an open reading frame (OPC) of an N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды p10Erop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI»-последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 6 shows a map of the expression plasmid p10Erop-. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is a sequence encoding a repressor of a lactose operon; “N-leader” is an open reading frame (OPC) of an N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 7 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HUrop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 7 shows a map of the expression plasmid p10E-HUrop-. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "N-leader" is an open reading frame (OPC) of the N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 8 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HDrop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 8 shows a map of the expression plasmid p10E-HDrop-. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "N-leader" is an open reading frame (OPC) of the N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 9 показана карта экспрессионной плазмиды pHYP. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 9 shows a map of the expression plasmid pHYP. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "N-leader" is an open reading frame (OPC) of the N-terminal leader containing a decahystidine cluster. Hok / Sok - plot hok / sok (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli; Hok is a product of the hok gene (toxin), Sok is a product of the sok gene. The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.
На Фигуре 10 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP+ плазмиды после 8 и 24 ч индукции 2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 7-12, приведены доверительные интервалы для р=0,05.The Figure 10 presents the results of measuring the proportion of cells containing ROP + plasmids after 8 and 24 hours of induction of 2 mm IPTG. The number of independent experiments is 7-12; confidence intervals for p = 0.05 are given.
На Фигуре 11 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP+ плазмиды без вставки после 24 ч индукции 0,2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 3-4, приведены доверительные интервалы для р=0,05.The Figure 11 presents the results of measuring the proportion of cells containing ROP + plasmids without insertion after 24 hours of induction of 0.2 mm IPTG. The number of independent experiments is 3-4; confidence intervals are given for p = 0.05.
На Фигуре 12 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP- плазмиды без вставки после 24 ч индукции 0,2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 3-4, приведены доверительные интервалы для р=0,05.Figure 12 shows the results of measuring the proportion of cells containing ROP - a plasmid without an insert, after 24 hours of induction with IPTG 0.2 mM. The number of independent experiments is 3-4; confidence intervals are given for p = 0.05.
Сущность и промышленная применимость настоящего изобретения иллюстрируются следующими примерами.The essence and industrial applicability of the present invention are illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение плазмиды pAL-HSExample 1. Obtaining plasmids pAL-HS
Участок hok/sok(host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli, последовательность которого депонирована в публичной базе данных GeneBank (GenBank X05813), получали методом полимеразной цепной реакции с использованием синтетических олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1); AS-HOS-F4 (SEQ ID NO:2); AS-HOS-F3 (SEQ ID NO:3); AS-HOS-F2 (SEQ ID NO:4); AS-HOS-F1 (SEQ ID NO:5); AS-HOS-R1 (SEQ ID NO:6); AS-HOS-R2 (SEQ ID NO:7); AS-HOS-R3 (SEQ ID NO:8); AS-HOS-R4 (SEQ ID NO:9); AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10) на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Нуклеотидные последовательности праймеров 5'-3':The hok / sok site (host killing / suppressor of killing) of the natural plasmid R1 Escherichia coli, the sequence of which was deposited in the GeneBank public database (GenBank X05813), was obtained by the polymerase chain reaction using AS-HOS-F5 synthetic oligonucleotides (SEQ ID NO: one); AS-HOS-F4 (SEQ ID NO: 2); AS-HOS-F3 (SEQ ID NO: 3); AS-HOS-F2 (SEQ ID NO: 4); AS-HOS-F1 (SEQ ID NO: 5); AS-HOS-R1 (SEQ ID NO: 6); AS-HOS-R2 (SEQ ID NO: 7); AS-HOS-R3 (SEQ ID NO: 8); AS-HOS-R4 (SEQ ID NO: 9); AS-HOS-R5 (SEQ ID NO: 10) on a Tertsik MS2 instrument (DNA Technology, Russia). The nucleotide sequences of primers 5'-3 ':
Участок hok/sok плазмиды R1 E coli (GenBank X05813) представлен в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:11.The hok / sok region of the plasmid R1 E coli (GenBank X05813) is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 11.
Ген hok кодирует 52 аминокислотный полипептидный токсин (SEQ ID NO:12), вызывающий диссипацию мембранного потенциала и имеющий стабильную мРНК, тогда как транскрипция гена "антитоксина" sok приводит к появлению короткоживущих коротких антисмысловых РНК, связывающихся с мРНК гена hok и препятствующих его трансляции. При потере бактериальной клеткой плазмиды, содержащей локус Hok/Sok, происходит прекращение транскрипции элемента sok и быстрый распад его мРНК и восстановление трансляции долгоживущей мРНК гена Hok, приводящее к смерти бактериальной клетки.The hok gene encodes a 52 amino acid polypeptide toxin (SEQ ID NO: 12) that causes membrane potential dissipation and has stable mRNA, while transcription of the sok antitoxin gene leads to the appearance of short-lived short antisense RNAs that bind to the hok gene mRNA and inhibit its translation. When a bacterial cell loses a plasmid containing an Hok / Sok locus, transcription of the sok element ceases and its mRNA decays rapidly and translation of the long-lived Hok gene is restored, resulting in the death of the bacterial cell.
Последовательность ПЦР-продукта, содержащего участок hok/sok плазмиды R1 E.coli, приведена в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:13. Внешние праймеры AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10) содержат сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции PspCI, BamHI, SphI.The sequence of the PCR product containing the hok / sok region of E. coli plasmid R1 is shown in the sequence list under the number SEQ ID NO: 13. External primers AS-HOS-F5 (SEQ ID NO: 1) and AS-HOS-R5 (SEQ ID NO: 10) contain recognition sites for restriction endonucleases PspCI, BamHI, SphI.
Продукт полимеразной цепной очищали из 1% агарозного геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США) по протоколу производителя. Очищенные продукты лигировали в плазмиду PAL-TA (ЗАО Евроген, Россия) ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва). Лигирование вели в объеме 10 или 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α и высевали на твердую агаризованную среду, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37 С. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды M13rev (SEQ ID NO:14) и M13dir (SEQ ID NO:15). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных конструкций PAL-HS определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров к последовательности вектора SP6 (SEQ ID NO:16) и T7prom (SEQ ID NO:17).The polymerase chain product was purified from a 1% agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System "kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol. The purified products were ligated into the PAL-TA plasmid (ZAO Eurogen, Russia) with T4 DNA ligase (Fermentas , Lithuania) Ligation was carried out in a volume of 10 or 20 μl, with a molar ratio of the vector and insert of 1:10, for 2-20 hours at room temperature.The obtained ligase mixtures transformed E. coli cells of strain DH5α and plated on solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / 1 ml of agar, and placed in a thermostat at 18 hours at 37 C. E. coli colonies selected as a result of blue-white screening were analyzed by clone PCR using primers for the recipient plasmid sequences M13rev (SEQ ID NO: 14) and M13dir (SEQ ID NO: 15) The selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp nutrient broth and plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol. For the resulting PAL-HS constructs, the nucleotide sequence was determined by PCR sequencing using primers for the sequence of the vector SP6 (SEQ ID NO: 16) and T7prom (SEQ ID NO: 17).
Пример 2. Получение экспрессионных плазмид р6Е, р8Е, рМЕ, р10Е и сравнение свойств лидерных пептидов при металлохелатной хроматографии в денатурирующих условияхExample 2. Obtaining expression plasmids p6E, p8E, pME, p10E and comparison of the properties of leader peptides in metal chelate chromatography under denaturing conditions
Последовательности, кодирующие фрагменты N-концевых дополнительных пептидов (тэгов) 6Е (SEQ ID NO:18), 8Е (SEQ ID NO:19), 10E (SEQ ID NO:20), MAT (SEQ ID NO:21), получали методом отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов с образованием выступающих «липких» 5′-концов. Для этого вносили в пробирку соответствующие пары олигонуклеотидов, по 100 пмоль каждого в общем объеме 10 мкл, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.The sequences encoding fragments of the N-terminal additional peptides (tags) 6E (SEQ ID NO: 18), 8E (SEQ ID NO: 19), 10E (SEQ ID NO: 20), MAT (SEQ ID NO: 21) were obtained by the method annealing of two partially complementary oligonucleotides with the formation of protruding “sticky” 5′-ends. For this, the corresponding pairs of oligonucleotides were introduced into the test tube, 100 pmol each in a total volume of 10 μl, heated to 95 ° C and slowly cooled to room temperature.
Для получения тэга 6Е использовали праймеры AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:22) и AD-6H-NheR (SEQ ID NO:23); для получения тэга 8Е использовали праймеры AD-8H-NcoF (SEQ ID NO:24) и AD-8H-NheR (SEQ ID NO:25); для получения тэга 10E использовали праймеры AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:26) и AD-10H-NheR (SEQ ID NO:27); для получения тэга MAT использовали праймеры AD-MAT-NcoF (SEQ ID NO:28) и AD-MAT-NheR (SEQ ID NO:29).To obtain tag 6E, primers AD-6H-NcoF (SEQ ID NO: 22) and AD-6H-NheR (SEQ ID NO: 23) were used; primers AD-8H-NcoF (SEQ ID NO: 24) and AD-8H-NheR (SEQ ID NO: 25) were used to obtain tag 8E; primers AD-10H-NcoF (SEQ ID NO: 26) and AD-10H-NheR (SEQ ID NO: 27) were used to obtain tag 10E; primers AD-MAT-NcoF (SEQ ID NO: 28) and AD-MAT-NheR (SEQ ID NO: 29) were used to obtain the MAT tag.
Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen, США) расщепляли последовательно эндонуклеазами NcoI и NheI. Для этого две акликвоты по 0,5 мкг очищенной плазмиды инкубировали 2 часа в водном термостате при 37°C с одной из двух эндонуклеаз рестрикции, контролировали электрофорезом в агарозном геле полноту линеаризации плазмид, после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем образцы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Расщепленную рестриктазами плазмиду обрабатывали равным объемом смеси фенол-хлороформ 1:1 и переосаждали водную фазу тремя объемами охлажденного этанола. Центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% раствором этанола, растворяли в воде и использовали для постановки реакции дотирования в рабочей концентрации 10 нг/мкл, вставки - соответствующие дуплексы олигонуклеотидов использовали в молярном соотношении вектор:вставка 1:10. Реакцию вели с использованием Т4 ДНК лигазы (Fermentas, Литва) по методике производителя. Инактивировали лигазу прогреванием реакционной смеси 20 мин при +65°С и проводили трансформацию компетентных клеток Е.coli штамма DH5α по методике, приведенной в [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Выращивали колонии трансформантов Е.coli на агаризованной среде, содержащей 30 мкг/мл канамицина и анализировали колонии методом "ПЦР с клонов", с использованием олигонуклеотидов T7t (SEQ ID NO:30) и T7prom (SEQ ID NO:17). Отобранные колонии, содержащие вставку ожидаемого размера, использовали для инокуляции жидких культур по 5 мл питательного бульона 2xYT-канамицин, выделяли плазмидные ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя и определяли нуклеотидную последовательность для области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7t (SEQ ID NO:30).The recipient plasmid pET28a (+) (Novagen, USA) was sequentially digested with NcoI and NheI endonucleases. For this, two 0.5 μg aliquots of the purified plasmid were incubated for 2 hours in a water thermostat at 37 ° C with one of the two restriction endonucleases, the completeness of linearization of the plasmids was controlled by agarose gel electrophoresis, after which a second restriction enzyme was added and incubated for another 2 hours. Then the samples were combined, restriction enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes. The restriction enzyme digested plasmid was treated with an equal volume of a 1: 1 phenol-chloroform mixture and the aqueous phase was reprecipitated with three volumes of chilled ethanol. It was centrifuged for 10 minutes at a speed of 13,200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with a 70% ethanol solution, dissolved in water and used to set up a dosing reaction at a working concentration of 10 ng / μl, inserts — corresponding oligonucleotide duplexes were used in a molar ratio of vector: insert 1 :10. The reaction was carried out using T4 DNA ligase (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's procedure. The ligase was inactivated by heating the reaction mixture for 20 min at + 65 ° C and transformation of competent E. coli cells of strain DH5α was carried out according to the procedure described in [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Colonies of E. coli transformants were grown on agar medium containing 30 μg / ml kanamycin and the colonies were analyzed by clone PCR using T7t oligonucleotides (SEQ ID NO: 30) and T7prom (SEQ ID NO: 17). Selected colonies containing an insert of the expected size were used to inoculate liquid cultures with 5 ml of 2xYT-kanamycin nutrient broth, plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol, and the nucleotide sequence for the insertion region was determined by PCR sequencing with using T7t primer (SEQ ID NO: 30).
Последовательности полученных векторов р6Е, р8Е, р10Е, рМЕ представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 соответственно.The sequences of the obtained vectors p6E, p8E, p10E, pME are presented in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, respectively.
Для проверки свойств кодируемых векторами N-концевых пептидов были получены экспрессионные плазмиды, кодирующие синтетический ген делеционного варианта тканевого активатора плазминогена человека, содержащий 355 из 527 аминокислот природного ТАП человека (аминокислоты 1-3 и 176-527) и сайт расщепления энтерокиназой (SEQ ID NO:43), слитый в рамке с соответствующими пептидами.To test the properties of the N-terminal peptides encoded by vectors, expression plasmids were obtained that encoded a synthetic gene for the deletion variant of human tissue plasminogen activator containing 355 of 527 amino acids of natural human TAP (amino acids 1-3 and 176-527) and an enterokinase cleavage site (SEQ ID NO : 43) fused in frame with the corresponding peptides.
Экспресионную плазмиду p10E-tPA получали, как описано в Справочном примере, приведенном ниже, плазмиды p6E-tPA, p8E-tPA и pME-tPA получали аналогично p10E-tPA. Для всех четырех полученных плазмид проводили секвенирование области вставки, в дальнейшей работе использовали клоны, не содержащие точечных мутаций.The expression plasmid p10E-tPA was obtained as described in the Reference example below, plasmids p6E-tPA, p8E-tPA and pME-tPA were obtained similarly to p10E-tPA. For all four plasmids obtained, the insertion region was sequenced; in further work, clones that did not contain point mutations were used.
Получали штаммы-продуценты слитных белков путем трансформации экспрессионных плазмид в клетки штамма BL21[DE3] (Novagen, США) методом электропорации. Проводили аналитические экспрессии целевых генов. Во всех четырех случаях большая часть целевых белков накапливалась в нерастворимой форме в составе телец включения, уровни экспрессии генов не имели существенных отличий. Препараты телец включения для четырех целевых слитных белков 6E-tPA, ME-tPA, 8E-tPA, 10Е-tPA - продуцируемых штаммами BL21[DE3]/p6E-tPA, BL21[DE3]/pME-tPA, BL21[DE3]/p8E-tPA, BL21[DE3]/p10E-tPA, соответственно, получали следующим образом. Отделяли осадки биомассы центрифугированием, осадки клеток ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис рН 7,4 2 мМ ЭДТА), добавляли лизоцим до 10 мкг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадки центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Осадки ресуспендировали в 20 мл раствора А, добавляли детергент NP-40 до 1%, суспензии обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли тельца включения центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные осадки телец включения ресуспендировали в растворе А, добавляли NaCl до 500 мМ, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные препараты обогащенных телец включения хранили при -70°С.Fusion protein producing strains were obtained by transforming expression plasmids into cells of strain BL21 [DE3] (Novagen, USA) by electroporation. Conducted analytical expression of the target genes. In all four cases, the majority of the target proteins accumulated in an insoluble form in the inclusion bodies, gene expression levels did not differ significantly. Inclusion Taurus preparations for four target fusion proteins 6E-tPA, ME-tPA, 8E-tPA, 10E-tPA produced by strains BL21 [DE3] / p6E-tPA, BL21 [DE3] / pME-tPA, BL21 [DE3] / p8E -tPA, BL21 [DE3] / p10E-tPA, respectively, was prepared as follows. Biomass pellets were separated by centrifugation, cell pellets were resuspended in 20 ml of solution A (50 mM Tris pH 7.4 2 mM EDTA), lysozyme up to 10 μg / ml and Triton X100 up to 0.1% were added, incubated for 30 min on ice. Cells and genomic DNA were destroyed using an ultrasonic disperser in 10 s pulses until the increased viscosity of the suspension disappeared. Precipitation was separated by centrifugation for 10 minutes at 18,000 rpm. Precipitation was resuspended in 20 ml of solution A, NP-40 detergent was added to 1%, the suspensions were treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, inclusion bodies were separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The resulting precipitates of inclusion bodies were resuspended in solution A, NaCl was added to 500 mM, the suspension was treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, and the precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The obtained preparations of enriched inclusion bodies were stored at -70 ° C.
Солюбилизировали навески по 50 мг телец включения каждого из вариантов белка в растворе 6М гуанидина гидрохлорида, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ β-меркаптоэтанола, рН=8,0. Инкубировали 10% суспензии телец включения 30 мин при +37°С при перемешивании и отделяли осадок клеточного дебриса центрифугированием. Готовили к работе колонку для металлохелатной хроматографии 1 мл HisTrap (GE Healthcare, США), содержащую агарозный сорбент с привитыми группами иминодиуксусной кислоты (IDA) и иммобилизованными ионами никеля. Колонку уравновешивали раствором А, содержащим 6М гуанидина гидрохлорида, 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, рН=7,5 и наносили растворы соответствующих слитных белков на скорости потока 0,2 мл/мин. Собирали фракцию не связавшихся с колонкой белков и промывали колонку раствором А до стабилизации базовой линии детектора (около 10 объемов колонки) на скорости потока 1 мл/мин. Проводили ступенчатую элюцию белков порциями по 5 мл растворов, содержащих 50, 100, 200, 500 мМ имидазола в растворе А, рН=7,5. Собирали элюаты и удаляли иммобилизованные ионы никеля (и координированные ими белковые молекулы) с колонки 5 мл раствора А, дополнительно содержащего 50 мМ ЭДТА-Na, элюат собирали.Samples of 50 mg Taurus were each solubilized for inclusion of each protein variant in a solution of 6M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl, 50 mM β-mercaptoethanol, pH = 8.0. A 10% suspension of inclusion bodies was incubated for 30 min at + 37 ° C with stirring and the cell debris sediment was separated by centrifugation. A column for
Проводили осаждение белков из растворов гуанидина гидрохлорида для проведения ДСН-ПААГ анализа белков, для этого к равным аликвотам всех элюатов и эквивалентной им аликвоте фракции проскока добавляли трихлоруксусную кислоту до 7%, перемешивали растворы, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, отделяли осадки белков центрифугированием, дважды промывали осадки охлажденным ацетоном и подсушивали осадки при комнатной температуре.Proteins were precipitated from solutions of guanidine hydrochloride to conduct SDS-PAGE analysis of proteins; for this, trichloroacetic acid up to 7% was added to equal aliquots of all eluates and an equivalent aliquot of the slip fraction, solutions were mixed, incubated for 30 min at room temperature, protein precipitates were separated by centrifugation, the precipitates were washed twice with chilled acetone and the precipitates were dried at room temperature.
Проводили ДСН-ПААГ анализ белковых фракций, гель окрашивали коллоидным раствором Кумасси синего (Fermentas, Литва), отмывали избыток красителя очищенной водой и определяли содержание белков в пластине геля методом денситометрии при помощи планшетного сканера в просвечивающем режиме. Полученное цифровое изображение геля с глубиной цвета 16 бит/канал анализировали с помощью программы TotalLab (Nonlinear Dynamics, Великобритания) и определяли объемы пиков, соответствующих полосам целевого белка во фракциях. Распределение целевого белка во фракциях для исследуемых тэгов приведено в таблице 1.SDS-PAGE analysis of protein fractions was performed, the gel was stained with a Kumasi blue colloidal solution (Fermentas, Lithuania), the excess dye was washed with purified water, and the protein content in the gel plate was determined by densitometry using a flatbed scanner in transmission mode. The obtained digital image of the gel with a color depth of 16 bits / channel was analyzed using the TotalLab program (Nonlinear Dynamics, United Kingdom) and the peak volumes corresponding to the bands of the target protein in the fractions were determined. The distribution of the target protein in fractions for the studied tags are shown in table 1.
Было установлено, что наибольшей устойчивостью к элюции возрастающими концентрациями имидазола обладает белок 10EtPA, при этом доля целевого белка, не элюированного 500 мМ имидазола и элюировавшаяся при удалении иммобилизованных ионов никеля при помощи ЭДТА, практически не зависит от длины и типа олигогистидинового кластера и остается незначительной. Поскольку большая часть видимых на геле белков Е.coli, связывающихся с металлохелатным сорбентом в денатурирующих условиях, элюируется при концентрации имидазола до 200 мМ включительно, предпочтительным вариантом очистки целевых белков является элюция примесных белков при концентрации имидазола 200 мМ и последующая элюция целевого белка при концентрации имидазола 500 мМ. При таком режиме хроматографии наилучший выход фиксируется для белков с тэгом 10Е.It was found that the 10EtPA protein has the highest resistance to elution with increasing concentrations of imidazole, while the fraction of the target protein not eluted with 500 mM imidazole and eluted upon removal of immobilized nickel ions using EDTA is practically independent of the length and type of the oligohistidine cluster and remains insignificant. Since most of the E. coli proteins visible on the gel, which bind to the metal chelate sorbent under denaturing conditions, elute at an imidazole concentration of up to 200 mM inclusive, the preferred option for purification of the target proteins is the elution of impurity proteins at an imidazole concentration of 200 mM and subsequent elution of the target protein at an imidazole concentration 500 mM. In this mode of chromatography, the best yield is recorded for proteins with a 10E tag.
Для верификации полученных данных был получен штамм-продуцент, кодирующий tPA без тэга, но с дополнительным остатком метионина на N-конце белка. При проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях для данного белка была установлено, что целевой белок не связывается с металлохелатным сорбентом и целиком обнаруживается во фракции несвязавшихся белков. Таким образом, собственные свойства денатурированного полипептида tPA с восстановленными дисульфидными связями не влияют значимым образом на связывание слитных белков с металлохелатной колонкой.To verify the obtained data, a producer strain encoding tPA without a tag, but with an additional methionine residue at the N-terminus of the protein, was obtained. When conducting metal chelate chromatography under denaturing conditions for this protein, it was found that the target protein does not bind to the metal chelate sorbent and is completely found in the fraction of unbound proteins. Thus, the intrinsic properties of the denatured tPA polypeptide with reduced disulfide bonds do not significantly affect the binding of fusion proteins to a metal chelate column.
Предположительно, при использовании тэгов, не содержащих кластер кислых аминокислот (сайт узнавания энтерокиназы DDDDK) вблизи олигогистидинового кластера, профиль элюции полипептидов с олигогистидиновыми кластерами различной длины будет отличаться от приведенного выше и устойчивость слитных белков к элюции может возрасти вплоть до невозможности провести элюцию целевого белка раствором с 500 мМ имидазола.Presumably, when using tags that do not contain a cluster of acidic amino acids (DDDDK enterokinase recognition site) near an oligo-histidine cluster, the elution profile of polypeptides with oligo-histidine clusters of different lengths will differ from the above and the resistance of fusion proteins to elution can increase up to the inability to elute the target protein with a solution with 500 mM imidazole.
Пример 3. Получение векторных плазмид p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR и сравнение их сегрегационной стабильностиExample 3. Obtaining vector plasmids p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR and comparison of their segregation stability
Для получения вектора p10E-HU реципиентную плазмиду р10Е расщепляли эндонуклеазами BglII и SphI. Донорную плазмиду PAL-HS, расщепляли эндонуклеазами BamHI и SphI. Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля набором WizardSV Gel and PCR Cean-Up System (Promega, США), после чего лигировали Т4 ДНК лигазой и трансформировали клетки Е.coli штамма DH5a. Колонии E.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Последовательность p10EHU определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7t (SEQ ID NO:30).To obtain the p10E-HU vector, the recipient plasmid p10E was digested with BglII and SphI endonucleases. The donor plasmid PAL-HS was digested with BamHI and SphI endonucleases. Restriction products were isolated from 1% agarose gel using the WizardSV Gel and PCR Cean-Up System kit (Promega, USA), after which T4 DNA was ligated with ligase and E. coli cells of strain DH5a were transformed. E. coli colonies were analyzed by clone PCR using AS-HOS-F5 oligonucleotides (SEQ ID NO: 1) and AS-HOS-R5 (SEQ ID NO: 10). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan, plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit. The p10EHU sequence was determined by PCR sequencing using a T7t primer (SEQ ID NO: 30).
Для получения векторов p10E-HD и p10E-HDR реципиентную плазмиду р10Е расщепляли эндонуклеазой PsiI. Донорную плазмиду PAL-HS, расщепляли эндонуклеазой PspCI (Fermentas, Литва). Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля, дотировали и трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Для определения ориентации вставки при первичном скрининге клонов использовали ПЦР с праймеров T7prom (SEQ ID NO:17) и AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) или AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Плазмида p10E-HD содержала вставку в прямой ориентации, плазмида p10E-HDR - в обратной ориентации. Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором Gene JET Plasmid Miniprep Kit. Последовательность p10EHD и p10EHDR определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7prom (SEQ ID NO:17).To obtain the vectors p10E-HD and p10E-HDR, the recipient plasmid p10E was digested with the endonuclease PsiI. The donor plasmid PAL-HS was digested with PspCI endonuclease (Fermentas, Lithuania). Restriction products were isolated from 1% agarose gel, and E. coli cells of strain DH5α were donated and transformed as described above. E. coli colonies were analyzed by clone PCR using AS-HOS-F5 oligonucleotides (SEQ ID NO: 1) and AS-HOS-R5 (SEQ ID NO: 10). PCR from primers T7prom (SEQ ID NO: 17) and AS-HOS-F5 (SEQ ID NO: 1) or AS-HOS-R5 (SEQ ID NO: 10) was used to determine the orientation of the insert during the initial screening of clones. Plasmid p10E-HD contained the insert in the direct orientation, plasmid p10E-HDR in the reverse orientation. Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated using the Gene JET Plasmid Miniprep Kit. The sequence of p10EHD and p10EHDR was determined by PCR sequencing using a T7prom primer (SEQ ID NO: 17).
Последовательности полученных плазмид p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 соответственно. Плазмиды различаются между собой положением и ориентации локуса сегрегационной стабилизации Hok/Sok. Поскольку локус находится вблизи активных промоторов Т7, lac и kanR, было предположено, что инициированная этими промоторами транскрипция участков плазмидной ДНК, захватывающих область вставки локуса Hok/Sok, может существенно повлиять на относительный уровень транскрипции генов hok и sokSok и, таким образом, изменять свойства локуса.The sequences of the obtained plasmids p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR are presented in the sequence Listing under the numbers SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, respectively. Plasmids differ in position and orientation of the Hok / Sok segregation stabilization locus. Since the locus is close to the active T7, lac, and kanR promoters, it was suggested that transcription of plasmid DNA sites that capture the region of the Hok / Sok locus initiated by these promoters could significantly affect the relative level of transcription of the hok and sokSok genes and, thus, change the properties locus.
Для сравнения сегрегационной стабильности полученных плазмид в них клонировали вставку малотоксичного для E.coli белка делеционного варианта тканевого активатора плазминогена с дополнительным N-концевым тэгом 10Е (tPA). Клонирование минигена tPA в созданные вектора проводили, как указано в примере 2. Штаммы-продуценты tPA в соответствующих векторах и штаммы, несущие исследуемые плазмиды без кодирующей белок вставки, получали путем трансформации штамма Е.coli BL21 [DE3] методом электропорации.To compare the segregation stability of the obtained plasmids, an insertion of a deletion variant of tissue plasminogen activator with an additional N-terminal tag of 10E (tPA) was cloned into them. Cloning of the tPA minigene into the created vectors was performed as described in Example 2. The tPA producing strains in the corresponding vectors and strains carrying the studied plasmids without the protein coding insert were obtained by electroporation of E. coli BL21 [DE3] strain.
Вели культивацию исследуемых штаммов по следующей общей схеме:We conducted the cultivation of the studied strains according to the following general scheme:
1. Высевали штамм из замороженного музея истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой 2xYT, содержащей 30 мкг/л канамицина и 1% глюкозы. Растили культуры в течение 14-18 ч.1. A strain from a frozen museum was plated with a draining stroke on a Petri dish with 2xYT agar medium containing 30 μg / L kanamycin and 1% glucose. Cultivated for 14-18 hours
2. Отбирали одиночные колонии типичного для BL21 [DE3] фенотипа и переносили их в пробирки с 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 30 мкг/л канамицина и 1% глюкозы. Вели рост культуры в течение 16 ч. Переносили 1 мл культуры в стерильную микропробирку и отделяли среду с остатками антибиотика центрифугированием. Ресуспендировали осадок клеток в 1 мл среды 2xYT.2. Single colonies of the phenotype typical for BL21 [DE3] were selected and transferred to test tubes with 5 ml of 2xYT liquid medium containing 30 μg / l kanamycin and 1% glucose. The culture was grown for 16 hours. 1 ml of culture was transferred to a sterile microtube and the medium with antibiotic residues was separated by centrifugation. Resuspend cell pellet in 1 ml of 2xYT medium.
3. Инокулировали 50 мкл полученной суспензии бактериальных клеток в 5 мл среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы, но не содержащей канамицин, вели рост 2 ч, после чего добавляли ИПТГ до 2 мМ и продолжали культивирование в течение 24 ч.3.
4. Через 8 ч после начала индукции отбирали аликвоту культуры, при помощи стерильной среды 2xYT делали разведения в кратностью 10 тыс и 1 млн. Высевали по 100 мкл полученных разведении на чашки со средой 2xYT с и без добавления 30 мг/л канамицина Культуры растили в течение 14-18 ч и подсчитывали выросшие колонии.4. 8 hours after the start of induction, an aliquot of the culture was taken, dilutions of 10 thousand and 1 million were made using sterile 2xYT medium. 100 μl of the obtained dilutions were plated on plates with 2xYT medium with and without 30 mg / l kanamycin. Cultures were grown in for 14-18 hours and the grown colonies were counted.
5. Проводили отбор аликвот жидкой культуры с шага 4 через 24 ч после индукции, готовили и высевали разведения по п.4 и проводили подсчет колоний.5. Aliquots of the liquid culture were selected from
Результаты измерения доли клеток, сохранивших плазмиды через 8 и 24 ч после начала индукции, приведены на Фиг.10. Для всех вариантов вставки локуса Hok/Sok не наблюдалось статистически значимого изменения сегрегационной стабильности плазмиды. Измерение сегрегационной устойчивости повторили для штаммов, трансформированных плазмидами без кодирующей вставки, при этом применяли выращивание культуры без антибиотика в присутствии 0,2 мМ ИПТГ в течение 24 ч. Результаты измерения долей клеток, сохранивших плазмиду, приведены на Фиг.11. Сегрегационная стабильность плазмид, не содержавших вставки, также не имела статистически значимых различий и не имела значимых отличий от стабильности плазмид, кодирующих нетоксичный белок. Было сделано предположение о том, что уровень экспрессии гена hok недостаточен для индукции гибели клеток при потере плазмиды, либо уровень экспрессии гена антитоксина sok слишком велик, либо функционирование гена hok затруднено экспрессией генов, гомологичных sok и расположенных в геноме клеток BL21[DE3]. Наиболее очевидным способом повышения уровня экспрессии генов hok и sok, присутствующих в конструируемых плазмидах, является повышение копийности плазмид в клетках, реализуемое путем удаления генетического элемента контроля копийности ROP.The results of measuring the proportion of cells that retained
Пример 4. Получение плазмид p10Erop-, p10E-HUrop-, p10E-HDRrop-, pHYP и сравнение их сегрегационной стабильностиExample 4. Obtaining plasmids p10Erop - , p10E-HUrop - , p10E-HDRrop - , pHYP and comparison of their segregation stability
Удаление фрагмента ДНК, кодирующего ROP элемент, проводили рестрикцией плазмид p10E (SEQ ID NO:33), p10E-HU (SEQ ID NO:35), p10E-HD (SEQ ID NO:36), p10E-HDR (SEQ ID NO:37) двумя эндонуклеазами рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием «тупых» концов - FspAI (Fermentas Литва) и Bst1107I (Fermentas Литва). Фрагменты после расщепления выделяли из агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США), после чего лигировали Т4 ДНК лигазой (Fermentas, Литва) по методике производителя. Продукты лигирования расщепляли теми же эндонуклеазами, после этого трансформировали Е.coli штамма DH5α. Клоны трансформантов наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Идентичность клонов подтверждали рестрикционным анализом с использованием тех же эндонуклеаз FspAI и Bst1107I по отсутствию выщепления фрагмента.The removal of the DNA fragment encoding the ROP element was performed by restriction of plasmids p10E (SEQ ID NO: 33), p10E-HU (SEQ ID NO: 35), p10E-HD (SEQ ID NO: 36), p10E-HDR (SEQ ID NO: 37) two restriction endonucleases that cleave DNA to form blunt ends - FspAI (Fermentas Lithuania) and Bst1107I (Fermentas Lithuania). Fragments after cleavage were isolated from agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, USA), after which T4 DNA was ligated with a ligase (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's method. Ligation products were digested with the same endonucleases, after which E. coli strain DH5α was transformed. Clones of transformants were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth and plasmid DNA was isolated using a GeneJET Plasmid Miniprep Kit reagent kit (Fermentas, Lithuania). The identity of the clones was confirmed by restriction analysis using the same FspAI and Bst1107I endonucleases for lack of fragment cleavage.
Последовательности полученных плазмид p10Erop-, p10E-HUrop-, pHYP, p10E-HDRrop- представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:41, соответственно.The sequences of the obtained plasmids p10Erop - , p10E-HUrop - , pHYP, p10E-HDRrop - are presented in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, respectively.
Анализ сегрегационной стабильности полученных плазмид проводили, как указано в примере 3. Результаты измерений представлены на Фигуре 12. Было установлено, что плазмида pHYP (элемент Hok-Sok в положении HD) обеспечивает приблизительно двукратное и статистически значимое (p<0,05) увеличение доли клеток, несущих плазмиду, по сравнению со всеми остальными исследованными плазмидами, при продолжительной индукции штаммов при помощи ИПТГ. Таким образом, был создан экспрессионный вектор, обеспечивающий повышенную сегрегационную стабильность при культивировании в отсутствие антибиотика и в присутствии индуктора экспрессии целевого гена, также позволяющий вести очистку целевых белков металлохелатной хроматографией в денатурирующих условиях с увеличенным выходом продукта.An analysis of the segregation stability of the obtained plasmids was carried out as described in Example 3. The measurement results are shown in Figure 12. It was found that the plasmid pHYP (Hok-Sok element in the HD position) provides an approximately twofold and statistically significant (p <0.05) increase in the proportion cells carrying the plasmid, compared with all other studied plasmids, with prolonged induction of strains using IPTG. Thus, an expression vector was created that provides increased segregation stability during cultivation in the absence of an antibiotic and in the presence of the target gene expression inducer, and also allows purification of target proteins by metal chelate chromatography under denaturing conditions with an increased yield of the product.
Справочный пример. Получение плазмиды p10E-tPAReference example. Obtaining plasmid p10E-tPA
Последовательность, кодирующую фрагмент N-концевого лидерного пептида, включающего декагистидиновый кластер, получали методом отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:44) и AD-10H-NheR (SEQ ID NO:45) с образованием выступающих «липких» 5'-концов. Для этого вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.The sequence encoding a fragment of the N-terminal leader peptide comprising the decagystidine cluster was obtained by annealing two partially complementary oligonucleotides AD-10H-NcoF (SEQ ID NO: 44) and AD-10H-NheR (SEQ ID NO: 45) with the formation of protruding " sticky 5'-ends. For this, 100 pm of each oligonucleotide was introduced into the test tube, heated to 95 ° C, and slowly cooled to room temperature.
Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen) расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и NheI. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, затем контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид (в пределах чувствительности метода), после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Рестрицированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл. Выделенные фрагменты дотировали с использованием Т-4 ДНК лигазы («Fermentas», Литва) по методике производителя. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с использованием олигонуклеотидов AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:44) и T7t (SEQ ID NO:46). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором «Gene JET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Для полученных генетических конструкций р10Е определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7t (SEQ ID NO:46).The recipient plasmid pET28a (+) (Novagen) was sequentially digested with each of the NcoI and NheI endonucleases. First, aliquots of the plasmid were incubated for 2 hours at 37 ° C with each of the restriction enzymes, then the complete linearization of the plasmids was controlled by agarose gel electrophoresis (within the sensitivity of the method), after which a second restriction enzyme was added and incubated for another 2 hours. Then the samples were combined, the restriction enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes. The restricted plasmid was reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for 10 minutes at a speed of 13200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water, and used to set up a ligation reaction at a working concentration of 10 -2 μg / μl. The isolated fragments were subsidized using T-4 DNA ligase (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's procedure. After that, cells of E. coli strain DH5α were transformed, as described above. E. coli colonies were analyzed by clone PCR using AD-10H-NcoF oligonucleotides (SEQ ID NO: 44) and T7t (SEQ ID NO: 46). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated using the Gene JET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol. For the obtained p10E genetic constructs, the DNA nucleotide sequence was determined by PCR sequencing with T7t primer (SEQ ID NO: 46).
Реципиентную плазмиду р10Е расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали при 37°С в течение 2 часов с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Расщепленную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл.The recipient plasmid p10E was sequentially digested with each of the NheI and HindIII endonucleases. First, aliquots of the plasmid were incubated at 37 ° C for 2 hours with each of the restriction enzymes, the linearization of the plasmids was monitored by agarose gel electrophoresis, then a second restriction enzyme was added and incubated for another 2 hours. Then the samples were combined, the enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes, and alkaline phosphatase dephosphorylation (Fermentas, Lithuania) was performed according to the manufacturer's protocol. Alkaline phosphatase was inactivated by heating to 85 ° C for 20 minutes. The digested and dephosphorylated plasmid was reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for 10 minutes at a speed of 13,200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water and used to set up a ligation reaction at a working concentration of 10 -2 μg / μl.
Реакцию лигирования предварительно расщепленного рестриктазами NheI и HindIII фрагмента SEQ ID NO:43, соответствующего минигену tPA и содержащего сайт расщепления энтерокиназы, и реципиентной плазмиды проводили, как описано выше. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Фрагмент SEQ ID NO:43, соответствующий минигену tPA и содержащий сайт расщепления энтерокиназы, получали методом ПЦР с использованием набора перекрывающихся праймеров. В качестве альтернативы указанный фрагмент может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.The ligation reaction of the preliminarily digested with restriction enzymes NheI and HindIII of the fragment SEQ ID NO: 43 corresponding to the tPA minigen and containing the enterokinase cleavage site and the recipient plasmid was carried out as described above. After that, cells of E. coli strain DH5α were transformed, as described above. The fragment of SEQ ID NO: 43, corresponding to the tPA minigen and containing the enterokinase cleavage site, was obtained by PCR using a set of overlapping primers. Alternatively, this fragment can be obtained using the cloning technology of Sloning BioTechnology, described in PCT application WO2005071077.
Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:47) и T7t (SEQ ID NO:46). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя. При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-tPA определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:47) и T7t (SEQ ID NO:46). В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена ТАП.E. coli colonies were analyzed by PCR from clones from primers T7prom (SEQ ID NO: 47) and T7t (SEQ ID NO: 46). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated with the Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol. Using PCR sequencing for the p10E-tPA construct, the nucleotide sequence of both complementary DNA strands was determined for the insertion region using primers T7prom (SEQ ID NO: 47) and T7t (SEQ ID NO: 46). As a result of sequencing, it was found that the obtained plasmid preparation does not contain mutations in the insertion region, i.e., the correct sequence of the TAP gene is encoded.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Claims (9)
- участка инициации репликации pBR322 ori;
- гена репрессора лактозного оперона;
- бактериального промотора;
- области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
- участка клонирования (полилинкера);
- участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке;
- фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; и
- гена, кодирующего бактериальный маркер селекции.1. A vector for producing a vector for expression in a bacterial cell of a precursor of a target recombinant protein fused to an N-terminal peptide containing a decagystidine cluster and a proteinase recognition site essentially consisting of:
- site of replication initiation pBR322 ori;
- lactose operon repressor gene;
- bacterial promoter;
a region encoding an N-terminal leader peptide containing a decagystidine cluster and, optionally, a proteinase recognition site;
- cloning site (polylinker);
- plot termination of transcription functioning in a bacterial cell;
- a fragment encoding a non-genomic pair of toxin-antitoxin, while the antitoxin gene is oriented in such a way that the direction of its transcription coincides with the direction of transcription of the target gene; and
- a gene encoding a bacterial selection marker.
- участка инициации репликации pBR322 ori;
- гена репрессора лактозного оперона;
- бактериального промотора;
- области, кодирующей N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
- участка клонирования (полилинкера) с введенной в него открытой рамкой считывания, кодирующей указанный целевой рекомбинантный белок, при этом, если в указанном векторе отсутствует сайт узнавания протеиназой, указанный сайт предварительно вводят перед открытой рамкой считывания;
- участка терминации транскрипции, функционирующего в бактериальной клетке;
- фрагмента, кодирующего негеномную пару токсин-антитоксин, при этом ген антитоксина ориентирован таким образом, что направление его транскрипции совпадает с направлением транскрипции целевого гена; и
- гена, кодирующего бактериальный маркер селекции.4. A vector for expression in a bacterial cell of a precursor of a target recombinant protein fused to an N-terminal peptide containing a decagidine cluster and a proteinase recognition site essentially consisting of:
- site of replication initiation pBR322 ori;
- lactose operon repressor gene;
- bacterial promoter;
a region encoding an N-terminal leader peptide containing a decagystidine cluster and, optionally, a proteinase recognition site;
- a cloning site (polylinker) with an open reading frame inserted encoding the indicated target recombinant protein, and if the proteinase recognition site is missing in the indicated vector, the specified site is pre-introduced before the open reading frame;
- a transcription termination site functioning in a bacterial cell;
- a fragment encoding a non-genomic pair of toxin-antitoxin, while the antitoxin gene is oriented in such a way that the direction of its transcription coincides with the direction of transcription of the target gene; and
- a gene encoding a bacterial selection marker.
- культивирование бактерии по п.6 в питательной среде, подходящей для указанной бактерии,
- очистку слитного белка методом металлохелатной хроматографии и
- отделение пептида от целевого рекомбинантного белка с использованием сайт-специфичной протеиназы.8. A method of obtaining a recombinant protein, including:
- culturing the bacteria according to claim 6 in a nutrient medium suitable for the specified bacteria,
- purification of fusion protein by metal chelate chromatography and
- separation of the peptide from the target recombinant protein using site-specific proteinase.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011150908/10A RU2496877C2 (en) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011150908/10A RU2496877C2 (en) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011150908A RU2011150908A (en) | 2013-06-20 |
RU2496877C2 true RU2496877C2 (en) | 2013-10-27 |
Family
ID=48785141
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011150908/10A RU2496877C2 (en) | 2011-12-15 | 2011-12-15 | PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2496877C2 (en) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2201455C2 (en) * | 1995-12-11 | 2003-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Method of preparing foreign protein in escherichia coli cells, plasmid vector and transformed strain escherichia coli for expression of foreign protein |
WO2007129087A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | The University Of Birmingham | Plasmid curing |
-
2011
- 2011-12-15 RU RU2011150908/10A patent/RU2496877C2/en active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2201455C2 (en) * | 1995-12-11 | 2003-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Method of preparing foreign protein in escherichia coli cells, plasmid vector and transformed strain escherichia coli for expression of foreign protein |
WO2007129087A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | The University Of Birmingham | Plasmid curing |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Graeslund S. et al.: "Protein production and purification", Nat Methods. 2008 Feb; 5(2):135-46. * |
Graeslund S. et al.: "Protein production and purification", Nat Methods. 2008 Feb; 5(2):135-46. Spadiut O. et al.: "A comparative summary of expression systems for the recombinant production of galactose oxidase", Spadiut et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:68, (реферат). * |
Spadiut O. et al.: "A comparative summary of expression systems for the recombinant production of galactose oxidase", Spadiut et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:68, (реферат). * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2011150908A (en) | 2013-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20190082318A (en) | CRISPR / CPF1 system and method | |
KR20160128362A (en) | Enhanced production of recombinant crm197 in e. coli | |
JPH09510611A (en) | Secretion of polypeptide | |
CN111278852A (en) | Production method of recombinant Erwinia asparaginase | |
JP2023517162A (en) | Generation of human basic fibroblast growth factor using Bacillus subtilis and an endonuclease | |
WO2019185751A1 (en) | Inhibitors of crispr-cas associated activity | |
CN112313336A (en) | Method for optimizing antibody expression | |
JP5794985B2 (en) | Vector containing mannose promoter and mannose promoter | |
US8080387B2 (en) | Method for preparing soluble and active recombinant proteins usins PDI as a fusion partner | |
CA2983894C (en) | Uncoupling growth and protein production | |
US8084597B2 (en) | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
JP4117033B2 (en) | Production method by biosynthesis of chemical substances | |
RU2496877C2 (en) | PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN | |
KR101841264B1 (en) | Recombinant Vector Including Gene of Autopahgy Activation Protein and Crystallizing Method for Recombinant Protein Using Thereof | |
JP2013501511A (en) | Fermentation method | |
CA2730741C (en) | Self-replicating vector lacking an antibiotic-resistance gene | |
KR20130141001A (en) | A novel vector system for isolation and purification of target proteins | |
RU2580031C2 (en) | PLASMID VECTOR pET-His8-TrxL-Acip1 STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE ACIPENSINA-1 AND METHOD OF PRODUCING SAID PEPTIDE | |
JP2001509391A (en) | Fusion protein comprising a coiled coil structure derived from bovine IF1ATPase inhibitor protein | |
RU2817891C1 (en) | ESCHERICHIA COLI L-ASPARAGINASE PRODUCER AND EXPRESSION PLASMID pET28a-AsnSYN CODING L-ASPARAGINASE | |
Ubeidat et al. | Expression and one-step purification of a developmentally regulated protein from Dictyostelium discoideum | |
RU2347811C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET-KSI-Buf2, CODING HYBRID PROTEIN, CONTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2, STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2-PRODUCER OF INDICATED PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2 | |
JPWO2004031243A1 (en) | Protein polymer and method for producing the same | |
KR20220061126A (en) | Caspase-2 variants | |
CN106755034B (en) | Expression, extraction and purification method of human ribosomal protein S5 |