RU2504387C2 - Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина - Google Patents
Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2504387C2 RU2504387C2 RU2011145666/15A RU2011145666A RU2504387C2 RU 2504387 C2 RU2504387 C2 RU 2504387C2 RU 2011145666/15 A RU2011145666/15 A RU 2011145666/15A RU 2011145666 A RU2011145666 A RU 2011145666A RU 2504387 C2 RU2504387 C2 RU 2504387C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hemoglobin
- polymer modified
- haemoglobin
- reaction
- stage
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности трансфузиологии, а именно к способу получения полимерного модифицированного гемоглобина путем ступенчатой поликонденсации выделенного из эритроцитарной массы очищенного гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с синтезированным полифункциональным сшивающим агентом - глутаровым альдегидом с глутаминовой кислотой и глутаматом натрия, где на первой стадии реакции ведут внутримолекулярную химическую сшивку лабильной в водном растворе молекулы гемоглобина, а на второй стадии - межмолекулярную сшивку уже модифицированных молекул гемоглобина с образованием полимерного модифицированного гемоглобина. Изобретение обеспечивает получение более эффективного полимерного модифицированного гемоглобина в виде полифункционального кровезамещающего раствора с функцией эффективного переноса кислорода, обладающего противошоковым и гемодинамическим действием, способным инициировать собственное кроветворение. 2 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности, - трансфузиологии и касается кровезамещающих препаратов с функцией переноса кислорода на основе гемоглобина.
В настоящее время известны способы получения гемоглобина, одним из которых гемоглобин получают в результате разрушения эритроцита. Другой способ основан на дезоксигенации гемоглобина донорской крови в водном растворе. Также известен способ получения кровезаменителя, где для получения дезоксигенированного гемоглобина используют свободную от лейкоцитов эритроцитарную массу, осаждают негемовые белки, после их удаления осуществляют концентрирование раствора гемоглобина ультрафильтрацией. Кроме того, известен способ, в котором их крови и эритроцитарной массы удаляют лейкоциты и тромбоциты, отмывают и лизируют эритроциты, переводят гемоглобин эритроцитов в СО-форму, подвергают фильтрации и тепловой обработке [RU 2162707, 24.03.1999; RU 2203087, 27.04.2003; RU 2341286, 20.12.2008].
Существенными и очевидными недостатками указанных аналогов являются следующие. Гемоглобин, полученный в результате разрушения эритроцитов, при введении в кровеносное русло быстро выводится из крови через почки, необратимо повреждая их из-за нефротоксичности. В другом случае при введении молекул гемоглобина в кровеносные сосуды он распадается на две отдельные единицы, которые также обладают нефротоксичностью и обладают, побочны отрицательным воздействием на микрофлору дыхательных путей и пищеводного тракта. Эти недостатки существенно снижают ценность получаемых препаратов и ограничивают его использование.
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату является способ получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью, включающий предварительную обработку и модификацию исходных компонентов, проведение реакции поликонденсации, введение терминатора [RU 2132687, А61К 35/18, 38/42; 10.07.1999]. В этом способе осуществляют реакцию взаимодействия дезоксигенированного гемоглобина с глутаровым альдегидом в буферном растворе с предварительной модификацией одного из взаимодействующих компонентов - глутарового альдегида и с завершением реакции добавлением вещества, закрывающего функциональные группы сшивателя.
Обладая преимуществом перед аналогами, данный способ получения полигемоглобина также скрывает в своей сущности очевидные и существенные недостатки, заключающиеся в недостаточной газотранспортной активности получаемого гемоглобина в связи с незначительными размерами его молекул и кратковременности его функционирования в кровеносной системе, что не позволяет получить эффективные показатели по кислородоснабжению органов, не устраняет его нефротоксичность и шоковые состояния индивида после введения гемоглобина. Эти недостатки заложены в процессе выбора компонентов, их обработке, последовательности операций, режимов и параметров их проведения, не позволяющих получить полифункциональный кровезамещающий раствор, который мог бы быть способным инициировать собственное кроветворение.
Технической задачей и положительным результатом изобретения является получение полимерного модифицированного гемоглобина с более высоким классом его эффективности в виде полифункционального кровезамещающего раствора с функцией эффективного переноса кислорода, обладающего противошоковым и гемодинамическим действием, способным инициировать собственное кроветворение; получение препарата с более высокими физико-химическими и биологическими свойствами: антиоксидантным, противовоспалительным и иммуномодулирующим - для восстановления нормальной жизнедеятельности организма.
Указанная техническая задача и эффект достигается за счет разработанного способа получения полимерного модифицированного гемоглобина, высокая эффективность которого проверена заявителями доклиническими и клиническими испытаниями.
Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина включает предварительную обработку и модификацию исходных компонентов, проведение реакции поликонденсации, введение терминатора, при этом ведут ступенчатую поликонденсацию выделенного из эритроцитарной массы очищенного гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с синтезированным полифункциональным сшивающим агентом-производным глутарового альдегида с диполярными ионами из ряда моноаминокарбоновых и моноаминодикарбоновых кислот и пептидов на их основе, где на первой стадии реакции ведут внутримолекулярную химическую сшивку лабильной в водном растворе молекулы гемоглобина, а на второй стадии проводят межмолекулярную сшивку уже модифицированных молекул гемоглобина с образованием полимерного модифицированного гемоглобина.
Способ характеризуется тем, что реакцию гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с полифункциональным сшивающим агентом проводят в токе азота или аргона при температуре 4-15°С.
Способ характеризуется также тем, что в качестве терминатора реакции используют восстановительные системы: боргидрид натрия и бисульфит натрия в диапазоне мольных соотношений от 1 до 100%.
Пример осуществления способа.
Гемоглобин (Гб) получают осмотическим гемолизом эритроцитов донорской крови, очищенный от клеточных и плазменных компонентов методами скоростного центрифугирования и многократной мембранной ультра- и диафильтрацией. Объем 5 г % р-ра Гб 100 мл.
Сшиватель - производные глутарового альдегида (ГА) с глутаминовой кислотой (ГК) или глутаматом натрия (Гm) в водном 0,9% растворе NaCl (физиологический р-р). Реакцию ГА с ГК проводили при t=10°C в токе инертного газа (азота, аргона). К 5,2 мл 3 г % ГА приливали 6 мл раствора ГК (5,6 г% р-р) в 6 мл физ. растворе (0,9% NaCl) или раствора Гm рН=6,8 (3,5 мг глутамата натрия в 6 мл физ. раствора). Общий объем сшивателя 11,2 мл.
Получение полимерного модифицированного Гб (полигемоглобина, ПГб).
100 мл 5 г% раствора Гб в 0,9% NaCl pH=6,85 (pH может быть от 6,4÷7,4 - эта область pH максимальной физиологической активности Гб, выше и ниже он подвержен автоокислению) помещают в колбу (реактор) емкостью ~200 мл. Реакция идет при постоянном перемешивании в токе инертного газа при t=10°C (интервал t° от 6 до 22°С, ниже 6°С реакция замедляется, а выше 22° - возможно автоокисление). Сшиватель добавляют в 2 приема (2 стадии).
на I стадии к дезоксигенированному Гб добавляют половину сшивателя (5,6 мл) - в результате образуется ПГб1 с ММ (молекулярной массой средневесовой) 72-128 кДа - это смесь мономера и димера Гб (ММГб=65 кДа) (таблица №1).
на II стадии добавляется вторая половина сшивателя (5,6 мл). На этой стадии ММПГб-2 достигает 230-320 кДа, что соответствует 3-5-мерам полигемоглобина.
Реакцию останавливают добавлением восстановителя натрий боргидрида (NaBH4) (60 мг в 10 мл р-ра) или бисульфита натрия (NaHSO3) (164 мг в 12 мл раствора), возможно их последовательное добавление (50/50) каждого в половинном количестве. Реакция идет при перемешивании в течение 30 минут.
После чего отключают ток инертного газа, полученный раствор ПГб сливают и проводят исследования:
1) Гельпроникающая хроматография (ГПХ) на сефорозе 6Б, уравновешенной 0,05 М фосфатным буфером рН=7,2. Определяется молекулярно-массовое распределение, рассчитываются средневесовые молекулярные массы ПГб (по калибровке), и содержание высокомолекулярных и низкомолекулярных фракций ПГб-2.
2) Кислородтранспортную функцию ПГб оценивали на приборе Гем-O-Скан, снимали кривые диссоциации оксигемоглобина (КДО) - зависимость степени насыщения ПГб кислородом от парциального давления кислорода (pO2). Характеристикой эффективности кислородного транспорта служит величина Р50 - парциальное давление кислорода при 50% насыщении Гб или ПГб кислородом. Для сравнения образцы Гб и ПГб диализовали против 0,05 М трис-HCl буфера в 0,9% NaCl (pH=7,4). КДО снимали при 37°С в диапазоне перепада парциального давления кислорода (pO2) в интервале 0-16 - мм Hg.
Преимущества двухстадийной подачи сшивателя:
1. Наблюдается стабильная воспроизводимость результатов (таблица №2) по ММ и фракционному составу.
2. Содержание низкомолекулярной фракции ПГб-2 (~65 кДа) снижается до 2-8%, а выход полимерной фракции достигает 92-98%.
3. При этом повышается эффективность газового транспорта ПГб-2 (по сравнению с Гб) (из КДО) величина Р50 увеличивается ~ в 1,5 раза.
Результаты осуществления способа сведены в таблицы 1 и 2.
Использование в качестве модификатора для ГА вместо ГК - глутамата натрия (Гm) дает более равномерное молекулярно-массовое распределение.
Гm хорошо растворим в воде: (ГК растворяется только при подщелачивании, медленно). Использование Гm, дает стандартное рН раствора (6,7-6,8), и сокращает стадию при получении сшивателя.
Claims (3)
1. Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина, включающий предварительную обработку и модификацию исходных компонентов, проведение реакции поликонденсации, введение терминатора, отличающийся тем, что ведут ступенчатую поликонденсацию выделенного из эритроцитарной массы очищенного гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с синтезированным полифункциональным сшивающим агентом глутаровым альдегидом с глутаминовой кислотой и глутаматом натрия, где на первой стадии реакции ведут внутримолекулярную химическую сшивку лабильной в водном растворе молекулы гемоглобина, а на второй стадии проводят межмолекулярную сшивку уже модифицированных молекул гемоглобина с образованием полимерного модифицированного гемоглобина.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию гемоглобина в смешанной окси/дезокси форме с полифункциональным сшивающим агентом проводят в токе азота или аргона при температуре 4-15°С.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве терминатора реакции используют восстановительные системы: боргидрид натрия и бисульфит натрия в диапазоне мольных соотношений от 1 до 100%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011145666/15A RU2504387C2 (ru) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011145666/15A RU2504387C2 (ru) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011145666A RU2011145666A (ru) | 2013-10-20 |
| RU2504387C2 true RU2504387C2 (ru) | 2014-01-20 |
Family
ID=49356642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011145666/15A RU2504387C2 (ru) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2504387C2 (ru) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2072853C1 (ru) * | 1990-01-02 | 1997-02-10 | Ажигирова Мария Алексеевна | Способ получения искусственного переносчика кислорода |
| RU2132687C1 (ru) * | 1996-04-23 | 1999-07-10 | Институт высомолекулярных соединений РАН | Способ получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью |
| RU2162707C2 (ru) * | 1999-03-24 | 2001-02-10 | Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии | Кровезаменитель - переносчик кислорода, состав для его получения и способ получения полимерного модифицированного гемоглобина |
| WO2002000229A1 (de) * | 2000-06-29 | 2002-01-03 | Sanguibiotech Ag | Verfahren zur herstellung künstlicher sauerstoffträger aus kovalent vernetzten hämoglobinen mit verbesserten funktionellen eigenschaften durch vernetzung in anwesenheit chemisch nicht reagierender effektoren der sauerstoffaffinität der hämoglobine |
| SU1840413A1 (ru) * | 1976-07-02 | 2007-01-10 | Институт высокомолекулярных соединений Российской Академии Наук (статус государственного учреждения) | Полимерный гемоглобин, обладающий способностью сохранять газотранспортную функцию гемоглобина, и способ его получения |
| RU2328304C1 (ru) * | 2007-03-22 | 2008-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Агент защиты клеток крови и восстановления кроветворной системы и фармакологическая комбинация для лечения онкологических больных |
| RU2340354C1 (ru) * | 2007-06-05 | 2008-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода |
| RU2341286C1 (ru) * | 2007-07-25 | 2008-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа |
-
2012
- 2012-04-12 RU RU2011145666/15A patent/RU2504387C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1840413A1 (ru) * | 1976-07-02 | 2007-01-10 | Институт высокомолекулярных соединений Российской Академии Наук (статус государственного учреждения) | Полимерный гемоглобин, обладающий способностью сохранять газотранспортную функцию гемоглобина, и способ его получения |
| RU2072853C1 (ru) * | 1990-01-02 | 1997-02-10 | Ажигирова Мария Алексеевна | Способ получения искусственного переносчика кислорода |
| RU2132687C1 (ru) * | 1996-04-23 | 1999-07-10 | Институт высомолекулярных соединений РАН | Способ получения полигемоглобина с повышенной кислородтранспортной эффективностью |
| RU2162707C2 (ru) * | 1999-03-24 | 2001-02-10 | Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии | Кровезаменитель - переносчик кислорода, состав для его получения и способ получения полимерного модифицированного гемоглобина |
| WO2002000229A1 (de) * | 2000-06-29 | 2002-01-03 | Sanguibiotech Ag | Verfahren zur herstellung künstlicher sauerstoffträger aus kovalent vernetzten hämoglobinen mit verbesserten funktionellen eigenschaften durch vernetzung in anwesenheit chemisch nicht reagierender effektoren der sauerstoffaffinität der hämoglobine |
| RU2328304C1 (ru) * | 2007-03-22 | 2008-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Агент защиты клеток крови и восстановления кроветворной системы и фармакологическая комбинация для лечения онкологических больных |
| RU2340354C1 (ru) * | 2007-06-05 | 2008-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода |
| RU2341286C1 (ru) * | 2007-07-25 | 2008-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геленпол" | Способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011145666A (ru) | 2013-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liang et al. | Enzyme-assisted peptide folding, assembly and anti-cancer properties | |
| US20190008775A1 (en) | Method for Preparing Modified Sodium Alginate Embolization Microsphere | |
| EP0912197B1 (de) | Hämoglobin-hydroxyethylstärke-konjugate als sauerstoff-transport-mittel | |
| JPH0365326B2 (ru) | ||
| CN107137699B (zh) | 一种天然血红蛋白类血液代用品的脱氧方法和制备工艺 | |
| Li et al. | Drug binding rate regulates the properties of polysaccharide prodrugs | |
| US8889830B2 (en) | Hemoglobin-albumin complex, and artificial plasma expander and artificial oxygen carrier containing the complex | |
| CN108553458B (zh) | 一种抗肿瘤纳米药物 | |
| CH629961A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines wasserloeslichen, polymerisierten, vernetzten haemoglobins. | |
| ES2284670T3 (es) | Procedimiento para fabricacion de vehiculos de oxigeno sinteticos a partir de hemoglobinas reticuladas covalentemente con propiedades funcionales mejoradas mediante reticulacion en presencia de efectores que no reaccionan quimicamente de la afinidad por oxigeno de la hemoglobina. | |
| CN103204904B (zh) | 一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| KR102144139B1 (ko) | 다이아스피린 가교결합된 페길화 헤모글로빈 | |
| CN112472815A (zh) | 一种硒肽及其制备方法和应用 | |
| Xie et al. | Targeted nanoparticles from xyloglucan–doxorubicin conjugate loaded with doxorubicin against drug resistance | |
| RU2361608C1 (ru) | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода, фармацевтическая композиция (варианты) | |
| KR20150132235A (ko) | 폴리알킬렌 산화물 발레르산염 헤모글로빈 접합체 | |
| CN110452374B (zh) | 具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用 | |
| ES2395894T3 (es) | Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso | |
| RU2504387C2 (ru) | Способ получения полимерного модифицированного гемоглобина | |
| JP2004504453A (ja) | 変性されたポリマーの成形体、それを製造する方法およびその使用 | |
| CN105311642A (zh) | 一种果胶抗癌前药的合成工艺 | |
| RU2340354C1 (ru) | Кровезаменитель с функцией переноса кислорода | |
| RU2341286C1 (ru) | Способ получения кровезаменителя и установка для осуществления способа | |
| GB1576752A (en) | Haemoglobin preparation | |
| JPS63208523A (ja) | 酸素運搬剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180413 |