RU2472775C1 - Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание - Google Patents
Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание Download PDFInfo
- Publication number
- RU2472775C1 RU2472775C1 RU2011123065/04A RU2011123065A RU2472775C1 RU 2472775 C1 RU2472775 C1 RU 2472775C1 RU 2011123065/04 A RU2011123065/04 A RU 2011123065/04A RU 2011123065 A RU2011123065 A RU 2011123065A RU 2472775 C1 RU2472775 C1 RU 2472775C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dinitrophenol
- respiration
- rate
- hydroxy
- cell
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к получению содержащих динитрофенольный фрагмент 2-гидрокси-3,5-динитро-N-(салицилиден)-анилину или 2-гидрокси-3,5-динитро-N-(4-диметиламинобензилиден)-анилину, рассеивающих протонный градиент, создаваемый дыханием, и влияющих на окислительное фосфорилирование в митохондриях, взаимодействием 2-амино-4,6-динитро фенола и салицилового альдегида или п-диметиламино бензальдегида. 5 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины, а также к биохимии и может быть использовано для получения биологически активных веществ, стимулирующих клеточное дыхание, в лабораторных и промышленных условиях.
Известен способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание (патент №2066995, от 12.10.1993 г., кл. А61К 35/14). Сущность способа в том, что ферментативный гидролиз сыворотки крови телят проводят с использованием бактериальной эндопротеазы в определенных условиях до получения субстанции препарата гидролизатов.
Известны также азометины, обладающие рострегулирующей активностью (патент №2146251, №2146252 от 18.01.1999 г.). Производные 6-метил-1,2,4-триазинона-5 обладают положительной рострегулирующей активностью и могут быть рекомендованы в сельском хозяйстве для повышения урожая культур.
Задача - получение соединений, обладающих стимулирующим действием на клеточное дыхание.
Сущность способа в том, что получены различные азометины, содержащие динитрофенольный фрагмент, соединенный с различными радикалами, рассеивающие протонный градиент, создаваемый дыханием, и влияющие на окислительное фосфорилирование в митохондриях.
Получают азометины реакцией пикраминовой кислоты с ароматическими альдегидами. Азометины - обширный класс соединений, синтезировано их достаточное множество. Среди них найдено множество соединений, обладающих биологической активностью, много лекарственных препаратов. Основное применение они находят в органическом синтезе, главным образом для получения вторичных аминов и гетероциклических соединений.
Нами синтезированы азометины на основе ароматических аминов и замещенных бензальдегидов.
2-гидрокси-3,5-динитро-N-(салицилиден)-анилин нами получен реакцией 2-амино-4,6-динитрофенола (пикраминовой кислоты) с салициловым альдегидом. Реакция протекает в течение 2-х часов на водяной бане при 75°С
В ИК-спектре полученного соединения обнаружена интенсивная полоса в области 1610 см-1, принадлежащая валентным колебаниям азометиновой группы.
В результате аналогичной реакции между 2-амино-4,6-динитрофенолом и парадиметиламинобензальдегидом образуется 2-гидрокси-3,5-динитро-N-(4-диметиламинобензилиден)-анилин:
В ИК-спектре полученного азометина обнаружена интенсивная полоса в области 1610 см-1, принадлежащая азометиновой группе.
Полученные соединения представляют собой окрашенные в оранжевый цвет кристаллические вещества, растворимые в спирте, хлороформе, бензоле.
Таким образом, общим в структуре исследуемых соединений является наличие динитрофенольного фрагмента.
Динитрофенол является довольно сильной кислотой и, следовательно, способен к обратимому связыванию протонов:
В то же время этот фрагмент гидрофобен и поэтому способствует проникновению через биомембрану. Объединение этих двух свойств делает производные 2,4-динитрофенола (ДНФ) разобщителями окислительного фосфорилирования.
Присоединение радикала R к динитрофенольному фрагменту существенно не изменяет способности этого фрагмента к диссоциации, поэтому производные динитрофенола также способны к разобщению окислительного фосфолирования. Скорость дыхания в разобщенном состоянии определяется активностью переносчиков электронов электрон-транспортной цепи или активностью фермента, поставляющего восстановительные эквиваленты в электрон-транспортную цепь. В нашем случае это сукцинатдегидрогеназа, поскольку в качестве субстрата использовался сукцинат.
На рис.1 представлена кривая кинетики потребления кислорода гомогенатом печени крыс в полярографической ячейке с электродом Кларка в качестве регистрирующего датчика. По оси абсцисс откладывается величина тока восстановления кислорода на электроде Кларка, по оси ординат отложено время. Скорость потребления кислорода определяется по тангенсу угла наклона кривой к оси ординат (V=dc/dt, V - скорость потребления, с - концентрация кислорода в ячейке, t - время). В ячейку последовательно добавляют буфер, гомогенат печени крыс, субстракт окисления (сукцинат), вещество А (2-гидрокси-3,5-динитросалицилиденанилина).
На рис.2 представлена кривая кинетики потребления кислорода гомогенатом печени крыс в полярографической ячейке с электродом Кларка в качестве регистрирующего датчика. По оси абсцисс откладывается величина тока восстановления кислорода на электроде Кларка по оси ординат отложено время. Скорость потребления кислорода определяется по тангенсу угла наклона кривой к оси ординат (V=dc/dt, V - скорость потребления, с - концентрация кислорода в ячейке, t - время). В ячейку последовательно добавляют буфер, гомогенат печени крыс, субстракт окисления (сукцинат), вещество В (2-гидрокси-3,5-динитро-N-(4-диметиламинобензилиден)-анилина).
На рис.3 представлена кривая кинетики потребления кислорода гомогенатом печени крыс в полярографической ячейке с электродом Кларка в качестве регистрирующего датчика. По оси абсцисс откладывается величина тока восстановления кислорода на электроде Кларка, по оси ординат отложено время. Скорость потребления кислорода определяется по тангенсу угла наклона кривой к оси ординат (V=dc/dt, V - скорость потребления, с - концентрация кислорода в ячейке, t - время). В ячейку последовательно добавляют буфер, гомогенат печени крыс, субстракт окисления (сукцинат), вещество С (4-метокси-5-амино-6-тио-(2,4-динирофенил)-пиримидина).
На рис.4 представлена кривая кинетики потребления кислорода гомогенатом печени крыс в полярографической ячейке с электродом Кларка в качестве регистрирующего датчика. По оси абсцисс откладывается величина тока восстановления кислорода на электроде Кларка, по оси ординат отложено время. Скорость потребления кислорода определяется по тангенсу угла наклона кривой к оси ординат (V=dc/dt, V - скорость потребления, с - концентрация кислорода в ячейке, t - время). В ячейку последовательно добавляют буфер, гомогенат печени крыс, субстракт окисления (сукцинат), пикраминовую кислоту.
На рис.5 представлена кривая кинетики потребления кислорода гомогенатом печени крыс в полярографической ячейке с электродом Кларка в качестве регистрирующего датчика. По оси абсцисс откладывается величина тока восстановления кислорода на электроде Кларка, по оси ординат отложено время. Скорость потребления кислорода определяется по тангенсу угла наклона кривой к оси ординат (V=dc/dt, V - скорость потребления, с - концентрация кислорода в ячейке, t - время). В ячейку последовательно добавляют буфер, гомогенат печени крыс, субстракт окисления (сукцинат), АДФ (аденозиндифосфорную кислоту), разобщитель (ДНФ, 2,4-динитрофенол). Чем сильнее разобщитель, тем сильнее ускоряется потребление кислорода.
В качестве стандарта для сравнения разобщающих способностей использовался ДНФ, так как это наиболее широко используемый в молекулярной биоэнергетике разобщитель. Известно, что в концентрации 10-4 моль/л ДНФ практически полностью разобщает окисление с фосфорилированием, то есть синтез АТФ в присутствии ДНФ практически отсутствует, а скорость дыхания максимальна. Следует, однако, отметить, что при достаточно долгом разобщенном дыхании в определенных условиях окисление сукцината может приводить к накоплению в митохондриях щавелевоуксусной кислоты (ЩУК), которая в микромолярных концентрациях сильно ингибирует активность сукцинатдегидрогеназы, что может приводить к практически полному подавлению дыхания. Условия, при которых в митохондриях накапливается ЩУК, состоят в том, что скорость образования ЩУК должна превышать скорость ее утилизации, либо в результате переаминирования, либо конденсацией с ацетил-К0А и образованием лимонной кислоты. Чтобы исключить ЩУКовое торможение, в среду инкубации добавляли глутамат, который в реакции переаминирования с ЩУК дает аспартат и α-кетоглутарат, которые не являются ингибиторами сукцинатдегидрогеназы. ДНФ в концентрации 10-4 моль/л ускоряет дыхание на 50% по сравнению с начальной скоростью дыхания на сукцинате. Вещество А в той же концентрации увеличивает скорость на 103% и таким образом оно является лучшим стимулятором дыхания по сравнению с ДНФ. Если предположить, что ДНФ полностью разобщает дыхание с фосфорилированием, то увеличение скорости дыхания в присутствии вещества А по сравнению с ДНФ может быть обусловлено либо повышением активности переносчиков электрон-транспортной цепи, либо активацией сукцинатдегидрогеназы. Вещество А по сравнению с ДНФ обладает дополнительным объемным гидрофобным радикалом, что должно увеличивать его растворимость в липидах мембран. Поэтому можно предположить, что концентрация вещества А во внутренней мембране митохондрий будет выше, чем концентрация ДНФ. Это, с одной стороны, может ускорить транспорт протонов через мембрану, а с другой стороны, привести к изменению фазового состояния липидов внутренней мембраны митохондрий. Например, это может привести к увеличению жидкостности (уменьшению вязкости) липидов мембраны.
Поскольку предполагается, что лимитирующей стадией электронного транспорта является перенос электронов от коэнзима-Q на цитохромную цепочку, причем скорость переноса определяется скоростью диффузии коэнзима-Q в мембране, то уменьшение вязкости должно привести к увеличению скорости диффузии коэнзима-Q, а следовательно, и скорости дыхания.
Вещество В ускоряет дыхание на 72%. Оно отличается от вещества А тем, что к ароматическому радикалу присоединена N(СН3)2 группа. Молекулярные веса веществ А и В близки и довольно близки их эффекты на скорость дыхания, различие, которое имеется, обусловлено, видимо, какими-то специфическими взаимодействиями с участниками электрон-транспортной цепи.
Наибольший стимулирующий эффект наблюдается для пикраминовой кислоты, которая по сравнению с ДНФ имеет добавочную NH2-группу, расположенную рядом с ОН-группой. Она увеличивает скорость дыхания на 144%. Это видимо приводит к увеличению константы диссоциации ОН-группы, при этом способность связывать и освобождать протон увеличивается, а это, в свою очередь, увеличивает протонофорную и, следовательно, разобщающую способности.
Из приведенных результатов видно, что вариация в химической структуре радикалов, соединенных с динитрофенольным фрагментом, влияет на стимулирующий эффект соединения. Мы выяснили, что эта зависимость величины эффекта от структуры связана не только с разобщающим действием этих соединений, но и с возможным их влиянием на электронный транспорт во внутренней мембране митохондрии и активность ферментов, поставляющих восстановительные эквиваленты (электроны) в электрон-транспортную цепь.
Скорость дыхания в разобщенном состоянии определяется активностью переносчиков электронов электрон-транспортной цепи.
Опыты проводили на гомогенате крыс. Крысу декапитировали и выделяли исследуемый орган - печень. Ткань промывали ледяным физиологическим раствором. Извлеченную из раствора ткань промакивали фильтровальной бумагой и взвешивали навеску в 1 грамм. Затем ткань измельчали ножницами. Готовили 10% гомогенат (1 г ткани + 9 мл среды выделения). Для этого использовали гомогенизатор Поттера с тефлоновым пестиком, гомогенизировали при 800 об/мин в течение 0,5 минуты.
Все операции проводились на холоде, кроме того стакан, тефлоновый пестик, пипетки и среду выделения предварительно охлаждали.
Состав среды выделения:
Сахароза | - 0,2 М |
ЭДТА | - 1 мМ |
Hepes | - 10 мМ |
KCl | - 50 мМ |
рН среды выделения доводили от 2,5Н NaOH до 7,5.
Определение скорости дыхания гомогената ткани крысы проводили полярографическим методом. Измерение дыхания проводили на полярографе ZP - 7. Среда инкубации:
Сахароза | - 0,2 М |
ЭДТА | - 1 мМ |
Hepes | - 10 мМ |
KCl | - 50 мМ |
KH2PO4 | - 2 мМ |
Дыхательный субстрат - сукцинат натрия (конечная концентрация 1 мМ); глутамат натрия (конечная концентрация 1 мМ).
Исследуемое вещество (конечная концентрация 10-4 М).
pH реактивов доводили от 2,5Н NaOH до 7,5.
В полярографическую ячейку с электродом через специальные отверстия шприцом вносили 1 мМ среды инкубации 26°С и включали самописец. В ячейку помещали магнитную мешалку. Через полминуты вносили микропипеткой 0,2 мл гомогената ткани.
В этих условиях регистрация продолжалась 0,5 минут, затем вносили 50 мкл сукцината Na. Еще через минуту добавляли 20 мкл исследуемого вещества. Регистрация проводилась трижды, и затем брали среднее.
Предлагаемый способ позволяет получить вещества, которые повышают эффективность потребления кислорода гомогенатами ткани печени крыс, что влияет на клеточное дыхание.
Азометины, содержащие динитрофенольный фрагмент, соединенный с различными радикалами, обладают стимулирующим эффектом на потребление кислорода гомогенатами ткани печени крыс. Величина эффекта зависит от структуры радикала, связанного с динитрофенольным фрагментом. Предполагается, что исследуемые вещества не только рассеивают протонный градиент, создаваемый дыханием, но оказывает влияние и на других участников окислительного фосфорилирования в митохондриях.
Claims (1)
- Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание, содержащих динитрофенольный фрагмент, таких как 2-гидрокси-3,5-динитро-N-(салицилиден)-анилин или 2-гидрокси-3,5-динитро-N-(4-диметиламинобензилиден)-анилин, рассеивающих протонный градиент, создаваемый дыханием и влияющих на окислительное фосфорилирование в митохондриях, взаимодействием 2-амино-4,6-динитрофенола и салицилового альдегида или п-диметиламинобензальдегида.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011123065/04A RU2472775C1 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011123065/04A RU2472775C1 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011123065A RU2011123065A (ru) | 2012-12-20 |
RU2472775C1 true RU2472775C1 (ru) | 2013-01-20 |
Family
ID=48806508
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011123065/04A RU2472775C1 (ru) | 2011-06-07 | 2011-06-07 | Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2472775C1 (ru) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2735344A (en) * | 1956-02-21 | larsson | ||
GB759871A (en) * | 1953-04-04 | 1956-10-24 | Bayer Ag | Chromium containing azomethine dyestuffs |
GB767754A (en) * | 1953-08-07 | 1957-02-06 | Sandoz Ltd | "halogenated naphthoquinone-imines and process for their manufacture" |
GB769688A (en) * | 1953-04-30 | 1957-03-13 | Hoechst Ag | Manufacture of water-soluble sulphochloracetic acid ester salts of leuco vat dyestuffs |
US5256822A (en) * | 1992-02-07 | 1993-10-26 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Imine derivatives and process for production thereof |
RU2097372C1 (ru) * | 1991-04-04 | 1997-11-27 | Зенека Лимитед | Способ получения ароматического азометина |
RU2101280C1 (ru) * | 1995-03-28 | 1998-01-10 | Стерлитамакский нефтехимический завод | Пиридиновые основания шиффа в качестве вулканизирующих агентов в каучуках скн и способ их получения |
US5753239A (en) * | 1991-05-15 | 1998-05-19 | Centre International De Recherches Dematologiques Galderma (Cird Galderma) | Bi-aromatic compounds and pharmaceutical and cosmetic compositions |
US20020193636A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-12-19 | Harald Winsel | Preparation of n-benzylamines |
-
2011
- 2011-06-07 RU RU2011123065/04A patent/RU2472775C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2735344A (en) * | 1956-02-21 | larsson | ||
GB759871A (en) * | 1953-04-04 | 1956-10-24 | Bayer Ag | Chromium containing azomethine dyestuffs |
GB769688A (en) * | 1953-04-30 | 1957-03-13 | Hoechst Ag | Manufacture of water-soluble sulphochloracetic acid ester salts of leuco vat dyestuffs |
GB767754A (en) * | 1953-08-07 | 1957-02-06 | Sandoz Ltd | "halogenated naphthoquinone-imines and process for their manufacture" |
RU2097372C1 (ru) * | 1991-04-04 | 1997-11-27 | Зенека Лимитед | Способ получения ароматического азометина |
US5753239A (en) * | 1991-05-15 | 1998-05-19 | Centre International De Recherches Dematologiques Galderma (Cird Galderma) | Bi-aromatic compounds and pharmaceutical and cosmetic compositions |
US5256822A (en) * | 1992-02-07 | 1993-10-26 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Imine derivatives and process for production thereof |
RU2101280C1 (ru) * | 1995-03-28 | 1998-01-10 | Стерлитамакский нефтехимический завод | Пиридиновые основания шиффа в качестве вулканизирующих агентов в каучуках скн и способ их получения |
US20020193636A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-12-19 | Harald Winsel | Preparation of n-benzylamines |
Non-Patent Citations (7)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2011123065A (ru) | 2012-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Schauenstein et al. | Formation and properties of reactive aldehydes | |
Michałowski et al. | Flow-injection chemiluminescence determination of epinephrine in pharmaceutical preparations using raw apple juice as enzyme source | |
Yandigeri et al. | Studies on mineral phosphate solubilization by cyanobacteria Westiellopsis and Anabaena | |
Zhang et al. | Efficient production of ectoine using ectoine-excreting strain | |
Picking et al. | MtpB, a member of the MttB superfamily from the human intestinal acetogen Eubacterium limosum, catalyzes proline betaine demethylation | |
Parker et al. | Action and timing of BacC and BacD in the late stages of biosynthesis of the dipeptide antibiotic bacilysin | |
CN103966276A (zh) | 酶催化法合成dl-丝氨酸的方法 | |
Harohally et al. | ZnCl2-mediated practical protocol for the synthesis of Amadori ketoses | |
Shanzer et al. | Biomimetic siderophores | |
JPS58157719A (ja) | 生化学的作用物質、該作用物質の調製法及び該作用物質を含有する薬剤 | |
Hamdane et al. | A catalytic intermediate and several flavin redox states stabilized by folate-dependent tRNA methyltransferase from Bacillus subtilis | |
Cao et al. | Simultaneous detection of NO and ROS by ESR in biological systems | |
Hu et al. | Glycine and serine markedly eliminate methylglyoxal in the presence of formaldehyde via the formation of imidazole salts | |
Kamio et al. | The chemistry of escapin: identification and quantification of the components in the complex mixture generated by an L‐amino acid oxidase in the defensive secretion of the sea snail Aplysia californica | |
US9574221B2 (en) | Method for the determination of the concentration of vitamin B6 in a sample | |
JP2021061802A (ja) | L−グルタミンの測定方法、及びそのためのキット | |
CN113004220B (zh) | 一种酯酶检测荧光探针、制备方法及应用 | |
Hanefeld et al. | Study of the (S)-hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis: mechanistic implications | |
RU2472775C1 (ru) | Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание | |
Letuta et al. | Magnetic field effects in bacteria E. coli in the presence of Mg isotopes | |
Banerjee et al. | Acute hypoxia elevates arginase 2 and induces polyamine stress response in zebrafish via evolutionarily conserved mechanism | |
JP6190999B2 (ja) | アルコール代謝促進剤として有効なオリゴペプチドの製造方法 | |
Diamant et al. | ATP level and CO2 production of mast cells in anaphylaxis | |
MITSUDA et al. | BIOGENESIS OF RIBOFLAVIN IN GREEN LEAVES I. CONFIRMATION OF ENZYMATIC REACTION FOR SYNTHESIS OF RIBOFLAVIN FROM 6, 7-DIMETHYL-8-RIBITYLLUMAZINE | |
Porter et al. | Rapid inactivation of brain glutamate decarboxylase by aspartate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180608 |