RU2481850C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ АКТИВНЫХ АНАМОРФНЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА Cordyceps С АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ АКТИВНЫХ АНАМОРФНЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА Cordyceps С АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2481850C1 RU2481850C1 RU2012100456/15A RU2012100456A RU2481850C1 RU 2481850 C1 RU2481850 C1 RU 2481850C1 RU 2012100456/15 A RU2012100456/15 A RU 2012100456/15A RU 2012100456 A RU2012100456 A RU 2012100456A RU 2481850 C1 RU2481850 C1 RU 2481850C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fungi
- cordyceps
- culture fluid
- anamorphic
- antibiotic activity
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к области фармакологии и медицины и представляет собой способ получения концентрата культуральной жидкости активных анаморфных видов грибов Р. farinosus, С. militare, В. brongniartii с антибиотической активностью, включающий культивирование грибов рода Cordyceps на жидких питательных средах (среда Чапека, отвары зерновых, неохмеленное пивное сусло (7%)) в стационарных условиях с последующей концентрацией культуральной жидкости, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют заражение тест-насекомых G. mellonella интрагемоцеллюлярно (введение в гемоцель 0,01 мл суспензии), погружение личинок в суспензию на 30 секунд, инфицирование корма грибами рода Cordyceps для получения вирулентных анаморфных форм, а затем от мумифицированных и меланизированных личинок G. mellonella путем пересева грибов с насекомого на жидкие питательные среды получают биотехнологические культуры, концентрированная культуральная жидкость которых обладает повышенной антибиотической активностью. Изобретение обеспечивает унификацию процесса получения концентрата культуральной жидкости анаморфных видов грибов рода Cordyceps. 3 пр., 3 табл.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области фармакологии и медицины и может найти применение в области онкологии как препараты, обладающие выраженной противоопухолевой активностью, а также для лечения таких заболеваний, как бронхит, пневмония, туберкулез, цирроз, ревматизм, действует как натуральный антибиотик, укрепляет здоровье, продлевает жизнь.
Хорошо известны БАД Cordyceps (Кордицепс NSP), используя которые, китайская женская команда по легкой атлетике установила мировые рекорды в 1993-1994 годах (http://vitolife.ru/product/bad-cordyceps-kordiceps-ot-kompanii-nsp).
Препарат Cordycepin from Cordyceps militaris (Sigma-Aldrich) известен как антибиотик и противораковый препарат. Cordyceps получил известность в коммерческой реализации как «гриб-насекомое», на его основе производят различные БАДы и лекарственные препараты. Род Cordyceps насчитывает более 200, в практике используют чаще всего два вида - С.sinensis и С.militaris. (Евлахова А.А. Энтомопатогенные грибы. Л.: Наука, 1974. 260 с.; Коваль Э.З. Определитель энтомофильных грибов СССР. Киев: Наукова думка, 1974. 260 с.; Коваль Э.З. Клавиципитальные грибы СССР. Киев: Наукова думка, 1984. - 287 с.). Насекомое со стромами находят в лесной подстилке, это телеоморфная стадия гриба (мейотическое половое спороношение). Как правило, для поражения насекомого и прорастания стромы нужно несколько месяцев. Наряду с телеоморфной стадией присутствует и анаморфная (бесполая) стадия, где размножение гриба происходит путем митотических делений, конидиями. Собираемые в природе насекомые со стромами, пораженные грибами (телеоморфная стадия), встречаются не часто и являются достаточно дорогим товаром. Корпорации, которые занимаются производством препаратов на основе грибов рода Cordyceps (китайские, японские, корейские и др.), чаще всего используют анаморфную стадию развития таких грибов, как Paecilomyces hepiali C., P.farinosus (Dicks et Fr.), Brown a Smith (телеоморфа С.sinensis (Berk.) Sacc.); Cephalosporium militare Y.Kabaysi (телеоморфа С.militaris (Fr.).
Известен гриб С.sinensis, паразитирующий на насекомых из различных отрядов (Lepidoptera, Coleoptera и др.). Этот гриб собирают в горах Тибета и Непала и используют как основу для получения биотехнологического мицелия и склероция при производстве БАВ и лекарственных препаратов (Коренева Н.В. Кордицепс и иммунная система: Некоммерческое Экспериментальное издание. М.: 2009. - 60 с., илл.).
Известный метод культивирования Cordyceps sinensis (Заявка Кореи №20100012923, A01G 1/04; A23K 1/14; A23L 1/28, 2010 г.) включает культивирование гриба в питательной среде, содержащей 1-3% кожицы цитрусовых, отруби риса 3%, патоку 1% и дрожжи, и получение 2% культуры Cordyceps sinensis при температуре 25-35°С в течение 4-7 дней.
Известен способ культивирования гриба Cordyceps (Заявка Китая №101215527, C12N 1/14, 2008 г.), в котором дикая и естественная спора, порожденная на Тибетском плато, привита организму куколки тутового шелкопряда после искусственного проращивания в куколке тутового шелкопряда.
Ближайшим аналогом является способ выращивания Cordyceps sinensis (Патент США №6737065, A23K 1/00, A23K 1/175, A23L 1/28, 2004 г.) в бульонах, содержащих воду от мытья от зерен, таких как рис, клейкий рис, ячмень, пшеница, просо, клейкое сорго обыкновенное, клейкое просо борова, и Кукушкины слезки с добавлением хрома, селена и германия.
Недостатком известного способа являются сложные и многокомпонентные составы питательной среды, ее несбалансированность по составу для многоразового использования, поэтому состав среды сложно унифицировать.
Задачей предлагаемого изобретения является стабильность и предсказуемость результатов за счет использования стандартных питательных сред и пассажей Cordyceps через тестовых насекомых.
Поставленная задача достигается тем, что в способе получения концентрата культуральной жидкости анаморфных видов грибов рода Cordyceps с антибиотической активностью, включающем культивирование грибов рода Cordyceps на жидких питательных средах в стационарных условиях с последующей концентрацией культуральной жидкости, дополнительно осуществляют заражение тест-насекомых грибами рода Cordyceps для получения вирулентных анаморфных форм и затем от мумифицированных и меланизированных насекомых путем пересева грибов с насекомых на стандартные жидкие питательные среды получают биотехнологические культуры, концентрированная культуральная жидкость которых обладает повышенной антибиотической активностью.
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1. Биологическая активность грибов рода Cordyceps зависит прежде всего от вирулентной активности. Среди грибов рода Cordyceps только немногие виды (Р.farinosus, С.militart, B.brongniartii) способны вызвать микоз тест-насекомых с достаточно высоким % гибели. Поэтому проводят отбор вирулентных форм после обнаружения пораженных кордицепсами насекомых в биогеоценозах, используя различные методы заражения: интрагемоцеллюлярно (введение в гемоцель 0,01 мл суспензии), погружение личинок в суспензию на 30 секунд, инфицирование корма. В качестве тест-насекомых используются личинки Galleria mellonella. Для заражения используют различный по составу инфекционный материал:
1. Р.farinosus (телеоморфа С.sinensis) - суспензия из растертых в порошок стром, склероций и мицелия, доза заражения личинок G.mellonella максимальная;
2. С.militare (телеоморфа С.militarise - такой же материал, как в п.1, доза заражения личинок G.mellonella максимальная;
3. В.brongniartii (телеоморфа С.brongniartii) - суспензия, состоящая из конидий и мицелия, доза заражения личинок G.mellonella максимальная (табл.1).
Таблица 1 | ||||
Заражение личинок G.mellonella различными способами для отбора вирулентных форм грибов рода Cordyceps (в каждом варианте опыта использовали по 30 личинок G.mellonella) | ||||
Видовое название гриба | Состав инфекционного материала | Гибель личинок G.mellonella (%) при заражении путем | ||
интрагемоцеллюлярным (введение в гемоцель личинкам 0,01 мл суспензии) | погружения в водную суспензию | скармливания инфицированного корма | ||
P.farinosus (телеоморфа С.sinensis) | Стромы + склероций + мицелий | 33,3 | 0 | 0 |
C.militare (телеоморфа С.militaris) | Стромы + склероций + мицелий | 60,0 | 16,6 | 0 |
В.brongniartii (телеоморфа С.brongniartii) | Склероций + мицелий | 100,0 | 43,3 | 36,6 |
Контроль - вода | 0 | 0 | 0 |
Грибы рода Cordyceps относятся к видам средней вирулентной активности, поэтому для поражения ими насекомых наиболее подходящим местом является лесная подстилка. Период заражения длится несколько месяцев. При заражении насекомых грибами Cordyceps возникает инфекционное заболевание, которое часто заканчивается гибелью насекомых с признаками мускардиноза (мумифицирование насекомых). На первом этапе микозы сопровождаются меланизацией - окислением фенольных соединений, катализируемым ферментом полифенолоксидазой. Одной из предпосылок меланизации следует считать резкое увеличение в крови насекомых количества гемоцитов, содержащих полифенолоксидазу, непосредственно после попадания микроорганизма в полость тела (Евлахова А.А., Павлюшин В.А. Механизмы защиты у насекомых от грибных патогенов в связи с факторами вирулентности. В сб.: Микроорганизмы в защите растений. - Иркутск: изд-во Иркут. ун-та, 1983. - 156 с.). Меланизация у насекомых, например у личинок большой вощинной моли (G.mellonella L.), характеризуется наличием черно-бурых пятен, которые появляются за несколько дней до гибели. Форма, размеры, расположение и количество пятен не зависят от вида гриба, но коррелируют с вирулентностью штамма. Так, при заражении высоковирулентными штаммами Metarhizium anisopliae и В.bassiana у личинок G.mellonella в большом количестве регистрировали мелкие бурые пятна (Логинов Е.В. Развитие меланоза и изменения плотности тела при бактериально-грибных смешанных инфекциях личинок большой пчелиной огневки. В сб.: Энтомопатогенные микроорганизмы и их использование в народном хозяйстве. - Иркутск: изд-во Иркут. ун-та, 1992. - 121 с.). Бурые пятна кутикулы насекомых представляют собой меланотическую капсулу или меланотический тромб, где кроме меланина и склеротина находятся протеины и аминокислоты. Поскольку лекарственное сырье, например С.sinensis, представляет гриб-насекомое, то ценность мумифицированных насекомых с большим количеством меланина в кутикуле значительно выше.
Признак меланизации личинок G.mellonella взят в качестве теста при отборе грибов рода Cordyceps. Мумифицированные меланизированные личинки G.mellonella служили основой для получения биотехнологических культур.
Для этого личинки выкладывали на стерильную влажную фильтровальную бумагу в чашки Петри и после их обрастания грибами производили пересев грибов на стерильные жидкие питательные среды: Чапека (NaNO3 - 3 г; KH2PO4 - 1 г; MgSO4·7 H2O - 0,5 г; KCl - 0,5 г; FeSO4 - 0,01 г; сахароза - 30 г; вода (дистиллированная) - 1 л) отвары злаков (овес (пшеница) - 100 г отваривается в течение 1 ч в 1 л воды, фильтруется, добавляется 30 г сахарозы), неохмеленное пивное сусло (1 л пивного сусла 7-8° по Баллингу). Указанные среды являются стандартными для оптимального роста многих микроскопических грибов, в том числе и энтомопатогенных, в данном случае для грибов рода Cordyceps.
Культивирование осуществляют в колбах в стационарных условиях. После 14-дневного культивирования при температуре 24-26°С культуральную жидкость (КЖ) отделяют фильтрованием и концентрируют при трехкратном замораживании. Для этого КЖ грибов, выращенных на жидкой питательной среде, отделяли от мицелия фильтрованием, а затем концентрировали вымораживанием в цилиндрах при температуре 18°С. После размораживания светлую часть КЖ отделяли. Повторяли замораживание трижды. Таким образом, КЖ освобождали от связанной воды и низкомолекулярных фракций жизнедеятельности грибов.
Пример 2. Жидкие концентраты КЖ анаморфных форм Р.farinosus, C.militare, В.brongniartii проверяли на антибиотическую активность. Для этого в центр чашки Петри со стерильной агаризованной средой РПА помещали стерильные стандартные диски фирмы BioMerieux, пропитанные исследуемыми концентратами КЖ грибов (табл.2).
Таблица 2 | ||||
Антибиотическая активность анаморфных видов грибов рода Cordyceps | ||||
Анаморфные грибы рода Cordyceps | Зона задержки роста тест культур микроорганизмов (мм) | |||
Sarcina rubra S2 | Bacillus mycoides B27 | Bacillus megaterium B35 | Staphylococcus sp. St.34 | |
Р.farinosus | 6,60±0,10 | 6,43±0,03 | 5,60±0,21 | 5,13±0,49 |
С.militare | 9,00±0,01 | 8,07±0,43 | 8,77±0,09 | 8,73±0,09 |
В.brongniartii | 9,00±0,01 | 8,83±0,12 | 8,82±0,03 | 8,85±0,09 |
Пример 3. Одновременно с выявлением антибиотической активности анаморфных видов рода Cordyceps, определяли антибиотическую активность и телеоморфных стадий развития грибов этого рода. Постановка эксперимента осуществлялась по той же методике, что и для анаморфной стадии, но материалом служили спиртовые экстракты, полученные:
- для гриба С.sinensis - из стром, склероция и мицелия;
- для гриба С.militaris - из стром;
- для гриба С.brongniartii - из склероция и мицелия (табл.3).
Таблица 3 | ||||
Антибиотическая активность телеоморфных видов грибов рода Cordyceps | ||||
Телеоморфные грибы рода Cordyceps | Зона задержки роста тест культур микроорганизмов (мм) | |||
Sarcina rubra S2 | Bacillus mycoides B27 | Bacillus megaterium B35 | Staphylococcus sp. St.34 | |
С.sinensis | 7,00±0,50 | 5,43±0,15 | 4,10±0,12 | 7,30±0,12 |
С.militaris | 7,60±0,15 | 6,70±1,00 | 4,63±0,07 | 4,90±0,31 |
С.brongniartii | 6,37±0,09 | 7,03±0,03 | 7,53±0,12 | 6,40±0,10 |
Для грибов рода Cordyceps как для анаморфных стадий развития (концентрированная КЖ биотехнологических культур), так и для телеоморфных прослеживается общая закономерность (таблицы 1-3), чем выше вирулентность культур (% гибели насекомых) с последующей мумификацией и меланизацией, тем выше антибиотическая активность.
Технический эффект заключается в унификации процесса получения концентрата культуральной жидкости анаморфных видов грибов рода Cordyceps. Учитывая распространенность препаратов на основе этих грибов, и то, что они не всегда отвечают требованиям терапевтической практики, способ позволяет получать биотехнологические культуры грибов рода Cordyceps на стандартных питательных средах со стабильными антибиотическими свойствами.
Claims (1)
- Способ получения концентрата культуральной жидкости активных анаморфных видов грибов Р. farinosus, С. militare, В. brongniartii с антибиотической активностью, включающий культивирование грибов рода Cordyceps на жидких питательных средах (среда Чапека, отвары зерновых, неохмеленное пивное сусло (7%)) в стационарных условиях с последующей концентрацией культуральной жидкости, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют заражение тест-насекомых G. mellonella интрагемоцеллюлярно (введение в гемоцель 0,01 мл суспензии), погружение личинок в суспензию на 30 секунд, инфицирование корма грибами рода Cordyceps для получения вирулентных анаморфных форм, а затем от мумифицированных и меланизированных личинок G. mellonella путем пересева грибов с насекомого на жидкие питательные среды получают биотехнологические культуры, концентрированная культуральная жидкость которых обладает повышенной антибиотической активностью.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012100456/15A RU2481850C1 (ru) | 2012-01-10 | 2012-01-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ АКТИВНЫХ АНАМОРФНЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА Cordyceps С АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012100456/15A RU2481850C1 (ru) | 2012-01-10 | 2012-01-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ АКТИВНЫХ АНАМОРФНЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА Cordyceps С АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2481850C1 true RU2481850C1 (ru) | 2013-05-20 |
Family
ID=48789738
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012100456/15A RU2481850C1 (ru) | 2012-01-10 | 2012-01-10 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ АКТИВНЫХ АНАМОРФНЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА Cordyceps С АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2481850C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112617015A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-09 | 青海珠峰冬虫夏草工程技术研究有限公司 | 含中国被毛孢培养物的饲料添加剂组合物及其制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6737065B2 (en) * | 2000-10-06 | 2004-05-18 | Jae-Mahn Song | Method for producing mushroom mycelia and uses thereof |
US20100124583A1 (en) * | 2008-04-30 | 2010-05-20 | Xyleco, Inc. | Processing biomass |
-
2012
- 2012-01-10 RU RU2012100456/15A patent/RU2481850C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6737065B2 (en) * | 2000-10-06 | 2004-05-18 | Jae-Mahn Song | Method for producing mushroom mycelia and uses thereof |
US20100124583A1 (en) * | 2008-04-30 | 2010-05-20 | Xyleco, Inc. | Processing biomass |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Masahiko Isaka et. all "Bioactive Substances from Insect Pathogenic Fungi", March 7, 2005, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), Thailand Science Park. * |
Успехи медицинской микологии. / Под ред. Ю.В.Сергеева, том 5, Материалы третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии, 2005, с.206-213. Si-Young Lee et. all. "Cultivation of entomopathogenic fungi for the search of antibacterial compounds", Mycophatologia, 2005, 160:321-325. * |
Успехи медицинской микологии. / Под ред. Ю.В.Сергеева, том 5, Материалы третьего Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии, 2005, с.206-213. Si-Young Lee et. all. "Cultivation of entomopathogenic fungi for the search of antibacterial compounds", Mycophatologia, 2005, 160:321-325. Masahiko Isaka et. all "Bioactive Substances from Insect Pathogenic Fungi", March 7, 2005, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), Thailand Science Park. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112617015A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-09 | 青海珠峰冬虫夏草工程技术研究有限公司 | 含中国被毛孢培养物的饲料添加剂组合物及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107475130B (zh) | 细柄棒束孢新菌种及其栽培方法和用途 | |
Kapoor et al. | Studies on different growth parameters of Ganoderma lucidum | |
Moslemi et al. | Alternaria infectoria and Stemphylium herbarum, two new pathogens of pyrethrum (Tanacetum cinerariifolium) in Australia | |
CN112501029A (zh) | 松蕈及其用于生产麦角硫因的方法 | |
CN112574893A (zh) | 鲍氏桑黄孔菌、其发酵产物的制备方法及应用 | |
KR20090054114A (ko) | 번데기동충하초버섯의 인공재배시 고함량의 코디세핀을안정적으로 생산하는 방법 | |
SONG et al. | First report of a new potato disease caused by Galactomyces candidum F12 in China | |
KR101200399B1 (ko) | 신규 애주름버섯 균주 및 이를 이용한 천마종자의 기내발아방법 | |
Li et al. | First report that Colletotrichum aenigma causes leaf spots on Aquilaria sinensis in China | |
RU2481850C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ АКТИВНЫХ АНАМОРФНЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА Cordyceps С АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
KR100405990B1 (ko) | 유기게르마늄 함유 동충하초의 제조방법 | |
KR20040047730A (ko) | 펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물 | |
JP4721128B2 (ja) | 冬虫夏草新菌株 | |
CN113308378A (zh) | 高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用 | |
JP2003116522A (ja) | 冬虫夏草培養用培地および冬虫夏草培養法 | |
CN113481108B (zh) | 一种刺激树干上捕食线虫真菌生长的营养基质及其制备方法和用法 | |
CN107325973B (zh) | 一株对榛椿象具有强致病力的白僵菌菌株及其应用 | |
CN109618811B (zh) | 产业化冬虫夏草人工培育方法 | |
TWI521058B (zh) | 牛樟芝培養方法及牛樟芝酒萃物之萃取方法 | |
KR100706132B1 (ko) | 펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물 | |
Kumari | In-vitro propagation of Ganoderma Lucidum–A medicinal mushroom in different culture medium | |
CN109401982B (zh) | 一株高效防治蚧壳虫的爪哇棒束孢 | |
CN109275667B (zh) | 爪哇棒束孢防治蚧壳虫的应用 | |
KR100754821B1 (ko) | 벌 동충하초 j―201 균주의 균사체와 그 세포외 다당체의대량 생산방법 | |
Huang et al. | Acceleration of mycelia growth by adding Grifola umbellata broth concentrate in solid-state and submerged cultures |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20140814 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170111 |