RU2412998C1

RU2412998C1 - Мутантная оксидаза d-аминокислот

Info

Publication number: RU2412998C1
Application number: RU2009142334/10A
Authority: RU
Inventors: Владимир Иванович Тишков (RU); Владимир Иванович Тишков; Наталья Владимировна Черскова (RU); Наталья Владимировна Черскова; Святослав Сергеевич Савин (RU); Святослав Сергеевич Савин; Лариса Ивановна Савина (RU); Лариса Ивановна Савина; Светлана Владимировна Хороненкова (RU); Светлана Владимировна Хороненкова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Инновации и высокие технологии МГУ"; Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2011-02-27

Abstract

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии. Предложена новая мутантная оксидаза D-аминокислот с повышенной температурной стабильностью. Аминокислотная последовательность фермента соответствует аминокислотной последовательности оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis дикого типа, в которой остаток триптофана в положении 46 заменен остатком фенилаланина, остаток цистеина в положении 298 замещен остатком аланина, а последние 6 аминокислот на С-конце заменены новой последовательностью из 28 остатков. Изобретение позволяет повысить температурную стабильность полученной мутантной оксидазы D-аминокислот по сравнению с термостабильностью фермента дикого типа. 2 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в ферментативных процессах тонкого органического синтеза для получения оптически активных соединений, альфа-кетокислот, неприродных L-аминокислот, цефалоспориновых антибиотиков и других органических соединений с использованием оксидазы D-аминокислот.

Получена новая мутантная форма оксидазы D-аминокислот (DAAO), характеризующаяся повышенной стабильностью по сравнению со стабильностью рекомбинантного фермента дикого типа. В качестве основы для получения новой мутантной формы DAAO использовали последовательность кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Предложенная мутантная форма отличается тем, что природный аминокислотный остаток триптофана в положении, соответствующем положению 46 в аминокислотной последовательности оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, заменен на остаток фенилаланина, природный остаток цистеина в положении, соответствующем положению 298 в аминокислотной последовательности того же фермента заменен на остаток аланина, а шесть остатков на С-конце фермента заменены на новую последовательность из 28 аминокислотных остатков. Данные замены могут быть использованы в комбинации с дополнительными другими мутациями, обеспечивающими приобретение оксидазами D-аминокислот новых или улучшенных свойств.

Настоящее изобретение относится к новым белкам, в частности мутантным оксидазам из дрожжей, которые обладают повышенной стабильностью по отношению к ферменту дикого типа, к кДНК, кодирующей мутантную оксидазу D-аминокислот, к применению данного фермента в процессах биокаталитического получения различных органических соединений, в том числе оптически активных веществ, альфа-кетокислот, неприродных L-аминокислот и других органических соединений, окисления цефалоспорина С и его производных с использованием оксидазы D-аминокислот.

Флавинадениндинуклеотид (ФАД) - зависимая оксидаза D-аминокислот катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот до соответствующих □-кетокислот с образованием иона аммония и пероксида водорода.

Фермент проявляет исключительно высокую специфичность к D-формам аминокислот, его применяют для получения неприродных L-аминокислот и □-кетокислот из дешевых рацемических смесей аминокислот. Помимо этого оксидаза D-аминокислот может быть использована в биокаталитическом двухферментом процессе превращения цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспорановую кислоту, которая является исходным соединением при синтезе полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков различных поколений. Примеры практического применения оксидазы D-аминокислот можно найти в обзорах (Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. D-Amino Acid Oxidase: Physiological Role and Applications. Biochemistry(Moscow), 2008, v.73, N13, p.1425-1432 и Pollegioni L., Molla G., Sacchi S., Rosini E., Verga R., Pilone M.S. Properties and applications of microbial D-amino acid oxidases: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, v.78, N1, p.1-16.). Также фермент может быть применен в медицинской диагностике шизофрении с использованием детекции концентрации D-серина в клетках нервной системы (Pernot P., Mothet J.P., Schuvailo O., Soldatkin A., Pollegioni L., Pilone M., Adeline M.T., Cespuglio R., Marinesco S. Characterization of a yeast D-amino acid oxidase microbiosensor for D-serine detection in the central nervous system. Anal. Chem, 2008, v.80, p.1589-1597)

Оксидазы D-аминокислот широко распространены в природе и могут быть выделены из разнообразных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, микроскопических грибов, водорослей), а также моллюсков, рыб, рептилий, птиц и млекопитающих. Подробный список известных источников оксидаз D-аминокислот можно найти в обзоре (Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. Биохимия, 2005, т.70, №1, с.51-67). Многие из генов, кодирующих данные ферменты, были клонированы и секвенированы, поэтому их можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Последовательность кДНК, кодирующую оксидазу D-аминокислот, встраивают в генно-инженерный вектор (плазмида, фаг и т.д.), который используют для трансформации микроорганизмов, например, бактерий E.coli или метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Полученный рекомбинантный штамм используют для экспрессии желаемого ферментного продукта.

Основными недостатками известных природных и рекомбинантных оксидаз D-аминокислот дикого типа являются невысокие температурная и операционная стабильность этих ферментов.

Среди описанных в литературе оксидаз D-аминокислот наиболее стабильным при высоких температурах является фермент из дрожжей T.variabilis (TvDAAO) (Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. Биохимия, 2005, т.70, №1, с.51-67). Среди известных оксидаз D-аминокислот, благодаря наилучшей каталитической активности с цефалоспорином С, TvDAAO также является наиболее перспективной для практического применения в процессах синтеза цефалоспориновых антибиотиков. Однако для практического применения этого фермента необходимо улучшать его температурную и операционную стабильности (обеспечивая снижение потери активности соответственно за счет денатурации белковой глобулы и за счет химической модификации аминокислотных остатков фермента в ходе реакции). Одним из подходов для решения поставленной задачи является мутагенез аминокислотных остатков целевого белка.

В настоящее время наибольшее количество экспериментов по мутагенезу оксидазы D-аминокислот выполнено для рекомбинантного фермента из дрожжей R.gracilis (см. обзор Pollegioni L., Piubelli L., Sacchi S., Pilone M.S., Molla G. Physiological functions of D-amino acid oxidases: from yeast to humans. Cell. Mol. Life Sci., 2007, v.64, № 11, pp.1373-1394). Для фермента из T.variabilis подобных работ опубликовано всего 4. В двух работах с использованием метода направленного мутагенеза изучали роль консервативных остатков His324 и Asp206 в катализе и связывании ФАД (Lin L.L., Wang W.C., Ju S.S. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase. FEMS Microbiol. Lett., 1999, v.176, № 2, pp.443-448; Ju S.S., Lin L.L., Wang W.C., Hsu W.H. A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. FEBS Lett., 1998, v.436, № 1, pp.119-122). Замены по остаткам His324 и Asp206 сильно ухудшали кинетические свойства или приводили к полной потере активности. В третьей работе направленный мутагенез в молекуле TvDAAO шести остатков метионина на остаток лейцина показал, что эти замены повышают стабильность фермента против инактивации пероксидом водорода (Ju S.S., Lin L.L., Chien H.R., Hsu W.H. Substitution of the critical methionine residues in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with leucine enhances its resistance to hydrogen peroxide. FEMS Microbiol. Lett., 2000, v.186, № 2, pp.215-219). Однако четыре мутации (Met104Leu, Met226Leu, Met245Leu и Met339Leu) приводили к резкому ухудшению кинетических свойств с D-аланином в качестве субстрата. В случае мутации Met209Leu ухудшилась константа Михаэлиса K_M (увеличение в 3,3 раза). В результате замены Metl56Leu значение K_M возросло в 1,5 раза, однако за счет увеличения каталитической константы k_cat в 3 раза общая каталитическая эффективность (отношение k_cat/K_M) повысилась в два раза. В патенте RU 2362806 (Тишков В.И., Хороненкова С. В., Савина Л.И. Мутантные оксидазы D-аминокислот. Приоритет от 23.07.2007, опубликовано 27.07.2009, Бюллетень "Изобретения. Полезные модели", 2009, № 21) охарактеризована замена остатка Cys108 на остатки серина, аланина и фенилаланина. Эти замены привели к изменению спектра субстратной специфичности, однако термостабильность мутантных ферментов с заменами Cys108Ser и особенно Cys108Ala снизилась по сравнению с таковой для TvDAAO дикого типа. Методом химической модификации было показано, что модификация или окисление остатка цистеина в положении 298 в TvDAAO приводит к полной потере активности (Schrader Т., Andreesen J.R. Evidence for the functional importance of Cys298 in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. Eur. J. Biochem., 1993, v.218, № 2, pp.735-744).

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого технического решения, состоит в получении мутантных форм оксидазы D-аминокислот из Т.variabilis с повышенной температурной стабильностью по сравнению со стабильностью фермента дикого типа.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в повышении температурной стабильности полученной мутантной формы оксидазы D-аминокислот по отношению к термостабильности фермента дикого типа.

Для достижения указанного технического результата, предложено использовать рекомбинантную оксидазу D-аминокислот, в которой в качестве основы использована аминокислотная последовательность оксидазы D-аминокислот из T.variabilis дикого типа со следующими модификациями: природный остаток цистеина в положении 298 заменен на остаток аланина, природный остаток триптофана в положении 46 заменен на остаток фенилаланина, а последние 6 аминокислот на С-конце природного фермента заменены последовательностью из 28 новых аминокислотных остатков. Одновременное введение вышеперечисленных аминокислотных замен обеспечивает повышение термостабильности фермента. Кроме того, в дополнение к введенным аминокислотным заменам, аминокислотная последовательность полученной оксидазы D-аминокислот может содержать, по меньшей мере, еще одну дополнительную замену, например, Cys108Phe, обеспечивающую улучшение термостабильности, химической стабильности, изменение кинетических свойств, попарное или одновременное улучшение всех вышеуказанных свойств по сравнению с аминокислотной последовательностью оксидазы D-аминокислот из T.variabilis дикого типа.

В дальнейшем получение и преимущества полученной модифицированной оксидазы D-аминокислот будут рассмотрены с использованием примеров получения и реализации модифицированной оксидазы D-аминокислот.

Пример 1.

Получение мутантной оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis, в которой остаток Cys298 заменен на остаток Ala и последние 6 аминокислотных остатков на С-конце заменены новой последовательностью из 28 аминокислот.

Все генно-инженерные манипуляции, если не оговорено особо, осуществлены в соответствии с Манниатис Е., Фрич. Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984 или в соответствии с инструкциями фирм-производителей приборов, наборов и других реагентов. Все эти методы хорошо известны специалистам в данной области.

Направленный мутагенез в гене daao из T.variabilis проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pKanDAAO, в которой ген оксидазы D-аминокислот находится под контролем сильного промотора РНК-полимеразы фага Т7 (фиг.1). Плазмида pKanDAAO получена из коммерчески доступной плазмиды pET33b (Novagen, США), в которую по сайтам рестрикции NcoI и BamHI встроена кДНК, кодирующая ген tvdaao из T.variabilis без интрона (Подробно получение плазмиды pKanDAAO см. в Давыдова Е.Е., Тишков В.И. Клонирование гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Вестник Московского Университета, Серия 2. Химия, 2002, v.43, № 6, с.353-355). Как видно из фиг.1 на 3'-конце гена tvdaao и в находящемся за ним полилинкере исходной плазмиды pET33b имеются сайты рестрикции SacI. Поэтому обработка плазмиды pKanDAAO этой рестриктазой приведет к выщеплению фрагмента ДНК длиной 38 оснований, в который входит часть гена tvdaao, включая «стоп» - кодон и часть полилинкера до сайта рестрикции SacI. При последующем лигировании получается плазмида pKanDAAO2 (фиг.2). В этой плазмиде в гене tvdaao удаляется фрагмент ДНК, кодирующий последние 6 аминокислот и «стоп» - кодон, и за счет изменения рамки считывания вместо этих 6 остатков появляются 28 новых. Как видно из фиг.2, новая открытая рамка считывания tvdaao2 захватывает оставшийся полилинкер и продолжается вплоть до терминатора T-T7L. Эта процедура и была использована для изменения С-конца фермента одновременно с введением замены Cys298Ala. Последовательность ДНК, кодирующая новую оксидазу D-аминокислот TvDAAO2, и соответствующая аминокислотная последовательность этого фермента представлены в SEQ ID № 1.

Плазмида pKanDAAO была выделена из клеток Е.coli с использованием набора для выделения плазмид NucleoSpin® Plus согласно инструкции фирмы-производителя (Macherey-Nagel GmbH & Со. KG).

Для введения мутации Cys298Ala в ген daao из T.variabilis с использованием ПЦР применяли праймеры на начало и конец гена:

DAOFor1

5'-ATATACCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGC-3'

DAORev5

5'-GTTTGGACGAGTAAGAGCTCTTTCGAC-3',

а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в триплете, кодирующем в гене daao остаток Cys в положении 298:

DAO_C298Afor

5'-GTGGCCAACGGCTTCGCGCACAATGTCAAGAGG-3'

DAO_C298Arev

5'-GTGCGCGAAGCCGTTGGCCACCGTCCTGGTAG-3'.

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Cys298Ala.

Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл (Eppendorf, Германия). Для предотвращения испарения реакционной смеси и ее конденсации на крышке в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали 5 мин при 95°C и затем проводили реакцию ПЦР по следующей программе: 1-я стадия - 95°C, 60 с; 2-стадия - 56°C, 60 с и 3-я стадия - 72°C, 2 мин, всего 25-35 циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72°C. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5° ниже T_m температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав (таблица 1):

Таблица 1
Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Количество	Компонент
2,5 мкл	10-кратный буфер для PFU Turbo ДНК-полимеразы (Stratagene, США)
2,5 мкл	смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5мМ
1 мкл	ДНК-матрица, концентрация ~10 нг/мкл
2 мкл	праймер 1, концентрация 5 нмоль/мл (Синтол, Россия)
2 мкл	праймер 2, концентрация 5 нмоль/мл (Синтол, Россия)
1 мкл	PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Stratagene, США)
до 25 мкл	деионизованная вода, очищенная с использованием системы MilliQ (Millipore, США)

На первом этапе проводили две полимеразные цепные реакции с использованием следующих пар праймеров: 1) DAOFor1+DAO_C298Arev и 2) DAO_C298Afor+DAORev5. В качестве матрицы использовали плазмиду pKanDAAO. Полученные продукты ПЦР, фрагмент 1 и фрагмент 2, очищали с использованием специального набора, например, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Затем проводили третью, объединяющую ПЦР с праймерами DAOFor1 и DAORev5, где в качестве ДНК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1 и 2.

Продукт третьей ПЦР очищали с использованием препаративного электрофореза в агарозном геле с применением предназначенных для этого наборов (например, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG)). Очищенный ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами Bspl9 и SacI в течение 2 часов при 37°C, затем инкубировали рестрикционную смесь для инактивации рестриктаз в течение 20 минут при 65°C (использовали рестриктазы и буфера фирмы Сибэнзим (Россия)). Затем полученные фрагменты ДНК очищали от коротких фрагментов препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией нужной полосы из агарозы с использованием специального набора, например, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) и лигировали с фрагментом исходной плазмиды pKanDAAO, из которой расщеплением по тем же сайтам рестрикции Bspl9 и SacI были удалены фрагмент гена daao из T.variabilis дикого типа и часть полилинкера. Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали клетки Е.coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ(lac-proAB) F'[traD36 proAB⁺ lacI^q lacZΔM15]) и выращивали в течение ночи при 37°C на твердой агаризованной среде LB, содержащей канамицин в концентрации 30 мкг/мл (плазмида pKanDAAO содержит ген устойчивости к канамицину). Выросшие колонии инокулировали в 6-8 мл среды 2YT, содержащей 30 мкг/мл канамицина, и растили при 37°C в течение 8-10 часов при аэрировании. Плазмидную ДНК выделяли из полученной культуры клеток с использованием предназначенного для этого набора, например, QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование плазмидной ДНК с использованием набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 (Perkin Elmer Applied Biosystems), который основан на дидезокситерминационном методе [Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, №12, pp.5463-5467], с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. В результате из 5 выделенных плазмид все 5 содержали только требуемую замену Cys298Ala. Таким образом, была получена плазмида pKanDAAO2_C298A, которая обеспечивала получение новой оксидазы D-аминокислот TvDAAO2 Cys298Ala с заменой Cys298Ala и заменой 6 остатков на С-конце на последовательность из 28 новых аминокислотных остатков.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pKanDAAO2_C298A и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 2. Изучение термостабильности мутантной оксидазы D-аминокислот TvDAAO2 Cys298Ala и фермента дикого типа.

Для оценки эффекта изменения температурной стабильности оксидазы D-аминокислот за счет введения замены Cys298Ala и замены аминокислотных остатков на С-конце проводили культивирование штаммов E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus, трансформированных соответственно плазмидами pKanDAAO2_C298A и pKanDAAO. После окончания культивирования клетки разрушали ультразвуком, удаляли клеточный дебрис, а бесклеточный экстракт использовали для изучения термостабильности. Получение препаратов мутантной TvDAAO2 Cys298Ala более высокой степени чистоты было невозможно из-за быстрой инактивации фермента даже при 4°C.

Методика культивирования и разрушения была одинакова как для мутантной TvDAAO2 Cys298Ala, так и для фермента дикого типа. Клетки Е.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus, содержащие одну из плазмид (pKanDAAO или pKanDAAO2_C298A) и синтезирующие целевой фермент, получали культивированием единичной колонии в колбах объемом 1 л, содержащих 150 мл среды 2YT и 30 мкг/мл канамицина при 37°C при непрерывном перемешивании (140 об/мин). По достижении поглощения среды на 600 нм величины A₆₀₀ 0,6-0,9 в колбы добавляли изопропил-бета-D-тиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,1 мМ и культивировали в течение 24 часов при 25°C. Клетки собирали центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин, 4°C) и ресуспендировали в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5 для получения 20% суспензии. Для предварительного разрушения клетки подвергали замораживанию-размораживанию и далее обрабатывали ультразвуком при охлаждении льдом, каждые 5 минут отбирая пробы для измерения активности фермента. По достижении постоянного значения активности полученный раствор центрифугировали (18000 об/мин, 30 мин, 4°C) для удаления осадка. Полученные супернатанты с мутантной TvDAAO2 Cys298Ala и ферментом дикого типа далее использовали для изучения температурной стабильности.

Для определения температурной стабильности 0,5 мл бесклеточных экстрактов с мутантной TvDAAO2 Cys298Ala и ферментом дикого типа в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0 (активность ферментов составляла 4 ед. активности на мл) помещали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл, затем пробирки инкубировали в водяном термостате при 25°C (точность термостатирования ± 0,1°). Через определенные промежутки времени отбирали пробы по 20 мкл и измеряли ферментативную активность.

Активность TvDAAO и ее мутантной формы TvDAAO2 Cys298Ala определяли по образованию пероксида водорода, для чего использовали пероксидазу из корней хрена (ПХ) фирмы Reanal (Венгрия) и ее субстрат АБТС (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)) фирмы Sigma (США). В качестве субстратов для мутантной DAAO и фермента дикого типа использовали D-метионин в концентрации 20 мМ. В кювету спектрофотометра (рабочий объем 1 мл, оптический путь 1 см) добавляли раствор D-аминокислоты в 50 мМ натрий- или калий-фосфатном буфере, рН 8,0 (ФБ), 20 мкл раствора АБТС (16 мг/мл) в воде, 10 мкл раствора пероксидазы в 50 мМ ФБ (1000 Ед/мл) и насыщенный кислородом 50 мМ ФБ (рН 8,0) до общего объема 980 мкл. После термостатирования в течение 10 мин при 30°C в реакционную смесь добавляли 20 мкл фермента. Накопление продукта окисления АБТС регистрировали на длине волны 414 нм (ε₄₁₄=36000 М^-1см^-1).

В качестве параметра, характеризующего термостабильность, использовали величину τ₅₀ - время за которое препарат исследуемого фермента терял 50% активности. Результаты определения представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, аминокислотная замена Cys298Ala привела к очень сильному снижению термостабильности. Величина τ₅₀ для мутанта TvDAAO2 Cys298Ala при 25°C составила 106 мин, в то время как для фермента дикого типа она была более 120 часов.

Пример 3. Получение мутантной оксидазы D-аминокислот TvDAAO2 Cys298Ala, Trp46Phe с использованием метода направленного мутагенеза.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pKanDAAO2_Cys298Ala, а в качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Trp46Phe, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

DAO_W46Ffor

5'-GGCACCTGCGAAAGGCGAGGTATATCCGATAC-3'

DAO_W46Frev

5'-CCTCGCCTTTCGCAGGTGCCAACTGGCTCAC-3'

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Trp46Phe.

Плазмида pKanDAAO2 с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутации Trp46Phe и Cys298Ala, получила название pKanDAAO2_(W46F, C298F).

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS (rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pKanDAAO2_(W46F, C298F) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 4. Изучение температурной стабильности мутантной оксидазы D-аминокислот TvDAAO2 с заменами Cys298Ala и Trp46Phe и фермента дикого типа.

Для точной оценки эффекта изменения температурной стабильности за счет введенных замен мутантный фермент TvDAAO2 W46F, C298A и оксидазу D-аминокислот дикого типа выделяли в высокоочищенном состоянии и определяли зависимость остаточной активности от времени инкубации при 56°C.

Методика получения высокоочищенных препаратов была одинакова как для мутантной TvDAAO2 W46F,C298A, так и для фермента дикого типа. Клетки Е.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus, содержащие одну из плазмид (pKanDAAO или pKanDAAO2_(W46F, C298A)) и синтезирующие целевой фермент, получали культивированием единичной колонии в колбах объемом 1 л, содержащих 150 мл среды 2YT и 30 мкг/мл канамицина при 37°C при непрерывном перемешивании (140 об/мин). По достижении поглощения среды на 600 нм величины A₆₀₀ 0,6-0,9 в колбы добавляли изопропил-бета-D-тиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,1 мМ и культивировали в течение 24 часов при 25°C. Клетки собирали центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин, 4°C) и ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 для получения 20% суспензии. Для предварительного разрушения клетки подвергали замораживанию-размораживанию и далее обрабатывали ультразвуком при охлаждении льдом, каждые 5 минут отбирая пробы для измерения активности фермента. По достижении постоянного значения активности полученный раствор центрифугировали (18000 об/мин, 30 мин, 4°C) для удаления осадка. Полученный супернатант нагревали в течение 10 мин при 45°C для инактивации каталазы и некоторых других белков, осадок удаляли центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин, 4°C).

Ионообменную FPLC хроматографию проводили на установке фирмы Pharmacia (Швеция). Раствор фермента наносили на колонку Source 15Q объемом 40 мл (Pharmacia Biotech, Швеция), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 (буфер А). После нанесения образца колонку промывали тем же буфером до нулевого поглощения на 280 нм выходящего из колонки раствора. Фермент элюировали с колонки со скоростью 10 мл/мин линейным градиентом 0-1М NaCl в буфере А. Собирали фракции, обладающие оксидазной активностью, объединяли их и концентрировали на мембране РМ10 в ячейке для концентрирования объемом 50 мл (мембрана и ячейка производства Amicon, США) до объема 5 мл. Полученный фермент наносили на колонку 2,5×100 см с Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Германия), уравновешенную 0,1 М фосфатным буфером, рН 8,0. Собирали фракции по 5 мл, определяли их поглощение на длине волны 280 нм A₂₈₀ на спектрофотометре Shimadzu 1601 PC (Shimadzu GmBH, Германия) и измеряли величину ферментативной активности с использованием пероксидазной реакции, как описано в примере 2. Отбирали фракции, имеющие постоянное отношение (активность/A₂₈₀). Чистота полученных препаратов составляла не менее 95% согласно данным аналитического электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофорез проводили на приборе BioRad (Англия) согласно инструкции фирмы-производителя.

Для определения термостабильности очищенных TvDAAO дикого типа и ее мутантной формы TvDAAO2 Trp46Phe, Cys298Ala 0,5 мл раствора каждого препарата (активность ферментов составляла 4 ед. активности на мл) в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0 помещали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и пробирки инкубировали в водяном термостате при 54°C (точность термостатирования ± 0,1°). Через определенные промежутки времени отбирали пробы по 20 мкл и измеряли ферментативную активность, как описано в примере 2.

В качестве параметра, характеризующего термостабильность, использовали величину τ₅₀ - время, за которое препарат исследуемого фермента терял 50% активности. Результаты определения представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, одновременное введение в TvDAAO2 замен Trp46Phe и Cys298Ala повышает температурную стабильность фермента в 1,3 раза.

Таблица 2.
Периоды полуинактивации оксидазы D-аминокисилот дикого типа и ее мутантных форм TvDAAO2 Cys298Ala и TvDAAO2 Trp46Phe, Cys298Ala
Форма фермента	Температура
	25°C		54°C
	τ₅₀	Эффект стабилизации, τ₅₀ ^мут/τ₅₀ ^дт	τ₅₀.	Эффект стабилизации, τ₅₀ ^мут/τ₅₀ ^дт
TvDAAO дикого типа (дт)	>120 часов	-	30 мин	-
TvDAAO2 Cys298Ala	106 мин	<0.015	н.о	н.о
TvDAAO2 Trp46Phe, Cys298Ala	н.о*	н.о	39 мин	1,3
*н.о. - не определяли

Claims

Мутантная оксидаза D-аминокислот с повышенной температурной стабильностью, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis дикого типа, в которой остаток триптофана в положении 46 заменен остатком фенилаланина, остаток цистеина в положении 298 замещен остатком аланина, а последние 6 аминокислот на С-конце заменены новой последовательностью из 28 остатков (SEQ ID №2).