RU2403063C1 - Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle - Google Patents

Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle Download PDF

Info

Publication number
RU2403063C1
RU2403063C1 RU2009132362/15A RU2009132362A RU2403063C1 RU 2403063 C1 RU2403063 C1 RU 2403063C1 RU 2009132362/15 A RU2009132362/15 A RU 2009132362/15A RU 2009132362 A RU2009132362 A RU 2009132362A RU 2403063 C1 RU2403063 C1 RU 2403063C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
vaccine
strain
inactivated
coronavirus
virus
Prior art date
Application number
RU2009132362/15A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Виталий Александрович Сергеев (RU)
Виталий Александрович Сергеев
Евгений Анатольевич Непоклонов (RU)
Евгений Анатольевич Непоклонов
Тарас Иванович Алипер (RU)
Тарас Иванович Алипер
Анна Евгеньевна Верховская (RU)
Анна Евгеньевна Верховская
Марина Александровна Корицкая (RU)
Марина Александровна Корицкая
Марианна Михайловна Демкина (RU)
Марианна Михайловна Демкина
Михаил Константинович Пирожков (RU)
Михаил Константинович Пирожков
Original Assignee
Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ") filed Critical Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ")
Priority to RU2009132362/15A priority Critical patent/RU2403063C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2403063C1 publication Critical patent/RU2403063C1/en

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, veterinary.
SUBSTANCE: invention relates to field of veterinary microbiology. Vaccine contains active substance and target additives. As active substance vaccine contains mixture of inactivated suspension of strain of cattle diarrhea virus SCV No 2336, family Flaviviridae, genus Pestivirus, inactivated suspension of strain of rotavirus SCV No 2337, family Reoviridae, genus Rotavirus; inactivated suspension of strain of coronavirus SCV No 2338, family Coronaviridae, genus Coronavirus, with activity of each of virus strains not lower than 106.5 TCD50 in 1 cm3 of vaccine, and inactivated suspension of cells of bacteria Escherichia coli serovariants O9:K30, O78:K80, O115, O141 :K99 and O101:F41, taken in mixture in equal proportion with concentration not less than 20 billion microbial cells in cm3 of vaccine.
EFFECT: vaccine is superior to known vaccines in spectrum of specific protection and efficiency of activity for sensitive group of animals, duration of expressed immunity, safety for animals in calf and newborn calves, in stability of preservation of biological properties, including antigenic and immunogenic activity for 18 months (observation term).
3 cl, 8 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых вакцин, которые могут быть использованы для предупреждения инфекционных болезней крупного рогатого скота, особенно у новорожденных телят, сопровождающихся нарушением функций органов желудочно-кишечного тракта различной степени тяжести.The invention relates to the field of virology, biotechnology and veterinary medicine and for the creation of new vaccines that can be used to prevent infectious diseases of cattle, especially in newborn calves, accompanied by a violation of the functions of the gastrointestinal tract of varying severity.

Болезни желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота (КРС) широко распространены во всех странах мира и наносят колоссальный экономический ущерб. Массовые энтериты и энтероколиты, клинически проявляющиеся диареями, регистрируются у 70-100% новорожденных телят уже к концу первых суток после рождения, а смертность больных телят составляет 15-55% (Павлов Д.К. Заболевания желудочно-кишечного тракта у новорожденных телят. // «Ветеринарная жизнь», июнь, №11, 2006).Diseases of the gastrointestinal tract of young cattle (cattle) are widespread in all countries of the world and cause enormous economic damage. Mass enteritis and enterocolitis, clinically manifested by diarrhea, are recorded in 70-100% of newborn calves by the end of the first day after birth, and mortality of sick calves is 15-55% (Pavlov D.K. Diseases of the gastrointestinal tract in newborn calves. / / “Veterinary Life”, June, No. 11, 2006).

Отличительной особенностью этих заболеваний является множественность инфекционных агентов, вызывающих сходные клинические проявления болезни. Смешанные формы инфекционных гастроэнтеритов характеризуются интенсивным развитием клинических признаков и обусловливаются различными ассоциациями энтропатогенных вирусов, таких как вирус диареи КРС, рота- и коронавирусы, вирулентность которых повышается на фоне различных неблагоприятных условий содержания и кормления. Течение вирусных инфекций, как правило, осложняется энтеротоксигенными колибактериями, которые выделяются взрослыми животными и попадают в кишечник новорожденного вместе с непатогенными колибактериями.A distinctive feature of these diseases is the multiplicity of infectious agents that cause similar clinical manifestations of the disease. Mixed forms of infectious gastroenteritis are characterized by the intensive development of clinical signs and are caused by various associations of entropathogenic viruses, such as cattle diarrhea virus, rota- and coronaviruses, the virulence of which increases due to various adverse conditions of feeding and feeding. The course of viral infections, as a rule, is complicated by enterotoxigenic colibacteria, which are secreted by adult animals and enter the intestines of the newborn along with non-pathogenic colibacilli.

Поскольку заражение телят инфекционными возбудителями происходит в первые часы и дни после рождения, основу стратегии специфической профилактики инфекционных желудочно-кишечных болезней составляет активная иммунизация стельных коров с целью обеспечения пассивной защиты потомства.Since calves are infected with infectious pathogens in the first hours and days after birth, the basis of the specific prevention strategy for infectious gastrointestinal diseases is the active immunization of pregnant cows in order to provide passive protection of the offspring.

К настоящему времени известно несколько комбинированных вакцин различной валентности против гастроэнтеритов КРС. Однако их применение не всегда сопровождается положительным эффектом, главным образом, из-за несбалансированности антигенного состава и низкого титра специфических антител в крови стельных коров и в молозиве, выпаиваемом новорожденными телятами.To date, several combination vaccines of various valencies against cattle gastroenteritis are known. However, their use is not always accompanied by a positive effect, mainly due to the imbalance of the antigenic composition and the low titer of specific antibodies in the blood of pregnant cows and in colostrum fed to newborn calves.

Известна комбинированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов крупного рогатого скота и телят, содержащая адъювант и инактивированные суспензии вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекции в титре 107,5-108,5 ТЦД50/см3, инактивированные суспензии вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции - в титре 106,5-107,5 ТЦД50/см3, взятые в вакцине в объемном соотношении 1:1:1:1:0,5:0,5 соответственно (Патент RU №2261111, A61K 39/295, опубл. 27.09.2005).A combined vaccine against viral pneumogastroenteritis of cattle and calves is known containing adjuvant and inactivated suspensions of infectious rhinotracheitis viruses, viral diarrhea, rotavirus and coronavirus infection in a titer of 10 7.5 -10 8.5 TCD 50 / cm3, inactivated suspensions of parainfluenza-3 viruses and respiratory syncytial infection - in the titer of 10 6.5 -10 7.5 TCD 50 / cm3 taken in the vaccine in a volume ratio of 1: 1: 1: 1: 0.5: 0.5, respectively (Patent RU No. 2261111, A61K 39/295, publ. 09/27/2005).

Однако известная комбинированная вакцина не обеспечивает иммунологическую защиту животных от инфекционных гастроэнтеритов бактериальной этиологии ввиду отсутствия в вакцине антигенов E.coli. Кроме того, вакцинные штаммы вирусов, входящие в ее состав, не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах, и, как следствие этого, известная вакцина является недостаточно эффективной.However, the known combination vaccine does not provide immunological protection of animals against infectious gastroenteritis of bacterial etiology due to the absence of E. coli antigens in the vaccine. In addition, the vaccine strains of viruses that make up its composition do not provide immunity to different subtypes and main antigenic variants of epizootic strains of pathogens circulating on farms, and, as a result, the known vaccine is not effective enough.

Известна ассоциированная вакцина против диареи телят, содержащая инактивированные этанолом клетки штаммов Escherichia coli 09:К99, Escherichia coli 0138:К88, Escherichia coli ГИСК N 200, Salmonella tuphimurium ГИСК N 195, Salmonella dublin ГИСК N 196, Salmonella enteritidis ГИСК N 197, Proteus vulgaris ГИСК N 198, Proteus mirabilis ГИСК N 199, Klebsiella pneumoniae ГИСК N 201, Klebsiella pneumoniae N ГИСК N 202, фенол, изотонический раствор хлорида натрия и адъювант гидроокись алюминия (Патент RU №2035916, A61K 39/125, опубл. 17.06.93).Known associated vaccine against calf diarrhea containing ethanol-inactivated cells of the strains of Escherichia coli 09: K99, Escherichia coli 0138: K88, Escherichia coli GISK N 200, Salmonella tuphimurium GISK N 195, Salmonella dublin GISK N 196, Salmonella enteritidis Prussis vulgaris GISK N196 HIS N 198, Proteus mirabilis HIS N 199, Klebsiella pneumoniae HIS N 201, Klebsiella pneumoniae N HIS 202, phenol, isotonic sodium chloride solution and adjuvant aluminum hydroxide (Patent RU No. 2035916, A61K 39/125, publ. 17.06.93) .

Недостатком известной ассоциированной вакцины является невысокая эффективность вследствие неполноты антигенного состава входящих в нее компонентов, поскольку в составе вакцины отсутствуют антигены вирусных возбудителей, вызывающих массовые вспышки диарейных болезней КРС.A disadvantage of the known associated vaccine is its low efficiency due to the incompleteness of the antigenic composition of its constituent components, since the vaccine does not contain antigens of viral pathogens that cause massive outbreaks of cattle diarrheal diseases.

Известна также формолтиомерсаловая вакцина против эшерихиоза телят, представляющая собой смесь инактивированных клеток энтеропатогенных штаммов E.coli 08:К43; 09, 015:К-14; 020, 026:К60; 041, 055, 078:К-80; 086:К-61:Н32; 0115, 0117:К-62; 0119, 0141 и 0149 (Ветеринарные препараты. Справочник. - М.: "Колос", 1981, стр.219-224).Also known is a formolthiomersal vaccine against calf Escherichiosis, which is a mixture of inactivated cells of enteropathogenic E. coli 08 strains: K43; 09, 015: K-14; 020, 026: K60; 041, 055, 078: K-80; 086: K-61: H32; 0115, 0117: K-62; 0119, 0141 and 0149 (Veterinary preparations. Handbook. - M .: Kolos, 1981, pp. 219-224).

Однако известная вакцина не предохраняет животных при смешанных формах инфекционных желудочно-кишечных болезней, т.к. не обладает специфической активностью в отношении основных возбудителей вирусной природы.However, the known vaccine does not protect animals with mixed forms of infectious gastrointestinal diseases, because It does not have specific activity against the main pathogens of a viral nature.

Известна ассоциированная вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят, содержащая инактивированные культуральные суспензии штаммов Bovine rotavirus "III-1", Bovine coronaviras "CM-1", Bovine Herpesvirus "ТКА-ВИЭВ-В2" с титрами соответственно 107,0-107,8 ТЦД50/мл, 105,0-105,8 ТЦД50/мл, 107,6-108,0, инактивированные суспензии клеток штаммов Ecsherichia coli, синтезирующих адгезины К99 и А20, с концентрацией 100 - 120 млрд.м.к. в 1 мл физиологического раствора, и гель гидроокиси алюминия (Патент RU №2145236, A61K 39/295, опубл. 10.02.2000).Known associated vaccine against rota-, corona-, herpesvirus and Escherichia diarrhea of newborn calves containing inactivated culture suspensions of strains of Bovine rotavirus "III-1", Bovine coronaviras "CM-1", Bovine Herpesvirus "TKA-VIEV-B2" with titers, respectively 107.0-107.8 TCD50 / ml, 105.0-105.8 TCD50 / ml, 107.6-108.0, inactivated cell suspensions of Ecsherichia coli strains synthesizing adhesins K99 and A20, with a concentration of 100-120 billion. m.k. in 1 ml of physiological saline, and a gel of aluminum hydroxide (Patent RU No. 2145236, A61K 39/295, publ. 10.02.2000).

Основным недостатком ассоциированной вакцины является низкая антигенная и иммуногенная активность вакцинных штаммов, а также отсутствие иммунитета к эшерихиозу, протекающему в формах колидиареи и колиэнтеротоксемии.The main disadvantage of the associated vaccine is the low antigenic and immunogenic activity of the vaccine strains, as well as the lack of immunity to escherichiosis occurring in the forms of colidiarrhea and colienterotoxemia.

Наиболее близким аналогом является вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», которая изготавливается из штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий; соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К 80, К 30; адгезивных антигенов 99, F-41, термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов и предназначена для профилактики вызываемых ими заболеваний (Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», утвержденная Департаментом ветеринарии 30.03.2007 г.).The closest analogue is the combined inactivated vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus disease, and calf disease “Kombovak-K”, which is made from strains of three viruses: rota-, corona- and viral diarrhea, protective antigens Escherichia; somatic 09, 078, 0115; capsular polysaccharide K 80, K 30; adhesive antigens 99, F-41, thermostable and thermolabile inactivated enterotoxins and is intended for the prevention of the diseases caused by them (Instructions for use of the inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus disease, and calf escherichiosis “Combovac-K”, approved by the Department of Veterinary Medicine on 30.03. 2007).

Недостатком известной комбинированной вакцины является относительно невысокий титр инфекционной активности входящих в ее состав вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней.A disadvantage of the known combination vaccine is the relatively low titer of infectious activity of the viral suspensions included in its composition, as a result of which the necessary amount of protective antigens against these diseases is not provided in the vaccine dose.

Задачей изобретения является разработка безопасной комбинированной (поливалентной) вакцины, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные и бактериальные антигены, которая позволит создать напряженный иммунитет против наиболее значимых возбудителей болезней, сопровождающихся поражением органов желудочно-кишечного тракта, и обеспечить, таким образом, сохранность молодняка и продуктивность взрослых животных.The objective of the invention is to develop a safe combined (multivalent) vaccine containing antigenically and immunogenically balanced viral and bacterial antigens, which will create intense immunity against the most significant pathogens associated with damage to the organs of the gastrointestinal tract, and thus ensure the safety of young animals and adult animal productivity.

Еще одной задачей является получение новых производственных штаммов вирусов ВД, РВ и KB, обладающих широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью не только в нативном виде, но и после инактивации, стабильно сохраняющих свои свойства, и пригодных для создания инактивированных комбинированных вакцин различной валентности.Another objective is to obtain new production strains of viruses VD, PB and KB, with a wide antigenic spectrum, high antigenic and immunogenic activity not only in their native form, but also after inactivation, stably preserving their properties, and suitable for creating inactivated combined vaccines of different valencies .

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала комбинированных вакцин против инфекционных болезней, сопровождающихся поражением органов желудочно-кишечного тракта, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных и родившихся телят против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота.The technical result of the invention is to expand the arsenal of combined vaccines against infectious diseases, accompanied by damage to the organs of the gastrointestinal tract, as well as to increase the stability, antigenic and immunogenic activity of the combined vaccine and create intense and prolonged immunity in vaccinated animals and born calves against viral diarrhea, company -, coronavirus disease and escherichiosis in cattle.

Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе вакцины новых производственных штаммов вирусов вируса диареи, рота- и коронавирусов КРС с широким антигенным спектром, а также за счет создания синергетической композиции поливалентной вакцины при объединении новых производственных штаммов вирусов с известными вакцинными штаммами эшерихий.The technical result of the invention is achieved due to the use of new production strains of diarrhea virus, rota and coronaviruses of cattle with a wide antigenic spectrum in the composition of the vaccine, as well as by creating a synergistic composition of a polyvalent vaccine when combining new production strains of viruses with known vaccine strains of Escherichia.

Сущность изобретения заключается в следующем.The invention consists in the following.

Предлагаемая инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличается тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь инактивированной суспензии штамма вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus; инактивированной суспензии штамма ротавируса ГКВ №2337, семейства Reoviridae, рода Rotavirus; инактивированной суспензии штамма коронавируса ГКВ №2338, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus; инактивированной суспензии клеток бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и О101:F41, в эффективном количестве.The proposed inactivated combination vaccine against viral diarrhea, rotavirus, coronavirus disease and bovine Escherichiosis, containing the active substance and target additives, is characterized in that as the active substance it contains a mixture of inactivated suspension of the bovine diarrhea virus strain GKV No. 2336, family Flaviviridae, genus Pestivirus; inactivated suspension of a strain of rotavirus STB No. 2337, family Reoviridae, genus Rotavirus; inactivated suspension of a strain of coronavirus STB No. 2338, family Coronaviridae, genus Coronavirus; inactivated suspension of bacterial cells of Escherichia coli serovariants O9: K30, O78: K80, O115, O141: K99 and O101: F41, in an effective amount.

Термин «эффективное количество» означает количество активного вещества, которое при введении коровам и/или телятам обеспечивает индукцию специфического иммунного ответа достаточного уровня в организме животных с последующим предупреждением от заболевания и симптомов заболевания, подлежащих профилактике.The term “effective amount” means an amount of an active substance which, when administered to cows and / or calves, provides the induction of a specific immune response of a sufficient level in animals, followed by a warning against the disease and the symptoms of the disease to be prevented.

Входящие в состав комбинированной вакцины штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, штамм ротавируса ГКВ №2337, семейства Reoviridae, рода Rotavirus и штамм коронавируса ГКВ №2338, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus, являются новыми производственными штаммами и впервые используются в составе вакцинных препаратов.The bovine diarrhea virus strain No. 2,336 of the cattle diarrhea virus included in the combined vaccine, the Flaviviridae family, the genus Pestivirus, the rotavirus strain of the GBV virus No. 2337, the Reoviridae family, the genus Rotavirus, and the coronavirus strain of the GBV No. 2,338, the Coronaviridae family, the new genus Coronavirus, are new first used in vaccine formulations.

Термин «производственный штамм» означает вакцинный штамм, изученный по своим биологическим свойствам, стабильный при хранении и пересевах, безвредный после инактивирования или аттенуирования для животного, хорошо адаптированный к системе культивирования, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью, как для чувствительной лабораторной модели, так и для естественно восприимчивых животных, а также характеризующийся широким антигенным спектром, доминирующим над эпизоотическими штаммами возбудителя.The term "production strain" means a vaccine strain, studied by its biological properties, stable during storage and replanting, harmless after inactivation or attenuation for the animal, well adapted to the cultivation system, with high antigenic and immunogenic activity, both for a sensitive laboratory model and for naturally susceptible animals, and also characterized by a wide antigenic spectrum that dominates epizootic strains of the pathogen.

Производственный штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2336 и характеризуется следующими признаками и свойствами.The bovine bovine diarrhea virus production strain No. 2,336 was deposited with the State Virus Collection Institute of the Institute of Virology of the Russian Academy of Medical Sciences, has the registration number of No. 2,336 bills and is characterized by the following features and properties.

Источник происхождения.Source of origin.

Источником получения нового производственного штамма вируса диареи ГКВ №2336 является вирусный штамм СТ-89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из содержимого кишечника телят с признаками диареи в культуре клеток почки новорожденного теленка, который прошел 82 последовательных пассажа в перевиваемой культуре клеток МДВК.The source of the new production strain of STB diarrhea virus No. 2336 is the ST-89 virus strain (author's name), isolated in 1989 from the intestines of calves with signs of diarrhea in the cell culture of the kidney of a newborn calf, which passed 82 consecutive passages in a transplanted cell culture of MDVC .

Морфологические свойства.Morphological properties.

Штамм ГКВ №2336 относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса диареи КРС, размером 40-60 нм и состоящие из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии и наружной липопротеидной оболочки.GKV strain No. 2336 belongs to the family Flaviviridae, genus Pestivirus. Electron microscopic examination using the method of negative contrasting of virus-containing culture material revealed virions characteristic of the cattle diarrhea virus, 40-60 nm in size and consisting of icosahedral symmetric nucleocapsid and external lipoprotein membrane.

Антигенные свойства.Antigenic properties.

Штамм ГКВ №2336 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.GKV strain No. 2336 shows high antigenic and immunogenic activity both natively and after inactivation, possesses a wide antigenic spectrum and dominates against field strains.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2336 вируса диареи КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ВД (табл.1).The introduction of Guinea pigs strain No. 2,336 of the cattle diarrhea virus leads to the formation of a humoral immune response to various strains and field isolates of the VD virus (Table 1).

Табл.1Table 1 Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2336 вируса ВДCross antigenic activity of the strain of ST-Bills No. 2336 virus VD Штамм/изолят вируса ВД для РНVD strain / isolate for pH Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2336 вируса ВД, M±mThe titer of virus-neutralizing antibodies in the blood serum of guinea pigs immunized with the strain of STB No. 2336 of the VD virus, M ± m ГКВ №2336ГКВ №2336 374,8±31,6374.8 ± 31.6 СТ-89ST-89 107,6±24,5107.6 ± 24.5 Изолят №865Isolate No. 865 168,9±21,3168.9 ± 21.3 Изолят№1204Isolate No. 1204 337,7±26,8337.7 ± 26.8 Изолят №663Isolate No. 663 174,8±22,4174.8 ± 22.4

Имеет тесное антигенное родство с вирусами классической чумы свиней и пограничной болезни овец.It has a close antigenic relationship with the viruses of classical swine fever and border disease of sheep.

Биотехнологические характеристики.Biotechnological characteristics.

Штамм ГКВ №2336 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 107,5-108,5 ТЦД50/см3.GKV strain No. 2336 multiplies well in the primary culture of calf kidney cells (cow embryos) and in the MDVK cell culture. In these cell cultures, the virus accumulates in a titer of 10 7.5 -10 8.5 TCD 50 / cm 3 .

Рекомендуемый способ хранения.Recommended storage method.

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°C.In a lyophilized state at a temperature not exceeding minus 60 ° C.

Периодичность освежения.Frequency of refreshment.

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.Once every three years in a culture of MDVC cells.

Дополнительные сведения о штамме.Additional information about the strain.

Штамм ГКВ №2336 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в тест-системе ПЦР.GKV strain No. 2336 is not contaminated by extraneous microflora. It is tested with reference serum (GB) and in the PCR test system.

Реактогенность - штамм ГКВ №2336 реактогенными свойствами не обладает.Reactogenicity - the strain of ST-Bills No. 2336 does not have reactogenic properties.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).Stability - retains the original biological (antigenic) properties during successive passages in the culture of MDVC cells for 10 passages (observation period).

Патогенность - выражена.Pathogenicity - expressed.

Контагиозность - выражена.Contagiousness - expressed.

Онкогенность - отсутствует.Oncogenicity is absent.

Производственный штамм ротавируса крупного рогатого скота ГКВ №2337 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2337 и характеризуется следующими признаками и свойствами.The bovine rotavirus production strain GKV No. 2337 was deposited in the State Virus Collection of the Institute of Virology of the Russian Academy of Medical Sciences, has the registration number of the GKV participant No. 2337 and is characterized by the following features and properties.

Источник происхождения.Source of origin.

Источником для получения нового производственного штамма ротавируса КРС является вирусный штамм К-88 (авторское название), выделенный в 1988 г. из содержимого кишечника теленка с выраженной диареей, который прошел 69 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.The source for a new production strain of cattle rotavirus is the K-88 virus strain (author's name), isolated in 1988 from the contents of the intestine of a calf with severe diarrhea, which passed 69 consecutive passages in transplanted cattle cell cultures.

Морфологические свойства.Morphological properties.

Штамм ГКВ №2337 относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции КРС: вирион представляет собой образование округлой формы диаметром 60-80 нм, напоминающий вид колеса.GKV strain No. 2337 belongs to the Reoviridae family, the genus Rotavirus and has morphological characteristics characteristic of the causative agent of rotavirus infection of cattle: the virion is a rounded shape with a diameter of 60-80 nm, resembling the appearance of a wheel.

Антигенные свойства.Antigenic properties.

Штамм ГКВ №2337 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.GKV strain No. 2337 shows high antigenic and immunogenic activity both natively and after inactivation, possesses a wide antigenic spectrum and dominates against field strains.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2337 ротавируса КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам ротавируса КРС (табл.2).The introduction of guinea pigs strain GKV No. 2,337 of cattle rotavirus leads to the formation of a humoral immune response to various strains and field isolates of cattle rotavirus (Table 2).

Табл.2Table 2 Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2337ротавируса КРСCross antigenic activity of a strain of ST-Bills No. 2337 of cattle rotavirus Штамм/изолят ротавируса для РНRavavirus strain / isolate for pH Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2337 ротавируса, M±mThe titer of virus-neutralizing antibodies in the blood serum of guinea pigs immunized with the STB strain No. 2,337 of rotavirus, M ± m ГКВ №2337ГКВ №2337 824,3±46,1824.3 ± 46.1 К-88K-88 406,2±36,0406.2 ± 36.0 Изолят №2810Isolate No. 2810 238,8±26,4238.8 ± 26.4 Изолят №Р-47Isolate No. P-47 219,4±24,2219.4 ± 24.2 Изолят №Р-56Isolate No. P-56 351,7±34,2351.7 ± 34.2

Имеет антигенное родство с ротавирусами, выделенными от других видов животных.Has antigenic affinity with rotaviruses isolated from other animal species.

Биотехнологические характеристики.Biotechnological characteristics.

Штамм хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-8,5 lg ТЦД50/см3.The strain reproduces well in the primary culture of calf kidney cells (cow embryos) and in the MDVK cell culture. In these cell cultures, the virus accumulates in a titer of 7.5-8.5 lg TCD 50 / cm 3 .

Рекомендуемый способ хранения.Recommended storage method.

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°C.In a lyophilized state at a temperature not exceeding minus 60 ° C.

Периодичность освежения.Frequency of refreshment.

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.Once every three years in a culture of MDVC cells.

Дополнительные сведения о штамме.Additional information about the strain.

Штамм ГКВ №2337 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в ИФА.GKV strain No. 2337 is not contaminated by extraneous microflora. Tested with reference serum (GB) and ELISA.

Реактогенность - штамм ГКВ №2337 реактогенными свойствами не обладает.Reactogenicity - the strain of ST-Bills No. 2337 does not have reactogenic properties.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).Stability - retains the original biological (antigenic) properties during successive passages in the culture of MDVC cells for 10 passages (observation period).

Патогенность - выражена.Pathogenicity - expressed.

Контагиозность - выражена.Contagiousness - expressed.

Онкогенность - отсутствует.Oncogenicity is absent.

Производственный штамм коронавируса крупного рогатого скота ГКВ №2338 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2338 и характеризуется следующими признаками и свойствами.The bovine coronavirus production strain of bovine bacilli, No. 2338, was deposited in the State Virus Collection of the Institute of Virology of the Russian Academy of Medical Sciences, has the registration number of bills, No. 2338, and is characterized by the following features and properties.

Источник происхождения.Source of origin.

Источником получения нового производственного штамма коронавируса КРС является вирусный штамм КВ-90 (авторское название), выделенный в 1990 г. из содержимого кишечника теленка с выраженной диареей в культуре клеток почки эмбриона коровы, который прошел 48 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.The source of the production of a new production strain of cattle coronavirus is the viral strain KV-90 (author's name), isolated in 1990 from the contents of the intestine of a calf with severe diarrhea in a culture of a kidney cell of a cow embryo, which passed 48 consecutive passages in cattle transplanted cultures.

Морфологические свойства.Morphological properties.

Штамм ГКВ №2338 относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: вирион представляет собой образование округлой или овальной формы диаметром 80-100 нм с булавовидными выступами длиной 12-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Геном вируса представлен однонитевой, фрагментированной РНК.GKV strain No. 2338 belongs to the Coronaviridae family, the genus Coronavirus, and has morphological characteristics characteristic of the causative agent of coronavirus infection of cattle: the virion is a round or oval shape with a diameter of 80-100 nm with club-shaped protrusions 12-24 nm long, forming a kind of solar corona. The virus genome is represented by single-stranded, fragmented RNA.

Биотехнологические характеристики.Biotechnological characteristics.

Штамм ГКВ №2338 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3.GKV strain No. 2338 propagates well in the primary culture of calf kidney cells (cow embryos) and MDVC cell culture. In these cell cultures, the virus accumulates in a titer of 6.5-7.5 lg TCD 50 / cm 3 .

Антигенные свойства.Antigenic properties.

Штамм ГКВ №2338 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.GKV strain No. 2338 shows high antigenic and immunogenic activity both in the native form and after inactivation, has a wide antigenic spectrum and dominates in relation to field strains.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2338 коронавируса КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам коронавируса КРС (табл.3).The introduction of guinea pig strain No. 2,338 of bovine coronavirus cattle leads to the formation of a humoral immune response to various strains and field isolates of coronavirus cattle (table 3).

Табл.3Table 3 Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2338 коронавируса КРСCross antigenic activity of a strain of STB No. 2338 of cattle coronavirus Штамм/изолят коронавируса для РНStrain / isolate of coronavirus for pH Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2338 коронавируса, M±mThe titer of virus-neutralizing antibodies in the blood serum of guinea pigs immunized with a strain of STB No. 2338 coronavirus, M ± m ГКВ №2338ГКВ №2338 247,3±41,8247.3 ± 41.8 КВ-90KV-90 187,4±36,6187.4 ± 36.6 Изолят №456Isolate No. 456 81,5±12,881.5 ± 12.8 Изолят №128Isolate No. 128 59,7±6,759.7 ± 6.7

Рекомендуемый способ хранения.Recommended storage method.

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.In a lyophilized state at a temperature not exceeding minus 60 ° С.

Периодичность освежения: один раз в три года в культуре клеток МДВК.Frequency of refreshment: once every three years in the culture of MDVC cells.

Дополнительные сведения о штамме: штамм не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью корона-клона.Additional information about the strain: the strain is not contaminated by extraneous microflora. Tested with a clone crown.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.Reactogenicity - does not possess reactogenic properties.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).Stability - retains the original biological (antigenic) properties during successive passages in the culture of MDVC cells for 10 passages (observation period).

Патогенность - выражена.Pathogenicity - expressed.

Контагиозность - выражена.Contagiousness - expressed.

Онкогенность - отсутствует.Oncogenicity is absent.

В составе комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота инактивированные вирусные суспензии штаммов ГКВ №2336, ГКВ №2337 и ГКВ №2338 содержатся с титром инфекционной активности каждого вируса не менее 106,5ТЦД50 в 1 см3 вакцины.As part of a combined vaccine against viral diarrhea, rotavirus, coronavirus disease and bovine Escherichiosis, inactivated viral suspensions of the strains of STB No. 2336, STB No. 2337 and STB No. 2338 are contained with an infectious activity titer of each virus of at least 10 6.5 TCD 50 in 1 see 3 vaccines.

Инактивацию вирусных суспензий осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина или димера этиленимина (ДЭИ).Inactivation of viral suspensions is carried out in any known manner, for example by adding formalin or ethyleneimine dimer (DEI).

В составе предлагаемой вакцины вирусные суспензии штаммов могут быть использованы в любых сочетаниях по объему в зависимости от титра инфекционной активности вирусных суспензий, например, при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2236, ГКВ №2337 - 108,5-9,0 ТЦД50/см3 и штамма ГКВ №2338 -107,0-7,5 ТЦД50/см3 вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:1:1 (смесь №1); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 108,5-9,0 ТЦД50/см3, штамма ГКВ №2337 - 107,5-8,5 ТЦД50/см3, штамма ГКВ №2338 - 106,5-7,0 ТЦД50/см3 вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 1:1:1 (смесь №2); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 107,5-8,5 ТЦД50/см3, штамма ГКВ №2337 - 108,5-9,0 ТЦД50/см3 и штамма ГКВ №2338 - 107,0-7,5 ТЦД50/см3 вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 4:1:1 (смесь №3). При этом следует отметить, что увеличение или уменьшение объема одного из компонентов не оказывает значительного влияния на антигенную активность готовой вакцины.In the composition of the proposed vaccine, viral suspensions of the strains can be used in any combination by volume depending on the titer of the infectious activity of the viral suspensions, for example, with the titer of the infectious activity of strains of STB No. 2236, STB No. 2337 - 10 8.5-9.0 TCD 50 / cm 3 and strain GKV No. 2338 -10 7.0-7.5 TCD 50 / cm 3 viral suspensions are mixed in a ratio by volume of 2: 1: 1 (mixture No. 1); or with the titer of infectious activity of the strain of STB No. 2336 - 10 8.5-9.0 TCD 50 / cm 3 , the strain of STB No. 2337 - 10 7.5-8.5 TCD 50 / cm 3 , the strain of STB No. 2338 - 10 6 5-7.0 TCD 50 / cm 3 viral suspensions are mixed in a ratio by volume of 1: 1: 1 (mixture No. 2); or with the titer of infectious activity of the strain of STB No. 2336 - 10 7.5-8.5 TCD 50 / cm 3 , the strain of STB No. 2337 - 10 8.5-9.0 TCD 50 / cm 3 and the strain of STB No. 2338 - 10 7 , 0-7.5 TCD 50 / cm 3 viral suspensions are mixed in a ratio by volume of 4: 1: 1 (mixture No. 3). It should be noted that an increase or decrease in the volume of one of the components does not significantly affect the antigenic activity of the finished vaccine.

Используемые для изготовления эшерихиозного компонента комбинированной вакцины штаммы Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41, продуцирующие антигены: соматические О9, О78, О115; капсульные полисахаридные К 80, К 30 и адгезивные К 99, F-41 известны и используются в различных сочетаниях при изготовлении вакцин и сывороток против эшерихиоза животных (см., например, авторское свидетельство SU №1149467, патенты РФ №№2043771, 2043772, 2070819, 2053792, 2222592 и др.). Однако нами было установлено, что при объединении известных штаммов эшерихий с новыми производственными штаммами вирусов в предлагаемой по изобретению комбинации наблюдается образование синергетической композиции, проявляемой в увеличении напряженности и длительности иммунитета к вирусному и эшерихиозному компонентам вакцины.The Escherichia coli strains of serovariants O9: K30, O78: K80, O115, O141: K99 and O101: F41 producing antigens: somatic O9, O78, O115; used for the manufacture of the Escherichia component of the combined vaccine; capsular polysaccharide K 80, K 30 and adhesive K 99, F-41 are known and used in various combinations in the manufacture of vaccines and sera against animal escherichiosis (see, for example, copyright certificate SU No. 1149467, RF patents No. 2043771, 2043772, 2070819 , 2053792, 2222592, etc.). However, we found that when combining known Escherichia strains with new production virus strains in the combination according to the invention, the formation of a synergistic composition is observed, which is manifested in an increase in tension and duration of immunity to the viral and Escherichia components of the vaccine.

В составе предлагаемой вакцины инактивированные суспензии клеток бактерий штаммов Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41 содержатся в равных соотношениях с конечной концентрацией не менее 20 млрд микробных клеток в 1 см3 вакцины.The composition of the proposed vaccine inactivated cell suspensions of bacteria of strains of Escherichia coli serovariants O9: K30, O78: K80, O115, O141: K99 and O101: F41 are contained in equal proportions with a final concentration of at least 20 billion microbial cells in 1 cm 3 of the vaccine.

Инактивацию суспензий клеток эшерихий осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина, содержащего не менее 37% формальдегида.Inactivation of Escherichia cell suspensions is carried out by any known method, for example, by adding formalin containing at least 37% formaldehyde.

Согласно изобретению комбинированная вакцина также содержит одну или более приемлемую в ветеринарии целевую добавку.According to the invention, the combination vaccine also contains one or more veterinary acceptable target additives.

Термин "целевая добавка" означает любые приемлемые в ветеринарии фармацевтические компоненты, которые традиционно используются для обеспечения сохранности антигенов в процессе технологической переработки, приготовления конечной рецептурной формы или последующего хранения и тому подобное.The term “target additive” means any pharmaceutical components acceptable in veterinary medicine that are traditionally used to ensure the preservation of antigens during processing, preparation of the final prescription form or subsequent storage and the like.

В качестве целевой добавки комбинированная вакцина может содержать растворитель, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, стабилизатор, антибактериальное и противогрибковое средства, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать дистиллированную воду, физиологический раствор, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин, сахарозу, желатозу, обезжиренное молоко и т.д.As a targeted additive, the combination vaccine may contain a solvent, an adjuvant, a solubilizing agent, a diluent, a preservative, a stabilizer, an antibacterial and antifungal agent, an isotonic agent, an absorption delaying agent, and the like. Diluents may include distilled water, saline, saline, dextrose, ethanol, glycerol and the like. Isotonic agents may include, among others, sodium chloride, dextrose, mannitol, sorbitol, and lactose. Stabilizers include albumin, sucrose, gelatose, skim milk, etc.

Адъюванты включают вещества, неспецифически усиливающие иммунный ответ к антигенам, и могут быть минерального происхождения - гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, алюминиево-калиевые квасцы; растительного происхождения - сапонин (Квил-А); адъюванты на основе минеральных и неминеральных масел; синтетический адъювант - мурамилдипептид и др.Adjuvants include substances that non-specifically enhance the immune response to antigens, and may be of mineral origin — alumina hydrate, aluminum phosphate, potassium alum; plant origin - saponin (Quil-A); adjuvants based on mineral and non-mineral oils; synthetic adjuvant - muramyl dipeptide, etc.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина преимущественно содержит адъювант, например гидрат окиси алюминия или смесь гидрата окиси алюминия с сапонином. При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 1:10000.As a target additive, the vaccine according to the invention preferably contains an adjuvant, for example alumina hydrate or a mixture of alumina hydrate with saponin. If necessary, as a target additive, the proposed vaccine may contain a preservative sodium thiolate in an amount of 1: 10000.

Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим предпочтительно от 20 до 30 об.% адъюванта.Although a person skilled in the art can easily determine the amount and concentration of adjuvants and additives that can be used in the context of the present invention, the present invention relates to compositions comprising preferably from 20 to 30 vol.% Adjuvant.

В предпочтительном варианте вакцина содержит 6%-ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 20 об.% и сапонин в количестве 0,05 об.%, что соответствует 12 г гидрата окиси алюминия и 500 мг сапонина в 1 л вакцины.In a preferred embodiment, the vaccine contains 6% alumina hydrate gel in an amount of 20 vol.% And saponin in an amount of 0.05 vol.%, Which corresponds to 12 g of alumina hydrate and 500 mg of saponin in 1 liter of vaccine.

Нижеследующие примеры рецептур являются чисто иллюстративными и не ограничивают рамки настоящего изобретения.The following formulation examples are illustrative only and do not limit the scope of the present invention.

Вакцина инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота представляет собой жидкость светло-красного цвета, при хранении образуется рыхлый белый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании.The vaccine is an inactivated combination vaccine against viral diarrhea, rotavirus, coronavirus disease and bovine Escherichiosis is a light red liquid, during storage a friable white precipitate forms, which easily breaks up into a homogeneous suspension when shaken.

Вакцина стабильна и сохраняет исходную активность при температуре 2-8°C не менее 18 месяцев (срок наблюдения).The vaccine is stable and retains its original activity at a temperature of 2-8 ° C for at least 18 months (observation period).

Комбинированную вакцину вводят стельным животным двукратно с интервалом 14-21 сут, первый раз - за 50-60 сут до отела, второй раз не позднее 30 дней до отела. Вакцину вводят внутримышечно взрослым животным в дозе 3 см3.The combined vaccine is administered to pregnant animals twice with an interval of 14-21 days, the first time 50-60 days before calving, the second time no later than 30 days before calving. The vaccine is administered intramuscularly to adult animals at a dose of 3 cm 3 .

Вакцина апробирована на крупном рогатом скоте в неблагополучных хозяйствах. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов инактивированной вакцины. Вакцинация повышает иммунитет у матерей и защищает потомство в период эмбрионального развития и в постнатальный период. При этом индуцируемый иммунный ответ характеризовался высокой специфичностью по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах.The vaccine was tested on cattle in dysfunctional farms. This testing confirms the harmlessness of the drug and its antiepizootic efficacy, manifested in enhancing the immunizing activity of the components of the inactivated vaccine. Vaccination increases immunity in mothers and protects offspring during embryonic development and in the postnatal period. Moreover, the induced immune response was characterized by high specificity with respect to different subtypes and main antigenic variants of epizootic strains of pathogens circulating on farms.

Защитный уровень антител у животных, привитых данной вакциной, сохранялся не менее 8 мес у взрослых животных, колостральный иммунитет у новорожденных телят - до 1,5 месяцев.The protective level of antibodies in animals vaccinated with this vaccine was maintained for at least 8 months in adult animals, and colostral immunity in newborn calves lasted up to 1.5 months.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.The invention is illustrated, but not limited to the following examples.

Пример 1. Получение инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза КРС.Example 1. Obtaining an inactivated combination vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus disease and Escherichia cattle.

Вакцину готовят из новых производственных штаммов вируса диареи ГКВ №2336, ротавируса ГКВ №2337, коронавируса ГКВ №2338 (вирусный компонент) и любых известных вакцинных штаммов бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41 (эшерихиозный компонент).The vaccine is prepared from new production strains of the diarrhea virus of the STB No. 2336, the rotavirus of the STB No. 2337, the coronavirus of the STB No. 2338 (viral component) and any known vaccine strains of bacteria Escherichia coli serovariants O9: K30, O78: K80, O115, O141: K99 and O01: O99 and O01: O99: O99 F41 (Escherichia component).

Технологический процесс состоит из следующих основных стадий: стадии получения вирусного компонента, стадии получения эшерихиозного компонента, объединение полученных вирусного и эшерихиозного компонентов, добавление адъюванта, смешивание всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.The technological process consists of the following main stages: the stage of obtaining the viral component, the stage of obtaining the Escherichia component, combining the obtained viral and Escherichia components, adding an adjuvant, mixing all components of the vaccine with subsequent packaging of the finished product.

A. Стадия получения вирусного компонента комбинированной вакцины.A. The step of obtaining the viral component of the combination vaccine.

Изготовление вирусного компонента комбинированной вакцины включает раздельные этапы получения вирусных суспензий из посевных материалов штаммов вируса диареи ГКВ №2336, ротавируса ГКВ №2337 и коронавируса ГКВ №2338; определения инфекционной активности каждой вирусной суспензии, инактивацию вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма и их объединение.The manufacture of the viral component of the combination vaccine includes separate steps for producing viral suspensions from the inoculum of strains of the diarrhea virus of GBV No. 2,336, rotavirus GBV No. 2,337 and coronavirus GBV No. 2,338; determination of the infectious activity of each viral suspension, inactivation of virus-containing culture fluids of each strain and their combination.

Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (seed lot system), при которой последовательные серии продукции получают из главного посевного материала (master seed lot) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве рабочий посевной материал (working seed lot) готовится из главного посевного материала. Готовый продукт производят из рабочего посевного материала, при этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значения, установленного при клинических испытаниях вакцин, исходя из требований безопасности и эффективности.The step for producing viral suspensions according to the invention is based on a seed lot system, in which successive series of products are obtained from the main seed (master seed lot) for a certain number of transfers (passages). In the current production, the working seed lot is prepared from the main seed. The finished product is made from working seed, and the number of transfers from the main seed should not exceed the value established during clinical trials of vaccines, based on safety and efficacy requirements.

Процесс получения системы посевных материалов каждого штамма вируса включает несколько этапов:The process of obtaining a seed system of each strain of the virus includes several stages:

- приготовление культуры клеток;- preparation of cell culture;

- проведение пассажей вируса;- carrying out passages of the virus;

- получение вирусной суспензии;- obtaining a viral suspension;

- промежуточный контроль штамма вируса;- intermediate control of a strain of the virus;

- лиофилизация, замораживание или инактивация штамма вируса;- lyophilization, freezing or inactivation of the virus strain;

- контроль штамма вируса.- control of the strain of the virus.

Все используемые для изготовления комбинированной вакцины штаммы вирусов выращивают в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК. Для культивирования штаммов ротавируса ГКВ №2337 и коронавируса ГКВ №2338 в поддерживающую среду добавляют трипсин в концентрации 5 мкг/см3.All virus strains used for the manufacture of the combination vaccine are grown in a transplanted MDVC calf kidney cell culture. For the cultivation of strains of rotavirus STB No. 2337 and coronavirus STB No. 2338, trypsin at a concentration of 5 μg / cm 3 is added to the support medium.

Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД 50/см3.The accumulation of viruses in cell culture is assessed by the cytopathic effect. The virus titer is calculated by the method of Reed and Mench and expressed in lg TCD 50 / cm 3 .

При достижении титра вирусов до значений 106,5-109,0 ТЦД50/см3 полученный вируссодержащий материал каждого штамма очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.When the titer of viruses reaches 10 6.5 -10 9.0 TCD 50 / cm 3 the resulting virus-containing material of each strain is purified from ballast impurities by centrifugation or any other known method.

Далее суспензии вирусов инактивируют раствором формалина, содержащим не менее 37% формальдегида. Полноту инактивации оценивают по отсутствию размножения вирусов в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей. Инактивированные суспензии вирусов объединяют с таким расчетом, чтобы в каждой серии титр инфекционной активности каждого из штаммов составлял не менее 106,5 ТЦД50/см3.Further, virus suspensions are inactivated with a formalin solution containing at least 37% formaldehyde. The completeness of inactivation is assessed by the absence of virus propagation in a sensitive cell culture for four passages. Inactivated virus suspensions are combined so that in each series the titer of the infectious activity of each of the strains is at least 10 6.5 TCD 50 / cm 3 .

При этом при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2336, ГКВ №2337 - 108,5-9,0 ТЦД50/см3 и штамма ГКВ №2338 - 107,0-7,5 ТЦД50/см3 вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:1:1 (смесь №1); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 108,5-9,0 ТЦД50/см3, штамма ГКВ №2337 - 107,5-8,5 ТЦД50/см3, штамма ГКВ №2338 - 106,5-7,0 ТЦД50/см3 вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 1:1:1 (смесь №2); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 107,5-8,5 ТЦД50/см3, штамма ГКВ №2337 - 108,5-9,0 ТЦД50/см3 и штамма ГКВ №2338 - 107,0-7,5 ТЦД50/см3 вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 4:1:1 (смесь №3).Moreover, when the titer of infectious activity of strains of STB No. 2336, STB No. 2337 - 10 8.5-9.0 TCD 50 / cm 3 and strain STB No. 2338 - 10 7.0-7.5 TCD 50 / cm 3 viral suspensions are mixed in a volume ratio of 2: 1: 1 (mixture No. 1); or with the titer of infectious activity of the strain of STB No. 2336 - 10 8.5-9.0 TCD 50 / cm 3 , the strain of STB No. 2337 - 10 7.5-8.5 TCD 50 / cm 3 , the strain of STB No. 2338 - 10 6 5-7.0 TCD 50 / cm 3 viral suspensions are mixed in a ratio by volume of 1: 1: 1 (mixture No. 2); or with the titer of infectious activity of the strain of STB No. 2336 - 10 7.5-8.5 TCD 50 / cm 3 , the strain of STB No. 2337 - 10 8.5-9.0 TCD 50 / cm 3 and the strain of STB No. 2338 - 10 7 , 0-7.5 TCD 50 / cm 3 viral suspensions are mixed in a ratio by volume of 4: 1: 1 (mixture No. 3).

Б. Стадия получения эшерихиозного компонента комбинированной вакцины.B. The stage of obtaining the Escherichia component of the combination vaccine.

Берут штаммы бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41, которые в соответствии с их антигенной формулой продуцируют соматические антигены О9, О78, О115; капсульные полисахаридные антигены К 80, К 30 и адгезивные антигены К 99, F-41.Bacterial strains of Escherichia coli of serovariants O9: K30, O78: K80, O115, O141: K99 and O101: F41 are taken, which in accordance with their antigenic formula produce somatic antigens O9, O78, O115; capsular polysaccharide antigens K 80, K 30 and adhesive antigens K 99, F-41.

Выращивание штаммов эшерихий включает в себя подготовку матриксной расплодки с последующим высевом ее в реактор.The cultivation of Escherichia strains includes the preparation of matrix seedling with its subsequent sowing in the reactor.

Для приготовления матриксной расплодки эшерихий культуру каждого штамма засевают с полужидкого агара в объеме 1-2 см3 в отдельный флакон, содержащий 80-100 см3 бульона Хоттингера. Посевы культивируют 8-10 часов при температуре 37±1°C. Выросшие культуры проверяют на чистоту макроскопически и микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Чистые культуры засевают каждую отдельно в 10-литровые бутыли с бульоном Хоттингера, наполненные не более чем на половину объема, и выращивают в течение 8-10 часов при температуре 37-38°C, периодически встряхивая. Проверенную на чистоту роста матровую расплодку каждого штамма засевают в отдельный реактор в количестве 5-10% от объема среды, добавляют 40%-ный раствор глюкозы до 0,2%-ной концентрации к объему среды и выращивают в течение 10-14 часов при температуре 37±1°C при непрерывной аэрации и перемешивании (подача воздуха под давлением 0,1-0,2 атм 50 л в час). Допускается совместное выращивание штаммов серологических вариантов О9:К30 и О78:К80 с учетом их колициногенности. Матровые расплодки штаммов смешивают в равных соотношениях.For the preparation of matrix brood Escherichia culture of each strain is seeded with semi-liquid agar in a volume of 1-2 cm 3 in a separate bottle containing 80-100 cm 3 of Hottinger broth. Crops are cultivated for 8-10 hours at a temperature of 37 ± 1 ° C. Grown cultures are checked for purity macroscopically and by microscopy of Gram stained smears. Pure cultures are each seeded separately in 10-liter bottles of Hottinger broth, filled not more than half the volume, and grown for 8-10 hours at a temperature of 37-38 ° C, periodically shaking. Checked for purity of growth, the matroe seedlings of each strain are seeded in a separate reactor in an amount of 5-10% of the medium volume, 40% glucose solution is added to a 0.2% concentration to the medium volume and grown for 10-14 hours at a temperature 37 ± 1 ° C with continuous aeration and stirring (air supply under pressure of 0.1-0.2 atm 50 l per hour). Co-cultivation of strains of serological variants O9: K30 and O78: K80 is allowed, taking into account their colicinogenicity. The brood seed strains are mixed in equal proportions.

Штаммы О115, О101:F41 и О141:К99 выращивают в отдельных реакторах. Изменение состава групп не допускается.Strains O115, O101: F41 and O141: K99 are grown in separate reactors. Changing the composition of groups is not allowed.

После окончания выращивания определяют концентрацию микробных тел в культуре, pH и чистоту культуры.After growing, determine the concentration of microbial bodies in the culture, pH and purity of the culture.

Выращенные в реакторах культуры штаммов О101:F41 и О141:К99 сепарируют в сепараторе АСГ - ЗМ с частотой вращения 4500-5000 мин-1, бактериальную массу ресуспендируют в реакторе в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации 80-100 млрд микробных тел в 1 см3 и прогревают при температуре 60-65°C в течение 20 минут. Супернатанты отделяют от бактериальных клеток путем центрифугирования при частоте вращения 10000-15000 мин-1 и проверяют на содержание адгезивных антигенов F41 и К99 в реакции диффузной преципитации.The strains O101: F41 and O141: K99 grown in the culture reactors are separated in an ASG - ZM separator with a rotation frequency of 4500-5000 min -1 , the bacterial mass is resuspended in a reactor in phosphate-urea buffer to a concentration of 80-100 billion microbial bodies in 1 cm 3 and heated at a temperature of 60-65 ° C for 20 minutes. Supernatants are separated from the bacterial cells by centrifugation at a speed of 10,000-15,000 min -1 and checked for the content of adhesive antigens F41 and K99 in the diffuse precipitation reaction.

Далее полученные культуры объединяют в равных соотношениях, добавляют формалин, разведенный физиологическим раствором 1:1, с таким расчетом, чтобы его концентрация в культуре была 0,3%. Инактивацию культур проводят в течение 15-16 суток при температуре 37±1°C. Полученную смесь инактивированных суспензий клеток концентрируют до получения бакмассы с содержанием 100-200 млрд микробных клеток в 1 см3.Next, the resulting cultures are combined in equal proportions, formalin diluted with physiological saline 1: 1 is added so that its concentration in the culture is 0.3%. Inactivation of cultures is carried out for 15-16 days at a temperature of 37 ± 1 ° C. The resulting mixture of inactivated cell suspensions is concentrated to obtain a back mass with a content of 100-200 billion microbial cells in 1 cm 3 .

В. Стадия объединения вирусного и эшерихиозного компонентов комбинированной вакцины.B. Stage of combining the viral and Escherichia components of the combination vaccine.

Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №1), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000 тщательно перемешивают.Inactivated virus suspensions prepared in stage A are mixed in the prescribed ratio depending on the titer of the infectious activity of the viral suspension of each strain (mixture No. 1), mixed thoroughly. Then add 6% gel of aluminum hydroxide (GOA) in an amount of 20% of the total volume, add saponin at a concentration of 500 mg / l and the preservative sodium thiolate at a concentration of 1: 10000 are thoroughly mixed.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов эшерихий, приготовленной на стадии Б, добавляют мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, затем смешивают с 6%-ным ГОА (20% от общего объема), тщательно перемешивают.To the inactivated bacterial cell suspension of the mixture of Escherichia strains prepared in stage B, sodium merthiolate is added at a concentration of 1: 10000 as a preservative, then mixed with 6% GOA (20% of the total volume), thoroughly mixed.

Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД50, эшерихий - не менее 20 млрд м.кл. в 1 см3.The viral and bacterial parts of the drug are mixed so that the concentration of viral antigens in the finished vaccine is at least 6.5 lg TCD 50 , and Escherichia is at least 20 billion cubic meters. in 1 cm 3 .

Вариант 2.Option 2

Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №2), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.Inactivated virus suspensions prepared in stage A are mixed in the prescribed ratio depending on the titer of the infectious activity of the viral suspension of each strain (mixture No. 2), mixed thoroughly. Then add 6% gel of aluminum hydroxide (GOA) in an amount of 20% of the total volume, add saponin at a concentration of 500 mg / l and preservative sodium thiolate at a concentration of 1: 10000, mix thoroughly.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов эшерихий, приготовленной на стадии Б, добавляют 6%-ный ГОА (20% от общего объема) и тщательно перемешивают. Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД50, эшерихий - не менее 20 млрд м.кл. в 1 см3.To inactivated bacterial cell suspension of a mixture of Escherichia strains prepared in stage B, add 6% GOA (20% of the total volume) and mix thoroughly. The viral and bacterial parts of the drug are mixed so that the concentration of viral antigens in the finished vaccine is at least 6.5 lg TCD 50 , and Escherichia is at least 20 billion cubic meters. in 1 cm 3 .

Вариант 3.Option 3

Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №3), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 30% от общего объема, тщательно перемешивают.Inactivated virus suspensions prepared in stage A are mixed in the prescribed ratio, depending on the titer of the infectious activity of the viral suspension of each strain (mixture No. 3), mixed thoroughly. Then add 6% gel of aluminum hydroxide (GOA) in an amount of 30% of the total volume, mix thoroughly.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов эшерихий, приготовленной на стадии Б, добавляют 6%-ный ГОА (30% от общего объема) и тщательно перемешивают.To inactivated bacterial cell suspension of a mixture of Escherichia strains prepared in stage B, add 6% GOA (30% of the total volume) and mix thoroughly.

Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД50, эшерихий - не менее 20 млрд м.кл. в 1 см3.The viral and bacterial parts of the drug are mixed so that the concentration of viral antigens in the finished vaccine is at least 6.5 lg TCD 50 , and Escherichia is at least 20 billion cubic meters. in 1 cm 3 .

Полученные варианты инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота имеет компонентный состав, приведенный в табл.4The obtained variants of the inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus diseases, and bovine Escherichiosis have a component composition shown in Table 4

Табл.4Table 4 Содержание ингредиентов в жидкой смеси, об.%The content of ingredients in the liquid mixture, vol.% ИнгредиентIngredient Титр, lg ТЦД50/см3 Titer, lg TCD 50 / cm 3 Содержание в жидкой смеси, об.%The content in the liquid mixture, vol.% Вариант 1Option 1 Вариант 2Option 2 Вариант 3Option 3 Вирус ВДVD virus 7,5-8,57.5-8.5 4040 8,5-9,08.5-9.0 30thirty 20twenty РотавирусRotavirus 7,5-8,57.5-8.5 20twenty 8,5-9,08.5-9.0 15fifteen 1010 КоронавирусCoronavirus 6,5-7,06.5-7.0 20twenty 7,0-7,57.0-7.5 15fifteen 1010 Суспензия клеток штаммов эшерихийEscherichia strain cell suspension -- 19,9419.94 19,9419.94 10,010.0 ГОА (6%-й гель)GOA (6% gel) -- 20twenty 20twenty 30thirty СапонинSaponin -- 0,050.05 0,050.05 -- Мертиолят натрияMertiolate Sodium -- 0,010.01 0,010.01 --

Пример 2. Оценка антигенной активности комбинированной вакцины на экспериментальных моделях.Example 2. Evaluation of the antigenic activity of a combination vaccine in experimental models.

Для определения антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины по изобретению в качестве экспериментальной модели используют лабораторных животных, при этом для оценки антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок массой 350-400 г, для определения антигенной активности адгезивных антигенов E.coli - кроликов массой 3-3,5 кг, для оценки иммуногенной активности по отношению к соматическим антигенам E.coli - белых беспородных мышей массой 18-20 г.To determine the antigenic and immunogenic activity of the combination vaccine according to the invention, laboratory animals are used as an experimental model, while to assess the antigenic activity of the viral components of the vaccine, guinea pigs weighing 350-400 g are used, to determine the antigenic activity of adhesive antigens of E. coli, rabbits weighing 3- 3.5 kg, to assess the immunogenic activity against somatic antigens of E. coli - white mongrel mice weighing 18-20 g.

Формируют группы по 10 животных в каждой: 3 опытные группы и 1 контрольную (морские свинки), 3 опытные группы и 1 контрольную (кролики).Groups of 10 animals are formed in each: 3 experimental groups and 1 control (guinea pigs), 3 experimental groups and 1 control (rabbits).

Морских свинок опытных групп иммунизируют исследуемой вакциной в дозе 0,25 см3; 0,5 см3 и 1,0 см3 соответственно, кроликов - в дозе 1,0 см3. При этом вакцину вводят морским свинкам внутримышечно, кроликам - подкожно. Животных контрольных групп не иммунизируют.Guinea pigs of the experimental groups are immunized with the test vaccine at a dose of 0.25 cm 3 ; 0.5 cm 3 and 1.0 cm 3, respectively, for rabbits - in a dose of 1.0 cm 3 . In this case, the vaccine is administered intramuscularly to guinea pigs, and subcutaneously to rabbits. Animal control groups are not immunized.

На 21 сутки после инъекции вакцины у всех животных берут кровь и отделяют сыворотку, которую затем исследуют на наличие специфических антител.On the 21st day after the injection of the vaccine, blood was taken from all animals and the serum was separated, which was then examined for the presence of specific antibodies.

Антигенную активность вирусного компонента вакцины оценивают по уровню вирус-специфических антител к вирусам ВД, РВ и КВ. Титр антител определяют в реакции нейтрализации (PH), которую проводят в 96-луночных планшетах по стандартной методике методом двукратных разведений испытуемой сыворотки против рабочей дозы каждого вируса 100 ТЦД50/лунка.The antigenic activity of the viral component of the vaccine is evaluated by the level of virus-specific antibodies to viruses VD, RV and KB. The antibody titer is determined in the neutralization reaction (PH), which is carried out in 96-well plates according to the standard method by double dilution of the test serum against a working dose of each virus of 100 TCD 50 / well.

Вируснейтрализующий титр исследуемой сыворотки выражают как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.The virus neutralizing titer of the test serum is expressed as its limiting dilution, inhibiting the development of the virus's CPD in 50% of infected cell cultures.

Антигенную активность адгезивных антигенов E.coli в вакцине оценивают в реакции агглютинации (РА) по титру антител в сыворотке крови вакцинированных кроликов.The antigenic activity of E. coli adhesive antigens in a vaccine is evaluated in an agglutination reaction (RA) by the titer of antibodies in the blood serum of vaccinated rabbits.

Для оценки иммуногенной активности вакцины по отношению к соматическим антигенам E.coli формируют 2 группы белых мышей по 20 животных в каждой. Животных контрольной группы иммунизируют двукратно с интервалом 10 сут. Вакцину вводят подкожно в дозе 0,1 см3. Животных контрольной группы не иммунизируют.To assess the immunogenic activity of the vaccine in relation to somatic antigens of E. coli, 2 groups of white mice of 20 animals each are formed. Animals of the control group are immunized twice with an interval of 10 days. The vaccine is administered subcutaneously at a dose of 0.1 cm 3 . Animals of the control group are not immunized.

Через 16-18 сут. после повторной инъекции вакцины мышей заражают внутрибрюшинно оттитрованной летальной дозой двух штаммов E.coli серогрупп О78 и О115. На штамм каждой серогруппы используют 10 вакцинированных и 10 контрольных животных.After 16-18 days. after repeated injection of the vaccine, the mice are infected with an intraperitoneally titrated lethal dose of two strains of E. coli serogroups O78 and O115. For each serogroup strain, 10 vaccinated and 10 control animals are used.

Иммуногенную активность вакцины по отношению к соматическим антигенам E.coli оценивают по количеству выживших животных в опытной группе.The immunogenic activity of the vaccine in relation to somatic antigens of E. coli is evaluated by the number of surviving animals in the experimental group.

Результаты исследования представлены в табл.5, которые свидетельствуют, что по антигенной активности комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота превосходит существующие аналоги.The results of the study are presented in Table 5, which indicate that the combined vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus diseases, and bovine escherichiosis is superior to existing analogues in antigenic activity.

Так, предлагаемая вакцина уже через 21 сутки после иммунизации обеспечивает выработку специфических антител ко всем вирусным компонентам препарата в высоком титре: к вирусу ВД - 1:222,9, к ротавирусу - 1:294,0, к коронавирусу - 1:207,9; к адгезивным антигенам эшерихий - от 1:540,5 до 1:720,0, иммуногенная активность вакцины составляет 90-100%.So, the proposed vaccine already 21 days after immunization provides the production of specific antibodies to all viral components of the drug in high titer: to the VD virus - 1: 222.9, to rotavirus - 1: 294.0, to coronavirus - 1: 207.9 ; to adhesive antigens of Escherichia - from 1: 540.5 to 1: 720.0, the immunogenic activity of the vaccine is 90-100%.

Животные контрольной группы на протяжении всего опыта были серонегативны к вирусам ВД, РВ, KB и эшерихиям.Animals of the control group throughout the experiment were seronegative for viruses VD, PB, KB and Escherichia.

Табл.5Table 5 Антигенная активность комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота на экспериментальных моделяхAntigenic activity of the combined vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus diseases, and bovine Escherichiosis in experimental models Группа жив-хLive group Титр антител в сыворотке крови морских свинокGuinea pig serum antibody titer Номер серииBatch number Титр антител в сыворотке крови кроликов к адгезив. АГAntibody titer in rabbit serum to adhesive. Ag Иммуногенная активность вакцины, % выживших б/мImmunogenic activity of the vaccine,% b / m survivors Доза препарата, см3 The dose of the drug, cm 3 Титр вируснейтрализующих антител, M±mThe titer of neutralizing antibodies, M ± m ВДVD РВRV KBKB O78O78 O115O115 II 0,250.25 28,8±2,128.8 ± 2.1 35,2±8,735.2 ± 8.7 86,4±5,786.4 ± 5.7 1one 540,5±25,4540.5 ± 25.4 9090 9090 IIII 0,50.5 222,9±23,2222.9 ± 23.2 294,0±28,5294.0 ± 28.5 207,9±24,5207.9 ± 24.5 22 720,0±68,3720.0 ± 68.3 100one hundred 100one hundred IIIIII 1,01,0 104,0±14,8104.0 ± 14.8 157,6±16,4157.6 ± 16.4 181,0±19,2181.0 ± 19.2 33 695,5±42,2695.5 ± 42.2 9090 100one hundred контрольthe control -- 00 00 00 00 00 00

Пример 3. Оценка стабильности комбинированной вакцины в процессе хранения.Example 3. Evaluation of the stability of the combination vaccine during storage.

Испытание стабильности комбинированной вакцины, полученной по примеру 1, проводят на экспериментальных животных - морских свинках и кроликах. При этом для оценки стабильности антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок, эшерихиозного компонента - кроликов и белых мышей.The stability test of the combination vaccine obtained in example 1 is carried out on experimental animals - guinea pigs and rabbits. Moreover, to assess the stability of the antigenic activity of the viral components of the vaccine, guinea pigs are used, and the Escherichia component is used in rabbits and white mice.

Для этого вакцину вводят через 6, 12 и 18 мес. хранения при температуре 4°C однократно: морским свинкам в дозе 0,5 см3, кроликам в дозе 1,0 см3. Через 21 сут после вакцинации сыворотку крови животных отбирают для исследования.For this, the vaccine is administered after 6, 12 and 18 months. storage at a temperature of 4 ° C once: guinea pigs at a dose of 0.5 cm 3 , rabbits at a dose of 1.0 cm 3 . Twenty-one days after vaccination, the blood serum of the animals was taken for examination.

Стабильность вирусного компонента вакцины оценивают в РН, эшерихиозного - в РА по отсутствию снижения титра антител ниже установленного уровня (1:16 и 1:200 соответственно) при хранении вакцины при +4°C в течение 18 месяцев.The stability of the viral component of the vaccine is assessed in pH, and of the Escherichia component in RA by the absence of a decrease in antibody titer below the established level (1:16 and 1: 200, respectively) when the vaccine is stored at + 4 ° C for 18 months.

Результаты испытания представлены в табл.6.The test results are presented in table.6.

Табл.6Table 6 Изменение антигенной активности комбинированной вакцины в процессе храненияChange in antigenic activity of the combined vaccine during storage Время храненияStorage time Титр антител в сыворотке крови вакцинированных лабораторных животных к возбудителюThe titer of antibodies in the blood serum of vaccinated laboratory animals to the pathogen ВДVD РВRV KBKB ЭшерихииEsherichia При изгот.When made. 222,9±23,2222.9 ± 23.2 294,0±28,5294.0 ± 28.5 207,9±24,5207.9 ± 24.5 720,0±68,3720.0 ± 68.3 6 мес.6 months 207,9±24,5207.9 ± 24.5 274,4±18,6274.4 ± 18.6 128,0±16,9128.0 ± 16.9 649,8±52,7649.8 ± 52.7 12 мес.12 months 157,6±16,4157.6 ± 16.4 181,0±16,7181.0 ± 16.7 90,5±13,490.5 ± 13.4 527,8±34,1527.8 ± 34.1 18 мес.18 months 119,4±21,2119.4 ± 21.2 111,4±14,5111.4 ± 14.5 59,7±10,959.7 ± 10.9 324,9±25,6324.9 ± 25.6

Пример 4. Производственное испытание экспериментальных серий комбинированной вакцины в опытах на коровах.Example 4. Production test of experimental series of combination vaccines in experiments on cows.

Испытание проводят на стельных коровах и нетелях в хозяйствах с высоким уровнем желудочно-кишечных болезней новорожденных телят, неблагополучных по вирусной диарее, рота-, коронавирусной болезням и эшерихиозу крупного рогатого скота.The test is carried out on pregnant cows and heifers in farms with a high level of gastrointestinal diseases of newborn calves, dysfunctional due to viral diarrhea, rota-, coronavirus diseases and bovine escherichiosis.

При этом животных делят на 2 группы: опытную и контрольную, по 20 голов в каждой группе.In this case, animals are divided into 2 groups: experimental and control, 20 goals in each group.

Животным опытной группы комбинированную вакцину, полученную по примеру 1, вводят внутримышечно в дозе 3,0 см3 двукратно с интервалом 14-21 сут, второй раз не позже, чем за 30 суток до отела.For the animals of the experimental group, the combined vaccine obtained according to Example 1 is administered intramuscularly at a dose of 3.0 cm 3 twice with an interval of 14-21 days, a second time no later than 30 days before calving.

В контрольной группе животных не вакцинируют.In the control group, animals are not vaccinated.

Для определения напряженности и продолжительности иммунитета у всех животных берут кровь до вакцинации и через 1, 2, 4, 6, 8 и 12 месяцев после вакцинации.To determine the tension and duration of immunity in all animals, blood is taken before vaccination and after 1, 2, 4, 6, 8 and 12 months after vaccination.

Эффективность вакцинации оценивают по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови коров и к эшерихиям - по уровню антител в РА к адгезивным антигенам эшерихий.Vaccination efficiency is assessed by the level of virus-neutralizing antibodies in the blood serum of cows and by Escherichia - by the level of antibodies in RA to the Escherichia adhesive antigens.

Результаты испытаний представлены в табл.7.The test results are presented in table.7.

Табл.7Table 7 Оценка активности вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота в опыте на коровахEvaluation of the activity of the vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus diseases, and bovine Escherichiosis in an experiment on cows Сроки исследований, месяцев после вакцинацииDuration of studies, months after vaccination Титр антител в сыворотке крови к возбудителюThe serum antibody titer to the pathogen ВДVD РВRV KBKB E.coliE.coli Опытная группаExperienced group До вакцинацииBefore vaccination 18,9±6,418.9 ± 6.4 23,6±2,923.6 ± 2.9 29,0±5,629.0 ± 5.6 61,7±15,161.7 ± 15.1 1one 476,7±30,1476.7 ± 30.1 961,3±46,2961.3 ± 46.2 1351,6±44,01351.6 ± 44.0 649,8±34,6649.8 ± 34.6 22 512,0±21,3512.0 ± 21.3 1229,0±61,41229.0 ± 61.4 1792,6±69,11792.6 ± 69.1 492,5±31,2492.5 ± 31.2 4four 494,5±32,3494.5 ± 32.3 684,1±38,1684.1 ± 38.1 749,6±48,2749.6 ± 48.2 373,2±28,9373.2 ± 28.9 66 247,3±41,8247.3 ± 41.8 394,0±28,9394.0 ± 28.9 430,5±38,1430.5 ± 38.1 324,9±24,7324.9 ± 24.7 88 163,1±14,5163.1 ± 14.5 238,8±36,4238.8 ± 36.4 349,7±35,6349.7 ± 35.6 282,8±18,3282.8 ± 18.3 1212 76,8±20,276.8 ± 20.2 82,9±22,682.9 ± 22.6 100,4±21,2100.4 ± 21.2 162,5±15,8162.5 ± 15.8 Контрольная группаControl group -- 17,5±3,917.5 ± 3.9 16,2±8,916.2 ± 8.9 32,9±14,732.9 ± 14.7 83,2±21,483.2 ± 21.4

Результаты исследования показывают, что иммунизация коров комбинированной вакциной по изобретению вызывает формирование выраженного иммунного ответа ко всем антигенам, входящим в состав вакцины, продолжительностью не менее 8 месяцев.The results of the study show that immunization of cows with the combination vaccine according to the invention causes the formation of a pronounced immune response to all antigens that make up the vaccine for at least 8 months.

Пример 5. Оценка колострального иммунитета у новорожденных телят.Example 5. Evaluation of colostral immunity in newborn calves.

В экспериментах используют 7-14-дневных телят, рожденных от коров, иммунизированных комбинированной вакциной по изобретению, контролем служат телята аналогичного возраста, полученные от невакцинированных коров.In the experiments, 7-14-day-old calves born to cows immunized with the combination vaccine of the invention are used; calves of a similar age obtained from unvaccinated cows are used as controls.

Все опытные и контрольные телята своевременно получают молозиво от своих матерей в течение первых двух часов после рождения и содержатся в одинаковых условиях.All experimental and control calves receive colostrum in a timely manner from their mothers during the first two hours after birth and are kept under the same conditions.

Оценку колострального иммунитета проводят путем определения титра вирус-специфических антител в сыворотке крови всех опытных и контрольных животных и к эшерихиям по уровню антител к адгезивным антигенам эшерихий. Результаты испытания представлены в табл.8.Assessment of colostral immunity is carried out by determining the titer of virus-specific antibodies in the blood serum of all experimental and control animals and to Escherichia by the level of antibodies to Escherichia adhesive antigens. The test results are presented in table.8.

Табл.8Table 8 Оценка колострального иммунитета вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота в опыте на телятахEvaluation of the colostral immunity of the vaccine against viral diarrhea, rota-, coronavirus diseases, and bovine Escherichiosis in an experiment on calves Возраст новорожденных телят, недельAge of newborn calves, weeks Титр антител в сыворотке крови к возбудителюThe serum antibody titer to the pathogen ВДVD РВRV KBKB E.coliE.coli Опытная группаExperienced group 1one 494,5±32,3494.5 ± 32.3 1097,5±36,61097.5 ± 36.6 1260,7±34,81260.7 ± 34.8 527,8±38,2527.8 ± 38.2 22 238,9±23,4238.9 ± 23.4 749,6±31,2749.6 ± 31.2 803,4±25,1803.4 ± 25.1 373,2±28,9373.2 ± 28.9 4four 163,1±21,4163.1 ± 21.4 461,4±28,6461.4 ± 28.6 476,7±30,1476.7 ± 30.1 114,9±11,2114.9 ± 11.2 66 107,6±24,1107.6 ± 24.1 100,4±16,9100.4 ± 16.9 84,4±18,584.4 ± 18.5 57,4±14,557.4 ± 14.5 Контрольная группаControl group 1one 19,5±5,919.5 ± 5.9 21,2±8,521.2 ± 8.5 29,9±10,229.9 ± 10.2 00 22 00 00 12,4±8,612.4 ± 8.6 00 4four 00 00 00 00 66 00 00 00 00

В результате исследования установлено, что вакцинация стельных коров исследуемой вакциной обеспечивает создание колострального иммунитета у телят, полученных от вакцинированных животных и получавших своевременно молозиво от своих матерей. Формирование колострального иммунитета подтверждается высокими титрами специфических антител к вирусным и эшерихиозному, которые сохранялись на протяжении всего срока наблюдения.As a result of the study, it was found that vaccination of pregnant cows with the studied vaccine provides the creation of colostral immunity in calves obtained from vaccinated animals and received colostrum in time from their mothers. The formation of colostral immunity is confirmed by high titers of specific antibodies to viral and Escherichia, which persisted throughout the observation period.

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют, что инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота в соответствии с изобретением имеет определяющее преимущество перед другими известными вакцинами по спектру специфической защиты и эффективности действия для восприимчивой группы животных, длительности напряженного иммунитета, безвредности для стельных животных, по стабильности сохранения биологических свойств, в т.ч. антигенной и иммуногенной активности на протяжении 18 месяцев (срок наблюдения). Вакцина экологически безопасна, не вызывает диссеминации патогенных агентов во внешнюю среду.Thus, the experiments show that the inactivated combination vaccine against viral diarrhea, rotavirus, coronavirus disease, and bovine Escherichiosis in accordance with the invention has a decisive advantage over other known vaccines in the spectrum of specific protection and efficacy for a susceptible group of animals, the duration of intense immunity, harmlessness to pregnant animals, on the stability of the preservation of biological properties, including antigenic and immunogenic activity for 18 months (observation period). The vaccine is environmentally friendly, does not cause dissemination of pathogenic agents into the external environment.

Claims (3)

1. Инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь инактивированной суспензии штамма вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, инактивированной суспензии штамма ротавируса ГКВ №2337, семейства Reoviridae, рода Rotavirus; инактивированной суспензии штамма коронавируса ГКВ №2338, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus, с активностью каждого из вирусных штаммов не менее 106,5 ТЦД50 в 1 см3 вакцины, и инактивированной суспензии клеток бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и О101:F41, взятых в смеси в равном соотношении с концентрацией не менее 20 млрд. микробных клеток в 1 см3 вакцины.1. Inactivated combination vaccine against viral diarrhea, rotavirus, coronavirus disease and bovine Escherichiosis, containing the active substance and target additives, characterized in that as the active substance it contains a mixture of inactivated suspension of the strain of bovine diarrhea virus of bovine animals No. 2336, family Flaviviridae, genus Pestivirus, inactivated suspension of a strain of rotavirus STB No. 2337, family Reoviridae, genus Rotavirus; inactivated suspension of the strain of coronavirus STB No. 2338, family Coronaviridae, genus Coronavirus, with the activity of each of the viral strains of at least 10 6.5 TCD 50 in 1 cm 3 of the vaccine, and inactivated suspension of bacterial cells Escherichia coli serovariants O9: K30, O78: K80, O115, O141: K99 and O101: F41 taken in a mixture in equal proportion with a concentration of at least 20 billion microbial cells in 1 cm 3 of the vaccine. 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве целевой добавки она содержит адьювант.2. The vaccine according to claim 1, characterized in that it contains an adjuvant as a target additive. 3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что в качестве адьюванта она содержит сапонин и/или гидроокись алюминия. 3. The vaccine according to claim 2, characterized in that it contains saponin and / or aluminum hydroxide as an adjuvant.
RU2009132362/15A 2009-08-28 2009-08-28 Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle RU2403063C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009132362/15A RU2403063C1 (en) 2009-08-28 2009-08-28 Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009132362/15A RU2403063C1 (en) 2009-08-28 2009-08-28 Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2403063C1 true RU2403063C1 (en) 2010-11-10

Family

ID=44025947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009132362/15A RU2403063C1 (en) 2009-08-28 2009-08-28 Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2403063C1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8440203B2 (en) 2009-11-06 2013-05-14 Intervet Inc. Methods of immunizing pregnant heifers at three months of gestation
RU2515058C1 (en) * 2012-09-17 2014-05-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Associated inactivated emulsion bovine viral diarrhoea, rotavirus and coronavirus infections vaccine
RU2685185C2 (en) * 2013-09-19 2019-04-16 Новавакс, Инк. IMMUNOGENIC MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS (MERS-CoV) COMPOSITIONS AND METHODS
RU2708891C1 (en) * 2018-06-19 2019-12-12 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) Vaccine for rota-, coronaviral infection and cattle colibacillosis
US10953089B1 (en) 2020-01-27 2021-03-23 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», утвержденная Департаментом ветеринарии 30.03.2007. *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8440203B2 (en) 2009-11-06 2013-05-14 Intervet Inc. Methods of immunizing pregnant heifers at three months of gestation
RU2515058C1 (en) * 2012-09-17 2014-05-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") Associated inactivated emulsion bovine viral diarrhoea, rotavirus and coronavirus infections vaccine
RU2685185C2 (en) * 2013-09-19 2019-04-16 Новавакс, Инк. IMMUNOGENIC MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS (MERS-CoV) COMPOSITIONS AND METHODS
US10751410B2 (en) 2013-09-19 2020-08-25 Novavax, Inc. Immunogenic middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) compositions and methods
RU2708891C1 (en) * 2018-06-19 2019-12-12 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) Vaccine for rota-, coronaviral infection and cattle colibacillosis
US10953089B1 (en) 2020-01-27 2021-03-23 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations
US11253586B2 (en) 2020-01-27 2022-02-22 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations
US11541112B2 (en) 2020-01-27 2023-01-03 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations
US11896664B2 (en) 2020-01-27 2024-02-13 Novavax, Inc. Corona virus vaccine formulations

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL194940C (en) Virus strain and vaccine to prevent pig reproduction and respiration syndrome.
US20050281842A1 (en) Inactivated bovine scours vaccines, process and method of preventing bovine scours
RU2403063C1 (en) Inactivated combined vaccine against viral diarrhea, rota-, corona-virus diseases and escherichiosis of cattle
US3526696A (en) Shipping fever vaccine
WO2016119078A1 (en) Combined use of haemophilus parasuis lc strain and lz-20100109 strain
RU2403061C1 (en) Inactivated combined vaccine against infectious rhinotracheitis, paraflu-3, respiratory syncytial disease, viral diarrhea and pasteurellosis of cattle
CN104288762B (en) A kind of vaccine combination and its preparation method and application
RU2395298C1 (en) Inactivated combined vaccine against cattle infectious rhinotracheitis, parainfluenza-3, virus diarrhoea, respiratory syncytial rota- and coronaviral disease
RU2378017C2 (en) Emulsion inactivated associated vaccine against cattle rednose and coronoviral infection
RU2395299C1 (en) Inactivated combined vaccine against cattle infectious rhinotracheitis, virus diarrhoea, rota-, coronavirus disease and leptospirosis
CN104248761B (en) A kind of vaccine combination and its preparation method and application
RU2395297C1 (en) Inactivated combined vaccine against cattle infectious rhinotracheitis, virus diarrhoea and leptospirosis
RU2696007C1 (en) Associated with parainfluenza-3 vaccine, infectious rhinotracheitis, viral diarrhea, rota- and coronaviral infections of cattle inactivated emulsion
RU2523389C1 (en) Method of production of hyperimmune serum against anaerobic enterotoxaemia and colibacillosis diarrhoea in calves
RU2297452C2 (en) Asia-1-type foot-and-mouth disease virus strain for producing of diagnostic and/or vaccine preparations
RU2589819C1 (en) VACCINE AGAINST INFECTIOUS BOVINE KERATOCONJUNCTIVITIS BASED ON ANTIGENS OF Moraxella bovis and Moraxella bovoculi BACTERIA
RU2457859C1 (en) Cattle viral diarrhoeia vaccine
RU2357755C2 (en) Inactivated vaccine against porcine transmissible gastroenteritis (ptge) and porcine epidemic diarrhea (ped) from enteric virus of artificially infected colostrum-free pigs (ptge/ped vaccine)
RU2806164C1 (en) Associated vaccine against canine distemper, parvovirus and coronavirus enteritis, adenovirus infection of dogs
CN103893750A (en) Anti-porcine pseudorabies and swine flu vaccine composition and application thereof
RU2504400C1 (en) Inactivated emulsion associated vaccine for cattle parainfluenza-3, infectious rhinotracheitis and viral diarrhoea
RU2825899C1 (en) Live cultural dry vaccine against porcine reproductive-respiratory syndrome and method for preparing vaccine
RU2269361C2 (en) Associated emulsion inactivated vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) and porcine parvovirus infection (ppvi)
RU2741643C1 (en) Associated vaccine against myxomatosis, pasteurellosis and viral haemorrhagic disease 1 and type 2 of rabbits
RU2456998C1 (en) Polyspecific rota-, coronaviral gastroenteritis and pig colibacillosis diarrhea hyperimmune serum

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE

Effective date: 20130619

PD4A Correction of name of patent owner
QZ41 Official registration of changes to a registered agreement (patent)

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20130619

Effective date: 20190305