RU2385348C2 - Экспрессирующая система - Google Patents
Экспрессирующая система Download PDFInfo
- Publication number
- RU2385348C2 RU2385348C2 RU2004134341/13A RU2004134341A RU2385348C2 RU 2385348 C2 RU2385348 C2 RU 2385348C2 RU 2004134341/13 A RU2004134341/13 A RU 2004134341/13A RU 2004134341 A RU2004134341 A RU 2004134341A RU 2385348 C2 RU2385348 C2 RU 2385348C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- domain
- protective
- immune response
- guanidine
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 34
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 claims abstract description 34
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 27
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 18
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims abstract description 17
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 101000585552 Bacillus anthracis Protective antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 30
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 30
- 101150006605 rpa gene Proteins 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 26
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 201000011442 Metachromatic leukodystrophy Diseases 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 101100449763 Anopheles gambiae GstD2 gene Proteins 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 101100069663 Caenorhabditis elegans gst-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101000906005 Fasciola hepatica Glutathione S-transferase class-mu 26 kDa isozyme 1 Proteins 0.000 description 5
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 5
- 102100036534 Glutathione S-transferase Mu 1 Human genes 0.000 description 5
- 101000851788 Homo sapiens Eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit ERF3A Proteins 0.000 description 5
- 101001071694 Homo sapiens Glutathione S-transferase Mu 1 Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101100449761 Musca domestica Gst1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 101100393846 Caenorhabditis elegans gst-4 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100449774 Musca domestica Gst4 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 102100038782 Carbohydrate sulfotransferase 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710158459 Carbohydrate sulfotransferase 1 Proteins 0.000 description 3
- -1 K12 Ion Chemical class 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 102100036533 Glutathione S-transferase Mu 2 Human genes 0.000 description 2
- 101001071691 Homo sapiens Glutathione S-transferase Mu 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000882995 Mus musculus Carbohydrate sulfotransferase 5 Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 208000022338 anthrax infection Diseases 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000034280 Bacillus anthracis str. Sterne Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000009722 regulation of fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение касается способа получения иммуногенного реагента, который вызывает иммунный ответ на инфекцию Bacillus anthracis, включающего в себя один или несколько полипептидов, которые вместе представляют три домена полноразмерного защитного антигена (РА) из В. anthracis или их варианты, и по меньшей мере один из указанных доменов включает в себя домен 1 или домен 4 РА или его вариант. Данные полипептиды указанного иммуногенного реагента, а также полноразмерный РА продуцируются в результате экспрессии в рекомбинантной клетке E.coli. Изобретение раскрывает также вектор экспрессии и нуклеиновую кислоту с процентной долей остатков гуанидина и цитозина более 35%, кодирующую иммуногенный полипептид, являющийся защитным антигеном (РА). Использование данного способа обеспечивает высокий выход иммуногенного полипептида. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые вызывают иммунный ответ, который является защитным ответом при инфицировании Bacillus anthracis, к способам их получения, к рекомбинантным клеткам Escherichia coli, используемым в этих способах, а также к используемым нуклеиновым кислотам и к трансформирующим векторам.
Существующие системы экспрессии Защитного Антигена (РА) для вакцинных систем в качестве экспрессирующего хозяина используют дефицитный по протеазе Bacillus subtilis. Несмотря на то что такие системы являются подходящими с точки зрения количественной характеристики и чистоты продукта, у них имеются и существенные недостатки. Во-первых, регуляторные системы, как правило, чужды данному хозяину, и это может тормозить экспрессию. Более существенный момент заключается в том, что используемые в настоящее время штаммы Bacillus subtilis образуют термостабильные споры, для которых нужно использовать специально для этого предназначенное растение.
В частности, в WO 00/02522 описываются репликоны VEE-вируса, которые экспрессируют РА или некие иммуногенные фрагменты.
Бактерия E.coli хорошо известна в качестве экспрессирующей системы для ряда человеческих вакцин. Несмотря на способность E.coli легко ферментировать при очень высоких клеточных плотностях, что делает данную бактерию идеальным хозяином для экспрессирования многих белков, предшествующие попытки экспрессировать и выделить рекомбинантный РА из цитозоля E.coli затруднялись из-за низкого выхода белка и протеолитической деградации (Singh и соавт., J. Biol. Chem. (1989) 264; 11099-11102, Vodkin и соавт., Cell (1993) 34; 693-697 и Sharma с соавт., Protein Expr. purif. (1996), 7, 33-38).
Недавно описан подход к сверхэкспрессированию РА в цитозоле E.coli в виде стабильного растворимого белка (Willhite с соавт., Protein and Peptide Letters, (1998), 5; 273-278). Примененный подход является одним из повышающих сродство tag-последовательности к N-концу РА, что позволяет получить простую систему выделения очисткой.
Трудность, присущая данной системе, заключается в том, что она нуждается в применении дополнительной вспомогательной технологической стадии для того, чтобы удалить tag-метку перед использованием РА.
Оптимизация кодона представляет собой методику, которая ныне хорошо известна и используется для конструирования искусственных генов. Существует некоторая избыточность генетического кода, поскольку большинство аминокислот кодируется более чем одной последовательностью кодона. Разные организмы предпочтительно используют тот или иной из этих отличающихся кодонов. Следует ожидать, что в результате оптимизации кодонов уровни экспрессии отдельных белков будут возрастать.
Как правило, это желательно, кроме случая с РА, когда повышенные уровни экспрессии будут приводить к протеолитической деградации и/или клеточной токсичности. В таких случаях возрастание уровней экспрессии может оказаться контрпродуктивным и привести к существенной клеточной токсичности.
Вместе с тем, к своему удивлению, авторы изобретения обнаружили, что этого не происходит в случае с E.coli и что в данной системе оптимизация кодона ведет к неожиданно высоким уровням экспрессии рекомбинантного РА, независимо от наличия или отсутствия протеолитических ферментов у данного штамма.
Кроме того, очевидно, что экспрессия защитного домена из РА не подавляет экспрессию в E.coli.
Была выяснена кристаллическая структура нативного РА (Petosa C. и соавт. Nature 385: 833-838, 1997), и было показано, что РА состоит из четырех разных и функционально независимых доменов: домена 1, разделенного на 1а, 1-167 аминокислот, и 1b, 168-258 аминокислот; домена 2, 259-487 аминокислот; домена 3, 488-595 аминокислот, и домена 4, 596-735 аминокислот.
Авторы изобретения установили, что некоторые домены, при их индивидуальном использовании, при использовании в слитых белках или в сочетании друг с другом, по всей вероятности, оказывают удивительно выраженные защитные эффекты.
В соответствии с настоящим изобретением, создали иммуногенный реагент, который вызывает иммунный ответ, который защищает от Bacillus anthracis, причем указанный реагент включает в себя один или несколько полипептидов, которые вместе представляют до трех доменов полноразмерного Защитного Антигена (РА) из B.anthracis или их варианты, и по меньшей мере один из указанных доменов включает в себя домен 1 или домен 4 РА или их варианты.
В данном случае этот реагент должен включать в себя смесь полипептидов или слитых пептидов, в которой отдельные полипептиды включают в себя один или несколько индивидуальных доменов РА.
В частности, данный реагент содержит полипептид(ы), включающий в себя домен 1, или домен 4 РА, или его вариант в виде, отличающемся от полноразмерного РА. В данном случае домены представлены, соответственно, полностью, в частности домен 1 представлен в его полноте.
Используемый здесь термин "полипептид" включает в себя белки и пептиды.
Используемый здесь экспрессирующий "вариант" относится к последовательностям аминокислот, которые отличаются от базовой последовательности тем, что одна или несколько аминокислот в данной последовательности делетированы или замещены другими аминокислотами, но которые все еще производят иммунный ответ, который защищает от Bacillus anthracis. Аминокислотные замены могут рассматриваться в качестве "консервативных", если та или иная аминокислота заменена отличающейся аминокислотой, в общем, с аналогичными свойствами. Неконсервативные замены - это такие замены, когда аминокислоты заменяются аминокислотами другого типа. В общих чертах, немногочисленные неконсервативные замены будут возможны без изменения биологической активности данного полипептида. Соответствующие варианты должны быть идентичны по меньшей мере на 60%, предпочтительно идентичны по меньшей мере на 75% и более предпочтительно идентичны по меньшей мере на 90% последовательности РА.
Идентичность отдельной вариантной последовательности РА можно определить, в частности, с использованием метода множественного выравнивания, описанного Lipman и Pearson (Lipman, D.J. & Pearson, W.R. (1985) Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol. 227, p.1435-1441). "Оптимизированная" процентная оценка должна быть вычислена по алгоритму Lipman-Pearson с помощью нижеследующих параметров: ktup=1, штраф за пробел=4 и штраф за длину пробела=12. Последовательности, для которых оценивается сходство, должны использоваться в качестве "тест-последовательности", то есть, базовую последовательность для сравнения, (SEQ ID No 1), необходимо первой включить в данный алгоритм.
Предпочтительно, если реагент согласно изобретению включает в себя полипептид, который обладает последовательностью домена 1 и/или домена 4 из РА дикого типа.
Наиболее предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает в себя домен 4 из РА B.anthracis.
Эти домены содержат следующие последовательности, представленные в нижеследующей Таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Домен | Аминокислоты полноразмерного РА* |
| 4 | 596-735 |
| 1 | 1-258 |
Эти номера аминокислот относятся к последовательности, которая приведена у Welkos с соавт. Gene 69 (1988) 287-300, и представлены ниже, соответственно, в виде SEQ ID No 15 (Фиг.4) и 3 (Фиг.3).
Домен 1 содержит две области, обозначаемые 1а и 1b. Область 1а включает в себя аминокислоты 1-167, а область 1b состоит из аминокислот 168-258. По-видимому, область 1а существенна для получения хорошего защитного ответа, и данный полный домен может быть предпочтительным.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сочетание доменов 1 и 4 или их защитных областей используется в качестве иммуногенного реагента, который обусловливает возрастание иммунного защитного ответа на B.anthracis. Данное сочетание, например, в виде химерного (гибридного) пептида может быть экспрессировано с использованием экспрессирующей системы согласно изобретению, которая вкратце изложена ниже.
При использовании домена 1, он соответствующим образом сливается с доменом 2 последовательности РА, но, по-видимому, предпочтительно сливается с доменом 2 и доменом 3.
Такого рода сочетания и их использование для профилактики и терапии создает еще один аспект настоящего изобретения.
Соответственно вышеописанные домены являются частью слитого (химерного или гибридного) белка, предпочтительно с N-концевым глутатион-s-трансферазным белком (GST). Белок GST не только содействует очистке слитого белка, но может также создавать адъювантное (иммуностимулирующее) действие, вероятно, в результате увеличения его размера.
Полипептиды согласно изобретению получают соответствующими традиционными способами. Например, их можно синтезировать, или они могут быть получены с использованием техники рекомбинантных ДНК. В частности, нуклеиновые кислоты, которые кодируют указанные домены, включают в себя экспрессирующий вектор, который используют для трансформации хозяйской клетки. Затем традиционными способами можно осуществить культивирование данной хозяйской клетки с последующим выделением нужного полипептида. Нуклеиновые кислоты, векторы и трансформированные клетки, используемые в данных способах, создают дополнительный аспект настоящего изобретения.
Вообще используемые хозяйские клетки должны представлять собой такие клетки, которые традиционно используются для получения РА, например Bacillus subtilis.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что домены, по отдельности или в сочетании, при определенных условиях могут успешно экспрессироваться в E coli.
Итак, в настоящем изобретении разработан способ получения иммуногенного полипептида, который вызывает иммунный ответ, который является защитным против B.anthracis, причем указанный способ включает в себя трансформирование хозяйской E.coli с помощью нуклеиновой кислоты, которая кодирует либо (а) защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызвать защитный иммунный ответ, либо (b) полипептид, включающий в себя по меньшей мере один защитный домен данного защитного антигена (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызвать защитный иммунный ответ, что описано выше, культивирование трансформированного хозяина и извлечение из него данного полипептида, при условии, что в тех случаях, когда данный полипептид представляет собой защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, процентная доля гуанидиновых и цитозиновых остатков в указанной нуклеиновой кислоте превышает 35%.
С использованием этих вариантов и с применением подходящего экспрессирующего хозяина можно добиться высокого выхода продукта.
Таблица, представляющая кодоны и частоты, с которыми они появляются в геномах Escherichia coli и Bacillus anthracis, приведена на Фиг.1. Ясно, что гуанидин и цитозин встречаются чаще у E.coli, чем у B.anthracis. Анализ содержания используемого данного кодона обнаруживает следующее:
| Виды | 1-я буква кодона GC | 2-я буква кодона GC | 3-я буква кодона GC | Общее GC-содержание |
| E.coli | 58,50% | 40,70% | 54,90% | 51,37% |
| B.anthracis | 44,51% | 31,07% | 25,20% | 33,59% |
Таким образом, по-видимому, кодонами, предпочтительно встречающимися у E.coli, являются такие кодоны, которые включают в себя, по возможности, гуанидин или цитозин.
C увеличением процентной доли нуклеотидов гуанидина и цитозина в указанной последовательности, используемой для кодирования иммуногенного белка, сверх того, что обычно обнаруживается в гене B.anthracis дикого типа, использование данного кодона будет улучшать экспрессию в E.coli.
Соответственно, процентная доля гуанидиновых и цитозиновых остатков в кодирующей нуклеиновой кислоте, используемой в настоящем изобретении, по меньшей мере, в тех случаях, когда данный полипептид представляет собой защитный антиген (РА) Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, превышает 40%, предпочтительно превышает 45% и наиболее предпочтительно превышает 50-52%.
Высокие уровни экспрессии защитных доменов могут быть достигнуты при использовании последовательности из B.anthracis дикого типа, кодирующей эти структурные единицы. Однако показатели экспрессии можно дополнительно улучшить путем повышения содержания GC в данной нуклеиновой кислоте, что описано выше.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает в себя экспрессию РА B.anthracis.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением, создали рекомбинантную клетку Escherichia coli, которую трансформируют с помощью нуклеиновой кислоты, которая кодирует защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, отличающуюся тем, что процентная доля остатков гуанидина и цитозина в данной нуклеиновой кислоте превышает 35%.
Как и раньше, соответствующая процентная доля остатков гуанидина и цитозина в данной кодирующей нуклеиновой кислоте превышает 40%, предпочтительно превышает 45% и наиболее предпочтительно превышает 50-52%.
Соответственно, нуклеиновая кислота согласно изобретению, используемая для трансформации клеток E.coli, представляет собой синтетический ген. В частности, данная нуклеиновая кислота представляет собой SEQ ID No 1, которая приведена на Фиг.2, или ее модифицированную форму.
Экспрессируемая "модифицированная форма" относится к другим нуклеиновокислотным последовательностям, которые кодируют РА или его фрагменты или варианты, которые вызывают защитный иммунный ответ, но которые используют несколько иные кодоны, обеспечивая выполнение требования о процентном содержании GC в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующие модифицированные формы должны быть сходны по меньшей мере на 80%, предпочтительно сходны на 90% и наиболее предпочтительно сходны по меньшей мере на 95% с SEQ ID No 1. В частности, данная нуклеиновая кислота включает в себя SEQ ID No 1.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения, в настоящем изобретении создали рекомбинантную клетку Escherichia coli, которая была трансформирована нуклеиновой кислотой, которая кодирует защитный домен защитного антигена (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ.
Предпочтительно, данная нуклеиновая кислота кодирует домен 1 или домен 4 B. anthracis.
Далее, в соответствии с настоящим изобретением, разработали способ получения иммуногенного полипептида, который вызывает иммунный ответ, который является защитным от B.anthracis, причем указанный способ включает в себя культивирование клетки, что описано выше, и извлечение нужного полипептида из данной культуры. Такие способы хорошо известны в данной области техники.
В соответствии еще с одним аспектом, в настоящем изобретении создали вектор, трансформирующий E.coli, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует защитный антиген (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ, отличающийся тем, что процентная доля гуанидиновых и цитозиновых остатков в данной нуклеиновой кислоте превышает 35%.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору, трансформирующему E.coli и содержащему нуклеиновую кислоту, которая кодирует защитный домен защитного антигена (РА) из Bacillus anthracis или его вариант, который может вызывать защитный иммунный ответ.
Соответствующие векторы, используемые для трансформации E.coli, хорошо известны в данной области техники. Например, Т7-экспрессирующая система обеспечивает высокие уровни экспрессии. Но, особенно предпочтительный вектор содержит pAG163, получаемый у Avecia (UK).
Нуклеиновая кислота SEQ ID No 1, или ее вариант, которая кодирует РА и которая обладает по меньшей мере 35%-ным, предпочтительно по меньшей мере 40%-ным, более предпочтительно по меньшей мере 45%-ным и наиболее предпочтительно 50-52%-ным содержанием GC, создает дополнительный аспект настоящего изобретения.
По необходимости, указанные варианты РА или домены могут экспрессироваться в виде соединения с другим белком, например с белком, который обеспечивает иную иммунность, с белком, который содействует очистке данного продукта, или с высокоэкспрессируемым белком (например, тиоредоксин, GST), который гарантирует подходящую инициацию или трансляцию.
При необходимости к данной экспрессирующей системе следует добавить дополнительные системы, такие как Т7-лизоцим, который улучшает репрессию данной системы, хотя в случае настоящего изобретения трудности, связанные с клеточной токсичностью, не отмечены.
В способе согласно изобретению можно использовать любой подходящий штамм E.coli. Пригодны штаммы, которые характеризуются недостаточностью по ряду протеаз (например, IonЇ, ompTЇ) и в отношении которых предполагается, что они должны минимизировать протеолиз. Однако авторы изобретения обнаружили, что нет необходимости использовать такие штаммы для достижения хорошего выхода продукта и что другие штаммы, такие как К12, как ни странно, производят большие количества продукта.
Ферментация штамма осуществляется, как правило, в стандартных условиях, которые известны в данной области техники. Например, ферментацию можно осуществлять в виде периодических культур, предпочтительно в больших колбах для встряхивания, с использованием сложной среды, содержащей антибиотики для сохранения плазмиды и с добавлением IPTG для индукции.
После культивирования клетки собирают и хранят при -20°С до тех пор, пока не потребуется операция по выделению очисткой.
Соответствующие схемы выделения очисткой экспрессируемого E.coli РА (варианта либо домена) можно адаптировать для схем, используемых для B.subtilis. Отдельные используемые стадии выделения очисткой зависят от физических характеристик рекомбинантного РА. Обычно осуществляют разделение с помощью ионообменной хроматографии в условиях, которые позволяют наибольшее дифференциальное связывание с данной колонкой и последующим сбором фракций с небольшим градиентом. В некоторых случаях для получения продукта с нужной технической характеристикой достаточной может оказаться единственная хроматографическая стадия.
При необходимости фракции можно анализировать на наличие данного продукта с использованием SDS PAGE или Вестерн-блоттинга.
Ниже иллюстрируется осуществление успешного клонирования и экспрессии панели химерных белков, представляющих собой интактные или неполные домены rPA. Иммуногенность и защитную эффективность этих химерных белков от заражения STI-спорами оценивают на модели A/J-мышей.
Все доменовые белки rPA оказываются иммуногенными для A/J-мышей и обеспечивают по меньшей мере частичную защиту при заражении по сравнению с контрольными GST-иммунизированными мышами. Белок-переносчик, GST присоединяется к N-концу доменных белков, не ослабляя иммуногенность слитых белков ни в условиях in vivo, что показано на антительном ответе, стимулированном у иммунизированных животных, ни в условиях in vitro в виде слитых белков, которые можно детектировать с помощью антисыворотки к rPA после Вестерн-блоттинга, что свидетельствует о том, что GST-метка не препятствует распознаванию rPA-эпитопа. Иммунизация крупными химерными белками дает наивысшие титры. В частности, мыши, иммунизированные полноразмерным химерным белком GST 1-4, в среднем продуцируют антисыворотку rPA с восьмикратной концентрацией по сравнению с группой, иммунизированной rPA (Фиг.5). Иммунизация мышей доменами 1-4 rPA с отщепленным GST дает приблизительно половину титра, продуцируемого при иммунизации указанным химерным белком. Отчего данный слитый белок должен быть гораздо более иммуногенным, остается невыясненным. Возможно, увеличенный размер данного белка может оказывать повышенное иммуногенное действие на иммунные эффекторные клетки. Но это не стимулирует такой ответ в такой же степени в других химерных белках, к тому же любое усиливающее иммуногенность действие GST-метки не повышает защиту от заражения, поскольку отщепляемые белки аналогичным образом защищены их химерными аналогами.
Несмотря на наличие высоких титров анти-rPA, в группах животных, иммунизированных с помощью GST1, отщепленного 1, GST1b-2, GST1b-3 и GST1-3, при сниженном уровне заражения 102 MLD, имеет место некоторый сбой в защите, и иммунизация этими белками не пролонгирует время выживания тех мышей, которые не выдержали заражения, в отличие от контрольных мышей, иммунизированных GST. Это дает основание полагать, что этот иммунный ответ не был соответствующим образом индуцирован этими белками для достижения полной резистентности к данному заражению. Как было показано в других исследованиях на мышах и морских свинках (Little S.F. и соавт. 1986. Infect. Immun. 52:356-363), не существует точной корреляции между титром антител против РА и защитой от заражения. Тем не менее, для защиты требуется некоторая пороговая величина антител (Cohen S. и соавт., 2000 Infect. Immun. 68:4549-4558), и это заставляет полагать, что клеточно-опосредованные компоненты иммунного ответа также нужны для стимулирования защиты (Williamson, 1989).
Как свидетельствуют результаты SDS-Page и Вестерн-блоттинга, полученные химерные белки GST1, GST1b-2 и GST1-2 оказались наименее стабильными, что, вероятно, связано с тем, что данные белки, в отсутствие домена 3, более подвержены деградации, и эта нестабильность, возможно, привела к утрате защитных эпитопов.
Определенная структурная конформация данных белков также, по-видимому, существенна для стимуляции защитного иммунного ответа. Удаление из данных химерных белков домена 1а приводит и к снижению титра антител и к ослаблению защиты при заражении по сравнению с их интактными аналогами GST1-2 и GST1-3. Аналогично этому мыши, иммунизированные с помощью одного лишь GST 1, были лишь частично защищены от заражения, но при объединении с доменом 2, в виде химерного белка GST1-2, отмечена полная защита при уровне заражения 102 MLD. Однако иммунный ответ, индуцированный в результате иммунизации с помощью химерного белка GST1-2, был недостаточным для создания полной защиты при более высоком уровне заражения в 103 MLD, что опять-таки могло быть связано с утратой защитных эпитопов в результате деградации данного белка.
Все группы животных, иммунизированных укороченными белками, содержащими домен 4, в том числе отдельно взятым GST 4, отдельно взятым отщепленным доменом 4, а также смесью из двух индивидуально экспрессируемых доменов, GST 1 и GST 4, были полностью защищены от заражения STI-спорами при 103 MLD (Таблица 1). Brossier с соавт. продемонстрировали снижение защиты у мышей, иммунизированных мутантным штаммом B. anthracis, который экспрессирует РА без домена 4 (Brossier F. и соавт. 2000. Infect. Immun. 68: 1781-1786), и это было подтверждено в данном исследовании, где иммунизация с помощью GST1-3 приводила к сбою в защите несмотря на высокие титры антител. Эти данные свидетельствуют, что домен 4 представляет собой иммунодоминантную субъединицу РА. Домен 4 представлен 139 аминокислотами на карбокси-конце полипептида РА. Он содержит рецепторный участок связывания хозяйской клетки (Little S.F. и соавт., 1996 Microbiology 142:707-715), идентифицированный как находящийся внутри и вблизи малой петли, расположенный между аминокислотными остатками 679-693 (Varughese M. и соавт. 1999 Infect. Immun. 67:1860-1865).
По этой причине интоксикация для хозяйской клетки является существенной, хотя было показано, что экспрессируемые формы РА, содержащие мутации (Varughese 1999, выше) или делеции (Brossier 1999, выше) на участке домена 4, не являются токсичными. Кристаллическая структура РА, представляющая собой домен 4 и, в частности, петлю этого домена, состоящая из 19 аминокислот (703-722), в большей степени не защищена, чем остальные три домена, которые плотно ассоциированы друг с другом (Petrosa 1997, выше). Данная структурная компоновка может превращать домен 4 в очень рельефный эпитоп для распознавания иммунными эффекторными клетками, и поэтому химерные белки, содержащие домен 4, должны вызывать наибольший иммунный ответ.
Кроме того, в настоящем исследовании проливается свет на роль РА в стимуляции защитного иммунного ответа, демонстрирующего, что защита от инфицирования сибирской язвой может быть отнесена на счет отдельных доменов РА.
Далее настоящее изобретение описывается подробно в примерах, со ссылками на прилагаемые чертежи.
На Фиг.1 представлены частоты кодонов, найденные у E.coli и B.anthracis;
на Фиг.2, в соответствии с настоящим изобретением, приведена последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует РА B.anthracis, как опубликовано у Welkos с соавт. выше;
на Фиг.3 приведены SEQ ID No 3-14, которые представляют собой последовательности аминокислот и ДНК, используемые для кодирования разных доменов или сочетаний доменов из РА, что детализировано ниже;
на Фиг.4 приведены SEQ ID No 15-16, которые представляют собой соответственно последовательности аминокислот и ДНК домена 4 РА;
Фиг.5 представляет собой таблицу, в которой показана концентрация IgG против rPA у A/J-мышей, иммунизированных внутримышечно в 1-й и 28-й дни 10 мкг химерного белка, содержащего РА-фрагмент, через 37 дней после первой иммунизации; представленные результаты соответствуют среднему значению ± стандартная ошибка (sem) в образцах, взятых у 5 мышей подопытной группы.
Пример 1
Исследование экспрессии у E. coli
Плазмиду pAG163::rPA, экспрессирующую rPA, модифицируют, заменяя KmR-маркер исходным TcR-геном. Эту плазмиду трансформируют в экспрессирующую клетку-хозяина E.coli BLR (DE3), а затем оценивают уровень экспрессии и растворимость. Данный штамм является дефицитным по внутриклеточной протеазе La (продукт гена Ion) и по протеазе наружной мембраны Ompt.
Однако проведенные исследования по экспрессии не показали какого-либо улучшения в накоплении растворимого белка у данного штамма в сравнении с хозяйскими штаммами K12 Ion+ (т.е. накопление компенсируется избыточным протеолизом). Сделан вывод о том, что никакой внутриклеточный протеолиз rPA не обусловлен действием La-протеазы.
Пример 2
Анализ ферментации
Осуществляли дополнительный анализ ферментации, который выполняли с использованием штамма K12 UT5600 (DE3) pAG163::rPA.
Установлено, что rPA в данной культуре распределяется между растворимой и нерастворимой фракциями (предположительно 350 мг/л для нерастворимого rPA, 650 мг/л для полноразмерного растворимого rPA). В используемых условиях (37°С, 1 мМ IPTG для индукции) растворимый rPA во встряхиваемых культурах в колбах обнаружению не поддается, но, с учетом результатов, описанных выше в Примере 1, вызывает удивление наличие большого количества растворимого rPA. Как бы то ни было, представляется, что регулирование ферментации, запуска и момента сбора клеток, выращенных в культуре, позволяет стабильно накапливать rPA в экспрессирующих штаммах K12 E.coli.
Пример 3
Образец rPA получают из материала, первоначально выделенного в виде нерастворимых внутриклеточных включений (внутриклеточные тельца) из ферментируемого штамма UT5600 (DE3) pAG163::rPA. Внутриклеточные включения дважды промывают с помощью 25 мМ трис-HCl рН 8,0 и один раз - с помощью этого же буфера + 2М мочевина. Затем их солюбилизируют в буфере с +8М мочевиной и дебрис осаждают. Мочевину удаляют путем разведения в 25 мМ трис-HCl рН 8,0 и статически инкубируют в течение ночи при 4°С. Разбавленный образец наносят на колонку с Q-сефарозой и белок элюируют NaCl-градиентом. Фракции, содержащие наиболее чистый rPA, объединяют, отбирают аликвоты и замораживают при -70°С. Тестирование данного образца с использованием 4-12% MES-SDS NuPAGE геля против известного стандарта свидетельствует о его высокой чистоте и низкой контаминации эндотоксином.
Пример 4
Дополнительная характеристика полученного продукта
N-концевое секвенирование полученного продукта показывает, что N-концевая последовательность состоит из MEVKQENRLL (SEQ ID NO 2).
Это подтверждает, что данный продукт, как и предполагалось, находится слева по отношению к инициаторному метионину.
Обнаружили, что полученный материал реагирует в Вестерн-блоте; по данным MALDI -MS, данный образец обладает массой приблизительно 82700 (по сравнению с предполагаемой массой 82915). Разницу между большой молекулярной массой полученного материала и массой используемого стандарта (66 кДа) рассматривают как указание на то, что материал существенно не укорочен, но и не исключает микрогетерогенности анализируемого образца.
Пример 5
Тестирование отдельных доменов РА
Индивидуальные домены РА получают в виде рекомбинантных белков в E.coli в виде химерных белков с белком-носителем глутатион-s-трансферазой (GST) и с использованием экспрессирующей системы Pharmacia pGEX-6P-3. Последовательности разных доменов и ДНК-последовательность, используемая для их кодирования, прилагаются в виде Фиг.3. Соответствующие аминокислотные и ДНК-последовательности даны ниже в Таблице 2.
Данные химерные белки используются для иммунизации A/J-мышей (Harlan Olac) путем внутримышечного введения 10 мкг соответствующего химерного белка, адсорбированного на 20% об/об алгидрогеле в общем объеме 100 мкл.
Животных дважды иммунизируют случайным образом, и развитие их защитного иммунитета определяется путем заражения спорами B. anthracis (STI-штамм) на уровне индикаторных доз. В нижеследующей таблице приведены данные о животных, оставшихся в живых к 14 дню после заражения.
| Таблица 2 | |||||||
| Степень заражения спорами/мышь | |||||||
| Домены | Аминокислотная SEQ ID No | ДНК SEQ ID No | 5х10 4 | 9х10 4 | 9х10 5 | 1х10 6 | 5х10 6 |
| GST-1 | 3 | 4 | 4/4 | 3/5 | |||
| Домены | Аминокислотная SEQ ID No | ДНК SEQ ID No | 5х10 4 | 9х10 4 | 9х10 5 | 1х10 6 | 5х10 6 |
| GST-1+2 | 5 | 6 | 4/4 5/5 |
4/5 5/5 |
|||
| GST-1b+2 | 7 | 8 | 2/5 | 1/5 | |||
| GST-1b+2+3 | 9 | 10 | 2/5 | 3/5 | |||
| GST-1+2+3 | 11 | 12 | Nd | 4/5 | 3/5 | ||
| GST-1+2+3+4 | 13 | 14 | Nd | 5/5 | 5/5 | ||
| 1+2+3+4 | 13 | 14 | Nd | Nd | 5/5 | 5/5 | |
Представленные данные свидетельствуют о том, что сочетание всех 4 доменов РА, представленное ли в виде химерного белка с GST или без нее, оказывает защитное действие и при самом высоком уровне заражения. Удаление домена 4, когда остаются 1+2+3, приводит к сбою защиты при наивысшем протестированном уровне заражения, 9х105. Домены 1+2 оказываются защитными в сочетании доменов 1+2+3 при уровне заражения 9х104 спор. Однако удаление домена 1а, когда остается слияние GST с доменами 1b+2, приводит к нарушению защиты при наивысших протестированных уровнях заражения (9х104), которая несколько улучшается при добавлении домена 3.
Полученные данные свидетельствуют о том, что защитный иммунитет, стимулированный РА, может быть связан с отдельными доменами (интактным доменом 1 и доменом 4) или с сочетаниями всех 4-х доменов, взятыми в измененном порядке.
Аминокислотная последовательность и ДНК-последовательность домена 4 представлены на Фиг.4 соответственно в виде SEQ ID No 15 и 16.
Пример 6
Дополнительное тестирование доменов в качестве вакцин
ДНК из B.anthracis Sterne, кодирующую домены РА, аминокислоты 1-259, 168-488, 1-488, 168-596, 1-596, 260-735, 489-735, 597-735 и 1-735 (соответственно укороченные GST1, GST1b-2, GST1-2, GST1b-3, GST1-3, GST2-4, GST3-4, GST4 и GST1-4), амплифицируют с помощью PCR и клонируют в XhoI/BamHI-сайты экспрессирующего вектора pGEX-6-P3 (Amersham-Pharmacia) правее от точки старта транскрипции и под lac-промотором. Белки, продуцируемые с использованием данной системы, экспрессируются в виде химерных (гибридных) белков с белком глутатион-s-трансфераза (GST) на N-конце. Затем рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую вышеуказанную ДНК, кодирующую домены РА, трансформируют в E.coli BL21 для анализа экспрессируемого белка.
E.coli BL21, заякоренную плазмидами pGEX-6-P3, культивируют в L-среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, 30 мкг/мл хлорамфеникола и 1% вес/объем глюкозы. Перед индуцированием с помощью 0,5 мМ IPTG культуры инкубируют в режиме встряхивания (170 об/мин-1) при 30°С и А600нм 0.4. Далее культуры инкубируют в течение 4 ч, с последующим сбором клеток путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 15 мин.
В результате начального экстрагирования укороченных химерных белков РА обнаружено, что они были получены в виде внутриклеточных телец. Осажденные клетки ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (PBS) и обрабатывают ультразвуком в течение 4х20 с на водяной бане с кусочками льда. Обработанную ультразвуком суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин и затем осадок клеток экстрагируют мочевиной путем их суспендирования в 8М мочевине и перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч. Эту суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 15000 об/мин и полученный супернатант диализуют против 100 мл Трис, рН 8,0, содержащим 400 мМ L-аргинина и 0,1 мМ ЭДТА перед диализом в PBS.
Успешная повторная упаковка укороченных химерных белков РА позволяет осуществить их выделение путем очистки на колонке по сродству с глутатионовой сефарозой CL-4B. Все экстракты (за исключением укороченного GST1b-2, аминокислотные остатки 168-487) наносят на 15 мл колонку с глутатионовой CL-4B сефарозой (Amersham-Parmacia), предварительно уравновешенную PBS и инкубированную с покачиванием в течение ночи при 4°С. Эту колонку промывают с помощью PBS и химерный белок элюируют 50 мМ Трис, рН 7,0, содержащим 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ восстановленного глутатиона. Фракции, содержащие укороченные РА, идентифицируют путем анализа в SDS-PAGE, объединяют и диализуют против PBS. Концентрацию белка определяют с использованием ВСА (Perbio).
Однако укороченный GST1b-2 невозможно элюировать с колонки по сродству с глутатионсефарозой CL-4B при использовании восстановленного глутатиона, и поэтому его выделяют путем очистки с использованием ионообменной хроматографии. В данном случае укороченный GST1b-2 перед загрузкой в колонку HiTrap Q (Amersham-Parmacia), уравновешенную 20 мМ Трис рН 8,0, диализуют против этого же буфера. Химерный белок элюируют возрастающим градиентом NaCl 0-1 М в 20 мМ Трис, рН 8,0. Фракции, содержащие указанный GST-белок, объединяют, концентрируют и загружают в гель-фильтрационную колонку HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham-Parmacia), предварительно уравновешенную PBS. Фракции, содержащие химерный белок, объединяют и концентрацию данного белка определяют с помощью ВСА (Perbio). Выход колеблется между 1 и 43 мг на литр культуры.
Молекулярные массы фрагментов и их распознавание антителами против РА подтверждают с использованием SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Анализ укороченных rPA с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга обнаруживает белковые полосы ожидаемого размера. Некоторая деградация всех исследованных укороченных rPA обнаруживает их явное сходство с рекомбинантным РА, экспрессируемым B.subtilis. Укороченные rPA GST1, GST1b-2 и GST1-2, в отсутствие домена 3, оказываются особенно чувствительными к деградации. Это аналогично тому, о чем сообщалось в отношении конструкций rPA, содержащих мутации в домене 3, которые невозможно выделить путем очистки из культуральных супернатантов B.anthracis (Brossier 1999), что свидетельствует о том, что домен 3, вероятно, стабилизирует домены 1 и 2.
В данном исследовании используют самок совершенно здоровых A/J-мышей (Harlan UK), поскольку они являются подходящей моделью для заражения сибирской язвой (Welkos, 1986). К началу данного исследования мыши были половозрелыми в возрасте семи недель.
A/J-мышей иммунизируют в 1-й и 28-й дни данного исследования 10 мкг химерного белка, адсорбированного до 20% 1,3% об/об Alhydrogel (HCI Biosector, Denmark) в общем объеме 100 мкл PBS. Были также включены группы животных, иммунизированных rPA из B.subtilis (Miller 1998) вместе с рекомбинантным контрольным белком GST или химерными белками, кодирующими домены 1, 4 и 1-4, которые содержат удаляемую GST-метку. Иммунизирующие дозы вводят внутримышечно в участки на задних лапках. У мышей берут образцы крови через 37 дней после первой иммунизации на анализ сывороточных антител с помощью фермент-зависимого иммуносорбентного анализа (ELISA).
Планшеты для микротитрования (Immulon 2, Dynex Technologies) покрывают в течение ночи при 4°С 5 мкг/мл rPA, экспрессируемого B.subtilis (Miller, 1998), в PBS, за исключением двух рядов на планшете, которые покрывают 5 мкг/мл мышиных антител против Fab (Sigma, Poole, Dorset). Планшеты промывают PBS, содержащим 1% об/об Твина 20 (PBS-T), и блокируют 5% вес/об обезжиренным порошковым молоком в PBS (реагент для анализа вестерн-блоттингом) в течение 2 ч при 37°С. В лунки, покрытые rPA, приливают сыворотку, разбавленную в два раза 1%-ным реагентом для анализа вестерн-блоттингом, и анализируют в повторе со стандартным мышиным IgG (Sigma), добавляемым к анти-Fab- антителам, покрывающим лунки, и инкубируют в течение ночи при 4°С. После промывки во все лунки добавляют пероксидазу хрена, конъюгированную с антителами козы против IgG мыши (Southern Biotechnology Associates Inc.), разбавленными 1:2000 в PBS, и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Планшеты вновь промывают перед добавлением субстрата 2,2'-Azinobis (3-этилбензтиазолинсульфоновая кислота) (1,09 мМ ABTS, Sigma). Через 20 мин инкубации при комнатной температуре измеряют поглощение в лунках при 414 нм (Titertek Multiscan, ICN Flow). Стандартные кривые рассчитывают с использованием программного обеспечения Titersoft version 3.1c. Титры были представлены в виде мкг IgG на мл сыворотки с вычислением групповых средних ± стандартная ошибка для данной средней (sem). Полученные результаты представлены на Фиг.5.
Все полученные укороченные rPA оказались иммуногенными и повышали у A/J-мышей средние значения концентраций IgG антисыворотки к rPA в диапазоне от 6 мкг на мл в группе, иммунизированной укороченным GST1b-2, до 1488 мкг на мл в группе, иммунизированной укороченным GST 1-4 (Фиг.5). У контрольных мышей, иммунизированных GST, антитела против rPA не обнаруживались.
Мышей заражали спорами B. anthracis STI на 70-й день режима иммунизации. Из штамма выделяли достаточное количество STI-спор, промывали дистиллированной водой и ресуспендировали в PBS до концентрации 1х107 и 1х106 спор на мл. Мышей заражали внутрибрюшинно 0,1 мл объемами, соответственно содержащими 1х106 и 1х105 спор на мышь, и контролировали их в течение 14 дней после заражения для установления их защитного статуса. Гуманное отношение к животным строго соблюдалось в том отношении, что выбраковывались те животные, у которых наблюдались клинические симптомы, сочетание которых указывает на наличие у него смертельной инфекции. Численность иммунизированных мышей, которые выживали к 14-му дню после заражения, приведена в Таблице 3.
| Таблица 3 | ||
| Домен | Уровни заражения MLD выжившие/количество зараженных (%) | |
| 102 MLD | 103 MLD | |
| GST 1 | 3/5 (60) | 1/5 (20) |
| GST 1b-2 | 1/5 (20) | Nd |
| GST 1-2 | 5/5 (100) | 3/5 (60) |
| GST 1b-3 | 3/5 (60) | Nd |
| GST 1-3 | 4/5 (80) | Nd |
| GST 1-4 | Nd | 5/5 (100) |
| GST 2-4 | Nd | 5/5 (100) |
| GST 3-4 | Nd | 5/5 (100) |
| GST 4 | 5/5 (100) | 5/5 (100) |
| GST 1+ GST 4 | Nd | 5/5 (100) |
| Отщепляемый 1 | 1/5 (20) | 2/5 |
| Отщепляемый 4 | 5/5 (100) | 5/5 |
| Отщепляемый 1-4 | Nd | 5/5 |
| rPA | Nd | 4/4 (100) |
| контроль | 0/5 (0) | 0/5 (0) |
| MLD = приблизительно 1х103 STI-спор Nd = не определялось |
||
Все группы, зараженные 103 MLD STI-спор, были полностью защищены, за исключением групп, иммунизированных GST1, GST1-2 и отщепленным доменом 1, где отмечен некоторый сбой в защите, и в контрольной группе, иммунизированной лишь GST, в которой все оказались восприимчивы к инфекции, со средним временем гибели (MTTD) 2,4±0,2 дня. При самом низком уровне заражения 102 MLD GST1-2, GST4 и отщепленным доменом 4 все иммунизированные группы были полностью защищены, но в других группах отмечен некоторый сбой в защите. Мыши, которые погибли в этих группах, характеризовались MTTD 4,5±0,2 дня, что несущественно отличается от контрольной группы, иммунизированной GST, в которой все погибли с показателем MTTD 4±0,4 дня.
Claims (13)
1. Способ получения иммуногенного полипептида, являющегося защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его варианта, которые способны вызвать защитный иммунный ответ, включающий трансформирование Escherichia coli, кодирующей указанный полипептид нуклеиновой кислотой, у которой процентная доля остатков гуанидина и цитозина более 35%, культивирование трансформированной клетки Escherichia colt-хозяина и извлечение из нее иммуногенного полипептида.
2. Способ по п.1, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет более 45%.
3. Способ по п.2, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет от 50-52%.
4. Рекомбинантная клетка Escherichia coli, трансформированная нуклеиновой кислотой с процентной долей остатков гуанидина и цитозина более 35%, кодирующей защитный антиген (PA) Bacillus anthracis или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ, и экспрессирующей иммуногенный полипептид, являющийся защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ.
5. Рекомбинантная клетка Escherichia coli по п.4, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет более 45%.
6. Рекомбинантная клетка Escherichia coli no п.5, где процентная доля остатков гуанидина и цитозина в указанной нуклеиновой кислоте составляет от 50-52%.
7. Рекомбинантная клетка Escherichia coli по п.6, где указанная нуклеиновая кислота представляет собой SEQ ID NO 1, которая приведена на Фиг.2, или ее модифицированную форму.
8. Рекомбинантная клетка Escherichia coli по п.7, где указанная нуклеиновая кислота представляет собой последовательность SEQ ID NO 1.
9. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту с процентной долей остатков гуанидина и цитозина более 35%, кодирующую защитный антиген (РА) Bacillus anthracis, или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ, для трансформации клетки Escherichia coli для экспрессии иммуногенного полипептида, являющегося защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его варианта, способных вызывать защитный иммунный ответ.
10. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный полипептид, являющийся защитным антигеном (PA) Bacillus anthracis, или его вариант, способные вызывать защитный иммунный ответ, имеющая или содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO 1, или по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO 1 при условии, что процентная доля остатков гуанидина и цитозина составляет 35%.
11. Нуклеиновая кислота по п.10, которая представляет собой последовательность SEQ ID NO 1.
12. Нуклеиновая кислота по п.10, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO 1.
13. Нуклеиновая кислота по п.12, которая содержит последовательность SEQ ID NO 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0016702.3A GB0016702D0 (en) | 2000-07-08 | 2000-07-08 | Expression system |
| GB0016702.3 | 2000-07-08 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003103779/13A Division RU2270865C2 (ru) | 2000-07-08 | 2001-07-06 | Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной bacillus anthracis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004134341A RU2004134341A (ru) | 2006-05-10 |
| RU2385348C2 true RU2385348C2 (ru) | 2010-03-27 |
Family
ID=9895205
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003103779/13A RU2270865C2 (ru) | 2000-07-08 | 2001-07-06 | Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной bacillus anthracis |
| RU2004134341/13A RU2385348C2 (ru) | 2000-07-08 | 2001-07-06 | Экспрессирующая система |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003103779/13A RU2270865C2 (ru) | 2000-07-08 | 2001-07-06 | Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной bacillus anthracis |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7537771B2 (ru) |
| EP (2) | EP1301606A1 (ru) |
| JP (2) | JP2004502460A (ru) |
| CN (2) | CN101012458A (ru) |
| AU (1) | AU2007201553B8 (ru) |
| CA (2) | CA2658217A1 (ru) |
| GB (1) | GB0016702D0 (ru) |
| RU (2) | RU2270865C2 (ru) |
| WO (1) | WO2002004646A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200210206B (ru) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0016702D0 (en) | 2000-07-08 | 2000-08-23 | Secr Defence Brit | Expression system |
| US7601351B1 (en) | 2002-06-26 | 2009-10-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies against protective antigen |
| AU2003278776A1 (en) * | 2002-09-10 | 2004-04-30 | Vical Incorporated | Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against bacillus anthracis infection |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| EP1572977B1 (en) | 2002-11-15 | 2010-03-03 | Gen-Probe Incorporated | Assay and compositions for detection of bacillus anthracis nucleic acid |
| EP1670505B1 (en) | 2003-09-18 | 2012-11-14 | GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Dna promoters and anthrax vaccines |
| FR2860005A1 (fr) * | 2003-09-23 | 2005-03-25 | Univ Aix Marseille Ii | Methode de detection d'agents bacteriens ou viraux de bioterrorisme |
| WO2005030991A1 (fr) * | 2003-09-23 | 2005-04-07 | Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii) | Methode de detection d’agents bacteriens ou viraux de bioterrorisme |
| GB0401036D0 (en) * | 2004-01-17 | 2004-02-18 | Royal Holloway University Of L | Improvements in or relating to vaccination |
| US8101735B2 (en) | 2004-06-16 | 2012-01-24 | Health Protection Agency | Preparation of protective antigen |
| US7355027B2 (en) * | 2004-06-16 | 2008-04-08 | Dynport Vaccine Company Llc | Bacillus anthracis protective antigen |
| AU2005269527B2 (en) | 2004-07-26 | 2011-12-01 | Pfenex Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
| CN100336908C (zh) * | 2004-09-10 | 2007-09-12 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种制备重组炭疽保护性抗原的方法及其专用表达质粒 |
| WO2006068647A1 (en) * | 2004-12-20 | 2006-06-29 | United States Army Medical Research And Materiel Command | Internal positive control for probe-based nucleic acid molecule assays and methods of making and using thereof |
| GB0504940D0 (en) * | 2005-03-10 | 2005-04-20 | Secr Defence | Vaccine formulation |
| EP1954307A4 (en) | 2005-11-14 | 2009-12-02 | Univ Maryland Biotech Inst | ORAL VACCINES AGAINST MILZBRAND ON SALMONELLA BASE |
| GB0525213D0 (en) * | 2005-12-12 | 2006-01-18 | Secr Defence | Vaccine |
| CA2634163A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Iq Corporation | Compositions and methods of modulating the immune response |
| GB0607462D0 (en) * | 2006-04-13 | 2006-05-24 | Avecia Ltd | Assay |
| JP2008231063A (ja) * | 2007-03-22 | 2008-10-02 | Takano Foods Kk | 納豆菌ワクチン |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| CA2685326A1 (en) | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Dow Global Technologies Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| US9616117B2 (en) | 2008-10-02 | 2017-04-11 | Pharmathene, Inc. | Anthrax vaccine formulation and uses thereof |
| US20110256172A1 (en) * | 2008-10-14 | 2011-10-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Epitope-targeted anthrax vaccine |
| US20100183675A1 (en) * | 2009-01-22 | 2010-07-22 | Allan Watkinson | Stable vaccine compositions and methods of use |
| US8187611B2 (en) * | 2009-10-29 | 2012-05-29 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Anti-peptide antibodies that cross react with protective antigen of Bacillus anthracis and uses thereof |
| US20110110968A1 (en) * | 2009-11-12 | 2011-05-12 | Stanley Goldman | Human optimized Bacillus anthracis protective antigen |
| CN101798565B (zh) * | 2010-02-26 | 2013-08-07 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 能在芽孢表面展示pa20蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用 |
| RU2633504C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2017-10-12 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм E.coli - продуцент полноразмерного протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц |
| RU2633508C1 (ru) * | 2016-12-27 | 2017-10-12 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Штамм E. coli - продуцент изолированного домена 1 протективного антигена Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц |
| WO2020116686A1 (ko) * | 2018-12-06 | 2020-06-11 | 고려대학교 산학협력단 | 인간 항-antxr 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5677274A (en) * | 1993-02-12 | 1997-10-14 | The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Anthrax toxin fusion proteins and related methods |
| DE69941454D1 (de) | 1998-07-10 | 2009-11-05 | U S Medical Res Inst Of Infect | Impfstoff gegen staphylokokken-vergiftung |
| GB0016702D0 (en) | 2000-07-08 | 2000-08-23 | Secr Defence Brit | Expression system |
-
2000
- 2000-07-08 GB GBGB0016702.3A patent/GB0016702D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-07-06 EP EP01947659A patent/EP1301606A1/en not_active Withdrawn
- 2001-07-06 RU RU2003103779/13A patent/RU2270865C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-07-06 CN CNA2006101290967A patent/CN101012458A/zh active Pending
- 2001-07-06 CA CA002658217A patent/CA2658217A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-06 WO PCT/GB2001/003065 patent/WO2002004646A1/en active IP Right Grant
- 2001-07-06 JP JP2002509500A patent/JP2004502460A/ja active Pending
- 2001-07-06 CA CA2413045A patent/CA2413045C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-06 EP EP07005671.8A patent/EP1808489B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-06 CN CNB018124097A patent/CN1322134C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-06 US US10/332,282 patent/US7537771B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-06 RU RU2004134341/13A patent/RU2385348C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-17 ZA ZA200210206A patent/ZA200210206B/xx unknown
-
2007
- 2007-03-26 US US11/728,384 patent/US8313928B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-04-05 AU AU2007201553A patent/AU2007201553B8/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-08-22 JP JP2011180293A patent/JP2012010706A/ja active Pending
-
2012
- 2012-09-26 US US13/627,071 patent/US9346860B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB0016702D0 (en) | 2000-08-23 |
| EP1808489A1 (en) | 2007-07-18 |
| US7537771B2 (en) | 2009-05-26 |
| JP2004502460A (ja) | 2004-01-29 |
| RU2270865C2 (ru) | 2006-02-27 |
| US20100266639A1 (en) | 2010-10-21 |
| US9346860B2 (en) | 2016-05-24 |
| AU2007201553B8 (en) | 2010-06-03 |
| RU2004134341A (ru) | 2006-05-10 |
| EP1808489B1 (en) | 2016-03-23 |
| US20130164823A1 (en) | 2013-06-27 |
| CN1322134C (zh) | 2007-06-20 |
| EP1301606A1 (en) | 2003-04-16 |
| US8313928B2 (en) | 2012-11-20 |
| JP2012010706A (ja) | 2012-01-19 |
| AU2007201553B2 (en) | 2010-04-22 |
| WO2002004646A1 (en) | 2002-01-17 |
| AU6930501A (en) | 2002-01-21 |
| CA2413045C (en) | 2016-06-21 |
| CN101012458A (zh) | 2007-08-08 |
| CA2413045A1 (en) | 2002-01-17 |
| CA2658217A1 (en) | 2002-01-17 |
| ZA200210206B (en) | 2004-03-17 |
| US20030170263A1 (en) | 2003-09-11 |
| AU2007201553A1 (en) | 2007-05-03 |
| CN1440459A (zh) | 2003-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2385348C2 (ru) | Экспрессирующая система | |
| JP2981286B2 (ja) | 破傷風トキシンフラグメントｃの発現 | |
| NO318018B1 (no) | Vaksinebehandling | |
| US8287880B2 (en) | Lipidated vaccine against dengue virus infection | |
| EP1724342B1 (en) | Process for preparing variant of erysipelothrix rhusiopathiae surface protective antigen in e. coli | |
| US6730306B1 (en) | Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions | |
| KR100338894B1 (ko) | 백신조성물 | |
| Hijnen et al. | The Bordetella pertussis virulence factor P. 69 pertactin retains its immunological properties after overproduction in Escherichia coli | |
| JP3072345B1 (ja) | 豚丹毒菌の組換えサブユニットワクチン | |
| US5788962A (en) | DNA sequences coding for mycoplasma hyopneumoniae surface antigens, corresponding proteins and use in vaccines and diagnostic procedures | |
| US6610300B1 (en) | Clostridium perfringens vaccine | |
| EP1931379B1 (en) | Proteins with improved solubility and methods for producing and using same | |
| Guillén et al. | Expression in Escherichia coli of the lpdA gene, protein sequence analysis and immunological characterization of the P64k protein from Neisseria meningitidis | |
| KR20110114600A (ko) | 재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법 | |
| US6287566B1 (en) | Protective peptides neurotoxin of C. botulinum | |
| EP1090994B1 (en) | Peptide repeat immunogens | |
| CN110041437B (zh) | 一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白 | |
| AU2001269305B2 (en) | Expression system | |
| KR102280493B1 (ko) | GnRH가 삽입된 STF2 재조합 단백질 및 이의 용도 | |
| EP1942188B1 (en) | Recombinant viral proteins and particles | |
| AU2001269305A1 (en) | Expression system | |
| KR0178110B1 (ko) | 대장균에서 발현된 인간유래 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 백신 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200707 |