RU2495934C2 - PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN - Google Patents

PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN Download PDF

Info

Publication number
RU2495934C2
RU2495934C2 RU2011121471/10A RU2011121471A RU2495934C2 RU 2495934 C2 RU2495934 C2 RU 2495934C2 RU 2011121471/10 A RU2011121471/10 A RU 2011121471/10A RU 2011121471 A RU2011121471 A RU 2011121471A RU 2495934 C2 RU2495934 C2 RU 2495934C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
light chain
mutein
enterokinase
precursor
human
Prior art date
Application number
RU2011121471/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2011121471A (en
Inventor
Надежда Александровна Орлова
Иван Иванович Воробьев
Виктор Александрович Мацкевич
Иван Владимирович Звягин
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ")
Priority to RU2011121471/10A priority Critical patent/RU2495934C2/en
Publication of RU2011121471A publication Critical patent/RU2011121471A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2495934C2 publication Critical patent/RU2495934C2/en

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, and represents a method of producing a recombinant mutein [C112S] of human enterokinase light chain, using a bacterium belonging to the genus Escherichia, transformed with an expression plasmid containing a DNA fragment encoding a mutein [C112S] inactive precursor of human enterokinase light chain, comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal peptide comprising a hexahistidine cluster and the enterokinase recognition sequence, and a sequence fused with it in frame encoding a precursor of mutein [C112S] of human enterokinase light chain with non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster under control of a promoter operating in the bacterial cell.
EFFECT: invention enables to produce the recombinant mutein of human enterokinase light chain with a high yield.
11 cl, 5 dwg, 1 tbl, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения ферментативно активного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с высоким выходом.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a technology for the production of biologically active substances (BAS) by genetic engineering methods, more specifically, to methods for producing an enzymatically active mutein [C112S] human light chain enterokinase in high yield.

Предшествующий уровень техники.The prior art.

Энтерокиназа (синоним: энтеропептидаза) - это сериновая протеиназа (шифр Международного Классификатора Ферментов ЕС 3.4.21.9), физиологический активатор трипсина с высокой избирательностью гидролиза пептидной связи Lys-X в сайте узнавания -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X-, где Х - любая аминокислота, кроме пролина (Light A. and Janska H., The amino-terminal sequence of the catalytic subunit of bovine enterokinase. J. Protein Chem., 1991, 10(5): 475-480). Энтерокиназа человека - мембранный белок, продуцируемый преимущественно энтероцитами двенадцатиперстной кишки (Grant, D.A.W.; Hermon-Taylor, J.; Enterokinase. Methods Enzym. Anal., 3rd Ed. (Bergmeyer, H.U., ed.) 5, 143-155 (1984)) и состоящий в зрелой форме из двух цепей, соединенными дисульфидной связью - тяжелой цепи (120 кДа) и легкой цепи (47 кДа). Протеолитическая активность энтерокиназы полностью обуславливается ее легкой цепью, удаление тяжелой цепи белка также практически не влияет на специфичность фермента в отношении искуственных субстратов, но понижает каталитическую эффективность энтерокиназы в отношении ее природного субстрата - трипсиногена (В.В.Лихарева, Б.В.Васьковецкий, H.Э.Шепель, С.К.Гаранин, А.Г.Михайлова, Л.Д.Румш. Новые субстраты энтеропептидазы 1. Биологически активные гепта-нонапептиды. Биоорганическая химия, 2003, том 29, №2, с.129-134).Enterokinase (synonym: enteropeptidase) is a serine proteinase (cipher of the International Classification of Enzymes EU 3.4.21.9), a physiological trypsin activator with high selectivity for the hydrolysis of the Lys-X peptide bond at the recognition site-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X-, where X is any amino acid except proline (Light A. and Janska H., The amino-terminal sequence of the catalytic subunit of bovine enterokinase. J. Protein Chem., 1991, 10 (5): 475-480). Human enterokinase is a membrane protein primarily produced by enterocytes of the duodenum (Grant, DAW; Hermon-Taylor, J .; Enterokinase. Methods Enzym. Anal., 3rd Ed. (Bergmeyer, HU, ed.) 5, 143-155 (1984) ) and consisting in mature form of two chains connected by a disulfide bond - a heavy chain (120 kDa) and a light chain (47 kDa). The proteolytic activity of enterokinase is completely determined by its light chain, the removal of the heavy chain of the protein also practically does not affect the specificity of the enzyme in relation to artificial substrates, but reduces the catalytic efficiency of enterokinase in relation to its natural substrate, trypsinogen (V.V. Likhareva, B.V. Vaskovetsky, H.E. Shepel, S.K. Garanin, A.G. Mikhaylova, L.D. Rumsh. New substrates of enteropeptidase 1. Biologically active hepta-nonapeptides. Bioorganic chemistry, 2003, volume 29, No. 2, p.129- 134).

В силу того, что высокая субстратная специфичность энтерокиназы имеет важное физиологическое значение, последовательность узнавания энтерокиназы -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- встречается только в составе активационных пептидов трипсиногенов. Это обстоятельство делает энтерокиназу чрезвычайно удобной специфической протеазой для получения биотехнологических лекарственных средств. Введение последовательности узнавания энтерокиназы непосредственно перед первым аминокислотным остатком зрелой формы целевого белка позволяет специфически разделять слитой белок или отделять от целевого белка N-концевой пептид и, таким образом, получать рекомбинантный белок без дополнительных аминокислотных остатков.Due to the fact that the high substrate specificity of enterokinase has important physiological significance, the recognition sequence of enterokinase-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- is found only in the composition of trypsinogen activation peptides. This fact makes enterokinase an extremely convenient specific protease for biotechnological drugs. The introduction of the enterokinase recognition sequence immediately before the first amino acid residue of the mature form of the target protein allows specific separation of the fusion protein or the N-terminal peptide from the target protein and, thus, to obtain a recombinant protein without additional amino acid residues.

Получение слитых белков или белков-предшественников с отделяемым N-концевым пептидом является предпочтительным способом биосинтеза гетерологичных белков для медицинского применения в бактериальной системе экспрессии Е.coli, поскольку способность Е.coli секретировать белки с лидерными пептидами довольно ограничена, а цитоплазматическая экспрессия неизбежно приводит к появлению продуктов с дополнительным остатком метионина на N-конце белка, что приводит к его иммуногенности и падению клинической эффективности.The preparation of fusion proteins or precursor proteins with a separable N-terminal peptide is the preferred method for biosynthesis of heterologous proteins for medical use in the bacterial expression system of E. coli, since the ability of E. coli to secrete proteins with leader peptides is rather limited, and cytoplasmic expression inevitably leads to products with an additional methionine residue at the N-terminus of the protein, which leads to its immunogenicity and a decrease in clinical efficacy.

Очевидным источником для выделения энтерокиназы является внутренняя выстилка двенадцатиперстной кишки крупного рогатого скота или свиней (Anderson LE, Walsh KA, Neurath H. Biochemistry, 1977, 16(15):3354-3360), при этом выделяемая энтерокиназа будет загрязнена сходными с ней протеолитическими ферментами и потенциально может содержать вирусы или прионы млекопитающих.An obvious source for the isolation of enterokinase is the internal lining of the duodenum of cattle or pigs (Anderson LE, Walsh KA, Neurath H. Biochemistry, 1977, 16 (15): 3354-3360), and the excreted enterokinase will be contaminated with proteolytic enzymes similar to it and could potentially contain mammalian viruses or prions.

Более предпочтительной для использования в биотехнологическом производстве является рекомбинантная энтерокиназа, точнее рекомбинантная легкая цепь энтерокиназы человека. Использование рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека вместо более распространенных вариантов энтерокиназы крупного рогатого скота позволяет полностью избежать загрязнения препаратов целевых белков следами потенциально иммуногенной для человека энтерокиназы крупного рогатого скота. Следует отметить, что выявление следовых количеств энтерокиназы, и, в особенности, следовых количеств ферментативно неактивных протеолитических фрагментов энтерокиназы в препаратах очищенных рекомбинантных белков для медицинского применения практически невозможно.Recombinant enterokinase, more specifically the recombinant human enterokinase light chain, is more preferred for use in biotechnological production. The use of a recombinant human enterokinase light chain instead of the more common variants of cattle enterokinase allows one to completely avoid contamination of target protein preparations with traces of cattle enterokinase potentially immunogenic for humans. It should be noted that the identification of trace amounts of enterokinase, and, especially, trace amounts of enzymatically inactive proteolytic fragments of enterokinase in preparations of purified recombinant proteins for medical use is practically impossible.

Рекомбинантная легкая цепь энтерокиназы была успешно получена в большинстве распространенных систем экспрессии гетерологичных генов, в том числе Esherichia coli (патент США 6746859), дрожжах Saccharomyces cerevisae (Choi SI, Song HW, Moon JW, Seong BL. Recombinant enterokinase light chain with affinity tag: expression from Saccharomyces cerevisiae and its utilities in fusion protein technology. Biotechnol Bioeng. 2001; 75(6):718-24) и Pichia pastoris (Vozza LA, Wittwer L, Higgins DR, Purcell TJ, Bergseid M, Collins-Racie LA, LaVallie ER, Hoeffler JP. Production of a recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechnology (N Y). 1996; 14(1):77-81), мицелиальных грибах Aspergillus (Svetina M, Krasevec N, Gaberc-Porekar V, Komel R. Expression of catalytic subunit of bovine enterokinase in the filamentous fungus Aspergillus niger. J Biotechnol. 2000; 76(2-3):245-51) и культивируемых клетках млекопитающих COS-1 (LaVallie ER, Rehemtulla A, Racie LA, DiBlasio EA, Ferenz C, Grant KL, Light A, McCoy JM. Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase. J Biol Chem. 1993; 268(31):23311-7).Recombinant enterokinase light chain has been successfully obtained in most common heterologous gene expression systems, including Esherichia coli (US Pat. No. 6746859), Saccharomyces cerevisae yeast (Choi SI, Song HW, Moon JW, Seong BL. Recombinant enterokinase light chain with affinity tag: expression from Saccharomyces cerevisiae and its utilities in fusion protein technology. Biotechnol Bioeng. 2001; 75 (6): 718-24) and Pichia pastoris (Vozza LA, Wittwer L, Higgins DR, Purcell TJ, Bergseid M, Collins-Racie LA, LaVallie ER, Hoeffler JP. Production of a recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechnology (NY). 1996; 14 (1): 77-81), Aspergillus mycelium fungi (Svetina M, Krasevec N, Gaberc- Porekar V, Komel R. Expression of catalytic subunit of bovine ente rokinase in the filamentous fungus Aspergillus niger. J Biotechnol. 2000; 76 (2-3): 245-51) and cultured mammalian cells COS-1 (LaVallie ER, Rehemtulla A, Racie LA, DiBlasio EA, Ferenz C, Grant KL, Light A, McCoy JM. Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit of bovine enterokinase. J Biol Chem. 1993; 268 (31): 23311-7).

Предпочтительной системой экспрессии энтерокиназы являются бактерии Е.coli, поскольку получаемый белок или его предшественник не подвергается гликозилированию и соответственно будет лишен антигенных детерминант олигосахаридов дрожжей. Удельная ферментативная активность гликозилированной и негликозилированной форм легкой цепи энтерокиназы практически не различается (патент США 6746859).E. coli bacteria are the preferred enterokinase expression system because the resulting protein or its precursor does not undergo glycosylation and, accordingly, will be deprived of the antigenic determinants of yeast oligosaccharides. The specific enzymatic activity of the glycosylated and non-glycosylated forms of the light chain of enterokinase is practically the same (US Pat. No. 6746859).

Протеолитическая активность энтерокиназы полностью исчезает при добавлении к N-концу легкой цепи любых аминокислотных остатков, вследствие этого прямая цитоплазматическая экспрессия гена легкой цепи энтерокиназы в Е.coli не приводит к появлению активного продукта (Song HW, Choi SI, Seong BL, Engineered recombinant enteropeptidase catalytic subunit: effect of N-terminal modification. Arch Biochem Biophys. 2002; 400(1):1-6). Для получения в Е.coli легкой цепи энтерокиназы без дополнительных аминокислотных остатков на N-конце могут быть применены два известных основных подхода - добавление к последовательности ДНК, кодирующей легкую цепь энтерокиназы, распознаваемого бактериями лидерного пептида или слияние последовательности ДНК, кодирующей легкую цепь энтерокиназы, в рамке с последовательностями, кодирующими белки-партнеры, например, тиоредоксин I, дисульфидизомеразу А, глутатион-S-трансферазу или мальтозо-связывающий белок. Домены белка-партнера и легкой цепи энтерокиназы при этом могут быть соединены линкерным участком, включающим сайт узнавания энтерокиназы -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-, непосредственно предшествующий первому аминокислотному остатку Ile легкой цепи энтерокиназы. В таком случае ферментативное разделение белка-партнера и интактной легкой цепи энтерокиназы может быть проведено аутокаталитически после добавления небольшого стартового количество ферментативно активной энтерокиназы.The proteolytic activity of enterokinase completely disappears when any amino acid residues are added to the N-terminus of the light chain; as a result, direct cytoplasmic expression of the enterokinase light chain gene in E. coli does not lead to the appearance of an active product (Song HW, Choi SI, Seong BL, Engineered recombinant enteropeptidase catalytic subunit: effect of N-terminal modification. Arch Biochem Biophys. 2002; 400 (1): 1-6). To obtain enterokinase light chain in E. coli without additional amino acid residues at the N-terminus, two well-known basic approaches can be used: adding a DNA encoding the light chain of enterokinase recognized by the leader peptide bacteria to the sequence or fusing the DNA sequence encoding the enterokinase light chain into framed with partner protein coding sequences, for example, thioredoxin I, disulfidisomerase A, glutathione S-transferase or maltose binding protein. The domains of the partner protein and enterokinase light chain can be connected by a linker site, including the enterokinase recognition site-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-, immediately preceding the first amino acid residue Ile of the enterokinase light chain. In this case, the enzymatic separation of the partner protein and the intact enterokinase light chain can be performed autocatalytically after adding a small starting amount of the enzymatically active enterokinase.

Второй подход к получению рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы с интактным N-концом является более распространенным, с его применением был получен ряд препаратов энтерокиназы с значительным выходом продукта и высокой удельной активностью. Так, в работе (Huang L, Ruan H, Gu W, Xu Z, Cen P, Fan L. Functional expression and purification of bovine enterokinase light chain in recombinant Escherichia coli. Prep Biochem Biotechnol. 2007; 37(3):205-17) при использовании белка-партнера дисульфидизомеразы A (DsbA) была достигнута конечная продуктивность 6,8 мг активной энтерокиназы быка на 1 литр бактериальной культуры. В случае белка-партнера тиоредоксина I была достигнута продуктивность 43 мг активной энтерокиназы быка на 1 л культуры (Yuan LD, Hua ZC. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2002; 2 5(2):300-4), при этом отделение энтерокиназы от белка-партнера происходило аутокаталитически in vivo, свободную энтерокиназу извлекали из фракции растворимых цитоплазматических белков и подвергали многостадийной хроматографической очистке. Особенно высокий выход активной легкой цепи энтерокиназы быка - 106 мг на 1 л культуры - был достигнут в работе (Tan H, Wang J, Zhao ZK. Purification and refolding optimization of recombinant bovine enterokinase light chain overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2007; 56(1):40-7. Epub 2007 Jul 18) при использовании глутатион-S-трансферазы в качестве белка-партнера.The second approach to obtaining a recombinant enterokinase light chain with an intact N-terminus is more common, with its use a number of enterokinase preparations with a significant yield and high specific activity were obtained. Thus, in (Huang L, Ruan H, Gu W, Xu Z, Cen P, Fan L. Functional expression and purification of bovine enterokinase light chain in recombinant Escherichia coli. Prep Biochem Biotechnol. 2007; 37 (3): 205- 17) using the partner protein of disulfide isomerase A (DsbA), the final productivity of 6.8 mg of bovine active enterokinase per 1 liter of bacterial culture was achieved. In the case of the partner protein of thioredoxin I, a productivity of 43 mg of bovine active enterokinase per 1 liter of culture was achieved (Yuan LD, Hua ZC. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2002; 2 5 (2): 300-4), while the separation of enterokinase from the partner protein occurred autocatalytically in vivo, free enterokinase was removed from the soluble cytoplasmic protein fraction and subjected to multistage chromatographic purification. A particularly high yield of the active light chain of bovine enterokinase - 106 mg per 1 liter of culture - was achieved in (Tan H, Wang J, Zhao ZK. Purification and refolding optimization of recombinant bovine enterokinase light chain overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2007 ; 56 (1): 40-7. Epub 2007 Jul 18) when using glutathione-S-transferase as a partner protein.

Препараты рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека были получены по аналогичной схеме с использованием тиоредоксина в качестве белка-партнера (Yuan LD, Hua ZC. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2002 Jul; 25(2):300-4), при этом слитой белок накапливался в нерастворимой форме, и выход конечного продукта был достаточно низок. В независимой работе (Yi JH, Zhang YX. [Refolding of the fusion protein of recombinant enterokinase light chain rEKL]. [Article in Chinese] Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2006 Sep; 22(5):811-5) был применен белок-партнер DsbA и выход конечного продукта увеличен до 60 мг/л культуры.Recombinant human enterokinase light chain preparations were prepared according to a similar scheme using thioredoxin as a partner protein (Yuan LD, Hua Z. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2002 Jul ; 25 (2): 300-4), while the fusion protein accumulated in an insoluble form, and the yield of the final product was quite low. In an independent paper (Yi JH, Zhang YX. [Refolding of the fusion protein of recombinant enterokinase light chain rEKL]. [Article in Chinese] Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2006 Sep; 22 (5): 811-5) was applied DsbA partner protein and the yield of the final product is increased to 60 mg / L culture.

Все перечисленные выше примеры получения рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы обладают основным неустранимым недостатком - неизбежным присутствием в препарате очищенной энтерокиназы остаточных количеств слитого белка, включающего иммуногенный для человека домен белка-партнера, как правило, бактериального происхождения. Чувствительные методы контроля остаточного уровня белка-партнера в препаратах рекомбинантной энтерокиназы являются весьма дорогостоящими и требуют использования антител к белку-партнеру. Вследствие этого получение рекомбинантной негликозилированной легкой цепи энтерокиназы человека с высоким выходом и без использования белков-партнеров представляет большой интерес для фармацевтической промышленности.All of the above examples of the preparation of a recombinant enterokinase light chain have the main irreparable disadvantage - the inevitable presence in the preparation of purified enterokinase of residual amounts of a fusion protein, including the immunogenic domain of a partner protein, usually of bacterial origin, for humans. Sensitive methods to control the residual level of the partner protein in recombinant enterokinase preparations are very expensive and require the use of antibodies to the partner protein. As a result, the preparation of a recombinant non-glycosylated human enterokinase light chain with a high yield and without the use of partner proteins is of great interest to the pharmaceutical industry.

Другим существенным недостатком описанных выше примеров является наличие непарного остатка цистеина в положении 112 легкой цепи энтерокиназы, который образует дисульфидную связь с остатком цистеина тяжелой цепи в природном белке. При выделении легкой цепи энтерокиназы из природных источников данный остаток цистеина обычно остается связанным с цистеином короткого остаточного пептида тяжелой цепи, в то время как у рекомбинантных вариантов легкой цепи энтерокиназы он должен находиться в восстановленном состоянии, что уменьшает стабильность фермента и потенциально может приводить к дисульфидному обмену с остатками цистеина расщепляемых энтерокиназой целевых белков и образованию ковалентных мультимеров.Another significant drawback of the examples described above is the presence of an unpaired cysteine residue at position 112 of the enterokinase light chain, which forms a disulfide bond with the heavy chain cysteine residue in the natural protein. When the enterokinase light chain is isolated from natural sources, this cysteine residue usually remains bound to the cysteine of the short residual heavy chain peptide, while in recombinant variants of the enterokinase light chain it should be in a reduced state, which reduces the stability of the enzyme and can potentially lead to disulfide exchange with cysteine residues of the target protein cleaved by enterokinase and the formation of covalent multimers.

Краткое описание настоящего изобретенияA brief description of the present invention

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии получения рекомбинантной негликозилированной легкой цепи энтерокиназы человека с более высоким выходом и без применения белков-партнеров.The technical problem solved by the authors was the creation of a technology for producing a recombinant non-glycosylated human enterokinase light chain with a higher yield and without the use of partner proteins.

Технический результат достигался путем создания технологии, включающей в себя новую экспрессионную плазмидную ДНК р6Е-hEK-6, кодирующую мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, создание штамма-продуцента E.coli на ее основе и технологию выделения рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека.The technical result was achieved by creating a technology including a new expression plasmid DNA p6E-hEK-6 encoding a human enterokinase light chain mutein [C112S], creating a producer strain E. coli based on it, and a human enterokinase recombinant light chain isolation technology.

В основе данного решения лежат разработанная авторами плазмидная ДНК р6Е-hEK-6 длиной 6031 п.о., кодирующая отщепляемый N-концевой лидерный пептид длиной 19 аминокислот, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека и последовательность, кодирующую неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер. Указанный фрагмент содержит оптимальные для Е.coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. Наличие короткого N-концевого пептида, практически не содержащего антигенных детерминант, позволяет проводить очистку ферментативно неактивного белка-предшественника в денатурирующих условиях при помощи металлохелатной хроматографии и проводить рефолдинг для очищенного белка-предшественника, что обычно приводит к значительному увеличению выхода ренатурированного целевого белка. Наличие неотщепляемого С-концевого гексагистидинового кластера позволяет удалять энтерокиназу из реакционной смеси при ее применении для расщепления гибридных белков и белков-предшественников.The basis of this solution is the 6031 bp plasmid DNA p6E-hEK-6 developed by the authors, encoding a cleavable N-terminal leader peptide of 19 amino acids in length, including a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence, a mutein coding sequence fused to it [ C112S] human enterokinase light chain and a sequence encoding a non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster. The indicated fragment contains codons optimal for E. coli, which allow increasing the expression level of the heterologous protein due to the effective translation of all amino acids of the polypeptide. The presence of a short N-terminal peptide that is practically free of antigenic determinants allows purification of the enzymatically inactive precursor protein under denaturing conditions using metal chelate chromatography and refolding of the purified precursor protein, which usually leads to a significant increase in the yield of the renatured target protein. The presence of a non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster allows removal of enterokinase from the reaction mixture when it is used to cleave fusion and precursor proteins.

Мутация [C112S] позволяет ренатурировать легкую цепь энтерокиназы человека с более высоким выходом, так как отсутствие непарного цистеина, который в природном белке участвует в образовании дисульфидной связи с тяжелой цепью, снижет вероятность установления межмолекулярных дисульфидных связей, т.е. образования ковалентных мультимеров.The mutation [C112S] allows one to renature the light chain of a human enterokinase with a higher yield, since the absence of unpaired cysteine, which in a natural protein is involved in the formation of a disulfide bond with a heavy chain, reduces the likelihood of establishing intermolecular disulfide bonds, i.e. the formation of covalent multimers.

Целью настоящего изобретения является предоставление экспрессионной плазмиды, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, и последовательность, кодирующую неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.The aim of the present invention is the provision of an expression plasmid containing a DNA fragment encoding a mutein [C112S] human enterokinase light chain comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence fused in frame with the mutein encoding sequence [C112S ] human enterokinase light chain, and the sequence encoding the non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster, under the control of a promoter, functioning him in a bacterial cell.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше экспрессионной плазмиды, где указанная плазмида представлена плазмидой p6E-hEK-6.It is also an object of the present invention to provide the expression plasmid described above, wherein said plasmid is represented by plasmid p6E-hEK-6.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной описанной выше плазмидой, - продуцента мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека.It is also an object of the present invention to provide a bacterium belonging to the genus Escherichia transformed with the plasmid described above, a producer of the human enterokinase mutein [C112S] light chain.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия представлена штаммом Е.coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above, wherein said bacterium is represented by E. coli strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6.

Также целью настоящего изобретения является предоставление предшественника рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, содержащего отщепляемый N-концевой пептид, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, а также неотщепляемый С-концевой пептид, содержащий гексагистидиновый кластер.It is also an object of the present invention to provide a recombinant mutein [C112S] precursor of a human enterokinase light chain comprising a cleavable N-terminal peptide comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence, as well as a non-cleavable C-terminal peptide containing a hexahistidine cluster.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, аутокаталитическое получение зрелого белка и выделение зрелого белка.Another objective of the present invention is the provision of a method for producing recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain, including culturing the bacteria described above in a nutrient medium, isolating inclusion bodies, solubilizing the precursor protein, denaturing metal chelate chromatography, refolding of the precursor protein, autocatalytic production of mature protein and the release of mature protein.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором культивируют штамм Е.coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6.It is also an object of the present invention to provide the method described above in which E. coli strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 is cultured.

Также целью настоящего изобретения является предоставление рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающего неотщепляемый С-концевой пептид, содержащий гексагистидиновый кластер, полученного описанным выше способом.It is also an object of the present invention to provide a recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain comprising a non-cleavable C-terminal peptide containing a hexahistidine cluster obtained by the method described above.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание способа получения рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с использованием бактерии, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой дополнительный пептид, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую рекомбинантный мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека и неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.To implement the present invention, the main technical problem was the creation of a method for producing recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain using a bacterium transformed with an expression plasmid containing a DNA fragment encoding a recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain precursor comprising a sequence that encodes a cleavable N -terminal additional peptide comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence, and fused to it is framed by a sequence encoding a recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain and non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster, under the control of a promoter that functions in a bacterial cell.

Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии предшественника рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.The term "expression plasmid" means plasmid DNA containing all the necessary genetic elements for the expression of a gene embedded in it, for example, such as a promoter, terminator. A specific example of the genetic elements necessary for the expression of the recombinant mutein [C112S] precursor of the human enterokinase light chain in the expression cassette of the present invention is, but is not limited to, the T7 bacteriophage RNA polymerase promoter.

Фрагментом ДНК, кодирующим предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой дополнительный пептид, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей рекомбинантный мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека и неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер. Указанный фрагмент ДНК может быть получен, например, методом ПНР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.The DNA fragment encoding the recombinant mutein precursor [C112S] of the human enterokinase light chain according to the present invention is, for example, a synthetic gene encoding the recombinant mutein [C112S] precursor of the human enterokinase light chain comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal additional peptide comprising hexahistide enterokinase recognition cluster and sequence fused to the sequence encoding the recombinant mutein [C112S] enteroca light chain Human neotscheplyaemy ase and C-terminal hexa-histidine cluster. The specified DNA fragment can be obtained, for example, by the method of Poland (see Example 1, Figure 1). Also, this DNA fragment can be obtained using the cloning technology of Sloning BioTechnology, described in PCT application WO2005071077.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в Е.coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей предшественник рекомбинаного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися в активно транслируемых генах Е.coli кодонами.In order to ensure efficient translation of the cloned gene into E. coli, it is preferable that in the sequence encoding the recombinant mutein [C112S] light chain precursor of human enterokinase, all rare codons are replaced by synonymous codons that are often found in actively translated E. coli genes.

Последовательность гена, кодирующего предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность предшественника рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность зрелого рекомбинаного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека представляет собой последовательность под номером SEQ ID NO:2 без 19 первых аминокислот.The sequence of the gene encoding the recombinant mutein precursor [C112S] human enterokinase light chain according to the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of the recombinant human enterokinase light chain precursor according to the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence of the mature recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain is the sequence number SEQ ID NO: 2 without the first 19 amino acids.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), кодирующей предшественник рекомбинаного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть выявлены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке и установления активности экспрессируемого продукта.DNA fragments that encode essentially the same protein can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment (SEQ ID NO: 1) encoding the precursor of the recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain, for example, using the site-directed method mutagenesis, so that one or more amino acid residues at a particular site will be deleted, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations. DNA fragments that encode essentially the same protein can be detected by expression of DNA fragments having the mutation described above in the corresponding cell and establishing the activity of the expressed product.

Энтерокиназа (синоним: энтеропептидаза) - это сериновая протеаза (шифр Международного Классификатора Ферментов ЕС 3.4.21.9), которая катализирует расщепление пептидной связи преимущественно после остатка лизина, более преимущественно между последовательностью аминокислот -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- и любой следующей аминокислотой, кроме пролина. Энтерокиназа человека - это мембранный гликозилированный белок, в зрелой форме состоящий из двух цепей, соединенных дисульфидными связями. Тяжелая цепь энтерокиназы имеет массу около 120 кДа, а легкая цепь - около 47 кДа. В организме Энтерокиназа осуществляет превращение трипсиногена в трипсин.Enterokinase (synonym: enteropeptidase) is a serine protease (cipher of the International Classification of Enzymes of the EU 3.4.21.9), which catalyzes the cleavage of the peptide bond mainly after the lysine residue, more preferably between the amino acid sequence-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- and any of the following amino acid, except proline. Human enterokinase is a membrane glycosylated protein in mature form consisting of two chains connected by disulfide bonds. The enterokinase heavy chain has a mass of about 120 kDa, and the light chain has a mass of about 47 kDa. In the body, Enterokinase converts trypsinogen to trypsin.

В силу того, что сайт узнавания энтерокиназы (-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-) относительно редко встречается в белках, энтеропептидаза широко используется в биотехнологии для расщепления рекомбинантных гибридных белков.Due to the fact that the enterokinase recognition site (-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-) is relatively rare in proteins, enteropeptidase is widely used in biotechnology to cleave recombinant fusion proteins.

Легкая цепь энтерокиназы является химотрипсиноподобной сериновой протеазой, обладает практически той же ферментативной активностью и специфичностью, что и полный белок.Enterokinase light chain is a chymotrypsin-like serine protease, has almost the same enzymatic activity and specificity as the full protein.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека, определяются по его протеолитической активности (его способности гидролизовать пептидную связь). Так, например, активность рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека можно детектировать по гидролизу синтетического субстрата как описано в Примере 5, либо по гидролизу слитых белков, содержащих сайт узнавания энтерокиназы, как описано в Примере 6. Считается, что вариант белка обладает свойствами рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека при условии, что активность указанного варианта составляет не ниже 1% активности нативной легкой цепи энтерокиназы человека.Indicators of functional activity, in which it is believed that the obtained protein has the properties of a recombinant human enterokinase light chain, are determined by its proteolytic activity (its ability to hydrolyze the peptide bond). For example, the activity of a recombinant human enterokinase light chain can be detected by hydrolysis of a synthetic substrate as described in Example 5, or by hydrolysis of fusion proteins containing an enterokinase recognition site, as described in Example 6. It is believed that the protein variant has the properties of a recombinant enterokinase light chain person, provided that the activity of this option is not less than 1% of the activity of the native light chain of human enterokinase.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой дополнительный пептид, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей рекомбинантный мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека и неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.The expression plasmid according to the present invention contains a DNA fragment encoding a human enterokinase light chain precursor of a recombinant mutein [C112S], comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal additional peptide comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence fused in conjunction with a recombinant coding sequence for recombinant [C112S] human enterokinase light chain and non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster, under the control of a promoter, func located in a bacterial cell.

В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, pET22b, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.As the recombinant plasmid of the present invention, various plasmids capable of expression in the recipient cell can be used, such as plasmids pBR322, pMW119, pUC19, pET22b, pET28b and the like, but the list of plasmids is not limited to them.

Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения являются плазмида, которая состоит из:A specific implementation of the present invention are a plasmid, which consists of:

1) фрагмента NheI-NcoI длиной 29 п.о., представляющего собой синтетический адаптер, кодирующий гексагистидиновый кластер;1) a 29 bp NheI-NcoI fragment, which is a synthetic adapter encoding a hexahistidine cluster;

2) фрагмента NcoI-HmdIII вектора рЕТ28а(+) длиной 5246 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона; последовательность, кодирующую С-концевой гексагистидиновый кластер;2) an NcoI-HmdIII fragment of vector pET28a (+) with a length of 5246 bp containing the region of the beginning of replication of the plasmid pBR322, the Rop-organizing Rop protein gene, the replication initiation site of bacteriophage f1, the sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, RNA promoter -polymerase bacteriophage T7; transcription termination site; a sequence encoding a repressor of a lactose operon; a sequence encoding a C-terminal hexahistidine cluster;

3) фрагмента NheI-HindIII длиной 756 п.о., кодирующего фрагмент рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой.3) a 756 bp NheI-HindIII fragment encoding a fragment of the recombinant human enterokinase light chain and a fused enterokinase recognition sequence.

Указанная плазмида содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: PsiI (371), PciI (2142), ApaI (4040), XbaI (5031), NheI (5099), PstI (5562), HindIII (5855).The indicated plasmid contains unique recognition sites for restriction endonucleases: PsiI (371), PciI (2142), ApaI (4040), XbaI (5031), NheI (5099), PstI (5562), HindIII (5855).

Структура плазмиды p6E-hEK-6 приведена на Фиг.2.The structure of the plasmid p6E-hEK-6 is shown in Figure 2.

При помощи созданной плазмиды можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащей к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии предшественника мутеина легкой цепи энтерокиназы человека может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.Using the created plasmid, it is possible to transform a bacterial cell, preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia, susceptible to such transformation by the indicated plasmid. The choice of a particular cell is not critical, since the methodology and methods of transformation are well known to those skilled in the art. Although the expression level of the human enterokinase light chain mutein precursor may vary depending on the type of cell and culturing conditions of the obtained transformant, the fact of expression of the target protein will take place subject to successful transformation of the recipient cell.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995)."Transformation of a cell with a plasmid" means the introduction of a plasmid into a cell using methods well known to those skilled in the art. Transformation with this plasmid leads to the expression of the gene encoding the protein of the present invention and to the synthesis of the protein in the bacterial cell. Transformation methods include any standard methods known to one skilled in the art, for example, the method described in Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка - продуцент предшественника мутеина легкой цепи энтерокиназы человека» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению предшественника мутеина легкой цепи энтерокиназы человека согласно настоящему изобретению, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка - продуцент предшественника мутеина рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека» также означает клетку, которая способна накапливать продукт предшественника мутеина легкой цепи энтерокиназы человека в количестве не менее чем 1 мг/л, более предпочтительно, не менее чем 40 мг/л. Указанный предшественник мутеина легкой цепи энтерокиназы человека накапливается в указанной клетке предпочтительно в виде телец включения.According to the present invention, “bacterial cell producing a human enterokinase light chain mutein precursor” means a bacterial cell having the ability to produce and accumulate a human enterokinase light chain mutein precursor according to the present invention when the bacterial cell according to the present invention is grown in said growth medium. As used herein, the term “bacterial cell producing the recombinant human enterokinase light chain mutein precursor producer” also means a cell that is capable of accumulating a human enterokinase light chain mutein precursor product in an amount of not less than 1 mg / L, more preferably not less than 40 mg / L . The specified precursor mutein of the human light chain enterokinase accumulates in the specified cell, preferably in the form of inclusion bodies.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник мутеина легкой цепи энтерокиназы человека.It is preferable to use a bacterium belonging to the genus Escherichia to transform a recombinant plasmid containing a DNA fragment encoding a human enterokinase light chain mutein precursor.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" may mean that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be given as examples.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента предшественника мутеина легкой цепи энтерокиназы человека согласно настоящему изобретению, является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].A specific example of a recipient strain for producing a human enterokinase light chain mutein precursor producer according to the present invention is, but is not limited to, Escherichia coli strain BL21 [DE3].

Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] is characterized by the following cultural, morphological, physiological and biochemical characters and genetic characters.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки, образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрия электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, канамицина сульфат 30 мкг/мл.Cultural and morphological features of the strain: gram-negative rods, form threads; on an agar medium — whitish large colonies with an uneven edge. The activity of the strain is determined by densitometry electrophoregram. The strain is stored under the following conditions: Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, 10% glycerol. The strain propagates under the following conditions - Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, kanamycin sulfate 30 μg / ml.

Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F- ompT gal dcm Ion hsdSB(rB - mB -)λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])Genetic features of the strain. The strain genotype is F - ompT gal dcm Ion hsdS B (r B - m B - ) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидой p6E-hEK-6 приводит к получению штамма-продуцента BL21[DE3]/p6E-hEK-6, который обеспечивает синтез рекомбинантного белка-предшественника мутеина легкой цепи энтерокиназы человека в количестве 30-70% от суммарного содержания белка клеток.Transformation of the Escherichia coli strain BL21 [DE3] with the plasmid p6E-hEK-6 yields the producer strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6, which provides the synthesis of recombinant human precursor protein mutein light chain enterokinase in an amount of 30-70% of total protein content of cells.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6 кодирует белок-предшественник 6Е-hEK-6, состоящий из аминокислотной последовательности мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, слитого с ним в рамке N-концевого пептида длиной 19 аминокислот, содержащего гексагистидиновый кластер, сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой мутеина легкой цепи энтерокиназы человека, и неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 encodes a 6E-hEK-6 precursor protein consisting of the amino acid sequence of the human enterokinase mutein [C112S] light chain fused to it in the frame of the 19-amino acid N-terminal peptide containing a hexahistidine cluster, an enterokinase cleavage site immediately in front of the first human enterokinase light chain mutein amino acid, and an non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster.

Способ получения мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, индукцию промотора гена предшественника мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, аутокаталитическое получение зрелого белка, инициируемое добавлением ферментативно активной энтерокиназы, и выделение указанного зрелого белка рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека.A method for producing a human enterokinase light chain mutein [C112S] according to the present invention includes culturing the bacterium described above in a culture medium suitable for growing said prokaryotic cells, inducing a human enterokinase light chain mutein [C112S] precursor gene promoter, isolating inclusion bodies, solubilizing the precursor protein , denaturing metal chelate chromatography, refolding of the precursor protein, autocatalytic production of the mature protein, initiated by the addition of the expression of an enzymatically active enterokinase; and the isolation of said mature recombinant mutein [C112S] light chain human enterokinase protein.

Особенности плазмиды и результаты ее практического применения приведены на следующих чертежах.Features of the plasmid and the results of its practical application are shown in the following drawings.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На Фигуре 1 показана схема сборки синтетического гена мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионной плазмиды p6E-hEK-6. Используются следующие обозначения: Полный предшественник h-EK; Protein ID AAC50138, 1019 а.к. - продукт экспрессии природного гена энтерокиназы человека; hEK-L[C112S]-PCR - продукт полимеразной цепной реакции, кодирующий мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека; 6xhis-hEK-L[C112S]-6xhis - продукт экспрессии плазмиды p6E-hEK-6. Пунктирная линия обозначает полимеразную цепную реакцию, сплошная - рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК.The Figure 1 shows the assembly scheme of the synthetic mutein gene [C112S] light chain human enterokinase from oligonucleotide primers and the scheme for obtaining the expression plasmid p6E-hEK-6. The following designations are used: Complete precursor h-EK; Protein ID AAC50138, 1019 a.k. - the product of expression of the natural human enterokinase gene; hEK-L [C112S] -PCR is a polymerase chain reaction product encoding a human enterokinase light chain mutein [C112S]; 6xhis-hEK-L [C112S] -6xhis is the expression product of the plasmid p6E-hEK-6. The dashed line indicates the polymerase chain reaction, the solid line indicates the restriction and ligation of DNA fragments.

На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды p6E-hEK-6. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «p6E-hEK-6» - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающего отделяемый N-концевой дополнительный пептид, содержащий гексагистидиновый кластер «6xhis», сайт узнавания энтерокиназой «EK-PRO», неотделяемый С-концевой гексагистидиновый кластер «6xhis»». Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.Figure 2 shows a map of the expression plasmid p6E-hEK-6. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "ROP" - gene of the RNA-organizing protein Rop; "F1 ori" is the site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "LacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "P6E-hEK-6" is an open reading frame (OPC) of a human enterokinase light chain mutein [C112S] precursor protein polypeptide comprising a detachable N-terminal additional peptide containing a 6xhis hexahistidine cluster, an EK-PRO enterokinase recognition site , non-separable C-terminal hexahistidine cluster "6xhis". The arrows indicate the directions of gene transcription, the numbers of the first and last nucleotides of the fragments are indicated in parentheses. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses.

На Фигуре 3 показана электрофореграмма тотального белка, фракций растворимого и нерастворимого белка клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/p6E-hEK-6 при индукции для двух случайно выбранных клонов. Культивация во встряхиваемой колбе, среда 2xYT, индукция 1 мМ ИПТГ, 37°С, 20 часов. Обозначения: T1 + и T2 + - тотальный белок после индукции, T1 - и T2 - - тотальный белок до индукции, S1 и S2 - фракция растворимых белков, I1 и I2 - фракция нерастворимых белков (тельца включения) для клонов 1 и 2 соответственно. М - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка указано стрелкой.Figure 3 shows the electrophoregram of the total protein, soluble and insoluble protein fractions of cells of the producer strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 upon induction for two randomly selected clones. Shake flask cultivation, 2xYT medium, induction of 1 mM IPTG, 37 ° C, 20 hours. Designations: T 1 + and T 2 + - total protein after induction, T 1 - and T 2 - - total protein before induction, S 1 and S 2 - fraction of soluble proteins, I 1 and I 2 - fraction of insoluble proteins (inclusion bodies ) for clones 1 and 2, respectively. M is a molecular weight marker. The molecular weights of the marker bands are indicated in kDa. The position of the target protein is indicated by the arrow.

На Фигуре 4 приведена электрофореграмма фракций белка-предшественника 6Е-hEK-6 при очистке металлохелатной хроматографией в денатурирующих условиях, рефолдинга и аутокаталитического процессинга. Восстанавливающие условия. Обозначения: "IB" - солюбилизированные тельца включения; "FF" - фракция проскока, "50-500" - фракции элюций соответствующими концентрациями имидазола, в мМ; "Е" - фракция элюата раствором ЭДТА-Na; "CLE" - зрелый белок hEK-6 после аутокаталитического процессинга N-концевого дополнительного пептида; "М" - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка указано стрелкой.The Figure 4 shows the electrophoregram of fractions of the protein precursor 6E-hEK-6 during purification by metal chelate chromatography under denaturing conditions, refolding and autocatalytic processing. Restorative conditions. Designations: "IB" - solubilized inclusion bodies; "FF" is the slip fraction, "50-500" is the elution fraction with the corresponding imidazole concentrations, in mM; "E" - eluate fraction with EDTA-Na solution; "CLE" - mature hEK-6 protein after autocatalytic processing of the N-terminal additional peptide; "M" is a molecular weight marker. The molecular weights of the marker bands are indicated in kDa. The position of the target protein is indicated by the arrow.

На Фигуре 5 показана электрофореграмма расщепления гибридного белка Trx-MOG очищенной энтерокиназой hEK-6. Невосстанавливающие условия. Обозначения: группа дорожек "1" - гидролиз гибридного белка при помощи hEK-6 в соотношении 1:200; дорожка "r" - реакционная смесь, дорожка "-" - фракция не связавшихся с металлохелатным сорбентом белков (MOG), дорожка "+" - фракция связавшихся с металлохелатным сорбентом белков, элюированных ЭДТА-Na (Trx, hEK-6). Группа дорожек "2" - гидролиз при помощи рекомбинантной энтерокиназы быка (Sigma, США) в соотношении 1:200; обозначения дорожек аналогично "I". Группа дорожек "no hEK-6" - контрольная инкубация гибридного белка без добавления энтерокиназ, обозначения дорожек аналогично "I". М - маркер молекулярных масс, массы приведены в кДа. Положения специфических продуктов распада гибридного белка Trx и MOG указаны стрелками.Figure 5 shows an electrophoregram of cleavage of the Trx-MOG fusion protein with purified hEK-6 enterokinase. Non-reducing conditions. Designations: group of tracks "1" - hydrolysis of the hybrid protein using hEK-6 in a ratio of 1: 200; lane "r" - reaction mixture, lane "-" - fraction of proteins not bound to the metal chelate sorbent (MOG), lane "+" - fraction of proteins bound to the metal chelate sorbent, eluted with EDTA-Na (Trx, hEK-6). Lane group 2 — hydrolysis using recombinant bovine enterokinase (Sigma, USA) in a ratio of 1: 200; track designations are similar to "I". Lane group "no hEK-6" - control incubation of the hybrid protein without the addition of enterokinases, the lane designations are similar to "I". M is a marker of molecular weights; weights are given in kDa. The positions of the specific breakdown products of the Trx and MOG fusion protein are indicated by arrows.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК pAL-hEKExample 1. Obtaining plasmid DNA pAL-hEK

Для аминокислотной последовательности, включающей легкую цепь энтерокиназы человека с добавленным 19-аминокислотным N-концевым пептидом (SEQ ID NO:3), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в Е.coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов.For the amino acid sequence including the human enterokinase light chain with the added 19-amino acid N-terminal peptide (SEQ ID NO: 3) containing the enterokinase recognition sequence, reverse translation was performed to the DNA nucleotide sequence. In this case, codons optimal for the expression of this gene in E. coli class B were used, and the structure of the gene was optimized for the secondary structure of the mRNA, GC composition, and the absence of undesirable regulatory elements (for example, the absence of internal ribosome binding sites) was ensured, as well as lack of extended repetitions, palindromes.

Индекс CAI (Codon Adaptation Index), отражающий эффективность экспрессии гена в данном организме, для полученной последовательности составил 0,7, что является хорошим прогностическим показателем для промышленной пригодности полученного на его основе штамма-продуцента. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:4.The CAI (Codon Adaptation Index) index, reflecting the efficiency of gene expression in a given organism, for the obtained sequence was 0.7, which is a good prognostic indicator for the industrial suitability of the producer strain obtained on its basis. The obtained nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4.

Синтетический ген рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека собирали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами AS-EKL-F1 - AS-EKL-F7 и AS-EKL-R1 - AS-EKL-R7 (SEQ ID NO:5-18), последовательности которых приведены в Таблице 1.The human recombinant enterokinase synthetic light chain gene was assembled by polymerase chain reaction (PCR) with primers AS-EKL-F1 — AS-EKL-F7 and AS-EKL-R1 — AS-EKL-R7 (SEQ ID NO: 5-18), the sequences of which are shown in Table 1.

ПЦР проводили на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Препаративные реакции проводили в объеме 50 мкл. Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пМ каждого праймерного олигонуклеотида; 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация - 94°С, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°С, 30 сек, отжиг 62°С 30 сек, наращивание цепи 72°С, 120 сек; 1 цикл - наращивание цепи 72°С, 10 мин.PCR was performed on a Tertsik MS2 instrument (DNA Technology, Russia). Preparative reactions were carried out in a volume of 50 μl. An incubation mixture of the following composition was prepared: 1x buffer for thermostable DNA polymerase; 10 pM of each primer oligonucleotide; 2 mM each deoxyribonucleotide triphosphate; 2 units thermostable DNA polymerase. 50 μl of mineral oil was layered on top of this mixture and amplified according to the scheme: 1 cycle - denaturation - 94 ° C, 3 min; 25 cycles - denaturation 94 ° С, 30 sec, annealing 62 ° С 30 sec, chain extension 72 ° С, 120 sec; 1 cycle - chain extension 72 ° С, 10 min.

Продукты ПЦР выделяли из 1% агарозного геля, используя набор реактивов «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega», США) по протоколу производителя, после чего лигировали в Т-вектор pGEM-T («Promega», США) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора («Fermentas», Литва). Лигирование вели в объеме 10 мкл при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°С в течение 45 секунд и инкубировали на льду в течение 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона LB и инкубировали при 37°С в течение 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37°С.PCR products were isolated from 1% agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System reagent kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol, and then they were ligated into the pGEM-T T-vector (Promega, USA ) using T4 phage DNA ligase and standard buffer solution (Fermentas, Lithuania). Ligation was carried out in a volume of 10 μl with a molar ratio of vector and insert 1:10, for 2-20 hours at room temperature. The obtained ligase mixtures transformed E. coli cells of strain DH5α, with the genotype F-φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r k -, m k +) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. For this, 5 μl of the ligase mixture was added to 200 μl of a frozen E. coli cell suspension, incubated on ice for 20 minutes to sorb plasmid DNA, heated to 42 ° C for 45 seconds, and incubated on ice for 5 minutes. Then 800 μl of LB nutrient broth was added and incubated at 37 ° C for 60 minutes. After incubation, the suspension was transferred to a Petri dish with a solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / 1 ml of agar, and placed in a thermostat for 18 hours at 37 ° C.

Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды T7prom (SEQ ID NO:19) и SP6 (SEQ ID NO:20). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона LB и проводили выделение плазмидной ДНК набором реактивов «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя, первичную нуклеотидную последовательность конструкции pAL-hEK подтверждали методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:19) и SP6 (SEQ ID NO:20).E. coli colonies selected as a result of blue-white screening were analyzed by clone PCR using primers for the recipient plasmid sequences T7prom (SEQ ID NO: 19) and SP6 (SEQ ID NO: 20). Selected clones were grown in 5 ml LB nutrient broth and plasmid DNA was isolated using the Wizard Plus SV Minipreps reagent kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol, the primary nucleotide sequence of the pAL-hEK construct was confirmed by PCR sequencing using T7prom primers ( SEQ ID NO: 19) and SP6 (SEQ ID NO: 20).

После этого проводили препаративную рестрикцию плазмиды pAL-hEK эндонуклеазами рестрикции NheI и HindIII. Продукты реакции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли с помощью набора реактивов Wizard SV Gel&PCR Clean-Up System no методике производителя донорный фрагмент для получения экспрессионной плазмиды р6Е-hEK-6.After that, preparative restriction of the plasmid pAL-hEK with restriction endonucleases NheI and HindIII was performed. The reaction products were separated on a 1% agarose gel and isolated using the Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System no. Reagent kit according to the manufacturer's method of the donor fragment to obtain the expression plasmid p6E-hEK-6.

Пример 2. Получение векторной плазмиды р6Е.Example 2. Obtaining a vector plasmid p6E.

Последовательность, кодирующую фрагмент N-концевого пептида, включающего гексагистидиновый кластер, получали методом отжига двух частично комплиментарных олигонуклеотидов AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:21) и AD-6H-NheR (SEQ ID NO:22) с образованием выступающих «липких» 5'-концов. Для этого вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.The sequence encoding a fragment of the N-terminal peptide comprising the hexahistidine cluster was obtained by annealing two partially complementary oligonucleotides AD-6H-NcoF (SEQ ID NO: 21) and AD-6H-NheR (SEQ ID NO: 22) with the formation of protruding "sticky" 5'-ends. For this, 100 pm of each oligonucleotide was introduced into the test tube, heated to 95 ° C, and slowly cooled to room temperature.

Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen) расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и NheI. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали в течение 2 часов при 37°C с каждой из рестриктаз, затем контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид (в пределах чувствительности метода), после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали в течение еще 2 часов. Затем пробы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Рестрицированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл. Выделенные фрагменты лигировали с использованием Т4 ДНК лигазы («Fermentas», Литва) по методике производителя. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:21) и T7t (SEQ ID NO:23). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Для полученных генетических конструкций р10Е определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7t (SEQ ID NO:23).The recipient plasmid pET28a (+) (Novagen) was sequentially digested with each of the NcoI and NheI endonucleases. First, aliquots of the plasmid were incubated for 2 hours at 37 ° C with each of the restriction enzymes, then the complete linearization of the plasmids was controlled by agarose gel electrophoresis (within the sensitivity of the method), after which a second restriction enzyme was added and incubated for another 2 hours. Then the samples were combined, the restriction enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes. The restricted plasmid was reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for 10 minutes at a speed of 13200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water, and used to set up a ligation reaction at a working concentration of 10 -2 μg / μl. The isolated fragments were ligated using T4 DNA ligase (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's procedure. After that, cells of E. coli strain DH5α were transformed, as described above. E. coli colonies were analyzed by clone PCR using AD-6H-NcoF oligonucleotides (SEQ ID NO: 21) and T7t (SEQ ID NO: 23). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol. For the obtained p10E genetic constructs, the DNA nucleotide sequence was determined by PCR sequencing with T7t primer (SEQ ID NO: 23).

Пример 3. Получение экспрессионной плазмидной ДНК р6Е-hEK-6.Example 3. Obtaining expression plasmid DNA p6E-hEK-6.

Реципиентную плазмиду р6Е расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали в течение еще 2 часов. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Рестрицированную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10-2 мкг/мкл.The recipient plasmid p6E was sequentially digested with each of the endonucleases NheI and HindIII. First, aliquots of the plasmid were incubated for 2 hours at 37 ° C with each of the restriction enzymes, the linearization of the plasmids was monitored by agarose gel electrophoresis, then a second restriction enzyme was added and incubated for another 2 hours. Then the samples were combined, the enzymes were inactivated by heating at 65 ° C for 20 minutes, and alkaline phosphatase dephosphorylation (Fermentas, Lithuania) was performed according to the manufacturer's protocol. Alkaline phosphatase was inactivated by heating to 85 ° C for 20 minutes. The restricted and dephosphorylated plasmid was reprecipitated with 3 volumes of ethanol, centrifuged for 10 minutes at a speed of 13200 rpm at room temperature, the precipitate was washed with 70% alcohol, dissolved in water and used to set up a ligation reaction at a working concentration of 10 -2 μg / μl.

Реакцию лигирования очищенного фрагмента, соответствующего минигену энтерокиназы и реципиентной плазмиды, проводили, как описано выше. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше.The ligation reaction of the purified fragment corresponding to the enterokinase minigen and the recipient plasmid was carried out as described above. After that, cells of E. coli strain DH5α were transformed, as described above.

Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:19) и T7t (SEQ ID NO:23). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя. При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции р6Е-hEK-6 определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:19) и T7t (SEQ ID NO:23). В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена мутеина легкой цепи энтерокиназы человека. Карта конструкции приведена на Фиг.2.E. coli colonies were analyzed by PCR from clones from primers T7prom (SEQ ID NO: 19) and T7t (SEQ ID NO: 23). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan nutrient broth, plasmid DNA was isolated with the Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol. Using PCR sequencing for the p6E-hEK-6 construct, the nucleotide sequence of both complementary DNA strands was determined for the insertion region using primers T7prom (SEQ ID NO: 19) and T7t (SEQ ID NO: 23). As a result of sequencing, it was found that the obtained plasmid preparation does not contain mutations in the insertion region, i.e., the correct sequence of the human enterokinase light chain mutein gene is encoded. The design map is shown in Fig.2.

Пример 4. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6, оценка продуктивности штамма-продуцента и локализация целевого белка.Example 4. Obtaining a producer strain of E. coli BL21 [DE3] / p6E-hEK-6, evaluating the productivity of the producer strain and localization of the target protein.

Для получения штамма-продуцента мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека конструкцию, полученную по примеру 3, использовали для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) (с генотипом F- ompT hsdSa (r-m-) gal dcm (DE3)) и проводили отбор клонов, сохраняющих уровень биосинтеза рекомбинантного полипептида после индукции не ниже 30% от суммарного клеточного белка в течение, по крайней мере, четырех последовательных пассажей. Для получения штамма Е.coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6 - продуцента белка-предшественника мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека клетки штамма Е.coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой р6Е-hEK-6. Трансформанты Е.coli BL21[DE3] высевали на агаризованную среду 2xYT с добавлением канамицина до 30 мкг/мл и глюкозы до 2%, проводили индукцию экспрессии целевого гена для пяти случайно выбранных колоний трансформантов с типичным фенотипом колоний. Клоны подращивали в питательном бульоне с добавлением канамицина до 30 мкг/мл и раствора глюкозы до 2% в течение 6-7 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 2 О.Е., индуцировали изопропилтио-β-D-галактозидом (ИПТГ) и культивировали в течение еще 16 ч. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-X100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию в течение 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка и фракций растворимых и нерасторимых белков для двух колоний штамма BL21[DE3]/p6E-hEK-6 приведены на Фиг.3.To obtain a producer strain of mutein [C112S] human enterokinase light chain, the construct obtained in Example 3 was used to transform competent Escherichia coli cells BL21 (DE3) (with the genotype F-ompT hsdSa (rm-) gal dcm (DE3)) and performed selection of clones that preserve the level of biosynthesis of the recombinant polypeptide after induction of at least 30% of the total cellular protein for at least four consecutive passages. To obtain E. coli strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6, a producer of the mutein [C112S] precursor protein of the human enterokinase light chain, cells of E. coli strain BL21 [DE3] were transformed with the expression plasmid p6E-hEK-6. E. coli BL21 [DE3] transformants were plated on 2xYT agar medium supplemented with kanamycin up to 30 μg / ml and glucose up to 2%, and target gene expression was induced for five randomly selected transformant colonies with a typical colony phenotype. Clones were grown in nutrient broth with the addition of kanamycin up to 30 μg / ml and glucose solution up to 2% for 6-7 hours, a new portion of the nutrient medium was inoculated with a ratio of 1: 100, the culture was grown until the optical density reached 2 O.E., induced isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) and cultured for another 16 hours. After cultivation, the cell pellet was centrifuged, the cells were resuspended in a solution of 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA-Na, 0.1% Triton-X100, 10 μg / ml lysozyme in the ratio of 10 ml of solution per 1 g of cell paste, allocated the suspension was burnt for 30 min on ice and the cells were destroyed by an ultrasonic disperser until the apparent viscosity of the suspension disappeared. Samples were taken for electrophoretic analysis, the soluble and insoluble fraction of proteins was separated by centrifugation in a microcentrifuge, the precipitate was additionally resuspended in the same solution, and precipitated by centrifugation. The results of electrophoretic analysis of total protein and fractions of soluble and insoluble proteins for two colonies of strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 are shown in Figure 3.

Электрофоретическая подвижность целевого белка соответствует расчетному значению. По данным гель-электрофореза белковых фракций целевой белок практически полностью локализован в нерастворимой фракции белков, т.е. находится в форме «телец включения».Electrophoretic mobility of the target protein corresponds to the calculated value. According to gel electrophoresis of protein fractions, the target protein is almost completely localized in the insoluble fraction of proteins, i.e. is in the form of a “inclusion body”.

Пример 5. Выделение, очистка, ренатурация и процессинг рекомбинантной легкой цепи энтерокиназы человека.Example 5. Isolation, purification, renaturation and processing of recombinant human enterokinase light chain.

Штамм-продуцент BL21[DE3]/p6E-hEK-6 высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 1% глюкозы, растили 14 часов при 37°С. Одну отдельную колонию штамма переносили в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 1% глюкозы, и растили на качалке в течение 14 часов при 37°С. Содержимым инокулировали 250 мл среды 2xYT, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 0,1% глюкозы, растили на качалке в течение 3,5 часов при 37°С, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили в течение еще 3-15 ч.The producer strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 was seeded from the museum with a loop by a draining stroke on a Petri dish with agarized LB medium containing 30 μg / ml kanamycin and 1% glucose, grown for 14 hours at 37 ° C. One single colony of the strain was transferred to 5 ml of LB liquid medium containing 30 μg / ml kanamycin and 1% glucose and grown on a shaker for 14 hours at 37 ° C. The contents were inoculated with 250 ml of 2xYT medium containing 30 μg / ml kanamycin and 0.1% glucose, grown on a shaker for 3.5 hours at 37 ° C, bacterial suspension samples were taken for analysis, IPTG was added to a final concentration of 1 mM and grown for another 3-15 hours

Осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис рН=7,4, 2 мМ ЭДТА), добавили лизоцим до 0,1 мг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали в течение 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 20000 об/мин. Осадок ресуспендировали в растворе А, добавляли детергент NP-40 до 1%, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 20000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в растворе А, добавляли NaCl до 500 мМ, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 20000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в растворе 50 мМ Трис рН=7,4 суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием в течение 10 мин при 20000 об/мин. Полученный осадок обогащенных телец включения хранили при -70°С.The cell pellet was separated by centrifugation, resuspended in 20 ml of solution A (50 mM Tris pH = 7.4, 2 mM EDTA), lysozyme up to 0.1 mg / ml and Triton X100 up to 0.1% were added, incubated for 30 min. ice. Cells and genomic DNA were destroyed using an ultrasonic disperser in 10 s pulses until the increased viscosity of the suspension disappeared. The precipitate was separated by centrifugation for 10 minutes at 20,000 rpm. The precipitate was resuspended in solution A, NP-40 detergent was added to 1%, the suspension was treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, and the precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The obtained precipitate was resuspended in solution A, NaCl was added to 500 mM, the suspension was treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, and the precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The resulting precipitate was resuspended in a solution of 50 mM Tris pH = 7.4, the suspension was treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, and the precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The resulting precipitate of enriched inclusion bodies was stored at -70 ° C.

Для проведения солюбилизации целевого белка к осадку телец включения добавляли раствор Б (8 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ бета-меркаптоэтанола, рН=9,5) в соотношении 10 мл раствора на 1 г осадка. Суспензию инкубировали при перемешивании 2 часа при +37°С, отделяли нерастворившийся клеточный дебрис центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Супернатант разбавляли в 5 раз раствором В (8М мочевины, 50 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН=8,0) для уменьшения конечной концентрации бета-меркаптоэтанола, отделяли выпавший осадок центрифугированием в течение 10 мин при 20000 об/мин и наносили супернатант на колонку с сорбентом Chelating Sepharose Fast Flow («GE Healthcare»,CUIA), содержащим хелатированные ионы никеля и уравновешенным раствором В. Последовательно промывали колонку раствором Г (8 М мочевины, 50 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН 7.0) и раствором Д (8 М мочевины, 50 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ имидазола рН=7,0) до стабилизации базовой линии. Элюировали очищенный белок растворами с концентрацией имидазола 100, 200 и 500 мМ и раствором Е (8 М мочевины, 50 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ ЭДТА-Na, рН=7,0). Элюат, содержащий очищенный белок-предшественник 6E-hEK-6, концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации общего белка 20 мг/мл и обессоливали, полученный раствор хранили в замороженном виде. Полипептид был очищен в денатурирующих условиях до видимой гомогенности (более 95% чистоты по денситометрии электрофореграммы, Фиг.4).To solubilize the target protein, solution B was added to the inclusion body precipitate (8 M urea, 50 mM Tris-HCl, 50 mM beta-mercaptoethanol, pH = 9.5) in the ratio of 10 ml of solution per 1 g of precipitate. The suspension was incubated with stirring for 2 hours at + 37 ° C, insoluble cell debris was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The supernatant was diluted 5 times with solution B (8M urea, 50 mm sodium phosphate, 500 mm sodium chloride, pH = 8.0) to reduce the final concentration of beta-mercaptoethanol, the precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm and applied column supernatant with a Chelating Sepharose Fast Flow sorbent (GE Healthcare, CUIA) containing chelated nickel ions and balanced solution B. The column was washed sequentially with solution G (8 M urea, 50 mm sodium phosphate, 500 mm sodium chloride, pH 7.0) and solution D (8 M urea, 50 mm sodium phosphate, 500 mm chlorine sodium ide, 50 mM imidazole, pH = 7.0) until stable baseline. The purified protein was eluted with solutions with an imidazole concentration of 100, 200 and 500 mM and solution E (8 M urea, 50 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, 50 mM EDTA-Na, pH = 7.0). The eluate containing the purified 6E-hEK-6 precursor protein was concentrated by ultrafiltration to a final concentration of total protein of 20 mg / ml and desalted; the resulting solution was stored frozen. The polypeptide was purified under denaturing conditions to apparent homogeneity (more than 95% purity by densitometry of the electrophoregram, Figure 4).

Для рефолдинга в растворе к размороженному раствору 6E-hEK-6 добавляли ДТТ до концентрации 10 мМ и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем белок разбавляли буферным раствором для рефолдинга (50 мМ ТРИС, рН=8,8, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ восстановленного глутатиона, 0,2 мМ окисленного глутатиона; 2 М мочевины) в соотношении 1:40 и инкубировали при комнатной температуре в течение 12-16 ч. После этого белок вновь концентрировали до 2 мг/мл ультрафильтрацией, вносили CaCl2 до 5 мМ, добавляли активную энтерокиназу ("Sigma", США) в молярном соотношении 1:1000 и вели аутокаталитическое отщепление N-концевого пептида в течение 16 ч при комнатной температуре. Полученный препарат зрелого белка hEK-6 обладал 50-90% удельной протеолитической активности в сравнении со стандартом рекомбинантной энтерокиназы ("Sigma", США). Ферментативную активность определяли при помощи синтетического субстрата GDDDDK-β-нафтиламид ("Sigma", США) по методике производителя субстрата.For refolding in solution, DTT was added to a thawed 6E-hEK-6 solution to a concentration of 10 mM and incubated at 37 ° C for 2 hours. Then, the protein was diluted with refolding buffer solution (50 mM TRIS, pH = 8.8, 2 mM EDTA, 2 mM reduced glutathione, 0.2 mM oxidized glutathione; 2 M urea) at a ratio of 1:40 and incubated at room temperature for 12-16 h. After that, the protein was again concentrated to 2 mg / ml by ultrafiltration, CaCl 2 was added to 5 mM, active enterokinase (Sigma, USA) was added in a 1: 1000 molar ratio, and the autocatalytic cleavage of the N-terminal peptide was carried out for 16 hours at room temperature. The resulting preparation of the mature protein hEK-6 possessed 50-90% specific proteolytic activity compared to the standard recombinant enterokinase (Sigma, USA). Enzymatic activity was determined using a synthetic substrate GDDDDK-β-naphthylamide (Sigma, USA) according to the method of the manufacturer of the substrate.

Пример 6. Расщепление модельного полипептида.Example 6. The cleavage of the model polypeptide.

Для проверки ферментативной активности препарата hEK-6 проводили расщепление модельного гибридного белка Trx-MOG, состоящего из N-концевого домена тиоредоксина I (Trx), линкерного участка, содержащего гексагистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназы, и непосредственно следующий за линкером внеклеточный домен миелинового олигодендроцитарного гликопротеина человека (MOG).To check the enzymatic activity of the hEK-6 preparation, the Trx-MOG model hybrid protein was cleaved, consisting of the N-terminal domain of thioredoxin I (Trx), a linker site containing a hexahistidine cluster and an enterokinase cleavage site, and the extracellular domain of myelin oligodendrocyter immediately following the linker human (MOG).

При подборе условий расщепления было установлено, что оптимальными для расщепления Trx-MOG являются условия соотношение фермент:субстрат 1:20 и реакционный буфер следующего состава: 25 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ CaCl2, 1 М мочевины. Данный гибридный белок относительно резистентен к воздействию энтерокиназы.When selecting the cleavage conditions, it was found that the optimal conditions for Trx-MOG cleavage are the enzyme: substrate ratio of 1:20 and the reaction buffer of the following composition: 25 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM CaCl 2 , 1 M urea. This fusion protein is relatively resistant to enterokinase.

Был проведен гидролиз двух порций Trx-MOG одинаковыми количествами белка hEK-6 и коммерчески доступной рекомбинантной легкой цепью энтерокиназы быка (Sigma, США). Результаты ДСН-ПААГ анализа реакционных смесей приведены на Фигуре 5. Полученные реакционные смеси (r) подвергались очистке при помощи 10 мкл аликвот металлохелатного сорбента Chelating Sepharose Fast Flow, заряженного ионами никеля. Исходный гибридный белок, отщепляемый N-концевой слитой белок-партнер, белок hEK-6 и, предположительно, препарат рекомбинантной энтерокиназы быка содержат гексагистидиновый кластер, поэтому все продукты реакции и исходные белки, кроме свободного продукта реакции MOG, связывались с сорбентом и видны на дорожках «+». Несвязавшийся с сорбентом белок на дорожках «-» представлял собой полностью очищенный свободный MOG.Two portions of Trx-MOG were hydrolyzed with the same amounts of hEK-6 protein and a commercially available recombinant bovine enterokinase light chain (Sigma, USA). The results of the SDS-PAGE analysis of the reaction mixtures are shown in Figure 5. The resulting reaction mixtures (r) were purified using 10 μl aliquots of the metal chelate sorbent Chelating Sepharose Fast Flow charged with nickel ions. The initial hybrid protein, cleaved by the N-terminal fusion partner protein, the hEK-6 protein and, presumably, the recombinant enterokinase preparation of the bovine contain a hexahistidine cluster, therefore all reaction products and the original proteins, except the free MOG reaction product, were bound to the sorbent and are visible on the tracks "+". Protein unbound with the sorbent on the “-” paths was a completely purified free MOG.

Приведенные результаты показали, что включение в последовательность синтезируемого целевого белка короткого дополнительного N-концевого пептида, кодируемого оптимальными для Е.coli кодонами, позволяет проводить хроматографическую очистку экспрессируемого белка в денатурирующих условиях методом металлохелатной хроматографии и проводить процедуру рефолдинга для очищенного белка-предшественника с высоким выходом. Такой порядок стадий позволяет получать полностью очищенный и ренатурированный продукт при помощи одной хроматографической стадии очистки. N-концевой пептид отделялся в ходе активации фермента, которая инициировалась внесением малых количеств активной энтерокиназы ("Sigma", США), а затем продолжалась автокаталитически.The results showed that the inclusion in the sequence of the synthesized target protein of a short additional N-terminal peptide encoded by codons optimal for E. coli allows chromatographic purification of the expressed protein under denaturing conditions by metal chelate chromatography and a refolding procedure for the purified precursor protein with high yield . This order of stages allows to obtain a completely purified and renatured product using a single chromatographic purification step. The N-terminal peptide was separated during the activation of the enzyme, which was initiated by the introduction of small amounts of active enterokinase (Sigma, USA), and then continued autocatalytically.

В случае использования для расщепления слитых белков полученный активный фермент энтерокиназы человека hEK-6 может быть удален металлохелатной хроматографией вместе с белком-партнером и остатками нерасщепленного слитого белка.In the case of using fusion proteins for cleavage, the obtained human enterokinase enzyme hEK-6 can be removed by metal chelate chromatography together with the partner protein and residues of the unsplit fusion protein.

Преимущества предлагаемого штамма Е.coli BL21[DE3] заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo мутеина легкой цепи энтерокиназы человека и контаминации выделяемого белка наиболее активными протеазами Е.coli. Встроенный в геном штамма-реципиента ген РНК полимеразы бактериофага Т7 под контролем lacUV5 промотора при использовании Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмидах приводит к быстрой и эффективной продукции белка.The advantages of the proposed E. coli BL21 [DE3] strain are the use of bacteria with the Lon OmpT phenotype, which excludes the possibility of proteolytic cleavage of the de novo synthesized human enterokinase light chain mutein and contamination of the secreted protein with the most active E. coli proteases. The T7 bacteriophage R7 polymerase RNA polymerase gene integrated in the genome of the recipient strain under the control of the lacUV5 promoter using the T7-lac promoter and T7 terminator in plasmids leads to fast and efficient protein production.

Еще одним общим преимуществом использованного штамма, экспрессионного вектора и стратегии биосинтеза является возможность проводить индукцию без изменения температуры культивирования.Another common advantage of the used strain, expression vector and biosynthesis strategy is the ability to carry out induction without changing the temperature of cultivation.

Еще одним преимуществом является возможность получения полностью активной легкой цепи энтерокиназы человека, не содержащей загрязнений белками-партнерами, без дополнительной хроматографической очистки.Another advantage is the possibility of obtaining a fully active light chain of human enterokinase, free of contamination by partner proteins, without additional chromatographic purification.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Таблица 1Table 1 Олигонуклеотиды для получения синтетического гена мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человекаOligonucleotides for the Synthesis of Human Enterokinase Light Chain Mutein [C112S] Gene НазваниеTitle Последовательность (5'-3')Sequence (5'-3 ') SEQ ID NOSEQ ID NO AS-EKL-F1AS-EKL-F1 ATGATGCACCTCGAGTTTAAAGTCAACTATACGGACT ATATCCAGCCGATTAGCCTGCCGGAGGAAAATCAAG TGTTTCCTCCGATGATGCACCTCGAGTTTAAAGTCAACTATACGGACT ATATCCAGCCGATTAGCCTGCCGGAGGAAAATCAAG TGTTTCCTCCG 55 AS-EKL-F2AS-EKL-F2 TCTCATTGACGAGATTGTGATCAACCCACACTACAAT CGCCGCCGCAAAGACAACGATATCGCCATGATGCAC CTCGAGTTTAATCTCATTGACGAGATTGTGATCAACCCACACTACAAT CGCCGCCGCAAAGACAACGATATCGCCATGATGCAC CTCGAGTTTAA 66 AS-EKL-F3AS-EKL-F3 ATGGACCGCAATTCTTGGCCTTCATATGAAAAGCAAT TTGACCTCTCCGCAAACCGTACCTCGTCTCATTGACG AGATTGTGATATGGACCGCAATTCTTGGCCTTCATATGAAAAGCAAT TTGACCTCTCCGCAAACCGTACCTCGTCTCATTGACG AGATTGTGAT 77 AS-EKL-F4AS-EKL-F4 AGTGAGTAGCGATTGGCTGGTTTCAGCAGCTCATTGC GTGTATGGCCGTAATCTGGAACCGTCGAAATGGACC GCAATTCTTGGAGTGAGTAGCGATTGGCTGGTTTCAGCAGCTCATTGC GTGTATGGCCGTAATCTGGAACCGTCGAAATGGACC GCAATTCTTGG 88 AS-EKL-F5AS-EKL-F5 AGAAGGTGCTTGGCCATGGGTGGTAGGTCTGTACTA TGGTGGGCGCCTTTTGTGTGGCGCGAGCTTAGTGAGT AGCGATTGGCTAGAAGGTGCTTGGCCATGGGTGGTAGGTCTGTACTA TGGTGGGCGCCTTTTGTGTGGCGCGAGCTTAGTGAGT AGCGATTGGCT 99 AS-EKL-F6AS-EKL-F6 AAGCTAGCGACTATAAAGATGACGATGATAAAATTG TGGGCGGCAGTAACGCGAAAGAAGGTGCTTGGCCATAAGCTAGCGACTATAAAGATGACGATGATAAAATTG TGGGCGGCAGTAACGCGAAAGAAGGTGCTTGGCCAT 1010 AS-EKLshort-F7AS-EKLshort-F7 AAGCTAGCGACTATAAAGATGAAGCTAGCGACTATAAAGATG 11eleven AS-EKL-R1AS-EKL-R1 AATATTCGCAGTGGTACCCTGATAAACTACGGTCCCC CAACCAGCAATGGAGCAATTCCGCCCCGGAGGAAAC ACTTGATTTTCAATATTCGCAGTGGTACCCTGATAAACTACGGTCCCC CAACCAGCAATGGAGCAATTCCGCCCCGGAGGAAAC ACTTGATTTTC 1212 AS-EKL-R2AS-EKL-R2 TTGTATTCTGGCATCTGCTGCTGGCAGCGTTCATTGG ACAGTAACGGGACGTCTGCTTCCTGCAGAATATTCGC AGTGGTACCCTTGTATTCTGGCATCTGCTGCTGGCAGCGTTCATTGG ACAGTAACGGGACGTCTGCTTCCTGCAGAATATTCGC AGTGGTACCC 1313 AS-EKL-R3AS-EKL-R3 AATCCCCTTGACAACTATCAATGCCGCCTTCTTCGTA GCCGGCACAGATCATATTCTCCGTGATGTTGTATTCT GGCATCTGCTAATCCCCTTGACAACTATCAATGCCGCCTTCTTCGTA GCCGGCACAGATCATATTCTCCGTGATGTTGTATTCT GGCATCTGCT 14fourteen AS-EKL-R4AS-EKL-R4 CGAAAGACGTAACGCCCGCCAGAAACCAGCGATTGT TCTCTTGACACATCAGAGGACCGCCCGAATCCCCTTG АСААСТАТСААCGAAAGACGTAACGCCCGCCAGAAACCAGCGATTGT TCTCTTGACACATCAGAGGACCGCCCGAATCCCCTTG ASAASTATSAA 15fifteen AS-EKL-R5AS-EKL-R5 ATCCATTCGGTAAAGCGTGAGACACGAGCATACACA CCCGGCCGATTAGGCAAGGCGCATTTATAGCCGAAA GACGTAACGCCCATCCATTCGGTAAAGCGTGAGACACGAGCATACACA CCCGGCCGATTAGGCAAGGCGCATTTATAGCCGAAA GACGTAACGCCC 1616 AS-EKL-R6AS-EKL-R6 CCAAGCTTCTATTAATGATGATGGTGATGGTGCAGG AAGCTCTGGATCCATTCGGTAAAGCGTGCCAAGCTTCTATTAATGATGATGGTGATGGTGCAGG AAGCTCTGGATCCATTCGGTAAAGCGTG 1717 AS-EKLshort-R7AS-EKLshort-R7 CCAAGCTTCTATTAATGATGACCAAGCTTCTATTAATGATGA 18eighteen

Claims (11)

1. Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода Escherichia неактивного предшественника мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, содержащего отщепляемый N-концевой пептид, включающий гексагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой, и неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер, под контролем промотора, функционирующего в указанной клетке бактерии, в следующей последовательности по существу содержащая:
- фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop;
- последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона;
- фрагмент ДНК, содержащий промотор, функционирующий в бактериальной клетке, и синтетический адаптер, кодирующий отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека;
- фрагмент, кодирующий предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером; и
- участок терминации транскрипции.1. A plasmid for expression in cells of a bacterium of the genus Escherichia of an inactive precursor of mutein [C112S] human enterokinase light chain containing a cleavable N-terminal peptide comprising a hexahistidine cluster and a fused framed recognition sequence with enterokinase, and a non-cleavable C-terminal hexahistridine control functioning in the specified bacterial cell, in the following sequence essentially containing:
- a fragment of the vector pET28a (+) containing the site for the initiation of replication of bacteriophage f1, the sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, the region of origin of replication of plasmid pBR322, the gene of the Rop-organizing protein Rop;
- a sequence encoding a repressor of a lactose operon;
- a DNA fragment containing a promoter that functions in a bacterial cell, and a synthetic adapter encoding a cleavable N-terminal leader, including a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence fused in frame with a sequence encoding a human enterokinase light chain mutein precursor [C112S];
- a fragment encoding a precursor of mutein [C112S] light chain human enterokinase with non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster; and
- plot termination of transcription. 2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным фрагментом ДНК, кодирующим предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с отщепляемым N-концевым пептидом, включающим гексагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой, и неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером является фрагмент ДНК, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID:1, или его вариант.2. The plasmid according to claim 1, characterized in that said DNA fragment encoding a human enterokinase precursor mutein [C112S] with a cleavable N-terminal peptide comprising a hexahistidine cluster and a fused enterokinase recognition sequence and a non-cleavable C-terminal hexahistide the cluster is a DNA fragment represented in the List of sequences under the number SEQ ID: 1, or a variant thereof. 3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.3. The plasmid according to claim 1, characterized in that the specified promoter is a promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7. 4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является плазмида p6E-hEK-6.4. The plasmid according to claim 1, characterized in that the plasmid is plasmid p6E-hEK-6. 5. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная плазмидой по п.1, - продуцент предшественника рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с отщепляемым N-концевым пептидом, включающим гексагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой, и неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером.5. The bacterium belonging to the genus Escherichia, transformed with the plasmid according to claim 1, is a producer of the recombinant mutein [C112S] precursor of the human enterokinase light chain with a cleavable N-terminal peptide comprising a hexahistidine cluster and a fusion sequence recognized by enterokinase and non-cleavable C terminal hexahistidine cluster. 6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что указанной бактерией является бактерия Е.Coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6.6. The bacterium according to claim 5, characterized in that said bacterium is E. coli BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 bacterium. 7. Предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с отщепляемым N-концевым пептидом, включающим гексагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой, и неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером, полученный путем культивирования бактерии по п.5 в питательной среде.7. The recombinant mutein [C112S] precursor of a human enterokinase light chain with a cleavable N-terminal peptide comprising a hexahistidine cluster and a fused framed recognition sequence with enterokinase and a non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster obtained by culturing the bacterium according to claim 5 in a nutrient medium. 8. Предшественник рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека по п.7, содержащий последовательность аминокислот, представленную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, или ее функциональный вариант.8. The precursor of the recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain according to claim 7, containing the amino acid sequence presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 2, or its functional variant. 9. Способ получения рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека по п.7, включающий культивирование бактерии по п.5 в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение указанного зрелого белка мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, содержащего неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер.9. The method for producing the recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain according to claim 7, including cultivating the bacteria according to claim 5 in a nutrient medium, isolating inclusion bodies, solubilizing the precursor protein, metal chelate chromatography under denaturing conditions, refolding the precursor protein, obtaining mature protein by treatment with enterokinase and isolation of the indicated mature mutein protein [C112S] human enterokinase light chain containing an uncleavable C-terminal hexahistidine cluster. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что культивируют штамм Е.coli BL21[DE3]/p6E-hEK-6.10. The method according to claim 9, characterized in that the E. coli strain BL21 [DE3] / p6E-hEK-6 is cultivated. 11. Рекомбинантный мутеин [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, содержащий неотщепляемый С-концевой гексагистидиновый кластер, полученный способом по п.9. 11. Recombinant mutein [C112S] human enterokinase light chain containing the non-cleavable C-terminal hexahistidine cluster obtained by the method of claim 9.
RU2011121471/10A 2011-05-30 2011-05-30 PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN RU2495934C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011121471/10A RU2495934C2 (en) 2011-05-30 2011-05-30 PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011121471/10A RU2495934C2 (en) 2011-05-30 2011-05-30 PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011121471A RU2011121471A (en) 2012-12-10
RU2495934C2 true RU2495934C2 (en) 2013-10-20

Family

ID=49255393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011121471/10A RU2495934C2 (en) 2011-05-30 2011-05-30 PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2495934C2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2716975C1 (en) * 2019-01-09 2020-03-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Recombinant plasmid dna coding fusion protein l-hep, escherichia coli strain producer of said protein and method of producing recombinant protein

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2182598C2 (en) * 1994-11-21 2002-05-20 Новартис Аг Modified proteinase inhibitors
EP0679189B1 (en) * 1993-01-15 2003-06-04 Genetics Institute, LLC Cloning of enterokinase and method of use
KR20030097036A (en) * 2002-06-18 2003-12-31 프로테온 주식회사 Recombinant enterokinase by modifying N-terminus or C-terminus of enterokinase light chain
US6746859B1 (en) * 1993-01-15 2004-06-08 Genetics Institute, Llc Cloning of enterokinase and method of use
RU2278688C1 (en) * 2004-12-02 2006-06-27 Сергей Викторович Луценко Human endostatin preparation and method for production thereof
RU2006110371A (en) * 2006-03-31 2007-10-10 Автономна некоммерческа организаци "Институт молекул рной диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU) VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES, GENETIC DESIGNS AND METHOD FOR PRODUCING COMPONENTS OF THIS COMPOSITION
CN102061302A (en) * 2010-11-26 2011-05-18 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 Synthetic method of enterokinase light chain gene and preparation method of expression product of enterokinase light chain gene

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0679189B1 (en) * 1993-01-15 2003-06-04 Genetics Institute, LLC Cloning of enterokinase and method of use
US6746859B1 (en) * 1993-01-15 2004-06-08 Genetics Institute, Llc Cloning of enterokinase and method of use
RU2182598C2 (en) * 1994-11-21 2002-05-20 Новартис Аг Modified proteinase inhibitors
KR20030097036A (en) * 2002-06-18 2003-12-31 프로테온 주식회사 Recombinant enterokinase by modifying N-terminus or C-terminus of enterokinase light chain
RU2278688C1 (en) * 2004-12-02 2006-06-27 Сергей Викторович Луценко Human endostatin preparation and method for production thereof
RU2006110371A (en) * 2006-03-31 2007-10-10 Автономна некоммерческа организаци "Институт молекул рной диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU) VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES, GENETIC DESIGNS AND METHOD FOR PRODUCING COMPONENTS OF THIS COMPOSITION
CN102061302A (en) * 2010-11-26 2011-05-18 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 Synthetic method of enterokinase light chain gene and preparation method of expression product of enterokinase light chain gene

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KITAMOTO Y. ET AL, Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortment of domains, Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, v.91, no.16, pp.7588-7592. *
YUAN L.D. ET AL., Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli, Protein Expr Purif., 2002, v.25, no.2, pp.300-304. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2716975C1 (en) * 2019-01-09 2020-03-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Recombinant plasmid dna coding fusion protein l-hep, escherichia coli strain producer of said protein and method of producing recombinant protein

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011121471A (en) 2012-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Weeks et al. Ligation independent cloning vectors for expression of SUMO fusions
JP5909172B2 (en) Production of recombinant protein by self-proteolytic cleavage of fusion protein
JP2009502125A (en) Method for secretory expression of lysostaphin in E. coli at high levels
CA2437342C (en) Method for producing recombinant trypsin
ZA200504958B (en) Use of caspase enzymes for maturation of engineered recombinant polypeptidew fusions
US20160083713A1 (en) Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
Hill et al. High Level Expression ofRicinus communisCasbene Synthase inEscherichia coliand Characterization of the Recombinant Enzyme
Yuan et al. Expression, purification, and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli
ES2819288T3 (en) Modified enterokinase light chain
JP2014512814A (en) A novel expression and secretion vector system for heterologous protein production in E. coli
CA2301698A1 (en) Zymogenic protease precursors that can be autocatalytically activated and their use
RU2495934C2 (en) PLASMID FOR EXPRESSION IN BACTERIA CELLS OF GENUS Escherichia OF INACTIVE PRECURSOR OF MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia, - PRODUCER OF PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, PRECURSOR OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN, RECOMBINANT MUTEIN [C112S] OF HUMAN ENTEROKINASE LIGHT CHAIN
CZ20032165A3 (en) Recombinant K proteinase
WO2014187960A1 (en) Removal of n-terminal extensions from fusion proteins
RU2144957C1 (en) Recombinant plasmid dna ppins07 encoding fused polypeptide containing human proinsulin and strain of bacterium escherichia coli - producer of fused polypeptide containing human proinsulin
RU2388826C2 (en) RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd
ES2337684T3 (en) RECOMBINANT CARBOXIPEPTIDASE B AND ITS PURIFICATION.
JP7449000B2 (en) Production of soluble recombinant proteins
RU2502803C2 (en) PLASMID FOR EXPRESSION IN CELLS OF BACTERIUM BELONGING TO Escherichia CLASS, NON-ACTIVE PREDECESSOR OF DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEINS; BACTERIUM BELONGING TO Escherichia CLASS, - PRODUCER OF NON-ACTIVE PREDECESSOR OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; PREDECESSOR OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; METHOD FOR OBTAINING RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; METHOD FOR OBTAINING CONJUGATES OF POLYETHYLENE GLYCOL AND RECOMBINANT MUTEIN OF HUMAN DNase I, FERMENTATIVE ACTIVE CONJUGATE OF MUTEIN OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN
Osadská et al. Optimization of expression of untagged and histidine-tagged human recombinant thrombin precursors in Escherichia coli
RU2426780C2 (en) EXPRESSION PLASMID DNA p6E-tTF CODING EXTRACELLULAR AND TRANSMEMBRANE DOMAINS OF HUMAN TISSUE FACTOR AND E.coli BL21 [DE3]/p6E-tTF STRAIN - PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN TISSUE FACTOR
CN110951711A (en) Esterase with activity of degrading chiral ester and encoding gene and application thereof
RU2813802C1 (en) Chimeric enzyme based on l-methionine-gamma-lyase fused with vhh antibody m456, and dna fragment coding said enzyme
KR102643064B1 (en) Human enterokinase fusion protein with improved expression level and solubility and a preparing method thereof
RU2528251C2 (en) FUSED PROTEIN OF THIOREDOXIN AND INFESTIN 4 DOMAIN, METHOD FOR PREPARING IT, EXPRESSION PLASMID DNA CODING FUSED PROTEIN, AND BACTERIUM Escherichia coli TRANSFORMED BY THIS PLASMID DNA

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170531