RU2496869C1 - Способ культивирования клеток человека и животных - Google Patents
Способ культивирования клеток человека и животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2496869C1 RU2496869C1 RU2012116328/10A RU2012116328A RU2496869C1 RU 2496869 C1 RU2496869 C1 RU 2496869C1 RU 2012116328/10 A RU2012116328/10 A RU 2012116328/10A RU 2012116328 A RU2012116328 A RU 2012116328A RU 2496869 C1 RU2496869 C1 RU 2496869C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- serum
- cells
- cultivation
- blood serum
- animal cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области цитологии и биотехнологии. Предложен способ культивирования клеток человека и животных на питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов буйволиц в объемном соотношении 5-7% сыворотки и 93-95% среды, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для культивирования клеток в культуре. 2 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток человека и животных, необходимых для производства вирусных вакцин, диагностикумов, получения моноклональных антител, биологически активных веществ, проведения диагностических исследований.
Необходимым компонентом питательных сред является сыворотка крови, без которой большинство культур клеток тканей человека и животных не растет in vitro. Сыворотка способствует размножению клеток, обуславливает их длительное прикрепление к субстрату, а также выполняет целый ряд регуляторных функций.
Известны способы культивирования клеток человека и животных с использованием сыворотки крови крупного рогатого скота (Общая и частная вирусология / Под редакцией В.М. Жданова. М., 1982. том 1. С.479-484; Животная клетка в культуре/ Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». 2000. С.67-88; Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. №18. С.89-91). Недостатками являются нестандартность, возможная контаминация вирусами и микоплазмами, содержание различных ингибиторов, задерживающих рост клеток и репродукцию вирусов.
Кроме того, одним из сдерживающих факторов в широком применении сыворотки крови крупного рогатого скота является наличие в ней антител ко многим возбудителям вирусных инфекций и, в первую очередь, таким, как парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит, аденовирусная инфекция, вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек, рота- и коронавирусные энтериты крупного рогатого скота. Наличие в сыворотке крови этих антител снижает результативность исследований в направлении адаптации штамма, выделения цитопатогенного вируса из патологического материала с целью постановки диагноза и, наконец, делает малоэффективным путь промышленного изготовления диагностических и вакцинных препаратов.
Для клеточной биотехнологии также предложены: - сыворотка крови северных оленей, - плодов крупного рогатого скота (ТУ 10-07-275-85; Гуненков ВВ., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. 2003. №6. С.37-41; Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. Вып.49. С.42-45; Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. №3. С.62-63).
Все эти сыворотки выпускаются в ограниченных количествах и полностью не удовлетворяют потребностей биотехнологии и вирусологии. Поэтому необходимы дальнейшие изыскания новых источников получения качественной и высокоактивной сыворотки крови для выращивания культур клеток.
Целью данного изобретения является повышение пролиферативной активности клеток за счет улучшения ростовых и адгезивных свойств питательной среды.
Пример 1. Культивирование клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (НЕр-2).
Во флакон со средой Игла+199 (смесь равных количеств среды Игла и среды 199) после добавления антибиотиков, из расчета: пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, пипеткой вносят сыворотку крови плодов буйволиц, в следующем объемном соотношении компонентов, %: среда - 95; сыворотка 5. Клетки НЕр-2 суспендируют в приготовленной таким образом среде, доводя их концентрацию до 100000 кл./мл. По 10 мл суспензии клеток пипеткой, при соблюдении условий асептики, вносят в культуральные флаконы, с рабочей поверхностью 20 см2. Флаконы помещают в термостат при 37°С. Через 3-4 суток культивирования формируется монослой клеток с типичной морфологией.
На вторые-третьи сутки культивирования клетки НЕр-2, выращиваемые с фетальной сывороткой, образовали сплошной монослой, тогда как с сывороткой крови крупного рогатого скота формирование монослоя отставало.
Процент адгезии через 4 ч при использовании питательной среды с экспериментальными сыворотками плодов буйволиц серий 1, 2 и 3 составил 8,8; 8,9 и 8,7 соответственно, в то время как в контроле он равнялся 6,3 (при посевной дозе клеток 100000 кл./мл). Высокий процент прикрепления клеток к стенке флаконов наблюдался через 14 часов культивирования: в экспериментальной сыворотке - 36,2; 38,5 и 37,7, в контрольной сыворотке - 33,8, соответственно.
Пример 2. Культивирование перевиваемой линии клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК).
Во флаконы с питательной средой Игла после добавления антибиотиков, из расчета: пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, пипеткой вносят сыворотку крови плода буйволицы, в следующем объемном соотношении компонентов, об., %: среда - 93; сыворотка - 7. Клетки ЛЭК суспендируют в приготовленной таким образом среде, доводя их концентрацию до 150000 кл./мл. По 10 мл суспензии клеток пипеткой, при соблюдении условий асептики, вносят во флаконы, с рабочей поверхностью 20 см2. Флаконы помещают в термостат при 37°C. Через 2-3 суток культивирования формируется монослой клеток с типичной морфологией.
На вторые сутки культивирования клетки ЛЭК, выращиваемые в среде с сывороткой крови плодов буйволиц, размножались интенсивно и формировали крупноочаговый монослой, тогда как в среде с сывороткой крови крупного рогатого скота число делящихся клеток на одно поле зрения было меньше.
Индекс пролиферации при использовании сыворотки крови плодов буйволиц в 3 сериях составил 2,8; 3,4 и 3,6, в среднем - 3,27±0,24, по сравнению с 2,8, при использовании бифабричной сыворотки крови крупного рогатого скота (при посевной дозе 150000 кл./мл). Жизнеспособность клеток колебалась от 74 до 100%.
Питательные среды (Игла, 199), содержащие сыворотку крови плодов буйволиц, обеспечивают достаточно высокую адгезивную, митотическую и пролиферативную активность, в концентрации 5-7% перевиваемых линий клеток НЕр-2 и ЛЭК.
Предлагаемый нами способ позволяет значительно удешевить процесс культивирования клеток и обеспечить получение на клеточных субстратах различных биологически активных веществ.
Список использованной литературы
1. Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. Вып.49. С.42-45.
2. Бердникова З.Е., Петручук Е.М., Шалунова Н.В., Ночевный В.Т. Методические указания «Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм». Утверждены Минздравом СССР 1988 г. М.: 1988. 18 с.
3. Гуненков В.В., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. 2003. №6. С.37-41.
4. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». 2000. С.67-88.
5. Михайлова Г.Р., Подчерняева Р.Я. Изучение ростстимулирующей активности отечественных сывороток различных видов животных. Вопросы вирусологии. 1990. №5. С.426-429.
6. Общая и частная вирусология/ Под редакцией В.М.Жданова. М., 1982. том 1. С.479-484.
7. Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. №18. С.89-91.
8. Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. №3. С.62-63.
Claims (1)
- Способ культивирования клеток животных, в том числе человека, путем засева клеточной суспензии на питательную среду, дополнительно содержащую сыворотку крови животных, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в присутствии сыворотки крови плодов буйволиц, при следующем объемном соотношении компонентов, об.%:
Синтетическая питательная среда 93-95 Сыворотка крови плодов буйволиц 5-7
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012116328/10A RU2496869C1 (ru) | 2012-04-23 | 2012-04-23 | Способ культивирования клеток человека и животных |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012116328/10A RU2496869C1 (ru) | 2012-04-23 | 2012-04-23 | Способ культивирования клеток человека и животных |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2496869C1 true RU2496869C1 (ru) | 2013-10-27 |
Family
ID=49446733
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012116328/10A RU2496869C1 (ru) | 2012-04-23 | 2012-04-23 | Способ культивирования клеток человека и животных |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2496869C1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030087372A1 (en) * | 2001-06-13 | 2003-05-08 | Genentech, Inc. | Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells |
-
2012
- 2012-04-23 RU RU2012116328/10A patent/RU2496869C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030087372A1 (en) * | 2001-06-13 | 2003-05-08 | Genentech, Inc. | Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
БУДУЛОВ НУРДИН РАГИМХАНОВИЧ. Респираторные болезни крупного рогатого скота в Дагестане: Автореферат. - Краснодар, 2009. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20170089924A (ko) | 줄기세포 재료 및 그 제조방법 | |
RU2496869C1 (ru) | Способ культивирования клеток человека и животных | |
RU2640556C2 (ru) | Культуральная среда для мезенхимальных стволовых клеток человека | |
CN103937736A (zh) | 鱼鳃细胞系的建立方法 | |
US20120190068A1 (en) | Drain down and re-feed of microcarrier bioreactor | |
RU2588666C1 (ru) | Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих | |
RU2488631C1 (ru) | ЛИНИЯ КЛЕТОК ПОЧКИ ТЕЛЕНКА Bos taurus RBT (Rene Bos Taurus) ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ | |
RU2542481C2 (ru) | Способ получения бактериологически чистых культур морских сине- зеленых микроводорослей | |
CN103725644B (zh) | 樱桃谷鸭胚上皮细胞系及其建立方法 | |
RU2506310C1 (ru) | ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ПОРОСЕНКА Sus scrofa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ | |
RU2648160C2 (ru) | Питательная среда для выделения бактерий yersinia enterocolitica | |
RU2797013C1 (ru) | Способ повышения эффективности культивирования в условиях in vitro каллусной культуры Базилика Обыкновенного (Ocimum basilicum) | |
RU2673718C1 (ru) | Питательная среда для культивирования перевиваемых клеточных линий млекопитающих | |
CN117417900A (zh) | 一种狂犬病疫苗用人二倍体细胞的无血清细胞培养方法和应用 | |
CN110241158B (zh) | 一种促进裸藻蛋白合成的方法 | |
CN103122333A (zh) | 一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法 | |
RU2529364C1 (ru) | Бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба | |
JPH08214876A (ja) | ウイルスの調製法 | |
CN109136170B (zh) | 一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用 | |
RU2371476C2 (ru) | Питательная среда для выделения возбудителя сапа | |
RU2723711C1 (ru) | Способ получения вакцины гидроокисьалюминиевой против мастита коров стрептококковой этиологии | |
Sharma et al. | An Introduction to Cell Culture | |
RU2553552C1 (ru) | Внк-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства | |
SU1360193A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток почки эмбриона человека дл накоплени и титровани вируса клещевого энцефалита | |
RU2129608C1 (ru) | Способ получения вируса краснухи и поддерживающая питательная среда для его культивирования (ее варианты) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160424 |