JPS63208523A

JPS63208523A - 酸素運搬剤

Info

Publication number: JPS63208523A
Application number: JP62042331A
Authority: JP
Inventors: Akikuni Yakida; 旭邦八木田; Yoshiki Koreeda; 此枝　義記; Takaharu Iwasaki; 敬治岩崎
Original assignee: Ajinomoto Co Inc; Fujirebio Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc; Fujirebio Inc
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1987-02-25
Publication date: 1988-08-30
Anticipated expiration: 2011-09-04
Also published as: JP2531661B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産栗上皇及青立団本発明は、ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体
を含有する癌患者の新規輸血用酸素運搬剤に関する。

の方が術後の予後が不良であることが報告されている（
へ木田ら「医学のあゆみ、１３９巻、第２号、１１９頁
、１９８６年）。

日がンしようとする。　壱癌根治手術において、手術時に５００〜６００ｍ１以上
の出血を供うときは、低酸素状態を改善するために輸血
が必要であり、従って前記従来品とは異なった、術後の
予後が良好である輸液の開発が望まれている。

。１　壱を”ンするための　。

本発明者は、前記問題点を解決すべく鋭意検討した結果
へモグロビンーポリアルキレン結合体を赤血球代替物と
して使用することにより、輸血群に比較し注入後の癌増
殖作用が抑えられることを見出し、この発見に基いて本
発明を完成するに至った。

本発明では、使用するヘモグロビン−ポリオキシアルキ
レン結合体例えばポリオキシアルキレン末端とヘモグロ
ビンのアミノ基との結合部分が下記の構造式よりなるヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体を使用するの
が好ましい。

ＣＨ２０（ＣＨｇ）−−ＣＯＮＨ−ｔｌｂ（式中、Ｈｂ
はヘモグロビンを表わし、ｎ＝１〜７である。）ポリオキシアルキレンは、例えばポリオキシエチレン（
エチレンオキサイドの重合体でポリエチレングリコール
ともいう。）、ポリオキシプロピレンあるいはエチレン
オキサイドとプロピレンオキサイドとの共重合体等水溶
性の高い重合物であり、その分子量は３００〜２０，０
００、製造される結合体の粘土等の観点から好ましくは
７５０〜１０，０００、特に好ましくは１０００〜６０
００、の範囲内にあるものである。

ポリオキシアルキレンの末端とカルボキシル基部分との
間の結合にはエステル結合、アミド結合、エーテル結合
等が考えられる。これらの結合のうちで特にエーテル結
合が有効である。従って、本発明に使用するヘモグロビ
ン−ポリオキシアルキレン結合体の調製に使用されるポ
リオキシアルキレンはヘモグロビンを結合させる末端が
一〇−（ＣＨｚ）　、１ＣＯＯＮに変換されているもの
が好ましい。

ｎは１〜１０程度であり、１〜７程度、特に１〜３程度
のものが選択されることが多い。

ポリオキシアルキレンの末端をこのような形に変換する
方法としては、白金、パラジウムの炭素担持触媒を用い
て末端炭素を酸化する方法、活性化二酸化マンガンで末
端のオキシメチル基を酸化してアルデヒドに変え、過酸
化水素でさらに酸化してカルボン酸にする方法、塩基の
存在下でポリオキシアルキレンにハロゲン化脂肪酸を反
応させる方法、ジアゾ基を有する脂肪酸とポリオキシア
ルキレンを反応させる方法などを利用すればよい。

このようにカルボキシル基を付与されたポリオキシアル
キレンとヘモグロビンの反応に際して、例えばＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフタル酸イミド
、ｐ−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノール等通
常のペプチド合成におけるカルボン酸活性化剤により活
性エステルとし、これとヘモグロビンと反応させてアミ
ド交換することもできるし、塩化チオニル等ハロゲン化
剤を作用させてポリオキシアルキレンの酸ハロゲン化物
とし、これとヘモグロビンとを反応させることもできる
。

本発明に使用するヘモグロビンは、ヒト、ウシ、ブタ、
ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、ニワトリ等ヘモグ
ロビンを有する動物由来のものであればよい０本明細書
でいうヘモグロビンとは、いわゆる異常ヘモグロビン（
Ｋ、Ｉｍａｉ、＾１ｌｏａｔｅｒｌｅＥｆｆｅｃｔｓ　
ｉｎ　Ｈａｅ＋＋＋ｏｇｌｏｂｉｎ、　Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、　１９８０参
照）あるいはピリドキサール−リン酸例えば、ピリドキ
サール−５′−リン酸、２−ツルー２−ホルミルピリド
キサール−５′−リン酸、ピリドキサール−硫酸、例え
ばピリドキサール−５′−硫酸、グリセリンリン酸類、
例えばグリセリン−２，３−シリン酸、糖リン酸、例え
ばグルコース−６−リン酸、アデノシン−５′−リン酸
等のヘモグロビンの誘導体であってもよい。

ヘモグロビンの反応時のｔ１度ハ、０．５〜２０％（重
量）程度、好ましくは０．５〜１０％（重量）程度であ
る。しかしながら、アミノ酸等が共存せずヘモグロビン
濃度が４％を越えた場合には、架橋反応が進んで高分子
化しゲル化しやすくなるので反応の管理に注意を要する
。一方、ヘモグロビンが低濃度になると反応容器が大型
化するとともに反応後に濃縮が必要になるので好ましく
ない。

ポリオキシアルキレンの使用量は、ヘモグロビン１モル
に対して１〜５０モル程度、好ましくは２〜１０モル程
度である。

ポリオキシアルキレンとヘモグロビンとの結合反応にお
いてアミノ酸又はアミンを共存させることにより、生成
するヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の分子
量をコントロールすることができる。これはポリオキシ
アルキレンの活性化されたカルボキシル基の一部にアミ
ノ酸又はアミンを結合させてヘモグロビンへの結合を阻
止することによる。この方法により、ヘモグロビンを希
薄溶液としなくとも好ましい結合体を得ることができる
。

反応時に存在せしめるアミノ酸は、例えば蛋白質の構成
アミノ酸を使用すればよく、リジン、アルギニン、ヒス
チジン等の塩基性アミノ酸、グリシン、フェニルアラニ
ン等の中性アミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸等
の酸性アミノ酸が例示される、一方、アミンはアンモニ
ア、脂肪族アミン、芳香族アミンのいずれでもよいが、
本物質が血流内に投与される関係から安全性の高いもの
が好ましい。アミノ酸およびアミンは１種であってもよ
く、２種以上であってもよい。アミノ酸又はアミンのア
ミノ基が第３級である場合には活性エステルの分解を触
媒することによりヘモグロビンと結合していないポリオ
キシアルキレンの末端は一部　　（ＣＨｚ）ｎ　　Ｃ０
ＯＨの形をとる。一方、第１級又は第２級の場合には末
端が一部−（Ｃ１１□）　、ｌ−Ｃ０Ｎ）ＩＲとなりＲ
の種類によってヘモグロビン表面の電荷や疎水性を替え
ることができる。これによって本発明の結合体を代用血
液に用いた場合に生体内の血液との混合によって接する
赤血球、白血球、血漿タンパク等との相互作用を変えて
免疫的認識等を好ましい方向に変えることができる。ア
ミノ酸の使用量はヘモグロビン１モルに対し１〜１００
モル程度、好ましくは５〜２０モル程度である。　゛ヘ
モグロビンとポリオキシアルキレンとを結合させる反応
時に、酸素不存在か酸素低濃度とするのが好ましい、酸
素分圧として０〜３０ｗＨｇ程度を選択すればよい。上
記酸素濃度以外の反応条件は、ヘモグロビンの変性を伴
わない条件であればいずれであってもよい。

酸素の濃度を低下させるには、窒素、アルゴン、ヘリウ
ム等の不活性ガスで反応容器中の空気を置換する方法、
容器中の酸素を還元剤（ＮａＢＨ４、Ｎａ２Ｓ２０等）
によって還元し除去する方法、ポンプ等で脱ガスしアル
ゴン等の不活性ガスで置換する方法等、公知の方法を採
用することができる。

このようにして得られたヘモグロビン−ポリアルキレン
結合体は通常は凍結乾燥して製剤化する。

従来、代用血液として使用する修飾ヘモグロビンの凍結
乾燥製剤の調製に際しては、いわゆる安定化剤を添加す
ることによりメトヘモグロビンの生成や不溶物の生成を
防止することが知られており、この安定化剤として、例
えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第
一鉄等の抗酸化剤、ＥＤＴＡ等のアミンおよびその塩が
提案されている。しかし、無機抗酸化剤は人体に有害で
あり不溶物の生成量が多く、また、ＥＤＴＡは長期保存
時の安定性が悪く、何れもメトヘモグロビンの発生を効
率よく防止することが困難である等の問題があった。

長期保存安定性の上では凍結乾燥製剤の形で使用され、
ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の凍結乾燥
製剤を調製するには、該結合体水溶液にマルトース、マ
ンニトール及び／またはグルコースの水溶液を添加して
、常法により凍結乾燥することにより達成できる。結合
体に対するマルトース及び／またはグルコースの混合割
合は、結合体１に対し重量比で０．１〜２．０とするの
が適当である。例えば、２〜２０Ｗ／Ｖ％の結合体水溶
液にマルトースを結合体に対して０．１〜２．０倍量、
保存安定性のうえから好ましくは０．５〜１６２倍量と
なるようにマルトース水溶液を加えて混合した後、−３
５℃〜−５０℃、２０〜６０分で凍結し、減圧上棚温１
０〜５０℃で５〜７０時間乾燥することにより凍結乾燥
製剤を得ることができる。さらに、保存安定性のうえか
ら、とくにヒスチジン、グルタミン、トリプトファンな
どのアミノ酸を添加するのが有効である。これらのアミ
ノ酸はマルトースやグルコースに比べて少量でよく、結
合体１に対し重量比で０．１−１とするのが適当である
。

結合体水溶液とマルトース溶液の混合及び凍結乾燥は、
従来公知の安定化剤を微量添加するようにしてもよく、
品質浸透圧調整のための塩類（ＮａＣ１、ＫＣ１＋　Ｃ
ａＣ１１Ａｃ０Ｎａ等）を添加することにより凍結乾燥
品の安定性はさらに高まる。

大施炭以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 ■　ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾
燥製剤の調製特開昭５３−１４１２１９号公報（用研ファインケミカ
ル＠）に述べられている方法で調製した白金パラジウム
炭素触媒２０ｇと市販のポリエチレングリコール（日本
油脂■２日本）（マクロゴール４０００）　２００　ｇ
を含む水溶液５００ｍｊ＋を１．５１オートクレーブ中
に入れ、加圧空気を導入して圧力を１０ｋｇ／ａｍ”と
し、９０℃で１０時間反応させた。　反応生成物は濾過
により触媒を除去したのち、活性炭で処理し、さらに水
から再結晶し１８０ｇの両末端にカルボキシル基を有す
るポリエチレングリコールの酸誘導体をえた。

この分子量約４０００のポリエチレングリコール酸２０
ｇ（５ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド４ｇ
をジシクロへキシルカルボジイミド　　　。

（ＤＣＣ）　７　ｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌ
に溶かし一夜攪拌した。生成した結晶のジシクロヘキシ
ル尿素を分離したのち、エチルエーテル４００ｍｊ！を
加えてポリエチレングリコールの活性化エステル１７ｇ
を沈澱させ、濾別後更にエーテルで洗浄した。一方、ヒ
トヘモグロビンは、期限切れ輸血用血液より得られた赤
血球　５０ｍ１を０．９％ＩＮ水酸ナトリウム溶液を加
えｐＨ７，８にした後更に３０反応させた。

反応液は分子量分画３万の限外濾過膜ＹＭ３０（Ａｎ＋
１ｃｏｎ社、米国）により限外濾過をくり返し、未反応
のポリエチレングリコールの濃度が１１００ｐｐ以下に
した。

ゲルタイプの充填カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーから生成物の分子量は約９．８万ダルトンと推定
された。なおポリエチレングリコールのヘモグロビンと
結合していない方の末端にはグリシンが結合している。

かくして得られた６、０％の修飾ヘモグロビン溶液に塩
類およびマルトースを表１のような組成になるように添
加した修飾ヘモグロビン溶液を調製し常法通り棚温で２
０℃で１８時間凍結乾燥し、製剤とした。

表　１　　　　　ヒヘモグロビンの濃度ヘモグロビン　　　　　　６〜６．５ｇ／ａｊメトヘモ
グロビン　　　−３００ｍ　ｇ　／　ｄｌＮａ”　　　
　　　　　　１２６ｍＥｇ／ＩＫ”　　　　　　　　　
　　４ｍＥｇ／ｌ１（Ｊ−９０ｍＥｇ／ｌＣＨ３ＣＯＯ−２０ｍＥｇ／ｊ！マルトース　　　　　　　　６ｇ／ｄｌ■　ヘモグロビ
ン−ポリオキシアルキレン結合体の腫瘍増殖抑制効果腫瘍に対する輸血の影響と本発明からなるヘモグロビン
−ポリオキシアルキレン結合体の効果を比較検討した。

本発明ではヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体
として上記に示した方法で調製した凍結乾燥製剤（以下
安定化ヘモグロビンと呼ぶ）を使用した。

実験系は以下の様に実施した。輸血又は本発明製剤の投
与は、腫瘍移植３日前、同時及び３日後の計３回施行し
、腫瘍移植１５日における腫瘍の面積を測定し、その効
果を比較検討した。

使用したマウス　　　Ｃ３Ｈ輸血用血液　　　　　ＩＣＲの尾静脈より採血したヘパ
リン加静脈血使用した腫瘍細胞　　ＭＨ１３４移植部位　　　　　　背部皮下にｌＸｌ０”個を移植輸血部位　　　　　　尾静脈よりＱ、ｌ　ｍ　１２輸血
非輸血群　　　　　　生理食塩水及び安定化ヘモグロビ
ンを使用この結果、以下の表のように、安定化ヘモグロビン投与
群は、輸血群に比べ有意に増殖を抑制しており、輸血に
よる弊害を取り除きうる手段であることを示した。

表２輸血群　　　　　　（Ｎ＝８）　　４１．３±１９．２
ｗｍ”非輸血群　　　　　（Ｎ・８）　　２１．９±８
．７直１２生理食塩水　　　　（Ｎ・３）　　３１．０
±５．１鶴２安定化ヘモグロビン（Ｎ・８）　　２９．
３±１１．２ｍｍ”文肌ｑ須果以上から明らかな如く、本発明の酸素運搬剤は癌患者の
輸血用代用血液として使用されても術後の予後の点で従
来の輸血群に比べ格段に改善されており、故に、本発明
は産業上極めて有用である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体を含
有する癌患者の輸血用酸素運搬剤。
（２）ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体のポ
リオキシアルキレン末端とヘモグロビンのアミノ基との
結合部分が構造式：−ＣＨ＿２−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＯＮＨ−Ｈｂ
（式中、Ｈｂはヘモグロビンを表わし、ｎ＝１〜７であ
る。）で示されるものである特許請求の範囲第１項記載
の運搬剤。
（３）ヘモグロビンが結合されていないポリオキシアル
キレン末端のうち少なくとも５０％にアミノ酸がアミド
結合されている特許請求の範囲第１項記載の酸素運搬剤
。
（４）アミノ酸が蛋白質の構成アミノ酸のいずれかであ
る特許請求の範囲第３項記載の酸素運搬剤。
（５）ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレン、ポ
リオキシプロピレン又はエチレンオキサイドとプロピレ
ンオキサイドの共重合体のいずれかである特許請求の範
囲第１項記載の酸素運搬剤。
（６）ポリオキシアルキレンの分子量が１０００〜６０
００の範囲内にある特許請求の範囲第１項記載の酸素運
搬剤。
（７）マルトースを含有する凍結乾燥された特許請求の
範囲第１項記載の酸素運搬剤。
（８）ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体１に
対してマルトースを重量比で０．１〜２．０含有する特
許請求の範囲第７項記載の酸素運搬剤。