RU2377300C2

RU2377300C2 - Glycolipid acyltransferase versions, synthesis method thereof and use

Info

Publication number: RU2377300C2
Application number: RU2006126715/13A
Authority: RU
Inventors: Аня Хеммингсен КЕЛЛЕТ-СМИТ (DK); Аня Хеммингсен КЕЛЛЕТ-СМИТ; Рикке Хеэг ЛОРЕНТСЕН (DK); Рикке Хеэг ЛОРЕНТСЕН; Йерн Борк СЕЭ (DK); Йерн Борк Сеэ; Йерн Дальгор МИККЕЛЬСОН (DK); Йерн Дальгор МИККЕЛЬСОН; Арно Де КРЭИЙ (NL); Арно Де КРЭИЙ
Original assignee: Даниско А/С
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2009-12-27
Also published as: RU2006126715A; CN101676390A; DE602004026229D1; ZA200605158B; GB0415999D0; CN103275944B; ATE462011T1; JP2010142243A; NZ547085A; CN103275944A; DK1704236T3; RU2377307C2; GB0330016D0; RU2006126654A; HK1106953A1; GB0416023D0

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to a method of producing a version of glycolipid acyltransferase enzyme, which involves: (a) selection of an initial enzyme which is glycolipid acyltransferase, where the enzyme contains amino acid motif GDSX, where X is one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S; (b) modification of one or more amino acids to obtain a glycolipid acyltransferase version; (c) testing the glycolipid acyltransferase version on transferase activity, and optionally hydrolytic activity with respect to a galactolipid substrate and, optionally, a phospholipid substrate and/or, optionally, triglyceride substrate; (d) selection of the version of the enzyme with high activity with respect to galactolipids compared to the initial enzyme; and, optionally, (e) obtaining a large amount of the version of the enzyme. The invention also relates to versions of the lipidacyltransferase enzyme, where the enzyme contains amino acid motif GDSX, where X is one or more of the following amino acid residues L, A, V, T, F, Y, H, Q, T, N, M or S, and where, compared to the initial sequence, the version of the enzyme contains one or more amino acid modifications.

EFFECT: obtaining versions of an enzyme with high transferase activity compared to the initial enzyme.

36 cl, 61 dwg, 14 tbl, 10 ex

Description

ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИLINK TO RELATED APPLICATIONS

Сделана ссылка на следующие связанные заявки: заявка США № 09/750990, поданная 20 июля 1999 г.; заявка США № 10/409391; заявка США № 60/489441, поданная 23 июля 2003 г.; заявка Великобритании № GB 0330016,7, поданная 24 декабря 2003 г., и международная патентная заявка № PCT/IB 2004/000655, поданная 15 января 2004 г. Каждая из этих заявок и каждый из приводимых в этих заявках документов ("цитируемые в заявке документы") и каждый документ, на который ссылались или который цитировали в документах ссылочной заявки в тексте или при выполнении этих заявок, а также во всех подтверждениях патентоспособности, поданных в процессе ее ведения, таким образом, приведен здесь в качестве ссылки. Также в данном тексте процитированы различные документы ("здесь ссылочные документы"). Каждый из ссылочных документов и каждый документ, который процитирован или на который сделана ссылка в ссылочных документах, таким образом, приведен здесь в качестве ссылки.Reference is made to the following related applications: US application No. 09/750990, filed July 20, 1999; US application No. 10/409391; US application No. 60/489441, filed July 23, 2003; UK application No. GB 0330016.7, filed December 24, 2003, and international patent application No. PCT / IB 2004/000655, filed January 15, 2004. Each of these applications and each of the documents cited in these applications ("cited in the application documents ") and each document referred to or quoted in the documents of the reference application in the text or during the execution of these applications, as well as in all confirmations of patentability filed in the course of its maintenance, is thus hereby incorporated by reference. Also, various documents are cited in this text ("reference documents here"). Each of the referenced documents and each document that is cited or referenced in the referenced documents is thus hereby incorporated by reference.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к способам получения вариантов ферментов. Настоящее изобретение дополнительно относится к новым вариантам ферментов и к применению этих новых вариантов ферментов.The present invention relates to methods for producing variants of enzymes. The present invention further relates to new variants of enzymes and to the use of these new variants of enzymes.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND

В последнее временя были найдены ферменты липид:холестеринацилтрансферазы (см., например, Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). В частности, были обнаружены глицерофосфолипид:холестеринацилтрансферазы (GCAT), которые подобно лецитин:холестеринацилтрансферазам (LCAT) растений и/или млекопитающих катализируют перенос жирной кислоты между фосфатидилхолином и холестерином.Recently, lipid enzymes have been found: cholesterol acyltransferases (see, for example, Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). In particular, glycerophospholipid: cholesterol acyltransferase (GCAT) was discovered, which, like lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) of plants and / or mammals, catalyze the transfer of fatty acid between phosphatidylcholine and cholesterol.

Upton и Buckley (TIBS 20, May 1995, p.178-179), а также Brumlik и Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996, p2060-2064) указывают, что липаза/ацилтрансфераза из Aeromonas hydrophila способна осуществлять перенос ацила на спиртовые рецепторы в водной среде.Upton and Buckley (TIBS 20, May 1995, p. 178-179), as well as Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996, p2060-2064) indicate that the lipase / acyltransferase from Aeromonas hydrophila is capable of transferring acyl to alcohol receptors in the aquatic environment.

Для ацетилтрансферазы A. hydrophila были идентифицированы предполагаемые домен связывания субстрата и активный центр (см., например, Thornton et al., 1988, Biochem. et Biophys. Acta. 959, 153-159 and Hilton & Buckley 1991 J. Biol. Chem. 266, 997-1000).For A. hydrophila acetyltransferase, the putative substrate binding domain and active center have been identified (see, e.g., Thornton et al., 1988, Biochem. Et Biophys. Acta. 959, 153-159 and Hilton & Buckley 1991 J. Biol. Chem. 266, 997-1000).

Buckley et al. (J. Bacteriol 1996, 178 (7) 2060-4) указали, что Ser16, Asp116 и His291 являются необходимыми аминокислотами, которые необходимы для поддержания ферментативной активности.Buckley et al. (J. Bacteriol 1996, 178 (7) 2060-4) indicated that Ser16, Asp116 and His291 are essential amino acids that are necessary to maintain enzymatic activity.

Robertson et al. (J. Biol. Chem. 1994, 269, 2146-50) указали на некоторые конкретные мутации ацилтрансферазы A. hydrophila, а именно Y226F, Y230F, Y30F, F13S, S18G, S18V, ни к одной из которых не относится настоящее изобретение.Robertson et al . (J. Biol. Chem. 1994, 269, 2146-50) indicated some specific mutations of the A. hydrophila acyltransferase, namely Y226F, Y230F, Y30F, F13S, S18G, S18V, none of which are related to the present invention.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ АСПЕКТОВ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF ASPECTS OF THE PRESENT INVENTION

Настоящее изобретение основано на открытии конкретных вариантов содержащего GDSХ фермента липидацилтрансферазы, которые обладают повышенной трансферазной активностью по сравнению с исходным ферментом. В частности, варианты по настоящему изобретению обладают повышенной по сравнению с исходным ферментом трансферазной активностью, используя в качестве донора ацила галактолипид. Эти липидацилтрансферазы в настоящем описании обозначены как гликолипидацилтрансферазы. Варианты по настоящему изобретению дополнительно могут обладать повышенным отношением трансферазной активности, используя галактолипиды в качестве доноров ацила к фосфолипидтрансферазной активности (отношение GL:PL), и/или повышенным отношением по сравнению с исходным ферментом отношением трансферазной активности, используя в качестве донора ацила галактолипиды, к галактолипидгидролизной активности (отношение GLt:GLh) по сравнению с отношением исходного фермента.The present invention is based on the discovery of specific variants of the GDSX-containing lipid acyltransferase enzyme that have increased transferase activity compared to the parent enzyme. In particular, the variants of the present invention have increased transferase activity compared to the starting enzyme, using galactolipid as an acyl donor. These lipid acyltransferases are referred to herein as glycolipid acyltransferases. Variants of the present invention may additionally have an increased ratio of transferase activity using galactolipids as acyl donors to phospholipid transferase activity (GL: PL ratio), and / or an increased ratio of transferase activity compared to the starting enzyme, using galactolipids as a donor, galactolipid hydrolysis activity (GLt: GLh ratio) compared to the ratio of the starting enzyme.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения варианта фермента гликолипидацилтрансферазы, предусматривающему: (a) отбор исходного фермента, представляющего собой фермент липидацилтрансферазу, отличающуюся тем, что фермент содержит аминокислотный мотив GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S; (b) модификацию одной или нескольких аминокислот с получением варианта липидацилтрансферазы; (c) тестирование варианта липидацилтрансферазы на активность в отношении галактолипидного субстрата и, необязательно, фосфолипидного субстрата и/или, необязательно, триглицеридного субстрата; (d) отбор варианта фермента с повышенной активностью в отношении галактолипидов по сравнению с исходным ферментом; и, необязательно, (e) получение большого количества варианта фермента.In a first aspect, the present invention relates to a method for producing a variant of a glycolipid acyltransferase enzyme, the method comprising: (a) selecting a parent enzyme representing a lipid acyltransferase enzyme, characterized in that the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S; (b) modifying one or more amino acids to produce a lipid acyltransferase variant; (c) testing a lipid acyltransferase variant for activity against a galactolipid substrate and, optionally, a phospholipid substrate and / or, optionally, a triglyceride substrate; (d) selection of a variant of the enzyme with increased activity against galactolipids compared to the starting enzyme; and, optionally, (e) obtaining a large number of variants of the enzyme.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к варианту фермента гликолипидацилтрансферазы, отличающегося тем, что фермент содержит аминокислотный мотив GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S и где вариант фермента по сравнению с исходной последовательностью содержит одну или несколько модификаций аминокислот в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (определенных здесь ниже).In another aspect, the present invention relates to a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, characterized in that the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S, and wherein the enzyme variant, as compared to the original sequence, contains one or more amino acid modifications at any one or more amino acid residues defined in set 2, or set 4, or set 6, or set 7 (defined hereinafter )

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к варианту фермента гликолипидацилтрансферазы, отличающемуся тем, что фермент содержит аминокислотный мотив GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S и где вариант фермента по сравнению с исходной последовательностью содержит одну или несколько модификаций аминокислот в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, подробно описанных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (определенных здесь ниже), идентифицируемых указанной исходной последовательностью, структурно сравненной с определенной здесь структурной моделью P10480, которая предпочтительно получена посредством структурного сравнения координат кристаллической структуры P10480 с 1IVN.PDB и/или 1DEO.PDB, как указано здесь.In an additional aspect, the present invention relates to a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, characterized in that the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S, and wherein the enzyme variant as compared to the original sequence contains one or more amino acid modifications in any one or more amino acid residues described in detail in set 2, or set 4, or set 6, or set 7 (defined herein lower ) Identified by said parent sequence compared structurally with the structural model of P10480 defined herein, which is preferably obtained by structural comparison of P10480 crystal structure coordinates with 1IVN.PDB and / or 1DEO.PDB, as defined herein.

Дополнительно настоящее изобретение относится к варианту фермента гликолипидацилтрансферазы, отличающемуся тем, что фермент содержит аминокислотный мотив GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S и где вариант фермента содержит одну или несколько модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, указанных в наборе 2, идентифицируемых при сравнении исходной последовательности с консенсусной последовательностью pfam (SEQ ID NO:1) и модифицируемых по структурной модели P10480 для обеспечения наибольшего перекрывания (см. фиг.55), как указано.Additionally, the present invention relates to a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, characterized in that the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S and where the variant enzyme contains one or more modifications of the amino acids compared to the original sequence in any one or more amino acid residues specified in set 2, identified by comparing the original sequence with a consensus the sequence of pfam (SEQ ID NO: 1) and modified according to the structural model P10480 to provide the greatest overlap (see Fig. 55), as indicated.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к варианту фермента гликолипидацилтрансферазы, где вариант фермента содержит аминокислотную последовательность, которая приведена в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45 за исключением одной или нескольких модификаций аминокислот в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 (определенных здесь ниже), идентифицируемых сравнением последовательности с SEQ ID NO:2.In an additional aspect, the present invention relates to a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, where the enzyme variant contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 43 or SEQ ID NO: 45 with the exception of one or more modifications of the amino acids in any one or more amino acid residues defined in set 2, or set 4, or set 6, or set e 7 (defined hereinbelow) identified by comparing the sequence with SEQ ID NO: 2.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к варианту фермента гликолипидацилтрансферазы, где вариант фермента содержит аминокислотную последовательность, которая приведена в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45 за исключением одной или нескольких модификаций аминокислот в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7, идентифицируемых указанной исходной последовательностью структурно сравненной с определенной здесь структурной моделью P10480, предпочтительно полученной посредством структурного сравнения координат кристаллической структуры P10480 с 1IVN.PDB и/или 1DEO.PDB, как указано здесь.In an additional aspect, the present invention relates to a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, where the enzyme variant contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 43 or SEQ ID NO: 45 with the exception of one or more modifications of the amino acids in any one or more amino acid residues defined in set 2, or set 4, or set 6, or set e 7, said identifiable reference sequence structurally compared with the structural model of P10480 defined herein, preferably obtained by structural comparison P10480 crystal structure coordinates with 1IVN.PDB and / or 1DEO.PDB, as defined herein.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к варианту фермента гликолипидацилтрансферазы, где вариант фермента содержит аминокислотную последовательность, которая приведена в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45 за исключением одной или нескольких модификаций аминокислот в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, указанных в наборе 2, идентифицируемых при сравнении исходной последовательности с консенсусной последовательностью pfam (SEQ ID NO:1) и модифицируемых по структурной модели P10480 для обеспечения наибольшего перекрывания (см. фиг.55), как указано.In an additional aspect, the present invention relates to a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, where the enzyme variant contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 43 or SEQ ID NO: 45 with the exception of one or more modifications of the amino acids in any, one or more amino acid residues specified in set 2, identified by comparison of the original hydrochloric sequence to the consensus sequence pfam (SEQ ID NO: 1) and the modified structural model of P10480 to ensure the greatest overlap (see 55, a.), as indicated.

Дополнительно настоящее изобретение относится к применению варианта гликолиполитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению для производства субстрата (предпочтительно пищевого продукта) для получения лизогликолипида, например дигалактозилмоноглицерида (DGMG) или моногалактозилмоноглицерида (MGMG), посредством обработки гликолипида (например, дигалактозилдиглицерида (DGDG) или моногалактозилдиглицерида (MGDG)) вариантом липолитического фермента по настоящему изобретению или полученным способом по настоящему изобретению с получением продукта частичного гидролиза, т.е. лизогликолипида.Additionally, the present invention relates to the use of a variant of the glycolipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention for the production of a substrate (preferably a food product) for producing a lysoglycolipid, for example digalactosyl monoglyceride (DGMG) or monogalactosyl monoglyceride (MGMG), by treating glycolipid (for example, digdiglactylglyceride ) or monogalactosyl diglyceride (MGDG)) a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention to obtain a partial hydrolysis product, i.e. lysoglycolipid.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению варианта липолитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению для производства субстрата (предпочтительно пищевого продукта) для получения лизофосфолипида, например лизолецитина, посредством обработки фосфолипида (например, лецитина) вариантом липолитического фермента по настоящему изобретению или полученным способом по настоящему изобретению с получением продукта частичного гидролиза, т.е. лизофосфолипида.In an additional aspect, the present invention relates to the use of a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention for the production of a substrate (preferably a food product) for producing a lysophospholipid, for example lysolecithin, by treating a phospholipid (for example, lecithin) with a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention to obtain a partial hydrolysis product, i.e. lysophospholipid.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, где способ предусматривает добавление варианта липолитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению к одному или нескольким ингредиентам пищевых продуктов.In one aspect, the present invention relates to a method for producing a food product, wherein the method comprises adding a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention to one or more food ingredients.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения выпеченного из теста продукта, где способ предусматривает добавление варианта липолитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению в тесто.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a baked product from a dough, wherein the method comprises adding a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention in the dough.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению варианта липолитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению в производстве яичного продукта для получения лизофосфолипидов.In another aspect, the present invention relates to the use of a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention in the manufacture of an egg product for the production of lysophospholipids.

В другом аспекте предоставлен способ обработки яиц или яичных продуктов, предусматривающий добавление варианта липолитического фермента по настоящему изобретению в яйцо или яичный продукт для получения лизофосфолипида.In another aspect, there is provided a method for treating eggs or egg products, comprising adding a variant of the lipolytic enzyme of the present invention to an egg or egg product to produce a lysophospholipid.

Варианты изобретения можно применять в способе получения полуфабрикатов пищевых продуктов, таких как макаронные изделия быстрого приготовления, по аналогии с WO 02/065854.Embodiments of the invention can be used in a method for producing convenience foods such as instant pasta, by analogy with WO 02/065854.

Настоящее изобретение относится к применению варианта липидацилтрансферазы по настоящему изобретению для получения предпочтительного технического результата или сочетания технических результатов, например, в пищевом продукте (такие как технические результаты, перечисленные здесь в разделе "Технические результаты").The present invention relates to the use of the variant lipid acyltransferase of the present invention to obtain a preferred technical result or a combination of technical results, for example, in a food product (such as the technical results listed here in the section "Technical results").

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментативного рафинирования растительных или пищевых масел, предусматривающему обработку пищевого или растительного масла вариантом липолитического фермента по настоящему изобретению или полученным способом по настоящему изобретению так, чтобы гидролизовать большую часть полярных липидов (например, фосфолипиды и/или гликолипиды).In an additional aspect, the present invention relates to a method for the enzymatic refinement of vegetable or edible oils, comprising treating edible or vegetable oil with a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or with the method of the present invention so as to hydrolyze most of the polar lipids (e.g. phospholipids and / or glycolipids) .

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу, предусматривающему обработку фосфолипида с тем, чтобы гидролизовать жирные ацильные группы, где способ предусматривает смешивание указанных фосфолипидов с вариантом липолитического фермента по настоящему изобретению или полученным способом по настоящему изобретению.In another aspect, the present invention relates to a method comprising treating a phospholipid to hydrolyze fatty acyl groups, wherein the method comprises mixing said phospholipids with a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or the obtained method of the present invention.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения содержания фосфолипидов в пищевом масле, предусматривающему обработку масла вариантом липолитического фермента по настоящему изобретению или полученным способом по настоящему изобретению с тем, чтобы гидролизовать большую часть фосфолипидов, и отделение содержащей гидролизованный фосфолипид водной фазы от масла.In another aspect, the present invention relates to a method for reducing the content of phospholipids in edible oil, comprising treating the oil with a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or with the method of the present invention in order to hydrolyze a majority of the phospholipids, and separating the aqueous phase containing the hydrolyzed phospholipid from the oil.

Также предоставлен способ получения варианта липолитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению, где способ предусматривает трансформацию клетки-хозяина рекомбинантной нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный вариант липолитического фермента, где клетка-хозяин способна к экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид липолитического фермента, культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты и получение варианта липолитического фермента.Also provided is a method for producing a variant of a lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention, where the method comprises transforming a host cell with a recombinant nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the indicated variant of a lipolytic enzyme, where the host cell is capable of expressing a nucleotide sequence encoding a polypeptide lipolytic enzyme, culturing a transformed host cell under conditions under oryh possible expression of the nucleic acid and obtaining a lipolytic enzyme variant.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению варианта липолитического фермента по настоящему изобретению или полученного способом по настоящему изобретению в биоконверсии полярных липидов (предпочтительно гликолипидов) для получения высокоценных продуктов, таких как сложные эфиры углеводов, и/или сложные эфиры белков, и/или сложные эфиры белковых субъединиц, и/или сложные эфиры оксикислот.In an additional aspect, the present invention relates to the use of a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention in the bioconversion of polar lipids (preferably glycolipids) to produce high-value products such as carbohydrate esters and / or protein esters and / or esters of protein subunits, and / or esters of hydroxy acids.

Способ биоконверсии полярных липидов (предпочтительно гликолипидов) в высокоценные продукты включает в себя смешивание указанного полярного липида с вариантом липолитического фермента по настоящему изобретению или полученным способом по настоящему изобретению.A method for bioconversion of polar lipids (preferably glycolipids) into high value products involves mixing said polar lipid with a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or the obtained method of the present invention.

Также настоящее изобретение дополнительно относится к иммобилизованному варианту липолитического фермента по настоящему изобретению или полученному способом по настоящему изобретению.Also, the present invention further relates to an immobilized variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention.

Аспекты настоящего изобретения предоставлены в формуле изобретения и в следующих ниже комментариях.Aspects of the present invention are provided in the claims and in the following comments.

Другие аспекты, относящиеся к нуклеотидным последовательностям, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают в себя: конструкцию, содержащую последовательности по настоящему изобретению; вектор, содержащий последовательности для применения по настоящему изобретению; плазмиду, содержащую последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную клетку, содержащую последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную ткань, содержащую последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный орган, содержащий последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированного хозяина, содержащего последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный организм, содержащий последовательности для применения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам экспрессии нуклеотидной последовательности для применения по настоящему изобретению с ее использованием, таким как экспрессия в клетке-хозяине; включая сюда способы для ее переноса. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам выделения нуклеотидной последовательности, таким как выделение из клетки-хозяина.Other aspects related to the nucleotide sequences that can be used in the present invention include: a construct comprising the sequences of the present invention; a vector containing sequences for use in the present invention; a plasmid containing sequences for use in the present invention; a transformed cell containing sequences for use in the present invention; transformed tissue containing sequences for use in the present invention; a transformed organ containing sequences for use in the present invention; a transformed host containing sequences for use in the present invention; a transformed organism containing sequences for use in the present invention. The present invention also relates to methods for expressing a nucleotide sequence for use with the present invention using it, such as expression in a host cell; including methods for transferring it here. The present invention further relates to methods for isolating a nucleotide sequence, such as isolation from a host cell.

Другие аспекты, относящиеся к аминокислотной последовательности для применения по настоящему изобретению включают в себя: конструкцию, кодирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; вектор, кодирующий аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; плазмиду, кодирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную клетку, экспрессирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную ткань, экспрессирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный орган, экспрессирующий аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированного хозяина, экспрессирующего аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный организм, экспрессирующий аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам очистки аминокислотной последовательности для применения по настоящему изобретению с ее использованием, таким как экспрессия в клетке-хозяине; включая сюда способы ее переноса, а затем очистки указанной последовательности.Other aspects related to the amino acid sequence for use in the present invention include: a construct encoding the amino acid sequences for use in the present invention; a vector encoding amino acid sequences for use in the present invention; a plasmid encoding the amino acid sequences for use in the present invention; a transformed cell expressing amino acid sequences for use in the present invention; transformed tissue expressing amino acid sequences for use in the present invention; a transformed organ expressing amino acid sequences for use in the present invention; a transformed host expressing amino acid sequences for use in the present invention; a transformed organism expressing amino acid sequences for use in the present invention. The present invention also relates to methods for purifying an amino acid sequence for use in the present invention using it, such as expression in a host cell; including here methods of transferring it and then purifying the indicated sequence.

Для удобства использования, эти и дополнительные аспекты настоящего изобретения будут обсуждены под соответствующими заголовками разделов. Однако информация каждого раздела не обязательно ограничена каждым конкретным разделом.For ease of use, these and additional aspects of the present invention will be discussed under the respective section headings. However, the information of each section is not necessarily limited to each specific section.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАБОРОВDEFINITION OF KITS

Набор аминокислот 1:Amino Acid Set 1:

Набор аминокислот 1 (необходимо отметить, что они представляют собой аминокислоты в 1IVN - фиг.57 и фиг.58).Set of amino acids 1 (it should be noted that they are amino acids in 1IVN - Fig. 57 and Fig. 58).

Gly8, Asp9, Ser10, Leu11, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe139, Phe140, Met141, Tyr145, Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158. Gly8, Asp9, Ser10, Leu11, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe121, Phe140, Met141, Tyr145, Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158.

Высококонсервативные мотивы, такие как GDSХ, и входящие в состав каталитического центра остатки, исключены из набора 1 (подчеркнутые остатки). Во избежание неопределенности набор 1 определен аминокислотными остатками в пределах 10 Å от центрального углеродного атома глицерина в активном центре модели 1IVN.Highly conserved motifs, such as GDSX, and residues that make up the catalytic center are excluded from set 1 (underlined residues). To avoid ambiguity, set 1 is determined by amino acid residues within 10 Å from the central carbon atom of glycerol in the active center of model 1IVN.

Набор аминокислот 2:Amino Acid Set 2:

Набор аминокислот 2 (необходимо отметить, что нумерация аминокислот относится к аминокислотам в зрелой последовательности P10480)Set of amino acids 2 (it should be noted that the numbering of amino acids refers to amino acids in the mature sequence P10480)

Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 и Val290.Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg1616, Ser616, Ser163, Arg1616, Ser163, Ser163, Ser163, Ser6 Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 and Val290.

Таблица выбранных остатков в наборе 1 по сравнению с набором 2:Table of selected residues in set 1 compared to set 2:

Набор аминокислот 3:Amino Acid Set 3:

Набор аминокислот 3 идентичен набору 2, но относится к кодирующей последовательности Aeromonas salmonicida (SEQ ID NO:28), т.е. номера аминокислотных остатков в наборе 3 на 18 больше, т.к. это отражает разницу между нумерацией аминокислот в зрелом белке (SEQ ID NO:2) по сравнению с белком, включающем в себя сигнальную последовательность (SEQ ID NO:28).The set of amino acids 3 is identical to set 2, but refers to the coding sequence of Aeromonas salmonicida (SEQ ID NO: 28), i.e. the numbers of amino acid residues in the set 3 are 18 more, because this reflects the difference between the numbering of amino acids in a mature protein (SEQ ID NO: 2) compared to a protein including a signal sequence (SEQ ID NO: 28).

Зрелые белки Aeromonas salmonicida GDSX (SEQ ID NO:28) и Aeromonas hydrophila GDSX (SEQ ID NO:26) отличаются пятью аминокислотами. Они представляют собой Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-, где остаток salmonicida приведен первым, а остаток hydrophila приведен последним (фиг.59). Белок hydrophila состоит в длину только из 317 аминокислот, и у него отсутствует остаток в положении 318. Aeromonas salmonicidae GDSX обладает значительно большей активностью в отношении полярных липидов, таких как галактолипидные субстраты, чем белок Aeromonas hydrophila. Сканирование участков проводилось на всех пяти позициях аминокислот.The mature proteins Aeromonas salmonicida GDSX (SEQ ID NO: 28) and Aeromonas hydrophila GDSX (SEQ ID NO: 26) are distinguished by five amino acids. They are Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-, where the salmonicida residue is given first and the hydrophila residue is last (Fig. 59). The hydrophila protein consists of only 317 amino acids in length and does not have a residue at position 318. Aeromonas salmonicidae GDSX has significantly greater activity against polar lipids, such as galactolipid substrates, than the Aeromonas hydrophila protein. Scanning sites was carried out at all five positions of amino acids.

Набор аминокислот 4:Amino Acid Set 4:

Набор аминокислот 4 представляет собой S3, Q182, E309, S310, и -318.The set of amino acids 4 is S3, Q182, E309, S310, and -318.

Набор аминокислот 5:Amino Acids Set 5:

F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157N, Y226F, D228N, Y230F.F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157N, Y226F, D228N, Y230F.

Набор аминокислот 6:Amino Acid Set 6:

Набор аминокислот 6 представляет собой Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318.The set of amino acids 6 is Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Al1616, , Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310.

Нумерация аминокислот в наборе 6 относится к аминокислотным остаткам в P10480 (SEQ ID NO:2) - соответствующие аминокислоты в других основных цепях последовательностей можно определить посредством гомологичного сравнения и/или структурного сравнение с P10480 и/или 1IVN.The amino acid numbering in set 6 refers to the amino acid residues in P10480 (SEQ ID NO: 2) - the corresponding amino acids in the other main chains of the sequences can be determined by homologous comparison and / or structural comparison with P10480 and / or 1IVN.

Набор аминокислот 7:Amino Acid Set 7:

Набор аминокислот 7 представляет собой Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), Y226X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), Y230X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), S18X (где X выбран из A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W или Y), D157X (где X выбран из A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y).The set of amino acids 7 is Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Al1616, , Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, X310, Ser310, Y330 selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), Y226X (where X is selected from A, C, D , E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), Y230X (where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), S18X (where X is selected from A, C, D, E, F, H, I, K, L, M , N, P, Q, R, T, W or Y), D157X (where X is selected from A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y).

Нумерация аминокислот в наборе 7 относится к аминокислотным остаткам в P10480 (SEQ ID NO:2) - соответствующие аминокислоты в других основных цепях последовательностей можно определить посредством гомологичного сравнения и/или структурного сравнение с P10480 и/или 1IVN.The amino acid numbering in set 7 refers to the amino acid residues in P10480 (SEQ ID NO: 2) - the corresponding amino acids in the other main chains of the sequences can be determined by homologous comparison and / or structural comparison with P10480 and / or 1IVN.

ПОДРОБНОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ АСПЕКТОВ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF ASPECTS OF THE PRESENT INVENTION

Предпочтительно исходный фермент липидацилтрансфераза содержит любую из следующих ниже аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45, или аминокислотную последовательность, обладающую 75% или более идентичностью с любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45.Preferably, the starting lipid acyltransferase enzyme contains any of the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 45, or an amino acid sequence having 75% or more identity with any of the sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 , SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 45.

Таким образом, исходный фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере, на 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, больше, чем, по меньшей мере, на 98% гомологична любой последовательности, представленной как SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45.Thus, the starting lipid acyltransferase enzyme of the present invention contains an amino acid sequence that is at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% more than at least 98% homologous to any sequence represented as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 43 and and SEQ ID NO: 45.

Таким образом, исходный фермент липидацилтрансфераза может кодировать любая из следующих ниже нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:46, или нуклеотидная последовательность, которая по меньшей мере, на 75% или более идентична любой из последовательностей, представленных как SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:46.Thus, the starting lipid acyltransferase enzyme can encode any of the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46, or the nucleotide sequence which is at least 75% or more identical to any of the sequences presented as SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SE Q ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46.

Таким образом, нуклеотидная последовательность может быть на 80% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, даже более предпочтительно на 98% или более идентична любой из последовательностей, представленных как SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44 или SEQ ID NO:46.Thus, the nucleotide sequence can be 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more identical to any of the sequences shown as SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38 , SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46.

Предпочтительно исходный фермент модифицирован по одному или нескольким из аминокислотных остатков, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7, при сравнении с эталонной последовательностью (SEQ ID NO:2) или структурном сравнении по структурной модели P10480, или сравненных по консенсусной последовательности pfam и модифицированных по структурной модели P10480.Preferably, the starting enzyme is modified according to one or more of the amino acid residues defined in set 2, or set 4, or set 6, or set 7, when compared to a reference sequence (SEQ ID NO: 2) or structural comparison according to structural model P10480, or compared by consensus pfam and modified by structural model P10480.

Таким образом, вариант фермента по сравнению с исходным ферментом может обладать повышенным отношением активности в отношении галактолипидов к активности в отношении либо фосфолипидов, либо/и триглицеридов.Thus, a variant of the enzyme compared with the starting enzyme may have an increased ratio of activity against galactolipids to activity against either phospholipids or / and triglycerides.

Таким образом, способ по настоящему изобретению может предусматривать тестирование варианта липидацилтрансферазы на:Thus, the method of the present invention may include testing a variant of lipid acyltransferase for:

(i) трансферазную активность в отношении галактолипидного субстрата, и(i) transferase activity against a galactolipid substrate, and

(ii) трансферазную активность в отношении фосфолипидного субстрата; и(ii) transferase activity against a phospholipid substrate; and

отбор варианта фермента, который по сравнению с исходным ферментом обладает повышенным отношением трансферазной активности в отношении галактолипидов к трансферазной активности в отношении фосфолипидов.selection of an enzyme variant which, in comparison with the starting enzyme, has an increased ratio of transferase activity with respect to galactolipids to transferase activity with respect to phospholipids.

Таким образом, отношение трансферазной активности варианта фермента по настоящему изобретению в отношении галактолипидов к трансферазной активности в отношении фосфолипидов может представлять собой, по меньшей мере, 1, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4 или, по меньшей мере, 5.Thus, the ratio of the transferase activity of a variant of the enzyme of the present invention in relation to galactolipids to the transferase activity in relation to phospholipids can be at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5.

(a) трансферазную активность в отношении галактолипидного субстрата, и(a) transferase activity against a galactolipid substrate, and

(b) гидролитическую активность в отношении галактолипидного субстрата; и(b) hydrolytic activity against a galactolipid substrate; and

отбор варианта фермента с повышенным отношением трансферазной активности в отношении галактолипидов к его гидролитической активности в отношении гликолипидов по сравнению с отношением исходного фермента.selection of an enzyme variant with an increased ratio of transferase activity in relation to galactolipids to its hydrolytic activity in relation to glycolipids compared to the ratio of the starting enzyme.

Таким образом, отношение трансферазной активности для галактолипидов к гидролитической активности в отношении галактолипидов может составлять более 1, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 4 или, по меньшей мере, 5.Thus, the ratio of transferase activity for galactolipids to hydrolytic activity against galactolipids can be more than 1, at least 1.5, at least 2, at least 4, or at least 5.

Анализ для определения трансферазной и гидролитической активности в отношении галактолипидов и/или фосфолипидов указан, например, в примере 8.An analysis to determine the transferase and hydrolytic activity against galactolipids and / or phospholipids is indicated, for example, in example 8.

Термин "повышенная активность в отношении галактолипидов" означает фермент, который по сравнению с исходным ферментом обладает повышенной (т.е. большей) трансферазной активностью, если липидным донором ацила является галактолипид, (галактолипидтрансферазная активность), и/или по сравнению с исходным ферментом обладает повышенным отношением галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности (отношение GLt:PLt), и/или по сравнению с исходным ферментом обладает повышенным отношением галактолипидтрансферазной активности к галактолипидгидролазной активности (отношение GLt:GLh).The term "increased activity against galactolipids" means an enzyme that, compared to the starting enzyme, has increased (i.e., greater) transferase activity if the galactolipid is the acyl lipid donor, (galactolipid transferase activity), and / or, compared to the starting enzyme, has an increased ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity (GLt: PLt ratio), and / or has an increased ratio of galactolipid transferase asset compared to the starting enzyme galactolipid hydrolase activity (GLt: GLh ratio).

Таким образом, вариант фермента по сравнению с исходным ферментом может обладать повышенной галактолипидтрансферазной активностью и либо такой же, либо меньшей галактолипидгидролитической активностью. Другими словами, таким образом, вариант фермента может обладать большей галактолипидтрансферазной активностью по сравнению с его галактолипидгидролитической активностью по сравнению с исходным ферментом. Таким образом, вариант фермента может предпочтительно переносить ацильную группу с галактолипида на акцептор ацила вместо простого гидролиза галактолипида.Thus, a variant of the enzyme, in comparison with the initial enzyme, may have increased galactolipid transferase activity and either the same or less galactolipid hydrolytic activity. In other words, thus, a variant of the enzyme may have greater galactolipid transferase activity compared to its galactolipid hydrolytic activity compared to the original enzyme. Thus, an enzyme variant can preferably transfer the acyl group from the galactolipid to the acyl acceptor instead of simply hydrolyzing the galactolipid.

В одном из вариантов осуществления фермент по настоящему изобретению может обладать повышенной трансферазной активностью в отношении фосфолипидов (т.е. повышенной фосфолипидтрансферазной активностью) по сравнению с исходным ферментом. Эта повышенная фосфолипидтрансферазная активность может быть независимой от повышенной активности в отношении галактолипидов. Однако, таким образом, вариант фермента может обладать повышенной галактолипидтрансферазной активностью и повышенной фосфолипидтрансферазной активностью.In one embodiment, the enzyme of the present invention may have increased transferase activity against phospholipids (i.e., increased phospholipid transferase activity) compared to the parent enzyme. This increased phospholipid transferase activity may be independent of the increased activity against galactolipids. However, in this way, an enzyme variant may have increased galactolipid transferase activity and increased phospholipid transferase activity.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к варианту фермента липидацилтрансферазы, отличающемуся тем, что фермент содержит аминокислотный мотив GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S, где вариант обладает повышенной активностью в отношении фосфолипидов, предпочтительно повышенной фосфолипидтрансферазной активностью, по сравнению с исходным ферментом и где вариант фермента содержит одну или несколько модификаций аминокислот по сравнению с исходной последовательностью в любых, одном или нескольких, аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7.In one of the embodiments the present invention relates to a variant of the enzyme lipid acyltransferase, characterized in that the enzyme contains an amino acid motif GDSX, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S, where the variant has increased activity against phospholipids, preferably increased phospholipid transferase activity, compared to the parent enzyme and where the variant enzyme contains one or more modifications of amino acids compared to the original sequence in any one or more amino acid residues defined in set 2, or set 4, or set 6, or set 7.

Как применяют здесь, термин "модифицирование" означает добавление, замену и/или удаление. Предпочтительно термин "модифицирование" означает "замену".As used here, the term "modification" means the addition, replacement and / or removal. Preferably, the term “modification” means “replacement”.

Во избежание неопределенности, когда в исходном ферменте замещена аминокислота, она предпочтительно замещена аминокислотой, отличающейся от аминокислоты, первоначально обнаруженной в исходном ферменте в этом положении, таким образом, чтобы получить вариант фермента. Другими словами, термин "замена" не предназначен для обозначения замещения аминокислоты той же аминокислотой.In order to avoid ambiguity, when an amino acid is substituted in the original enzyme, it is preferably substituted with an amino acid different from the amino acid originally found in the original enzyme at this position, so as to obtain an enzyme variant. In other words, the term “substitution” is not intended to mean the substitution of an amino acid with the same amino acid.

Предпочтительно исходный фермент представляет собой фермент, содержащий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:28.Preferably, the parent enzyme is an enzyme comprising the amino acid sequence represented as SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 28.

Предпочтительно вариант фермента представляет собой фермент, содержащий аминокислотную последовательность, где данная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:2 за исключением одной или нескольких модификаций аминокислот в любых одном или нескольких аминокислотных остатках, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7.Preferably, the enzyme variant is an enzyme comprising an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is represented as SEQ ID NO: 2 with the exception of one or more modifications of the amino acids in any one or more amino acid residues defined in set 2, or set 4, or set 6, or set 7.

В одном из вариантов осуществления предпочтительный вариант фермента содержит по сравнению с исходной последовательностью одну или несколько модификаций аминокислот, по меньшей мере, в одном из аминокислотных остатков, определенных в наборе 4.In one embodiment, the preferred enzyme variant contains, in comparison with the original sequence, one or more modifications of the amino acids in at least one of the amino acid residues defined in set 4.

Таким образом, вариант фермента по сравнению с исходным ферментом содержит одну или несколько из следующих ниже модификаций аминокислот:Thus, a variant of the enzyme as compared to the starting enzyme contains one or more of the following amino acid modifications:

S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T или G;S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T or G;

E309Q, R или A, предпочтительно Q или R;E309Q, R or A, preferably Q or R;

-318Y, H, S или Y, предпочтительно Y.-318Y, H, S or Y, preferably Y.

Предпочтительно X из мотива GDSX представляет собой L. Таким образом, предпочтительно исходный фермент содержит аминокислотный мотив GDSL.Preferably X from the GDSX motif is L. Thus, preferably, the parent enzyme contains the GDSL amino acid motif.

Предпочтительно способ получения варианта фермента липидацилтрансферазы дополнительно предусматривает одну или несколько из следующих ниже стадий:Preferably, the method for producing a variant lipid acyltransferase enzyme further comprises one or more of the following steps:

1) картирование структурной гомологии или1) mapping structural homology or

2) сравнение по гомологии последовательностей.2) comparison by sequence homology.

Таким образом, картирование структурной гомологии может предусматривать одну или несколько из следующих ниже стадий:Thus, structural homology mapping may include one or more of the following steps:

i) сравнение исходной последовательности со структурной моделью (1IVN.PDB), показанной на фиг.52;i) comparing the original sequence with the structural model (1IVN.PDB) shown in Fig;

ii) выбор одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах сферы размером 10 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53) (такие как один или несколько из аминокислотных остатков, определенных в наборе 1 или наборе 2); иii) selecting one or more amino acid residues within a 10 Å sphere with a center in the central carbon atom of the glycerol molecule in the active center (see FIG. 53) (such as one or more of the amino acid residues defined in set 1 or set 2) ; and

iii) модификацию указанной исходной последовательности одной или нескольких аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ii).iii) a modification of the specified initial sequence of one or more amino acids selected in accordance with stage (ii).

В одном из вариантов осуществления выбранный аминокислотный остаток может находиться в пределах сферы размером 9, предпочтительно в пределах 8, 7, 6, 5, 4, или 3 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53).In one embodiment, the selected amino acid residue may be within a sphere of size 9, preferably within 8, 7, 6, 5, 4, or 3 Å centered on the central carbon atom of the glycerol molecule in the active center (see FIG. 53) .

ii) выбор одой или нескольких аминокислот в пределах сферы размером 10 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53) (таких как один или несколько из аминокислотных остатков, определенных в наборе 1 или наборе 2);ii) selecting one or more amino acids within a 10 Å sphere centered on the central carbon atom of a glycerol molecule in the active center (see FIG. 53) (such as one or more of the amino acid residues defined in set 1 or set 2);

iii) определение того, являются ли один или несколько аминокислотных остатков, выбранных в соответствии со стадией (ii), высококонсервативными (особенно являются ли они остатками активного центра, и/или частью мотива GDSХ, и/или частью мотива GANDY); иiii) determining whether one or more amino acid residues selected in accordance with step (ii) are highly conserved (especially whether they are active center residues and / or part of the GDSX motif and / or part of the GANDY motif); and

iv) модификацию указанной исходной последовательности одной или нескольких аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ii), за исключением консервативных областей, идентифицированных в соответствии со стадией (iii).iv) a modification of the specified initial sequence of one or more amino acids selected in accordance with stage (ii), with the exception of the conservative regions identified in accordance with stage (iii).

Альтернативно описанному выше картированию структурной гомологии или совместно с ним картирование структурной гомологии можно проводить посредством выбора конкретных областей петель (LR) или промежуточных областей (IVR), полученных из сравнения с pfam (сравнение 2, фиг.56), перекрывающихся с моделью P10480 и 1IVN. Области петель (LR) или промежуточные области (IVR) определены ниже в таблице:Alternative to the structural homology mapping described above, or in conjunction with it, structural homology mapping can be carried out by selecting specific loop regions (LR) or intermediate regions (IVR) obtained from the comparison with pfam (comparison 2, FIG. 56), overlapping with the model P10480 and 1IVN . Loop areas (LR) or intermediate areas (IVR) are defined in the table below:

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариант фермента ацилтрансферазы содержит не только модификации аминокислот по одной или нескольким из аминокислот, определенных в любом из наборов 1-4 и 6-7, но также содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, одной или нескольких, определенных выше промежуточных областей (IVR1-6) (предпочтительно в одной или нескольких из IVR 3, 5 и 6, более предпочтительно в IVR5 или IVR 6) и/или в одной или нескольких из определенных выше областей петель (LR1-5) (предпочтительно в одной или нескольких из LR1, LR2 или LR5, более предпочтительно в LR5).In some embodiments of the present invention, the acyltransferase enzyme variant not only contains amino acid modifications of one or more of the amino acids defined in any of sets 1-4 and 6-7, but also contains at least one amino acid modification of one or more of the above intermediate regions (IVR1-6) (preferably in one or more of IVR 3, 5 and 6, more preferably in IVR5 or IVR 6) and / or in one or more of the above-defined loop regions (LR1-5) (preferably in one or several FIR of LR1, LR2 or LR5, more preferably in LR5).

В одном из вариантов осуществления вариант ацилтрансферазы по настоящему изобретению или полученный способом по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, которые определены не только в одном или нескольких наборах 2, 4, 6 и 7, но также находятся в одной или нескольких IVR 1-6 (предпочтительно в пределах IVR 3, 5 или 6, более предпочтительно в пределах IVR 5 или IVR 6) или в одной или нескольких из LR 1-5 (предпочтительно в пределах LR1, LR2 или LR5, более предпочтительно в пределах LR5).In one embodiment, the acyltransferase variant of the present invention or obtained by the method of the present invention may contain one or more modifications of amino acids that are defined not only in one or more sets 2, 4, 6 and 7, but also are in one or more IVR 1 -6 (preferably within IVR 3, 5 or 6, more preferably within IVR 5 or IVR 6) or in one or more of LR 1-5 (preferably within LR1, LR2 or LR5, more preferably within LR5).

Таким образом, вариант ацилтрансферазы по настоящему изобретению или полученный способом по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, которые находятся не только в наборе 1 или 2, но также расположены в пределах IVR 3.Thus, the acyltransferase variant of the present invention or obtained by the method of the present invention may contain one or more modifications of amino acids that are not only in set 1 or 2, but also located within IVR 3.

Таким образом, вариант ацилтрансферазы по настоящему изобретению или полученный способом по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, которые находятся не только в наборе 1 или 2, но также расположены в пределах IVR 5.Thus, the acyltransferase variant of the present invention or obtained by the method of the present invention may contain one or more modifications of amino acids that are not only in set 1 or 2, but also located within IVR 5.

Таким образом, вариант ацилтрансферазы по настоящему изобретению или полученный способом по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, которые находятся не только в наборе 1 или 2, но также расположены в пределах IVR 6.Thus, an acyltransferase variant of the present invention or obtained by the method of the present invention may contain one or more modifications of amino acids that are not only in set 1 or 2, but also located within IVR 6.

Таким образом, вариант ацилтрансферазы по настоящему изобретению или полученный способом по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, которые находятся не только в наборе 1 или 2, но также расположены в пределах LR 1.Thus, the acyltransferase variant of the present invention or obtained by the method of the present invention may contain one or more modifications of amino acids that are not only in set 1 or 2, but also located within LR 1.

Таким образом, вариант ацилтрансферазы по настоящему изобретению или полученный способом по настоящему изобретению может содержать одну или несколько модификаций аминокислот, которые находятся не только в наборе 1 или 2, но также расположены в пределах LR 2.Thus, the acyltransferase variant of the present invention or obtained by the method of the present invention may contain one or more modifications of amino acids that are not only in set 1 or 2, but also located within LR 2.

Подобным образом в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариант фермента ацилтрансферазы не только содержит модификацию аминокислоты в одном или нескольких аминокислотных остатках, находящихся в пределах сферы размером 10, предпочтительно в пределах 9, 8, 7, 6, 5, 4, или 3 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53), но также содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в одной или нескольких из определенных выше промежуточных областях (IVR1-6) (предпочтительно в одной или нескольких из IVR 3, 5 и 6, более предпочтительно в IVR 5 или IVR 6) и/или в одной или нескольких из определенных выше областей петель (LR1-5) (предпочтительно в одной или нескольких из LR1, LR2 или LR5, более предпочтительно в LR5).Similarly, in some embodiments of the present invention, the acyltransferase enzyme variant not only comprises an amino acid modification in one or more amino acid residues within a 10-sphere, preferably within 9, 8, 7, 6, 5, 4, or 3 Å centered in the central carbon atom of the glycerol molecule in the active center (see FIG. 53), but also contains at least one amino acid modification in one or more of the above-defined intermediate regions (IVR1-6) (preferably in one and whether several of IVRs 3, 5 and 6, more preferably in IVR 5 or IVR 6) and / or in one or more of the above-defined loop regions (LR1-5) (preferably in one or more of LR1, LR2 or LR5, more preferably in LR5).

В одном из вариантов осуществления предпочтительная модификация аминокислоты расположена в одном или нескольких аминокислотных остатках, находящихся в пределах сферы размером 10 Å, а также в пределах LR5.In one embodiment, the preferred amino acid modification is located in one or more amino acid residues within a 10 Å sphere, and also within LR5.

ii) выбор одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах сферы 10 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53) (такие как один или несколько аминокислотных остатков, определенных в наборе 1 или наборе 2); и/или выбор одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах IVR1-6 (предпочтительно в пределах IVR 3, 5 или 6, более предпочтительно в пределах IVR 5 или IVR6); и/или выбор одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах LR1-5 (предпочтительно в пределах LR1, LR2 или LR5, более предпочтительно в пределах LR5); иii) selecting one or more amino acid residues within a 10 Å sphere centered on the central carbon atom of the glycerol molecule in the active center (see FIG. 53) (such as one or more amino acid residues defined in set 1 or set 2); and / or the selection of one or more amino acid residues within IVR1-6 (preferably within IVR 3, 5 or 6, more preferably within IVR 5 or IVR6); and / or selecting one or more amino acid residues within LR1-5 (preferably within LR1, LR2 or LR5, more preferably within LR5); and

iii) модификацию в указанной исходной последовательности одной или нескольких аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ii).iii) a modification in the specified initial sequence of one or more amino acids selected in accordance with stage (ii).

ii) выбор одой или нескольких аминокислот в пределах сферы 10 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53) (таких как один или несколько из аминокислотных остатков, определенных в наборе 1 или наборе 2); и/или выбор одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах IVR1-6 (предпочтительно в пределах IVR 3, 5 или 6, более предпочтительно в пределах IVR 5 или IVR 6); и/или выбор одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах LR1-5 (предпочтительно в пределах LR1, LR2 или LR5, более предпочтительно в пределах LR5);ii) selecting one or more amino acids within a 10 Å sphere centered on the central carbon atom of a glycerol molecule in the active center (see FIG. 53) (such as one or more of the amino acid residues defined in set 1 or set 2); and / or the selection of one or more amino acid residues within IVR1-6 (preferably within IVR 3, 5 or 6, more preferably within IVR 5 or IVR 6); and / or selecting one or more amino acid residues within LR1-5 (preferably within LR1, LR2 or LR5, more preferably within LR5);

iii) определение того, являются ли один или несколько аминокислотных остатков, выбранных в соответствии со стадией (ii), высококонсервативными (особенно являются ли они остатками активного центра и/или частью мотива GDSХ, и/или частью мотива GANDY); иiii) determining whether one or more amino acid residues selected in accordance with step (ii) are highly conserved (especially if they are active center residues and / or part of the GDSX motif and / or part of the GANDY motif); and

модификацию в указанной исходной последовательности одной или нескольких аминокислот, выбранных в соответствии со стадией (ii), за исключением консервативных областей, идентифицированных в соответствии со стадией (iii).the modification in the specified initial sequence of one or more amino acids selected in accordance with stage (ii), with the exception of the conservative regions identified in accordance with stage (iii).

Таким образом, одна или несколько аминокислот, выбранных в подробно описанных выше способах, расположен не только в пределах сферы размером 10 Å с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (см. фиг.53) (такие как один или несколько аминокислотных остатков, определенных в наборе 1 или наборе 2), но также расположены в пределах одной или нескольких из IVR 1-6 (предпочтительно в пределах IVR 3, 5 или 6, более предпочтительно в пределах IVR 5 или IVR 6) или в пределах одной или нескольких из LR 1-5 (предпочтительно в пределах LR1, LR2 или LR5, более предпочтительно в пределах LR5).Thus, one or more amino acids selected in the methods described above is not only located within a 10 Å sphere centered on the central carbon atom of the glycerol molecule in the active center (see FIG. 53) (such as one or more amino acid residues defined in set 1 or set 2) but also located within one or more of IVR 1-6 (preferably within IVR 3, 5 or 6, more preferably within IVR 5 or IVR 6) or within one or more from LR 1-5 (preferably within LR1, LR2 and whether LR5, more preferably within LR5).

В одном из вариантов осуществления предпочтительные одна или несколько модификаций аминокислот находятся в пределах LR5. В том случае когда модификация(и) расположена в пределах LR5, модификация не является одной из тех, которые определенны в наборе 5. Таким образом, одна или несколько модификаций аминокислот не только попадают в область, определенную посредством LR5, но также состоят из аминокислот в пределах одной или нескольких из набора 2, набора 4, набора 6 или набора 7.In one embodiment, preferred one or more amino acid modifications are within LR5. In the case where the modification (s) is located within LR5, the modification is not one of those defined in set 5. Thus, one or more modifications of amino acids not only fall into the region defined by LR5, but also consist of amino acids in within one or more of set 2, set 4, set 6, or set 7.

Таким образом, сравнение по гомологии последовательностей может предусматривать одну или несколько из следующих ниже стадий:Thus, a sequence homology comparison may include one or more of the following steps:

i) выбор первой исходной липидацилтрансферазы;i) selection of a first parent lipid acyltransferase;

ii) идентификацию второй родственной липидацилтрансферазы с желаемой активностью;ii) identification of a second related lipid acyltransferase with the desired activity;

iii) сравнение указанной первой исходной липидацилтрансферазы и второй родственной липидацилтрансферазы;iii) comparing said first parent lipid acyltransferase and a second related lipid acyltransferase;

iv) идентификацию аминокислотных остатков, отличающихся у двух последовательностей; иiv) identification of amino acid residues that differ in the two sequences; and

v) модификацию в указанной исходной липидацилтрансферазе одного или нескольких из аминокислотных остатков, идентифицированных в соответствии со стадией (iv).v) a modification in the specified source lipid acyltransferase of one or more of the amino acid residues identified in accordance with stage (iv).

v) определение того, являются ли один или несколько аминокислотных остатков, выбранных в соответствии со стадией (iv), высококонсервативными (особенно являются ли они остатками активного центра, и/или частью мотива GDSХ, и/или частью мотива GANDY); иv) determining whether one or more amino acid residues selected in accordance with step (iv) are highly conserved (especially if they are active center residues and / or part of the GDSX motif and / or part of the GANDY motif); and

vi) модификацию в указанной исходной последовательности одного или нескольких из аминокислотных остатков, идентифицированных в соответствии со стадией (iv), за исключением консервативных областей, идентифицированных в соответствии со стадией (v).vi) a modification in the specified initial sequence of one or more of the amino acid residues identified in accordance with stage (iv), with the exception of conservative regions identified in accordance with stage (v).

Таким образом, указанная первая исходная липидацилтрансфераза может содержать любую из следующих ниже аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45.Thus, said first starting lipid acyltransferase may contain any of the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 45.

Таким образом, указанная вторая родственная липидацилтрансфераза может содержать любую из следующих ниже аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45.Thus, said second related lipid acyltransferase may contain any of the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 45.

Вариант фермента по сравнению с исходным ферментом должен содержать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления вариант фермента по сравнению с исходным ферментом может содержать, по меньшей мере 2, предпочтительно, по меньшей мере 3, предпочтительно, по меньшей мере 4, предпочтительно, по меньшей мере 5, предпочтительно, по меньшей мере 6, предпочтительно, по меньшей мере 7, предпочтительно, по меньшей мере 8, предпочтительно, по меньшей мере 9, предпочтительно, по меньшей мере 10 модификаций аминокислот.A variant of the enzyme compared to the starting enzyme must contain at least one amino acid modification. In some embodiments, the implementation of the variant of the enzyme compared with the original enzyme may contain at least 2, preferably at least 3, preferably at least 4, preferably at least 5, preferably at least 6, preferably at at least 7, preferably at least 8, preferably at least 9, preferably at least 10 modifications of the amino acids.

Таким образом, способы по настоящему изобретению могут предусматривать дополнительную стадию получения варианта фермента в композицию фермента и/или композицию пищевого продукта, такую как улучшенная хлебобулочная композиция.Thus, the methods of the present invention may include an additional step for producing an enzyme variant into an enzyme composition and / or a food product composition, such as an improved bakery composition.

Для сравнения последовательности полипептида GDSХ (исходная последовательность) с SEQ ID NO:2 (P01480), можно применять сравнение последовательностей, такое как парное сравнение (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html). Таким образом, можно определить и модифицировать эквивалентные аминокислоты в альтернативных исходных полипептидах GDSХ, которые соответствуют одной или нескольким из аминокислот, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 в отношении SEQ ID NO:2. Как легко поймут специалисты, при применении парного сравнения emboss, как правило, достаточно стандартных установок. Соответствующие остатки можно идентифицировать с применением "needle" для получения сравнения, охватывающего всю длину обоих последовательностей. Однако также возможно найти лучшую область сходства между двумя последовательностями с применением "water".To compare the sequence of the GDSX polypeptide (original sequence) with SEQ ID NO: 2 (P01480), a sequence comparison, such as pairwise comparison (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html), can be used. Thus, it is possible to determine and modify equivalent amino acids in the alternative source GDSX polypeptides that correspond to one or more of the amino acids defined in set 2, or set 4, or set 6, or set 7 in relation to SEQ ID NO: 2. As experts will easily understand, when using the emboss pair comparison, as a rule, standard settings are sufficient. Appropriate residues can be identified using a needle to obtain a comparison covering the entire length of both sequences. However, it is also possible to find a better area of similarity between the two sequences using "water".

Альтернативно, особенно в случаях, когда исходные полипептиды GDSХ обладают низкой гомологией с SEQ ID NO:2, соответствующие аминокислоты в альтернативных исходных полипептидах GDSХ, которые соответствуют одной или нескольким из аминокислот, определенных в наборе 2, наборе 4, наборе 6 или наборе 7 в отношении SEQ ID NO:2, можно определить посредством структурного сравнения со структурной моделью P10480, полученного посредством сравнения полученной из P10480 структурной модели со структурными координатами 1IVN.PDB и 1DEO.PDB с применением "Deep View Swiss-PDB viewer" (полученного с www.expasy.org/spdbv/) (фиг.53 и пример 1). Эквивалентные остатки идентифицируют как остатки, перекрывающиеся или находящиеся в непосредственной близости с остатками в полученной структурной модели P10480, как проиллюстрировано в таблице, сравнивающей набор 1 и набор 2 (см. раздел, озаглавленный "Определение наборов", здесь выше). Таким образом, другие полипептиды GDSX можно сравнивать по отношению к координатам кристалла 1IVN.PBD, и определять эквивалентные набору 1 остатки.Alternatively, especially in cases where the original GDSX polypeptides have low homology with SEQ ID NO: 2, the corresponding amino acids in the alternative original GDSX polypeptides that correspond to one or more of the amino acids defined in set 2, set 4, set 6, or set 7 in with respect to SEQ ID NO: 2, can be determined by structural comparison with the structural model P10480 obtained by comparing the structural model obtained from P10480 with the structural coordinates 1IVN.PDB and 1DEO.PDB using the "Deep View Swiss-PDB viewer" (obtained th with www.expasy.org/spdbv/) (53 and Example 1). Equivalent residues are identified as residues that overlap or are in close proximity to residues in the resulting structural model P10480, as illustrated in the table comparing set 1 and set 2 (see the section entitled “Set Definition”, above). Thus, other GDSX polypeptides can be compared with respect to the coordinates of the 1IVN.PBD crystal, and residues equivalent to a set of 1 can be determined.

Альтернативно, особенно в случаях, когда исходный полипептид GDSХ обладает низкой гомологией с SEQ ID NO:2, эквивалентные аминокислоты в альтернативных исходных полипептидах GDSХ, которые соответствуют одной или нескольким из аминокислот, определенных в наборе 2, или наборе 4, или наборе 6, или наборе 7 в отношении SEQ ID NO:2, можно определить из сравнения, полученного на основании базы данных PFAM (консенсус PFAM), модифицированного на основании структурного сравнения, как показано в Выравнивании 1 (фиг.55). Модификация на основе структурных моделей может являться необходимой для незначительного сдвига сравнения для обеспечения наибольшего перекрывания. Сравнение 1 (фиг.55) предоставляет руководство для этого.Alternatively, especially in cases where the starting GDSX polypeptide has low homology with SEQ ID NO: 2, equivalent amino acids in the alternative starting GDSX polypeptides that correspond to one or more of the amino acids defined in set 2, or set 4, or set 6, or set 7 in relation to SEQ ID NO: 2 can be determined from the comparison obtained from the PFAM database (PFAM consensus) modified based on the structural comparison, as shown in Alignment 1 (Fig. 55). Modification based on structural models may be necessary for a slight shift in comparison to provide the greatest overlap. Comparison 1 (FIG. 55) provides guidance for this.

Вариант фермента по настоящему изобретению предпочтительно не содержит одну или несколько из модификаций аминокислот, определенных в наборе 5.A variant of the enzyme of the present invention preferably does not contain one or more of the amino acid modifications defined in set 5.

Таким образом, вариант фермента можно получить с применением сайт-специфического мутагенеза.Thus, an enzyme variant can be obtained using site-specific mutagenesis.

Альтернативно мутации можно вводить случайным образом, например, с применением коммерческого набора, такого как набор GeneMorph PCR mutagenesis kit из Stratagene, или набор Diversify PCR random mutagenesis kit из Clontech. К способам оптимизации мутагенеза, основанного на ПЦР, который также можно сочетать с применением мутагенных аналогов ДНК, таких, как описаны в EP0 866 796, относится EP0 583 265. Для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками подходят технологии подверженной ошибкам ПЦР. К молекулярному преобразованию липаз относится WO 0206457.Alternative mutations can be introduced randomly, for example, using a commercial kit, such as the GeneMorph PCR mutagenesis kit from Stratagene, or the Diversify PCR random mutagenesis kit from Clontech. Methods for optimizing PCR-based mutagenesis, which can also be combined with mutagenic DNA analogs, such as those described in EP0 866 796, include EP0 583 265. Error prone PCR techniques are suitable for producing lipid acyltransferases with preferred characteristics. Molecular transformation of lipases includes WO 0206457.

Третий способ для получения новых последовательностей представляет собой фрагментирование неидентичных нуклеотидных последовательностей, или посредством применения ряда рестрикционных ферментов или такого фермента, как ДНКаза I, и повторную сборку полноразмерных нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные белки (далее здесь называют "перестановка"). Альтернативно можно применять одну или несколько неидентичных нуклеотидных последовательностей и вносить мутации в течение повторной сборки полноразмерной нуклеотидной последовательности. Для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками пригодны технологии перестановки ДНК и перестановки семейств. Пригодные способы для проведения "перестановки" можно найти в EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606. Перестановку также можно сочетать с другими формами мутагенеза ДНК, как описано в патенте США 6180406 и WO 01/34835.A third method for generating new sequences is the fragmentation of non-identical nucleotide sequences, or by the use of a number of restriction enzymes or an enzyme such as DNase I, and the reassembly of full-length nucleotide sequences encoding functional proteins (hereinafter referred to as "permutation"). Alternatively, one or more non-identical nucleotide sequences can be used and mutations introduced during the reassembly of the full-length nucleotide sequence. DNA permutation and family permutation technologies are suitable for producing lipid acyltransferases with preferred characteristics. Suitable methods for carrying out the "rearrangement" can be found in EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606. The rearrangement can also be combined with other forms of DNA mutagenesis, as described in US patent 6180406 and WO 01/34835.

Таким образом, в нуклеотидной последовательности можно получать множество участков направленных или случайных мутаций, или in vivo, или in vitro, и далее различными способами можно исследовать кодируемый вариант полипептида на улучшенную функциональность.Thus, in the nucleotide sequence, you can get many sections of directed or random mutations, either in vivo or in vitro , and then in various ways you can explore the encoded version of the polypeptide for improved functionality.

В качестве неограничивающего примера, кроме того, мутантные или природные варианты полинуклеотидной последовательности для получения новых вариантов можно рекомбинировать или с диким типом или с другими мутантными или природными вариантами. Такие новые варианты также можно исследовать на улучшенную функциональность кодируемого полипептида.As a non-limiting example, in addition, mutant or natural variants of the polynucleotide sequence to obtain new variants can be recombined with either the wild type or other mutant or natural variants. Such new options can also be investigated for improved functionality of the encoded polypeptide.

Для локализованного случайного мутагенеза и/или перестановки предпочтительно можно выбирать следующие области: IVR3, IVR5, IVR6, LR1, LR2, и/или LR5, наиболее предпочтительно LR5.For localized random mutagenesis and / or rearrangement, it is preferable to select the following regions: IVR3, IVR5, IVR6, LR1, LR2, and / or LR5, most preferably LR5.

Для получения библиотек вариантов можно применять микробных эукариотических или прокариотических экспрессирующих хозяев. Для обеспечения одинаковой экспрессии в пределах библиотеки вариантов предпочтительными могут быть системы с низкой копийностью, предпочтительно с одним фактом хромосомной экспрессии. Также предпочтительны экспрессирующие системы с высокой частотой трансформации, особенно для экспрессии больших библиотек вариантов (> 1000 колоний), таких как библиотеки, полученные с применением технологий случайного мутагенеза и/или перестановки.To obtain libraries of variants, microbial eukaryotic or prokaryotic expressing hosts can be used. To ensure uniform expression within a library of variants, low copy number systems, preferably with a single chromosome expression, may be preferred. Expressing systems with a high transformation frequency are also preferred, especially for expressing large variant libraries (> 1000 colonies), such as libraries obtained using random mutagenesis and / or rearrangement technologies.

Пригодные способы для применения эукариотического экспрессирующего хозяина, т.е. дрожжей, для получения ферментов описаны в EP1131416. Микробные эукариотические экспрессирующие хозяева, такие как дрожжи, могут быть предпочтительны для экспрессии библиотек вариантов, полученных с применением исходного гена эукариотической ацилтрансферазы.Suitable methods for using a eukaryotic expression host, i.e. yeast, for the production of enzymes are described in EP1131416. Microbial eukaryotic expression hosts, such as yeast, may be preferred for expression of variant libraries obtained using the original eukaryotic acyltransferase gene.

Пригодные способы с применением в качестве экспрессирующего хозяина для получения ферментов Bacillus, т.е. Bacillus subtilis описаны в WO 02/14490. Микробные прокариотические экспрессирующие хозяева, такие как Bacillus, могут быть предпочтительны для экспрессии библиотек вариантов, полученных с применением исходного гена прокариотической ацилтрансферазы, например, эталонной последовательности P10480 (SEQ ID NO:2).Suitable methods using as an expression host to obtain Bacillus enzymes, i.e. Bacillus subtilis are described in WO 02/14490. Microbial prokaryotic expression hosts, such as Bacillus , may be preferred for expression of variant libraries obtained using the parent prokaryotic acyltransferase gene, for example, the reference sequence P10480 (SEQ ID NO: 2).

Таким образом, вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению сохраняет по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 95%, предпочтительно, по меньшей мере 97%, предпочтительно, по меньшей мере 99% гомологии с исходным ферментом.Thus, the lipid acyltransferase variant of the present invention retains at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 97%, preferably at at least 99% homology with the starting enzyme.

Пригодные исходные ферменты могут включать в себя любой фермент с эстеразной или липазной активностью.Suitable starting enzymes may include any enzyme with esterase or lipase activity.

Предпочтительно исходный фермент сравнен с консенсусной последовательностью рfam00657.Preferably, the starting enzyme is compared with the consensus sequence pfam00657.

В предпочтительном варианте осуществления вариант фермента липидацилтрансферазы сохраняет или включает в себя по меньшей мере один или несколько аминокислотных остатков консенсусной последовательности рfam00657, находящихся в участках GDSХ, GANDY и HPT.In a preferred embodiment, a variant of the lipid acyltransferase enzyme stores or includes at least one or more amino acid residues of the consensus sequence pfam00657 located in the GDSX, GANDY and HPT regions.

Ферменты, такие как липазы без или с низкой липидацилтрансферазной активностью в водной среде, для введения или усиления трансферазной активности можно подвергнуть мутированию с применением средств молекулярного преобразования, таким образом, получая вариант фермента липидацилтрансферазы со значительной трансферазной активностью, пригодный для применения в композициях и способах по настоящему изобретению.Enzymes, such as lipases without or with low lipid acyltransferase activity in an aqueous medium, can be mutated to introduce or enhance transferase activity using molecular transformation means, thus obtaining a variant of a lipid acyltransferase enzyme with significant transferase activity, suitable for use in compositions and methods according to the present invention.

Таким образом, липидацилтрансфераза для применения по изобретению может представлять собой вариант с повышенной ферментативной активностью в отношении полярных липидов, предпочтительно гликолипидов, по сравнению с исходным ферментом. Предпочтительно такие варианты также обладают низкой или не обладают активностью в отношении полярных лизолипидов. Повышенная активность в отношении полярных липидов, предпочтительно гликолипидов, может являться результатом гидролиза и/или трансферазной активности или их сочетания.Thus, a lipid acyltransferase for use according to the invention may be a variant with increased enzymatic activity against polar lipids, preferably glycolipids, compared to the starting enzyme. Preferably, such variants also have low or no activity against polar lysolipids. Increased activity against polar lipids, preferably glycolipids, may result from hydrolysis and / or transferase activity, or a combination thereof.

Вариант липидацилтрансферазы для применения по изобретению может обладать уменьшенной активностью в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов по сравнению с исходным ферментом.The lipid acyltransferase variant for use in the invention may have reduced activity against triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides compared to the parent enzyme.

Таким образом, у варианта фермента может отсутствовать активность в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов. Низкая активность в отношении триглицеридов предпочтительна в вариантах белков, которые нужно использовать для применений в хлебопечении для обработки яиц или яичных продуктов и/или для рафинирования масел.Thus, an enzyme variant may lack activity against triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides. Low triglyceride activity is preferred in protein variants that are to be used for baking applications for processing eggs or egg products and / or for refining oils.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления вариант фермента может обладать высокой активностью в отношении диглицеридов и у него может отсутствовать или быть низкой активность в отношении триглицеридов.Thus, in one embodiment, the enzyme variant may have high activity against diglycerides and may lack or have low activity against triglycerides.

При обозначении здесь конкретных аминокислотных остатков нумерация представляет собой нумерацию, полученную при сравнении варианта последовательности с эталонной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2.When designating specific amino acid residues here, the numbering is the numbering obtained by comparing a variant of the sequence with the reference sequence represented as SEQ ID NO: 2.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно содержит одну или несколько из следующих ниже аминокислотных замен:In one aspect, the enzyme variant preferably contains one or more of the following amino acid substitutions:

S3A, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y; и/или S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y; and / or

L17A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или L17A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

S18A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W или Y; и/или S18A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W or Y; and / or

K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Y30A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; и/или Y30A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; and / or

G40A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или G40A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

W111A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиW111A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

V112А, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y; и/илиV112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y; and / or

A114C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиA114C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Y117A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; и/илиY117A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; and / or

L118A, С, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиL118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

P156A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиP156A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиD157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

G159A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиG159A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Q160A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y; и/илиQ160A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y; and / or

N161A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиN161A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

P162A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиP162A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

S163A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y; и/илиS163A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y; and / or

A164C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиA164C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

R165A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y; и/илиR165A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W or Y; and / or

S166A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y; и/илиS166A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y; and / or

Q167A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y; и/илиQ167A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y; and / or

K168A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиK168A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

V169A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y; и/илиV169A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y; and / or

V170A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y; и/илиV170A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y; and / or

E171A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиE171A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

A172C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиA172C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; и/илиY179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; and / or

H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиH180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

N181A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиN181A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно K; и/илиQ182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y, preferably K; and / or

M209A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиM209A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

L210 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиL210 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

R211 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиR211 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

N215 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиN215 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Y226A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; и/илиY226A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; and / or

Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; и/илиY230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; and / or

K284A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиK284A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

M285A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/илиM285A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

Q289A, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y; и/или Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y; and / or

V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y; и/или V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y; and / or

E309A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; и/или E309A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; and / or

S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y.S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y.

В дополнение или альтернативно к этому могут присутствовать одно или несколько расширений на C-конце. Предпочтительно дополнительное расширение на C-конце состоит из одной или нескольких алифатических аминокислот, предпочтительно неполярных аминокислот, более предпочтительно из I, L, V или G. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к варианту фермента, включающему в себя одно или несколько из следующих дополнений на C-конце: 318I, 318L, 318V, 318G.In addition or alternatively, one or more extensions at the C-terminus may be present. Preferably, the additional extension at the C-terminus consists of one or more aliphatic amino acids, preferably non-polar amino acids, more preferably I, L, V or G. Thus, the present invention further relates to an enzyme variant comprising one or more of the following additions at the C-terminus: 318I, 318L, 318V, 318G.

В том случае когда остатки в исходной основной цепи отличаются от остатков в P10480 (SEQ ID NO:2), как определено посредством гомологичного сравнения и/или структурного сравнения с P10480 и/или 1IVN, может быть желательным заменить остатки, выравнивающиеся с любым одним или несколькими из следующих ниже остатков в P10480 (SEQ ID NO:2): Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309 или Ser310, на найденный в P10480 остаток соответственно.In the case where the residues in the original backbone differ from the residues in P10480 (SEQ ID NO: 2), as determined by homologous comparison and / or structural comparison with P10480 and / or 1IVN, it may be desirable to replace the residues aligned with any one or a few of the following residues in P10480 (SEQ ID NO: 2): Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160 , Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Glg181, Asn215, L282, L282 or Ser310, for the residue found in P10480, respectively .

Найдено, что следующие ниже остатки дикого типа P10480 предпочтительны для сохранения хорошей активности, особенно хорошей трансферазной активности для галактолипида:, L17, W111, R221, S3, G40, N88, K22, Y117, L118, N181, M209, M285, E309, M23. Таким образом, вариант фермента предпочтительно содержит в любом одном или нескольких из этих участков найденный в P10480 аминокислотный остаток.It was found that the following wild-type residues P10480 are preferred to maintain good activity, especially good transferase activity for galactolipid :, L17, W111, R221, S3, G40, N88, K22, Y117, L118, N181, M209, M285, E309, M23 . Thus, a variant of the enzyme preferably contains in any one or more of these regions the amino acid residue found in P10480.

Варианты ферментов с повышенной гидролитической активностью в отношении полярного липида также могут обладать повышенной трансферазной активностью для полярного липида.Variants of enzymes with increased hydrolytic activity against the polar lipid may also have increased transferase activity for the polar lipid.

Варианты ферментов с повышенной гидролитической активностью в отношении фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (PC), также могут обладать повышенной трансферазной активностью для фосфолипида.Variants of enzymes with increased hydrolytic activity against a phospholipid, such as phosphatidylcholine (PC), may also have increased transferase activity for a phospholipid.

Варианты ферментов с повышенной гидролитической активностью в отношении галактолипида, такого как DGDG, также могут обладать повышенной трансферазной активностью для галактолипида.Variants of enzymes with increased hydrolytic activity against galactolipid, such as DGDG, may also have increased transferase activity for galactolipid.

Варианты ферментов с повышенной трансферазной активностью для фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (PC), также могут обладать повышенной гидролитической активностью в отношении фосфолипида.Enzyme variants with enhanced transferase activity for a phospholipid, such as phosphatidylcholine (PC), may also have increased hydrolytic activity with respect to the phospholipid.

Варианты ферментов с повышенной трансферазной активностью для галактолипида, такого как DGDG, также могут обладать повышенной гидролитической активностью в отношении галактолипида.Enzyme variants with enhanced transferase activity for a galactolipid, such as DGDG, may also have increased hydrolytic activity against galactolipid.

Варианты ферментов с повышенной трансферазной активностью для полярного липида также могут обладать повышенной гидролитической активностью в отношении полярного липида.Variants of enzymes with increased transferase activity for the polar lipid may also have increased hydrolytic activity against the polar lipid.

Таким образом, в связывание субстрата могут быть вовлечены один или несколько из следующих ниже участков: Leu17; Ala114; Tyr179; His180; Asn181; Met209; Leu210; Arg211; Asn215; Lys284; Met285; Gln289; Val290.Thus, one or more of the following sites may be involved in substrate binding: Leu17; Ala114; Tyr179; His180; Asn181; Met209; Leu210; Arg211; Asn215; Lys284; Met285; Gln289; Val290.

Вариант фермента по настоящему изобретению по сравнению с исходным ферментом может обладать одной или несколькими из следующих ниже функциональных характеристик:A variant of the enzyme of the present invention in comparison with the original enzyme may have one or more of the following functional characteristics:

1) повышенной относительной трансферазной активностью в отношении галактолипида (DG) по сравнению с PC, подсчитанной как % T_DG/T_PC (как проиллюстрировано в примере 8);1) increased relative transferase activity against galactolipid (DG) compared with PC, calculated as% T _DG / T _PC (as illustrated in example 8);

2) повышенной абсолютной трансферазной активностью в отношении галактолипида (DG) (как проиллюстрировано в примере 8);2) increased absolute transferase activity against galactolipid (DG) (as illustrated in example 8);

3) повышенной трансферазной активностью с применением галактолипида в качестве донора (T_DG) по отношению к гидролитической активности H_DG у галактолипида (DG) (как проиллюстрировано в примере 8);3) increased transferase activity using galactolipid as a donor (T _DG ) in relation to the hydrolytic activity of H _DG in galactolipid (DG) (as illustrated in example 8);

4) повышенной абсолютной трансферазной активностью в отношении PC (как проиллюстрировано в примере 8);4) increased absolute transferase activity against PC (as illustrated in example 8);

где DG представляет собой галактолипид (например, DGDG) (и также может быть обозначен здесь как GL), а PC представляет собой фосфолипид (например, лецитин). Варианты с повышенной активностью в отношении галактолипида включают в себя варианты в пределах категорий 1), 2) и 3), указанных выше. Варианты с повышенной активностью в отношении галактолипидов также могут обладать повышенной активностью у фосфолипидов (как для категории 4, выше).where DG is a galactolipid (e.g., DGDG) (and may also be referred to herein as GL), and PC is a phospholipid (e.g., lecithin). Options with increased activity against galactolipid include options within the categories 1), 2) and 3) indicated above. Options with increased activity against galactolipids may also have increased activity in phospholipids (as for category 4, above).

1. К варианту фермента с повышенной относительной трансферазной активностью в отношении DG по сравнению с PC, подсчитанной как %T1. The variant of the enzyme with increased relative transferase activity against DG compared with PC, calculated as% T _DGDg /T/ T _PCPC , может приводить модификация по одному или нескольким из следующих ниже остатков:, may result in a modification to one or more of the following residues:

-318, N215, L210, S310, Е309, Н180, N80, V112, Y30X (где X выбран из А, С, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), V290, Q289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), Q182.-318, N215, L210, S310, Е309, Н180, N80, V112, Y30X (where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R , S, T, V or W), V290, Q289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X (where X is selected from A, C , D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), Q182.

Как правило, предпочтительными могут являться одна или несколько из следующих ниже замен:Generally, one or more of the following substitutions may be preferred:

S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y, предпочтительно M, R, N, G, T, Q, P, Y, S, L, E, W, наиболее предпочтительно QS3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y, preferably M, R, N, G, T, Q , P, Y, S, L, E, W, most preferably Q

K22A, E, C, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно A, C, E или RK22A, E, C, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably A, C, E or R

Y30A, C, D, H, K, M, N, P, Q, R, T, V, W, G, I, L, S, M, A, R или E, предпочтительно H, T, W, N, D, C, Q, G, I, L, S, M, A, R или EY30A, C, D, H, K, M, N, P, Q, R, T, V, W, G, I, L, S, M, A, R or E, preferably H, T, W, N , D, C, Q, G, I, L, S, M, A, R or E

G40L, N, T, V или AG40L, N, T, V or A

N80N, R, D, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W или Y, предпочтительно H, I, Y, C, Q, M, S, W, L, N, R, D или FN80N, R, D, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W or Y, preferably H, I, Y, C, Q , M, S, W, L, N, R, D or F

P81A, C, D, E, F, G H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно I, M, F, G, V, Y, D, C или AP81A, C, D, E, F, GH, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably I, M, F, G, V, Y, D , C or A

K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно H, K, S или RK82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably H, K, S or R

N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно I, Y, M, T, Q, S, W, F, V или PN87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably I, Y, M, T, Q, S , W, F, V or P

N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно C, V, A или FN88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably C, V, A or F

V112CV112C

Y117A, С, D, E, F, H, T, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V или W, предпочтительно A, N, E, H, T, I, F, C, P или SY117A, C, D, E, F, H, T, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V or W, preferably A, N, E, H, T, I , F, C, P or S

L118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно FL118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably F

V112A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y, предпочтительно I, M, F, Y, N, E, T, Q, H или PV112A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y, preferably I, M, F, Y, N, E, T , Q, H or P

Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W, предпочтительно F, C, H, I, L, M, P, V или WY179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W, preferably F, C, H, I, L, M , P, V or W

H180K, Q, A, C, D, E, F, G, I, L, M, P, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно M, F, С, К или QH180K, Q, A, C, D, E, F, G, I, L, M, P, R, S, T, V, W or Y, preferably M, F, C, K or Q

N181A или VN181A or V

Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, или Y, предпочтительно KQ182A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, or Y, preferably K

M209L, K, M, A, C, D, E, F, G, H, I, N, P, Q, R, S, T, V, W, или Y, предпочтительно I, F, T, D, C, H, L, K, M или PM209L, K, M, A, C, D, E, F, G, H, I, N, P, Q, R, S, T, V, W, or Y, preferably I, F, T, D, C, H, L, K, M or P

L210 G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, C, F, K, P или Y, предпочтительно G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, Т, Y или FL210 G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, C, F, K, P or Y, preferably G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, Y or F

R211G, Q, K, D, A, C, E, F, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно G, Q, K, D, H, I, M, F, P, S, Y, N, C, L или WR211G, Q, K, D, A, C, E, F, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y, preferably G, Q, K, D, H , I, M, F, P, S, Y, N, C, L or W

N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно I, F, P, T, W, H или AN215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably I, F, P, T, W , H or A

Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W, предпочтительно I, T, G, D, R, E, V, M или S, наиболее предпочтительно I, D, R или EY230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, or W, preferably I, T, G, D, R, E, V , M or S, most preferably I, D, R or E

Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G, R, N или P, более предпочтительно R, T, D, K, N или PQ289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y, preferably F, W, H, I, Y, L , D, C, K, V, E, G, R, N or P, more preferably R, T, D, K, N or P

V290A, C, D, E, H, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или YV290A, C , D, E, H, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y

E309S, Q, R, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, T, V, W или Y, предпочтительно F, W, N, H, I, M, S, Q, R, A или YE309S, Q, R, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, T, V, W or Y, preferably F, W, N, H, I, M , S, Q, R, A or Y

S310A, P, T, H, M, K, G, C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W или Y, предпочтительно F, Y, C, L, K, A, P, T, H, M, K или GS310A, P, T, H, M, K, G, C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W or Y, preferably F, Y, C, L, K, A , P, T, H, M, K or G

-318 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, H или S.-318 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, H or S.

Предпочтительно к варианту фермента с повышенной относительной трансферазной активностью в отношении DG по сравнению с PC, подсчитанной как %T_DG/T_PC, может приводить одна или несколько из следующих ниже модификаций:Preferably, one or more of the following modifications can result in a variant of the enzyme with increased relative transferase activity against DG compared to PC, calculated as% T _DG / T _PC .

S3A, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y, предпочтительно M, R, N, G, T, Q, P, Y, S, L, E, W, наиболее предпочтительно QS3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y, preferably M, R, N, G, T, Q , P, Y, S, L, E, W, most preferably Q

G40L, N, T, V или AG40L, N, T, V or A

Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W, предпочтительно I, T, G, D, R, E, V, M или S, наиболее предпочтительно D, R или EY230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, or W, preferably I, T, G, D, R, E, V , M or S, most preferably D, R or E

Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G или P, более предпочтительно R, T, D, K или P.Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y, preferably F, W, H, I, Y, L , D, C, K, V, E, G or P, more preferably R, T, D, K or P.

К варианту фермента с повышенной относительной трансферазной активностью в отношении DG по сравнению с PC, подсчитанной как %T_DG/T_PC, приводит модификация одной или нескольких из следующих ниже модификаций:A variant of the enzyme with increased relative transferase activity against DG compared with PC, calculated as% T _DG / T _PC , leads to a modification of one or more of the following modifications:

-318Y, H или S-318Y, H or S

N215HN215H

L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q или TL210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q or T

S310A, P, T, H, M, K или GS310A, P, T, H, M, K or G

E309S, Q, A или RE309S, Q, A or R

H180K, T или QH180K, T or Q

N80N, R или DN80N, R or D

V112CV112C

Y30G, I, L, S, M, A, R или E, более предпочтительно Y30M, A или RY30G, I, L, S, M, A, R or E, more preferably Y30M, A or R

V290R, E, H или AV290R, E, H or A

Q289R, T, D или NQ289R, T, D or N

K22EK22E

G40LG40l

Y179V или RY179V or R

M209L, K или MM209L, K or M

L211G, Q, K или DL211G, Q, K or D

Y230V Y230V

G40Q, L или VG40Q, L or V

N88WN88w

N87R или D.N87R or D.

Для некоторых вариантов осуществления также могут быть пригодными следующие ниже замены:The following substitutions may also be suitable for some embodiments:

K22A или CK22A or C

P81GP81g

N87MN87M

Y117A, N, E, H или ТY117A, N, E, H or T

N181A или VN181A or V

Y230IY230I

V290HV290h

N87R, D, E или МN87R, D, E or M

Q182T.Q182T.

Предпочтительно остатки, модифицированные для увеличения отношения галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности, представляют собой один или несколько из следующих ниже: -318, N215, L210, E309, H180, N80.Preferably, the moieties modified to increase the ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity are one or more of the following: -318, N215, L210, E309, H180, N80.

Как правило, предпочтительны одна или несколько из следующих ниже замен:Generally, one or more of the following substitutions is preferred:

-318 Y, H или S, наиболее предпочтительно Y-318 Y, H or S, most preferably Y

N215HN215H

L210D, Q или ТL210D, Q or T

Е309Q или RE309Q or R

H180K или QH180K or Q

N80N, R или D.N80N, R or D.

2. К варианту с повышенной абсолютной трансферазной активностью в отношении DG может приводить модификация по одному или нескольким из следующих ниже остатков:2. The modification with one or more of the following residues may lead to a variant with increased absolute transferase activity against DG:

-318, N215, L210, S310, Е309, Н180, N80, V112, Y30X (где X выбран из A, С, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), V290, Q 289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), V290, N87, Q182, S3, S310, K82, A309.-318, N215, L210, S310, Е309, Н180, N80, V112, Y30X (where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R , S, T, V or W), V290, Q 289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X (where X is selected from A, C, D, E, G , H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), V290, N87, Q182, S3, S310, K82, A309.

В частности, к варианту с повышенной абсолютной трансферазной активностью в отношении DG может приводить одна или несколько из следующих ниже модификаций:In particular, one or more of the following modifications may result in a variant with increased absolute transferase activity against DG:

-318Y, H, S, A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V или W, предпочтительно Y, H, S или I-318Y, H, S, A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V or W, preferably Y, H, S or I

N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно H, I, F, P, T, W или A, наиболее предпочтительно H, S, L, R, YN215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably H, I, F, P, T, W or A, most preferably H, S, L, R, Y

L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, C, F, K, P или Y, предпочтительно D, Q, T, Y или FL210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, C, F, K, P or Y, preferably D, Q, T, Y or F

S310A, P, T, H, M, K, G, C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W или Y, предпочтительно F, Y, C, L, K или PS310A, P, T, H, M, K, G, C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W or Y, preferably F, Y, C, L, K or P

E309S, Q, R, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W или Y; предпочтительно S, Q, R, F, W, N, H, I, M или Y, наиболее предпочтительно S, Q, R, N, P или AE309S, Q, R, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W or Y; preferably S, Q, R, F, W, N, H, I, M or Y, most preferably S, Q, R, N, P or A

H180A, C, D, E, F, G, I, K, Q, L, M, P, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно K, Q, M, F или C, наиболее предпочтительно Т, К или QH180A, C, D, E, F, G, I, K, Q, L, M, P, R, S, T, V, W or Y; preferably K, Q, M, F or C, most preferably T, K or Q

N181A или VN181A or V

N80N, R, D, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W или Y, предпочтительно H, I, Y, C, Q, M, S, W, L, N, R, D или F, наиболее предпочтительно N, R, D, P, V, A или GN80N, R, D, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W or Y, preferably H, I, Y, C, Q , M, S, W, L, N, R, D or F, most preferably N, R, D, P, V, A or G

V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y; предпочтительно I, M, F, Y, N, E, T, Q, H или PV112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y; preferably I, M, F, Y, N, E, T, Q, H or P

Y30G, I, L, S, A, E, C, D, H, K, M, N, P, Q, R, T, V или W, предпочтительно H, T, W, N, D, C или QY30G, I, L, S, A, E, C, D, H, K, M, N, P, Q, R, T, V or W, preferably H, T, W, N, D, C or Q

V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или YV290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y

Q289A, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно R, E, G, P, N или RQ289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y; preferably R, E, G, P, N or R

K22A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно СK22A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably C

Y179A, С, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; предпочтительно F, C, H, I, L, M, P или W, более предпочтительно E, R, N, V, K, SY179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; preferably F, C, H, I, L, M, P or W, more preferably E, R, N, V, K, S

M209A, C, D, E, F, G, H, I, L, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно R, N, Y, E или VM209A, C, D, E, F, G, H, I, L, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably R, N, Y, E or V

R211A, C, E, F, G. H, I, L, M. N, P, Q, K, D, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно H, I, M, F, P, S, Y, N, C, L или W, наиболее предпочтительно RR211A, C, E, F, G. H, I, L, M. N, P, Q, K, D, R, S, T, V, W or Y, preferably H, I, M, F, P , S, Y, N, C, L or W, most preferably R

S310 C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W или Y, предпочтительно F, Y, C, L, K или PS310 C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W or Y, preferably F, Y, C, L, K or P

S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y, предпочтительно M, R, N, A, G, T, Q, P, Y или S наиболее предпочтительно Q или NS3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y, preferably M, R, N, A, G, T , Q, P, Y or S most preferably Q or N

K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно H, K, S, E или RK82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably H, K, S, E or R

P81A, C, D, E, F, G, H, I, K. L, M, N, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно I, M, F, V, Y, D, C или AP81A, C, D, E, F, G, H, I, K. L, M, N, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably I, M, F, V, Y, D, C or A

N87A, C, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, D, E, S, T, V, W или Y; предпочтительно L, G или AN87A, C, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, D, E, S, T, V, W or Y; preferably L, G or A

Y117A, N, E, H, T, C, D, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, V или W; предпочтительно I, F, C, P или SY117A, N, E, H, T, C, D, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, V or W; preferably I, F, C, P or S

N87A, C, F, G, H, I, K, L, P, Q, S, T, V, W или Y; предпочтительно I, Y, T, Q, S, W, F, V или PN87A, C, F, G, H, I, K, L, P, Q, S, T, V, W or Y; preferably I, Y, T, Q, S, W, F, V or P

Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно D или KQ182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y, preferably D or K

Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W, предпочтительно W, H, Q, L, P или C, наиболее предпочтительно T или GY230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W, preferably W, H, Q, L, P or C, most preferably T or G

D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y, предпочтительно CD157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y, preferably C

G40LG40l

Y226I.Y226I

-318Y, H или S-318Y, H or S

N215HN215H

S310A, P, T, H, M, K или GS310A, P, T, H, M, K or G

Е309S, Q или RE309S, Q or R

H180K или QH180K or Q

N80N, R или DN80N, R or D

V112СV112C

Y30G, I, L, S, M, A, R или Е, более предпочтительно Y30M, A или RY30G, I, L, S, M, A, R or E, more preferably Y30M, A or R

V290R, E, H или АV290R, E, H or A

Q289R или NQ289R or N

K22EK22E

Q40LQ40L

Y179VY179V

M209L, K или МM209L, K or M

L211G, Q, K или D.L211G, Q, K or D.

K22А или CK22A or C

Р81GP81G

N87 MN87 M

Y117A, N, E, H или ТY117A, N, E, H or T

N181A или VN181A or V

Y230 IY230 I

V290HV290h

N87R, D, E или МN87R, D, E or M

Q182T.Q182T.

Предпочтительно остатки, модифицированные для увеличения трансферазной активности для галактолипидного субстрата (DGDG), представляют собой один или несколько из следующих ниже: -318, N215, L210, E309, H180, N80.Preferably, residues modified to increase transferase activity for the galactolipid substrate (DGDG) are one or more of the following: -318, N215, L210, E309, H180, N80.

-318Y, H или S, наиболее предпочтительно Y-318Y, H or S, most preferably Y

N215HN215H

L210D, Q или ТL210D, Q or T

Е309Q или RE309Q or R

H180K или QH180K or Q

N80N, R или D.N80N, R or D.

3. К варианту фермента с повышенной трансферазной активностью T3. To a variant of the enzyme with increased transferase activity T _DGDg по отношению к гидролитической активности H in relation to the hydrolytic activity of H _DGDg в отношении DG может приводить модификация в одном или нескольких из следующих ниже остатков: with respect to DG, a modification may occur in one or more of the following residues:

Y230, S310, H180, Q289, G40, N88, Y179, N215, L210, N80, Y30X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), N87, M209, R211, S18X (где X конкретно выбран из A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W или Y).Y230, S310, H180, Q289, G40, N88, Y179, N215, L210, N80, Y30X (where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), N87, M209, R211, S18X (where X is specifically selected from A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W or Y).

Предпочтительно к варианту фермента с повышенной трансферазной активностью T_DG по отношению к гидролитической активности H_DG в отношении DG может приводить одна или несколько из следующих ниже модификаций:Preferably, one or more of the following modifications may result in a variant of the enzyme with increased transferase activity of T _DG with respect to the hydrolytic activity of H _DG with respect to DG:

Y230A, С, D, E, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, S, Т или W, предпочтительно W, H, Q, L, P или СY230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T or W, preferably W, H, Q, L, P or C

S310A, С, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W или Y, предпочтительно F, Y, C, L, К или PS310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W or Y, preferably F, Y, C, L, K or P

Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, или W, предпочтительно F, C, H, I, L, M, P или WY179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, or W, preferably F, C, H, I, L, M, P or W

H180А, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, V, W или Y, предпочтительно M, F или CH180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, V, W or Y, preferably M, F or C

Q289A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, V, W или Y; предпочтительно F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G или PQ289A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, V, W or Y; preferably F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G or P

G40A, C, D, E, F, H, I, K, M, N, P, R, S, T, W или Y; предпочтительно I, P, W или YG40A, C, D, E, F, H, I, K, M, N, P, R, S, T, W or Y; preferably I, P, W or Y

N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V или Y; предпочтительно I или HN88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V or Y; preferably I or H

N87A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W или Y; предпочтительно I, Y, T, Q, S, W, F, V или P.N87A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W or Y; preferably I, Y, T, Q, S, W, F, V or P.

Как правило, предпочтительны одна или несколько из следующих ниже замен (такие варианты ферментов могут обладать сниженной гидролитической активностью (галактолипид и/или фосфолипиды) и/или повышенной трансферазной активностью для галактолипида):Typically, one or more of the following substitutions is preferred (such enzyme variants may have reduced hydrolytic activity (galactolipid and / or phospholipids) and / or increased transferase activity for galactolipid):

Y179 E, R, N или QY179 E, R, N or Q

N215GN215G

L210D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V или SL210D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V or S

N80GN80G

Y30LY30L

N87G.N87G.

Как правило, предпочтительны одна или несколько из следующих ниже замен (такие варианты ферментов могут обладать сниженной гидролитической активностью (галактолипид и/или фосфолипиды) при сохранении значительной трансферазной активности для галактолипида:Typically, one or more of the following substitutions is preferred (such enzyme variants may have reduced hydrolytic activity (galactolipid and / or phospholipids) while maintaining significant transferase activity for galactolipid:

Y179 E, R, N, QY179 E, R, N, Q

N215 GN215 G

L210 D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V и SL210 D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V and S

N80 GN80 G

Y30 LY30 L

N87 GN87 g

H180 I, TH180 I, T

M209 YM209 Y

R211 D, T и GR211 D, T and G

S18 G, M и TS18 G, M and T

G40 R и MG40 R and M

N88 WN88 w

N87 C, D, R, E и G.N87 C, D, R, E and G.

4. К варианту фермента с повышенной абсолютной трансферазной активностью в отношении фосфолипида может приводить модификация одного или нескольких из следующих ниже остатков:4. A variant of the enzyme with increased absolute transferase activity against phospholipid may result in a modification of one or more of the following residues:

S3, D157, S310, Е309, Y179, N215, К22, Q289, М23, Н180, М209, L210, R211, Р81, V112, N80, L82, N88; N87.S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180, M209, L210, R211, P81 , V112, N80, L82, N88; N87.

Конкретные модификации, которые могут обеспечить вариант фермента с улучшенной трансферазной активностью для фосфолипида, можно выбрать из одной или нескольких из следующих ниже:Specific modifications that can provide a variant of the enzyme with improved transferase activity for phospholipid, you can choose from one or more of the following:

S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y; предпочтительно N, E, K, R, A, P или M, наиболее предпочтительно S3AS3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y; preferably N, E, K, R, A, P or M, most preferably S3A

D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K или CD157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K or C

S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y; предпочтительно S310TS310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y; preferably S310T

-318 E-318 E

E309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W или Y; предпочтительно Е309 R, E, L, R или AE309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W or Y; preferably E309 R, E, L, R or A

Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W; предпочтительно Y179 D, T, E, R, N, V, K, Q или S, более предпочтительно E, R, N, V, K или QY179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; preferably Y179 D, T, E, R, N, V, K, Q or S, more preferably E, R, N, V, K or Q

N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно N215 S, L, R или YN215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably N215 S, L, R or Y

K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно К22 E, R, C или AK22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably K22 E, R, C or A

Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно Q289 R, E, G, P или NQ289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W or Y; preferably Q289 R, E, G, P or N

M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно М23 K, Q, L, G, T или SM23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably M23 K, Q, L, G, T or S

H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно H180 Q, R или KH180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably H180 Q, R or K

М209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно М209 Q, S, R, A, N, Y, E, V или LM209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably M209 Q, S, R, A, N, Y, E, V or L

L210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно L210 R, A, V, S, T, I, W или ML210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably L210 R, A, V, S, T, I, W or M

R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W или Y; предпочтительно R211TR211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W or Y; preferably R211T

P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно P81GP81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably P81G

V112А, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, S, T, W или Y; предпочтительно V112CV112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W or Y; preferably V112C

N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно N80 R, G, N, D, P, T, E, V, A или GN80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably N80 R, G, N, D, P, T, E, V, A or G

L82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно L82N, S или EL82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably L82N, S or E

N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно N88CN88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably N88C

N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W или Y; предпочтительно N87M или G.N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y; preferably N87M or G.

К варианту фермента с повышенной абсолютной трансферазной активностью в отношении фосфолипида приводит модификация одного или нескольких из следующих ниже остатков:A modification of one or more of the following residues leads to a variant of the enzyme with increased absolute transferase activity against phospholipid:

S3 N, R, A, GS3 N, R, A, G

M23 K, Q, L, G, T, SM23 K, Q, L, G, T, S

H180 RH180 R

L82 GL82 G

Y179 E, R, N, V, K или QY179 E, R, N, V, K or Q

E309 R, S, L или A.E309 R, S, L or A.

5. Остатки, модификация которых приводит к повышенной трансферазной активности для галактолипидного субстрата (DGDG) и увеличению отношения галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности, включают в себя один или несколько из: -318, N215, L210, S310, E309, H180, N80, V112, Y30X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), V290, Q 289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X (где X выбран из A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V или W), Q182. 5. Residues, the modification of which leads to increased transferase activity for the galactolipid substrate (DGDG) and an increase in the ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity, include one or more of: -318, N215, L210, S310, E309, H180, N80, V112 , Y30X (where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W), V290, Q 289, K22 , G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X (where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q , R, S, T, V or W), Q182.

-318 Y, H или S-318 Y, H or S

N215HN215H

S310A, P, T, H, M, K или GS310A, P, T, H, M, K or G

E309S, A, Q или RE309S, A, Q or R

H180K или QH180K or Q

N80N, R или DN80N, R or D

V112CV112C

V290R, E, H или АV290R, E, H or A

Q289R или NQ289R or N

K22EK22E

G40LG40l

Y179VY179V

M209L, K или МM209L, K or M

K211G, Q, K или D.K211G, Q, K or D.

K22A или СK22A or C

P81GP81g

N87 MN87 M

Y117A, N, E, H или TY117A, N, E, H or T

N181A или VN181A or V

Y230IY230I

V290HV290h

N87R, D, E или МN87R, D, E or M

Q182T.Q182T.

Предпочтительно остатки, модифицированные для увеличения трансферазной активности для галактолипидного субстрата (DGDG) и/или увеличения отношения галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности представляют собой один или несколько из следующих ниже: -318, N215, L210, E309, H180, N80.Preferably, residues modified to increase the transferase activity for the galactolipid substrate (DGDG) and / or increase the ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity are one or more of the following: -318, N215, L210, E309, H180, N80.

-318 Y, H или S, более предпочтительно Y-318 Y, H or S, more preferably Y

N215HN215H

L210D, Q или TL210D, Q or T

E309Q или RE309Q or R

H180K или QH180K or Q

N80N, R или D.N80N, R or D.

6. Выявлено, что для сохранения хорошей активности, особенно хорошей трансферазной активности для галактолипида, предпочтительны следующие остатки дикого типа P10480:6. It was revealed that in order to maintain good activity, especially good transferase activity for galactolipid, the following wild-type P10480 residues are preferred:

W111, R211, N181, S3, L17, G40, N88, Y117, L118, N181, K22, M209, M285, M23.W111, R211, N181, S3, L17, G40, N88, Y117, L118, N181, K22, M209, M285, M23.

Предпочтительно данные остатки в варианте фермента сохранены.Preferably, these residues are preserved in an enzyme variant.

При получении варианта GDSХ-ацилтрансферазы для повышенной трансферазной активности в отношении галактолипидных субстратов, где исходный фермент несет остаток, соответствующий остаткам последовательности P10480 в положениях W111, R211, N181, S3, L17, G40, N88, Y117, L118, N181, K22, M209, M285, M23, отличный от остатка найденного в P10480, вариант может предпочтительно в соответствующем положении содержать замену для включения в него аминокислотного остатка, найденного в последовательности P10480.Upon receipt of the GDSX acyltransferase variant for increased transferase activity against galactolipid substrates, where the starting enzyme carries a residue corresponding to the residues of the sequence P10480 at positions W111, R211, N181, S3, L17, G40, N88, Y117, L118, N181, K22, M209 , M285, M23, other than the residue found in P10480, the variant may preferably at the appropriate position contain a substitution to include the amino acid residue found in the sequence P10480.

L17 предпочтительно представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток.L17 is preferably a hydrophobic amino acid residue.

7. Повышенной трансферазной активностью для галактолипидного субстрата (DGDG) и/или увеличенным отношением галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности могут обладать следующие ниже сочетания:7. The following combinations may have increased transferase activity for galactolipid substrate (DGDG) and / or an increased ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity:

N215H и -318YN215H and -318Y

N215H и L210D, Q или TN215H and L210D, Q or T

-318Y и L210D, Q или Т-318Y and L210D, Q or T

N215H и -318Y и L210D, Q или Т.N215H and -318Y and L210D, Q or T.

Также указанные выше сочетания необязательно могут включать в себя добавление аминокислоты на C-конце, такое как -318Y, H или S, или, предпочтительно -318Y.Also, the above combinations may optionally include the addition of an amino acid at the C-terminus, such as -318Y, H or S, or, preferably -318Y.

Также указанные выше сочетания необязательно могут включать в себя следующую ниже модификацию:Also, the above combinations may optionally include the following modification:

Таким образом, повышенной трансферазной активностью для галактолипидного субстрата (DGDG) и/или увеличенным отношением галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности может обладать одно или несколько из следующих ниже сочетаний:Thus, one or more of the following combinations may have increased transferase activity for the galactolipid substrate (DGDG) and / or an increased ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity:

Е309А, Q или R.E309A, Q or R.

N215H и -318Y, H или S, предпочтительно Y.N215H and -318Y, H or S, preferably Y.

L210D, Q или T и -318Y, H или S, предпочтительно Y.L210D, Q or T and -318Y, H or S, preferably Y.

N215H и Е309А, Q или RN215H and E309A, Q or R

L210D, Q или Т и Е309А, Q или RL210D, Q or T and E309A, Q or R

-318Y и Е309А, Q или R-318Y and E309A, Q or R

Также указанные выше сочетания необязательно могут включать в себя замену в положении Q182, предпочтительно Q182K.Also, the above combinations may optionally include a substitution at position Q182, preferably Q182K.

Повышенной трансферазной активностью для галактолипидного субстрата (DGDG), и/или увеличенным отношением галактолипидтрансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности, и/или повышенным отношением галактолипидтрансферазной активности к гидролитической активности могут обладать следующие ниже сочетания:The following combinations may possess increased transferase activity for the galactolipid substrate (DGDG), and / or an increased ratio of galactolipid transferase activity to phospholipid transferase activity, and / or an increased ratio of galactolipid transferase activity to hydrolytic activity:

N215H и N80GN215H and N80G

-318Y и N80G-318Y and N80G

L210D или Q и N80GL210D or Q and N80G

N215H и N88NN215H and N88N

-318Y и N88N-318Y and N88N

L210D или Q и N88NL210D or Q and N88N

N215H и Y30LN215H and Y30L

-318Y и Y30L-318Y and Y30L

L210D или Q и Y30LL210D or Q and Y30L

N215H и N87GN215H and N87G

-318Y и N87G-318Y and N87G

L210D или Q и N87GL210D or Q and N87G

N215H и Y179E, R, N или QN215H and Y179E, R, N or Q

-318Y и Y179E, R, N или Q-318Y and Y179E, R, N or Q

L210D или Q и Y179E, R, N или QL210D or Q and Y179E, R, N or Q

Как указано выше, при обозначении здесь конкретных аминокислотных остатков нумерация представляет собой нумерацию, полученную из сравнения варианта последовательности с эталонной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2.As indicated above, when referring to specific amino acid residues here, the numbering is the numbering obtained from comparing a variant of the sequence with the reference sequence shown as SEQ ID NO: 2.

Во избежание неопределенности, когда конкретная аминокислота указана в конкретном участке, например L118, например, это относится к конкретной аминокислоте остатка номер 118 в SEQ ID NO:2. Однако аминокислотный остаток в участке 118 в другом исходном ферменте может быть отличным от лейцина.For the avoidance of doubt, when a particular amino acid is indicated in a particular region, for example L118, for example, this refers to a specific amino acid of residue number 118 in SEQ ID NO: 2. However, the amino acid residue at site 118 in a different starting enzyme may be different from leucine.

Таким образом, когда указано заменить аминокислоту в остатке 118, хотя указание может быть сделано в отношении L118, специалист в данной области легко поймет, что когда исходный фермент отличен от исходного фермента, представленного в SEQ ID NO:2, замещаемая аминокислота может не быть лейцином. Следовательно, возможно, что при замене в исходном ферменте аминокислотной последовательности, которая не является ферментом с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2, новая (замещающая) аминокислота может являться такой же, как указана в SEQ ID NO:2. Например, это может происходить в том случае, когда аминокислота в указанном остатке 118 не является лейцином и, следовательно, отлична от аминокислоты в остатке 118 в SEQ ID NO:2. Другими словами, в остатке 118, например, если в исходном ферменте в данном положении находится отличная от лейцина аминокислота, данную аминокислоту по настоящему изобретению можно заменить на лейцин.Thus, when it is indicated to replace the amino acid at residue 118, although an indication may be made regarding L118, one skilled in the art will readily understand that when the starting enzyme is different from the starting enzyme shown in SEQ ID NO: 2, the substituted amino acid may not be leucine . Therefore, it is possible that when replacing an amino acid sequence in the original enzyme that is not an enzyme with the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2, the new (substituting) amino acid may be the same as that indicated in SEQ ID NO: 2. For example, this may occur when the amino acid at the indicated residue 118 is not leucine and, therefore, is different from the amino acid at the residue 118 in SEQ ID NO: 2. In other words, at residue 118, for example, if an amino acid other than leucine is present in the starting enzyme at this position, the amino acid of the present invention can be replaced with leucine.

Как применяют здесь, термин "липидацилтрансфераза" означает фермент, обладающий ацилтрансферазной активностью (как правило классифицируемой в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов (1992) Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry и Molecular Biology как E.C. 2.3.1.x), вследствие чего фермент способен к переносу ацильной группы с липида на один или несколько акцепторных субстратов, таких как один или несколько из следующих ниже: стерин; станол; углевод; белок; белковая субъединица; глицерин.As used here, the term "lipid acyltransferase" means an enzyme with acyltransferase activity (usually classified in accordance with the recommendations for the nomenclature of enzymes (1992) Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology as EC 2.3.1.x), as a result of which the enzyme is capable of transferring an acyl group from a lipid to one or more acceptor substrates, such as one or more of the following: sterol; stanol; carbohydrate; protein; protein subunit; glycerol.

Предпочтительно липидацилтрансфераза способна к переносу ацильной группы с липида, по меньшей мере, на стерин и/или станол, например, на холестерин.Preferably, the lipid acyltransferase is capable of transferring the acyl group from the lipid to at least sterol and / or stanol, for example cholesterol.

Предпочтительно вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению и/или для применения в способах и/или применениях настоящего изобретения способен к переносу ацильной группы с липида (как определено здесь) на один или несколько из следующих ниже субстратов-акцепторов ацила: стерин, станол, углевод, белок или его субъединицы или глицерин.Preferably, the lipid acyltransferase variant of the present invention and / or for use in the methods and / or applications of the present invention is capable of transferring an acyl group from a lipid (as defined herein) to one or more of the following acyl acceptor substrates: sterol, stanol, carbohydrate, protein or its subunits or glycerin.

Для некоторых аспектов "акцептор ацила" по настоящему изобретению может представлять собой любое соединение, включающее в себя гидроксильную группу (-OH), такое как, например, многоатомные спирты, включающие в себя глицерин; стерин; станолы; углеводы; гидроксикислоты, включающие в себя фруктовые кислоты, лимонную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту и аскорбиновую кислоту; белки или их субъединицы, такие как, например, аминокислоты, гидролизаты белков и пептиды (частично гидролизованный белок); и их смеси и производные. Предпочтительно "акцептор ацила" по настоящему изобретению не является водой.For some aspects, the “acyl acceptor” of the present invention may be any compound including a hydroxyl group (-OH), such as, for example, polyols, including glycerol; sterol; stanols; carbohydrates; hydroxyacids, including fruit acids, citric acid, tartaric acid, lactic acid and ascorbic acid; proteins or their subunits, such as, for example, amino acids, protein hydrolysates and peptides (partially hydrolyzed protein); and mixtures and derivatives thereof. Preferably, the “acyl acceptor” of the present invention is not water.

В одном из вариантов осуществления акцептор ацила предпочтительно не является моноглицеридом и/или диглицеридом.In one embodiment, the acyl acceptor is preferably not a monoglyceride and / or diglyceride.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно способен к переносу ацильной группы с липида на стерин и/или станол.In one aspect, the enzyme variant is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to sterol and / or stanol.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно способен к переносу ацильной группы с липида на углевод.In one aspect, the enzyme variant is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a carbohydrate.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно способен к переносу ацильной группы с липида на белок или его субъединицы. Таким образом, белковая субъединица может представлять собой одну или несколько из следующих ниже: аминокислоту, гидролизат белка, пептид, дипептид, олигопептид, полипептид.In one aspect, the enzyme variant is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a protein or its subunits. Thus, the protein subunit can be one or more of the following: amino acid, protein hydrolyzate, peptide, dipeptide, oligopeptide, polypeptide.

Таким образом, в белке или белковой субъединице акцептор ацила может представлять собой одно или несколько из следующих ниже составляющих белка или белковой субъединицы: серин, треонин, тирозин, или цистеин.Thus, in a protein or protein subunit, the acyl acceptor may be one or more of the following components of the protein or protein subunit: serine, threonine, tyrosine, or cysteine.

Когда белковая субъединица представляет собой аминокислоту, тогда аминокислота может представлять собой любую подходящую аминокислоту. Таким образом, аминокислота может представлять собой, например, одну или несколько из серина, треонина, тирозина или цистеина.When the protein subunit is an amino acid, then the amino acid can be any suitable amino acid. Thus, the amino acid can be, for example, one or more of serine, threonine, tyrosine or cysteine.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно способен к переносу ацильной группы с липида на глицерин.In one aspect, the enzyme variant is preferably capable of transferring an acyl group from lipid to glycerin.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно способен к переносу ацильной группы с липида на гидроксикислоту.In one aspect, the enzyme variant is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a hydroxy acid.

В одном из аспектов вариант фермента предпочтительно способен к переносу ацильной группы с липида на многоатомный спирт.In one aspect, the enzyme variant is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid to a polyhydric alcohol.

В одном из аспектов вариант липидацилтрансферазы также может быть способным к переносу ацильной группы с липида на стерин и/или станол, дополнительно быть способным к переносу ацильной группы с липида на один или несколько из следующих ниже: углевод, белок, белковая субъединица, глицерин.In one aspect, the lipid acyltransferase variant may also be capable of transferring an acyl group from a lipid to sterol and / or stanol, and additionally be capable of transferring an acyl group from a lipid to one or more of the following: carbohydrate, protein, protein subunit, glycerol.

Предпочтительно липидный субстрат, на который действует вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению, представляет собой один или несколько из следующих ниже липидов: фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин, триацилглицерид, кардиолипин, диглицерид или гликолипид, например, такой как, дигалактозилдиглицерид (DGDG) или моногалактозилдиглицерид (MGDG). Более предпочтительно вариант фермента по настоящему изобретению действует на один или оба из DGDG и MGDG. Предпочтительно вариант фермента по настоящему изобретению не обладает (или обладает только ограниченной) активностью в отношении дигалактозилмоноглицерида (DGMG) и моногалактозилмоноглицерида (MGMG). Таким образом, предпочтительно липидный субстрат не является одним или обоими из DGMG или MGMG. Данный липидный субстрат может быть обозначен здесь как "липидный донор ацила". Как применяют здесь, термин лецитин включает в себя фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.Preferably, the lipid substrate affected by the lipid acyltransferase variant of the present invention is one or more of the following lipids: a phospholipid, such as lecithin, for example phosphatidylcholine, triacylglyceride, cardiolipin, diglyceride or glycolipid, for example, such as digalactidyl or monogalactosyl diglyceride (MGDG). More preferably, an enzyme variant of the present invention acts on one or both of DGDG and MGDG. Preferably, the enzyme variant of the present invention does not have (or has only limited) activity against digalactosyl monoglyceride (DGMG) and monogalactosyl monoglyceride (MGMG). Thus, preferably, the lipid substrate is not one or both of DGMG or MGMG. This lipid substrate may be referred to herein as “lipid acyl donor”. As used herein, the term lecithin includes phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine and phosphatidylglycerol.

Как применяют здесь, термин "галактолипид" означает один или несколько из DGDG или DGMG.As used here, the term "galactolipid" means one or more of DGDG or DGMG.

Как применяют здесь, термин "фосфолипид" обозначает лецитин, включающий в себя фосфатидилхолин.As used here, the term "phospholipid" refers to lecithin, including phosphatidylcholine.

Как применяют здесь, термин "полярный липид" обозначает фосфолипиды и/или галактолипид, предпочтительно фосфолипиды и галактолипид.As used herein, the term “polar lipid” refers to phospholipids and / or galactolipid, preferably phospholipids and galactolipid.

Для некоторых аспектов липидный субстрат, на который действует вариант липидацилтрансферазы, предпочтительно представляет собой фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин.For some aspects, the lipid substrate upon which the lipid acyltransferase variant acts is preferably a phospholipid, such as lecithin, for example phosphatidylcholine.

Для некоторых аспектов липидный субстрат предпочтительно представляет собой гликолипид, например, такой как DGDG или MGDG.For some aspects, the lipid substrate is preferably a glycolipid, such as, for example, DGDG or MGDG.

Предпочтительно липидный субстрат представляет собой пищевой липид, то есть липидный компонент пищевого продукта.Preferably, the lipid substrate is a food lipid, that is, a lipid component of a food product.

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению предпочтительно неспособен или по существу не способен действовать на триглицерид и/или на 1-моноглицерид и/или 2-моноглицерид.For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention is preferably incapable or substantially incapable of acting on the triglyceride and / or 1-monoglyceride and / or 2-monoglyceride.

Таким образом, липидный субстрат или липидный донор ацила может представлять собой один или несколько липидов, присутствующих в одном или нескольких из следующих ниже субстратов: жиры, включающие в себя свиной, топленый жир или жир масла; масла, включающие в себя масла, экстрагированные или полученные из пальмового масла, подсолнечного масла, масла из соевых бобов, сафлоровое масло, масло из семян хлопка, масло из земляного ореха, кукурузное масло, оливковое масло, арахисовое масло, кокосовое масло и масло из рапсового семени. Лецитин из сои, рапсового семени или яичного желтка также представляет собой пригодный липидный субстрат. Липидный субстрат может представлять собой липид овса или другое вещество из растений, содержащее галактолипиды.Thus, a lipid substrate or an acyl lipid donor may be one or more lipids present in one or more of the following substrates: fats, including pork, ghee, or butter; oils including oils extracted or derived from palm oil, sunflower oil, soybean oil, safflower oil, cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, peanut oil, coconut oil and rapeseed oil seed. Lecithin from soy, rapeseed or egg yolk is also a suitable lipid substrate. The lipid substrate may be oat lipid or other plant material containing galactolipids.

В одном из аспектов липидный донор ацила предпочтительно представляет собой лецитин (такой как фосфатидилхолин) в яичном желтке.In one aspect, the acyl lipid donor is preferably lecithin (such as phosphatidylcholine) in egg yolk.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид можно выбрать из липидов с длиной цепей жирных кислот от 8 до 22 атомов углерода.For some aspects of the present invention, the lipid can be selected from lipids with chain lengths of fatty acids from 8 to 22 carbon atoms.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид можно выбрать из липидов с длиной цепей жирных кислот от 16 до 22 атомов углерода, более предпочтительно от 16 до 20 атомов углерода.For some aspects of the present invention, the lipid can be selected from lipids with chain lengths of fatty acids from 16 to 22 carbon atoms, more preferably from 16 to 20 carbon atoms.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения липид можно выбрать из липидов с длиной цепей жирных кислот не более чем 14 атомов углерода, соответственно из липидов с длиной цепей жирных кислот от 4 до 14 атомов углерода, соответственно от 4 до 10 атомов углерода, соответственно от 4 до 8 атомов углерода.For some aspects of the present invention, the lipid can be selected from lipids with a chain length of fatty acids of not more than 14 carbon atoms, respectively, from lipids with a chain length of fatty acids from 4 to 14 carbon atoms, respectively from 4 to 10 carbon atoms, respectively from 4 to 8 carbon atoms.

Таким образом, вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению может проявлять один или несколько из следующих ниже видов липазной активности: гликолипазная активность (E.C. 3.1.1.26), триацилглицероллипазная активность (E.C. 3.1.1.3), активность фосфолипазы A2 (E.C. 3.1.1.4) или активность фосфолипазы A1 (E.C. 3.1.1.32). Как применяют здесь, термин "гликолипазная активность" включает в себя "галактолипазную активность".Thus, the lipid acyltransferase variant of the present invention can exhibit one or more of the following types of lipase activity: glycolipase activity (EC 3.1.1.26), triacylglycerol lipase activity (EC 3.1.1.3), phospholipase A2 activity (EC 3.1.1.4) or phospholipase activity A1 (EC 3.1.1.32). As used here, the term "glycolipase activity" includes "galactolipase activity".

Таким образом, вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению может обладать, по меньшей мере, одним или несколькими из следующих ниже видов активности: гликолипазная активность (E.C. 3.1.1.26) и/или активность фосфолипазы A1 (E.C. 3.1.1.32) и/или активность фосфолипазы A2 (E.C. 3.1.1.4).Thus, the variant lipid acyltransferase of the present invention may have at least one or more of the following activities: glycolipase activity (EC 3.1.1.26) and / or phospholipase A1 activity (EC 3.1.1.32) and / or phospholipase A2 activity (EC 3.1.1.4).

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению может обладать, по меньшей мере, гликолипазной активностью (E.C. 3.1.1.26).For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention may have at least glycolipase activity (E.C. 3.1.1.26).

Таким образом, для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению может быть способным к переносу ацильной группы с гликолипида и/или фосфолипида на один или несколько из следующих ниже акцепторных субстратов: стерин, станол, углевод, белок, глицерин.Thus, for some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention may be capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to one or more of the following acceptor substrates: sterol, stanol, carbohydrate, protein, glycerol.

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению предпочтительно способен к переносу ацильной группы с гликолипида и/или фосфолипида на стерин и/или станол с формированием, по меньшей мере, сложного эфира стерина и/или сложного эфира станола.For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention is preferably capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to sterol and / or stanol to form at least sterol ester and / or stanol ester.

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению предпочтительно способен к переносу ацильной группы с гликолипида и/или фосфолипида на углевод с формированием, по меньшей мере, сложного эфира углевода.For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention is preferably capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to a carbohydrate to form at least a carbohydrate ester.

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению предпочтительно способен к переносу ацильной группы с гликолипида и/или фосфолипида на белок с формированием, по меньшей мере, сложного эфира белка (или конденсата белка с жирной кислотой).For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention is preferably capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to a protein to form at least a protein ester (or a protein condensate with a fatty acid).

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению предпочтительно способен к переносу ацильной группы с гликолипида и/или фосфолипида на глицерин с формированием, по меньшей мере, диглицерида и/или моноглицерида.For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention is preferably capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to glycerol to form at least diglyceride and / or monoglyceride.

Для некоторых аспектов вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению предпочтительно не проявляет триацилглицеринлипазной активности (E.C. 3.1.1.3).For some aspects, the lipid acyltransferase variant of the present invention preferably does not exhibit triacylglycerol lipase activity (E.C. 3.1.1.3).

В некоторых аспектах вариант липидацилтрансферазы может быть способен к переносу ацильной группы с липида на стерин и/или станол. Таким образом, в одном из вариантов осуществления "акцептор ацила" по настоящему изобретению может представлять собой или стерин, или станол, или сочетание стерина и станол. In some aspects, the lipid acyltransferase variant may be capable of transferring the acyl group from lipid to sterol and / or stanol. Thus, in one embodiment, the “acyl acceptor” of the present invention can be either sterol or stanol, or a combination of sterol and stanol.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления стерин и/или станол может содержать одну или несколько из следующих ниже структурных особенностей:Thus, in one embodiment, the sterol and / or stanol may contain one or more of the following structural features:

i) 3-бета гидроксильная группа или 3-альфа гидроксильная группа; и/илиi) a 3-beta hydroxyl group or a 3-alpha hydroxyl group; and / or

ii) Циклы A:B в цис-положении или циклы A:B в транс-положении или C₅-C₆ является ненасыщенной.ii) A: B cycles in the cis position or A: B cycles in the trans position or C ₅ -C ₆ is unsaturated.

Пригодные стериновые акцепторы ацила включают в себя холестерин и фитостерины, например альфа-ситостерин, бета-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, кампастерин, 5,6-дигидростерин, брассикастерин, альфа-спинастерин, бета-спинастерин, гамма-спинастерин, дельта-спинастерин, фукостерин, димостерин, аскостерин, серебистерин, эпистерин, анастерин, гипостерин, хондрилластерин, десмостерин, халиностерин, пролиферастерин, клионастерин, гликозиды стерина и другие природные или синтетические изомерные формы и производные.Suitable sterile acyl acceptors include cholesterol and phytosterols, for example alpha-sitosterol, beta-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, campasterol, 5,6-dihydrosterol, brassicasterin, alpha-spinasterin, beta-spinasterin, gamma, spinasterin, gamma, fucosterol, dimosterol, ascosterol, silveryterin, episterin, anasterin, hyposterol, chondrilasterin, desmosterin, chalinosterol, proliferafasterin, klionasterin, sterol glycosides and other natural or synthetic isomeric forms and derivatives.

Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения в качестве акцептора ацила может действовать более чем один стерин и/или станол, таким образом, в качестве акцептора ацила может действовать более чем два стерина и/или станола. Другими словами, таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения может быть получен более чем один сложный эфир стерина и/или сложный эфир станола. Таким образом, когда акцептором ацила является холестерин, в качестве акцепторов ацила также могут действовать один или несколько дополнительных стеринов или один или несколько станолов. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения in situ эфира холестерина в сочетании, по меньшей мере, с одним сложным эфиром стерина или сложным эфиром станола. Другими словами, для некоторых аспектов настоящего изобретения липидацилтрансфераза может переносить ацильную группу с липида на холестерин и, по меньшей мере, один дополнительный стерин и/или, по меньшей мере, один станол.Thus, in one aspect of the present invention, more than one sterol and / or stanol can act as an acyl acceptor, thus more than two sterol and / or stanol can act as an acyl acceptor. In other words, thus, in one aspect of the present invention, more than one sterol ester and / or stanol ester can be obtained. Thus, when cholesterol is an acyl acceptor, one or more additional sterols or one or more stanols can also act as acyl acceptors. Thus, in one aspect, the present invention relates to a method for producing an in situ cholesterol ester in combination with at least one sterol ester or stanol ester. In other words, for some aspects of the present invention, a lipid acyltransferase can transfer an acyl group from lipid to cholesterol and at least one additional sterol and / or at least one stanol.

В одном из аспектов стериновый акцептор ацила предпочтительно представляет собой один или несколько из следующих ниже: альфа-ситостерин, бета-ситостерин, стигмастерин, эргостерин и кампестерин.In one aspect, the acyl sterol acceptor is preferably one or more of the following: alpha-sitosterol, beta-sitosterol, stigmasterol, ergosterol and campesterol.

В одном из аспектов стериновый акцептор ацила предпочтительно представляет собой холестерин. В том случае когда акцептором ацила для варианта липидацилтрансферазы является холестерин, количество свободного холестерина в пищевом продукте по сравнению с пищевым продуктом до воздействия варианта липидацилтрансферазы и/или по сравнению с эквивалентным пищевым продуктом, не обработанным вариантом липидацилтрансферазы, уменьшено.In one aspect, the acyl sterol acceptor is preferably cholesterol. In the case where the acyl acceptor for the lipid acyltransferase variant is cholesterol, the amount of free cholesterol in the food product compared to the food product before exposure to the lipid acyltransferase variant and / or compared to an equivalent food product not treated with the lipid acyltransferase variant is reduced.

Пригодные станоловые акцепторы ацила включают в себя фитостанолы, например бета-ситостанол или ss-ситостанол.Suitable stanol acyl acceptors include phytostanols, for example beta-sitostanol or ss-sitostanol.

В одном из аспектов стериновый и/или станоловый акцептор ацила предпочтительно представляют собой стерин и/или станол, отличный от холестерина.In one aspect, the sterol and / or stanol acyl acceptor is preferably sterol and / or stanol other than cholesterol.

В некоторых аспектах пищевой продукт, полученный по настоящему изобретению, можно применять для уменьшения холестерина в сыворотке крови и/или для уменьшения липопротеинов низкой плотности. Холестерин сыворотки крови и липопротеины низкой плотности у людей ассоциированы с определенными болезнями, например, такими как атеросклероз и/или заболевание сердца. Таким образом, предусмотрено, что пищевые продукты, полученные по настоящему изобретению, можно применять для уменьшения риска таких заболеваний.In some aspects, the food product of the present invention can be used to reduce serum cholesterol and / or to reduce low density lipoproteins. Serum cholesterol and low density lipoproteins in humans are associated with certain diseases, such as atherosclerosis and / or heart disease. Thus, it is contemplated that food products of the present invention can be used to reduce the risk of such diseases.

Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению пищевого продукта по настоящему изобретению для применения в лечении и/или профилактике атеросклероза и/или заболевания сердца. Таким образом, в одном из аспектов пищевой продукт можно рассматривать как нутрицевтик.Thus, in one aspect, the present invention relates to the use of a food product of the present invention for use in the treatment and / or prevention of atherosclerosis and / or heart disease. Thus, in one aspect, the food product can be considered as nutraceutical.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к лекарственному средству, включающему в себя пищевой продукт по настоящему изобретению.In an additional aspect, the present invention relates to a medicament comprising a food product of the present invention.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания у человека или животного, где способ включает в себя введение пациенту эффективного количества пищевого продукта по настоящему изобретению.In an additional aspect, the present invention relates to a method for treating and / or preventing a disease in a human or animal, wherein the method comprises administering to the patient an effective amount of a food product of the present invention.

Таким образом, стериновый и/или станоловый "акцептор ацила" может находиться в пищевом продукте естественным образом. Альтернативно стерин и/или станол можно добавлять в пищевой продукт. В том случае когда стерин и/или станол добавляют к пищевому продукту, стерин и/или станол можно добавлять перед добавлением липидацилтрансферазы по настоящему изобретению, одновременно с ним, и/или после него. Таким образом, настоящее изобретение может включать в себя добавление экзогенных стеринов/станолов, особенно фитостеринов/фитостанолов, в пищевой продукт до добавления варианта фермента по настоящему изобретению или одновременно с ним.Thus, the sterol and / or stanol “acyl acceptor” can naturally occur in the food product. Alternatively, sterol and / or stanol can be added to the food product. In the case where sterol and / or stanol is added to the food product, sterol and / or stanol can be added before adding the lipid acyltransferase of the present invention, simultaneously with it, and / or after it. Thus, the present invention may include the addition of exogenous sterols / stanols, especially phytosterols / phytostanols, to a food product prior to or simultaneously with the addition of an enzyme variant of the present invention.

Для некоторых аспектов один или несколько стеринов, находящихся в пищевом продукте, можно конвертировать в один или несколько станолов до или в то же время, когда по настоящему изобретению добавляют вариант липидацилтрансферазы. Для преобразования стеринов в станолы можно применять любой пригодный способ. Например, преобразование можно осуществлять, например, посредством химической гидрогенизации. Преобразование можно проводить до добавления варианта липидацилтрансферазы по настоящему изобретению или одновременно с добавлением варианта липидацилтрансферазы по настоящему изобретению. Таким образом, ферменты для преобразования стерина в станолы указаны в WO00/061771.For some aspects, one or more sterols present in the food product can be converted to one or more stanols before or at the same time that the lipid acyltransferase variant is added in the present invention. Any suitable method can be used to convert sterols to stanols. For example, the conversion can be carried out, for example, by chemical hydrogenation. The conversion can be carried out before the addition of the lipid acyltransferase variant of the present invention or simultaneously with the addition of the lipid acyltransferase variant of the present invention. Thus, enzymes for converting sterol to stanols are indicated in WO00 / 061771.

Таким образом настоящее изобретение можно применять для получения в пищевом продукте сложных эфиров фитостанолов in situ. Сложные эфиры фитостанолов обладают повышенной растворимостью в липидных мембранах, биодоступностью и полезны для здоровья (см., например, WO92/99640).Thus, the present invention can be applied to obtain in situ phytostanol esters in a food product. Phytostanol esters have increased solubility in lipid membranes, bioavailability and health benefits (see, for example, WO92 / 99640).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сложный эфир станола и/или сложный эфир стерина может представлять собой ароматизатор и/или структурообразователь. В таких случаях настоящее изобретение относится к получению ароматизаторов и/или структурообразователей in situ.In some embodiments of the present invention, the stanol ester and / or sterol ester may be a flavoring and / or structuring agent. In such cases, the present invention relates to the production of flavorings and / or builders in situ .

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу получения сложного эфир стерина и/или сложного эфира станола из растений и лизолецитина в пищевом масле (таком как растительное масло, например, таком как масло из бобов сои) без образования свободных жирных кислот обработкой масла вариантом фермента по настоящему изобретению. В таких случаях полученный таким образом лизолецитин можно удалять с применением способа рафинирования. Можно использовать любой способ рафинирования, такой как один или несколько из известных способов рафинирования. Если необходимо, любые свободные жирные кислоты можно удалять посредством дезодорирования. Необходимо отметить, что никакой полученный в масле сложный эфир станола/стерина способом дезодорирования не удаляется. Таким образом, полученное пищевое масло содержит сложные эфиры стеринов и/или сложные эфиры станолов, которые могут обладать полезными питательными и/или нутрицевтическими эффектами, такими как уменьшение уровней холестерина в крови.In one embodiment, the present invention relates to a method for producing sterol ester and / or stanol ester from plants and lysolecithin in edible oil (such as vegetable oil, for example, such as soybean oil) without forming free fatty acids by treating the oil with an oil variant the enzyme of the present invention. In such cases, the lysolecithin thus obtained can be removed using a refining method. Any refining method may be used, such as one or more of the known refining methods. If necessary, any free fatty acids can be removed by deodorization. It should be noted that no stanol / sterol ester obtained in oil is removed by the deodorization method. Thus, the resulting edible oil contains sterol esters and / or stanol esters, which may have beneficial nutritional and / or nutraceutical effects, such as lowering blood cholesterol levels.

Пригодные масла, для которых можно проводить данный способ, представляют собой масла, среди прочего включающие в себя лецитин и стерин/станол. Таким образом, масло после обработки представляет собой неочищенное масло. Таким образом, пригодное в пищу масло может представлять собой одно или несколько из следующих ниже: масло ростков злаков, масло семян хлопка, масло льняного семени, пальмовое масло, арахисовое масло, масло семян рапса, кунжутное масло, соевое масло, подсолнечное масло и масло ростков пшеницы.Suitable oils for which this method can be carried out are oils, inter alia including lecithin and sterol / stanol. Thus, the oil after processing is a crude oil. Thus, edible oil may be one or more of the following: cereal germ oil, cottonseed oil, flaxseed oil, palm oil, peanut oil, rapeseed oil, sesame oil, soybean oil, sunflower oil and sprout oil wheat.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению может использовать в качестве акцептора ацила углевод. Углеводный акцептор ацила может представлять собой один или несколько из следующих ниже: моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид. Предпочтительно углевод представляет собой один или несколько из следующих ниже: глюкоза, фруктоза, ангидрофруктоза, мальтоза, лактоза, сахароза, галактоза, ксилоза, ксилоолигосахариды, арабиноза, мальтоолигосахариды, тагатоза, микротецин, аскопирон P, аскопирон T, кортальцерон.For some aspects of the present invention, the lipid acyltransferase variant of the present invention can use a carbohydrate as an acyl acceptor. The acyl carbohydrate acceptor may be one or more of the following: a monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide or polysaccharide. Preferably, the carbohydrate is one or more of the following: glucose, fructose, anhydrofructose, maltose, lactose, sucrose, galactose, xylose, xylo-oligosaccharides, arabinose, maltooligosaccharides, tagatose, microthecin, ascopyron P, ascopyron T, cortalcerone.

Таким образом, углеводный "акцептор ацила" может находиться в пищевых продуктах от природы. Альтернативно углевод можно добавлять в пищевой продукт. В том случае когда углевод добавляют в пищевой продукт, углевод можно добавлять перед добавлением варианта липидацилтрансферазы по настоящему изобретению, вместе с ним и/или после него.Thus, the carbohydrate "acyl acceptor" can be found in foods by nature. Alternative carbohydrate may be added to the food product. When a carbohydrate is added to the food product, the carbohydrate may be added before, together with and / or after the lipid acyltransferase variant of the present invention.

Сложные эфиры углеводов могут функционировать в пищевых продуктах как полноценные эмульгаторы. Таким образом, в том случае когда фермент действует для переноса ацильной группы на сахар, изобретение относится к получению второго эмульгатора в пищевом продукте in situ.Carbohydrate esters can function as complete emulsifiers in foods. Thus, in the case where the enzyme acts to transfer the acyl group to sugar, the invention relates to the production of a second emulsifier in an in situ food product.

В некоторых вариантах осуществления вариант липидацилтрансферазы может использовать в качестве акцептора ацила и стерин и/или станол и углевод.In some embodiments, the lipid acyltransferase variant may use acyl and sterol and / or stanol and carbohydrate as an acceptor.

Применение варианта липидацилтрансферазы, способной переносить ацильную группу на углевод, а также на стерин и/или станол, особенно предпочтительно для пищевых продуктов, содержащих яйца. В частности, присутствие сахаров, в частности глюкозы, в яйцах и яичных продуктах часто рассматривают как неблагоприятное. Яичный желток может содержать до 1% глюкозы. Как правило, яичные продукты или продукты, основанные на яичных продуктах, для удаления части или всей этой глюкозы можно обрабатывать оксидазой глюкозы. Однако по настоящему изобретению этот нежелательный сахар можно легко удалить посредством "этерификации" сахара с формированием сложного эфира сахара.The use of a variant of lipid acyltransferase capable of transferring an acyl group to a carbohydrate, as well as to sterol and / or stanol, is particularly preferred for food products containing eggs. In particular, the presence of sugars, in particular glucose, in eggs and egg products is often considered unfavorable. Egg yolk may contain up to 1% glucose. Typically, egg products or products based on egg products can be treated with glucose oxidase to remove part or all of this glucose. However, in the present invention, this unwanted sugar can be easily removed by “esterifying” the sugar to form a sugar ester.

Для некоторых аспектов настоящего изобретения вариант липидацилтрансферазы по настоящему изобретению в качестве акцептора ацила может использовать белок. Таким образом, белок может представлять собой один несколько из белков, находящихся в пищевом продукте, например в молочном продукте и/или мясном продукте. В качестве неограничивающих примеров пригодные белки могут представлять собой белки, находящиеся в твороге или сыворотке, такие как лактоглобулин. Другие пригодные белки включают в себя яичный овальбумин, глиадин, глютенин, пуроиндолин, переносящие липиды белки из злаков и миозин из мяса.For some aspects of the present invention, the lipid acyltransferase variant of the present invention can use a protein as an acyl acceptor. Thus, the protein may be one of several of the proteins found in a food product, for example in a dairy product and / or meat product. By way of non-limiting examples, suitable proteins may be those found in cottage cheese or whey, such as lactoglobulin. Other suitable proteins include egg ovalbumin, gliadin, glutenin, puroindoline, lipid-transporting proteins from cereals and myosin from meat.

Предпочтительно исходный фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может отличаться по следующим критериям:Preferably, the starting lipid acyltransferase enzyme of the present invention may differ according to the following criteria:

(i) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно определить как активность по переносу сложного эфира, где ацильная часть исходной эфирной связи липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с формированием нового сложного эфира; и(i) the enzyme has acyltransferase activity, which can be defined as ester transfer activity, where the acyl portion of the initial ether linkage of the acyl lipid donor is transferred to the acyl acceptor to form a new ester; and

(ii) фермент содержит аминокислотный мотив GDSX, где X представляет собой один или несколько из следующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S.(ii) the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S.

Предпочтительно X из мотива GDSX представляет собой L. Таким образом, предпочтительно фермент по настоящему изобретению включает в себя аминокислотный мотив GDSL.Preferably X from the GDSX motif is L. Thus, preferably, the enzyme of the present invention includes the GDSL amino acid motif.

Мотив GDSX состоит из четырех консервативных аминокислот. Предпочтительно серин в мотиве представляет собой каталитический серин фермента липидацилтрансферазы. Таким образом, серин мотива GDSX может находиться в положении, соответствующем Ser-16 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, как указано в Brumlik и Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064).The GDSX motif consists of four conservative amino acids. Preferably, the serine in the motif is a catalytic serine of a lipid acyltransferase enzyme. Thus, the serine of the GDSX motif may be in the position corresponding to Ser-16 in the lipolytic enzyme Aeromonas hydrophila , as described in Brumlik and Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064).

Для определения того, есть ли в белке мотив GDSX по настоящему изобретению, предпочтительно последовательность сравнивают с профилями скрытой марковской модели (профили HMM) базы данных рfam.To determine whether a GDSX motif of the present invention is present in a protein, the sequence is preferably compared to profiles of the hidden Markov model (HMM profiles) of the pfam database.

Pfam представляет собой базу данных семейств белковых доменов. Pfam содержит выверенные сравнения множества последовательностей для каждого семейства, а также профиль скрытых марковских моделей (профиль HMM) для идентификации этих доменов в новых последовательностях. Введение в pfam можно найти у Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Скрытые марковские модели применяют в ряде баз данных, стремящихся классифицировать белки, для обзора см. Bateman A and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.Pfam is a database of protein domain families. Pfam contains verified comparisons of multiple sequences for each family, as well as a hidden Markov model profile (HMM profile) to identify these domains in new sequences. An introduction to pfam can be found in Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. thirty; 276-280. Hidden Markov models are used in a number of databases seeking to classify proteins; for a review, see Bateman A and Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve& db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve& db = PubMed & list_uids = 12230032 & dopt = Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&

db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstractdb = PubMed & list_uids = 11752314 & dopt = Abstract

Для подробного разъяснения скрытых марковских моделей и того, как их применяют в базе данных pfam см. Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. Пакет программного обеспечения Hammer можно получить из Washington University, St Louis, USA.For a detailed explanation of hidden Markov models and how they are used in the pfam database, see Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. The Hammer software package is available from Washington University, St Louis, USA.

Альтернативно мотив GDSX можно идентифицировать с применением пакета программного обеспечения Hammer, инструкции предоставлены в Durbin R, Eddy S, и Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 и ссылках в ней, и профиль HMMER2, предоставленный в пределах данной спецификации.Alternatively, the GDSX motif can be identified using the Hammer software package; instructions are provided in Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 and the references therein, and the HMMER2 profile provided within this specification.

К базе данных PFAM можно получить доступ, например, через несколько серверов, в настоящее время расположенных на следующих ниже веб-сайтах:The PFAM database can be accessed, for example, through several servers currently located on the following websites:

http://www.sanger.ac.uk/Software/pfam/index.shtmlhttp://www.sanger.ac.uk/Software/pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/http://pfam.cgb.ki.se/

База данных предлагает средство поиска, где можно вводить белковую последовательность. Затем с применением параметров по умолчанию базы данных белковую последовательность анализируют на присутствие доменов pfam. Домен GDSX является известным в базе данных доменом, и по существу распознается его присутствие в любой введенной в запросе последовательности. База данных возвращает сравнение консенсусной последовательности pfam00657 с вводимой в запросе последовательностью.The database offers a search tool where you can enter the protein sequence. Then, using the default parameters of the database, the protein sequence is analyzed for the presence of pfam domains. The GDSX domain is a domain known in the database, and essentially its presence in any sequence entered in the request is recognized. The database returns a comparison of the consensus sequence pfam00657 with the sequence entered in the query.

Множественное сравнение, включающее в себя Aeromonas salmonicida или Aeromonas hydrophila, можно получить:Multiple comparisons, including Aeromonas salmonicida or Aeromonas hydrophila, can be obtained:

a) вручнуюa) manually

получение сравнения представляющего интерес белка с консенсусной последовательностью pfam00657 и получение сравнения P10480 с консенсусной последовательностью pfam00657 по описанной выше процедуре;obtaining a comparison of the protein of interest with the pfam00657 consensus sequence and obtaining a comparison of P10480 with the pfam00657 consensus sequence according to the above procedure;

илиor

b) с помощью базы данных.b) using the database.

После идентификации консенсусной последовательности рfam00657 база данных предоставляет возможность показать сравнение вводимой в запросе последовательности по выбранному сравнению консенсусной последовательности pfam00657. P10480 является частью этого выбранного сравнения и обозначается как GCAT_AERHY. И вводимая в запросе последовательность и P10480 отображаются в одном и том же окне.After identifying the pfam00657 consensus sequence, the database provides the ability to show a comparison of the sequence entered in the query against the selected pfam00657 consensus sequence comparison. P10480 is part of this selected comparison and is denoted as GCAT_AERHY. Both the sequence entered in the request and P10480 are displayed in the same window.

Эталонная последовательность Aeromonas hydrophila: Aeromonas hydrophila reference sequence:

Остатки липазы Aeromonas hydrophila GDSX пронумерованы в файле P10480 в NCBI, номера в данном тексте относятся к номерам, присвоенным в данном файле, который в настоящем изобретении используют для определения конкретных аминокислотных остатков, которые в предпочтительном варианте осуществления присутствуют в ферментах липидацилтрансферазы по изобретению.The Aeromonas hydrophila GDSX lipase residues are numbered in file P10480 in the NCBI, the numbers in this text refer to the numbers assigned in this file, which in the present invention are used to determine the specific amino acid residues that, in a preferred embodiment, are present in the lipid acyltransferase enzymes of the invention.

Проводили сравнение pfam (фиг.33 и фиг.34):A comparison of pfam (FIG. 33 and FIG. 34) was performed:

Можно распознать следующие ниже консервативные остатки, и в предпочтительном варианте осуществления они могут присутствовать в вариантах ферментов для применения в композициях и способах по изобретению;The following conserved residues can be recognized, and in a preferred embodiment, they may be present in enzyme variants for use in the compositions and methods of the invention;

где 'hid' означает гидрофобный остаток, выбранный из Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.where 'hid' means a hydrophobic residue selected from Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.

Предпочтительно исходный фермент липидацилтрансфераза и/или его вариант для применения в композициях/способах по изобретению можно сравнивать с применением консенсусной последовательности рfam00657.Preferably, the parent lipid acyltransferase enzyme and / or its variant for use in the compositions / methods of the invention can be compared using the consensus sequence pfam00657.

Предпочтительно положительное совпадение с профилем скрытой марковской модели (профиль HMM) семейства доменов pfam00657 указывает на присутствие домена GDSL или GDSX по настоящему изобретению.Preferably, a positive match with the hidden Markov model profile (HMM profile) of the pfam00657 domain family indicates the presence of the GDSL or GDSX domain of the present invention.

Предпочтительно при сравнении с консенсусной последовательностью pfam00657 исходная липидацилтрансфераза и/или ее вариант для применения в композициях/способах по изобретению обладает, по меньшей мере, одним, предпочтительно более чем одним, предпочтительно - более чем двумя, из следующих ниже: участок GDSX, участок GANDY, участок HPT. Таким образом, исходная липидацилтрансфераза и/или ее вариант может обладать участком GDSX и участком GANDY. Альтернативно исходный фермент и/или его вариант может обладать участком GDSX и участком HPT. Предпочтительно исходный фермент и/или его вариант содержит, по меньшей мере, участок GDSX.Preferably, when compared with the consensus sequence pfam00657, the starting lipid acyltransferase and / or its variant for use in the compositions / methods of the invention has at least one, preferably more than one, preferably more than two, of the following: GDSX section, GANDY section HPT site. Thus, the starting lipid acyltransferase and / or its variant may have a GDSX region and a GANDY region. Alternatively, the parent enzyme and / or variant thereof may have a GDSX region and an HPT region. Preferably, the parent enzyme and / or variant thereof comprises at least a GDSX region.

Предпочтительно при сравнении с консенсусной последовательностью pfam00657 исходный фермент и/или его вариант для применения в композициях/способах по изобретению по сравнению с эталонной полипептидной последовательностью A.hydrophilia обладает, по меньшей мере, одним, предпочтительно более чем одним, предпочтительно более чем двумя, предпочтительно более чем тремя, предпочтительно более чем четырьмя, предпочтительно более чем пятью, предпочтительно более чем шестью, предпочтительно более чем семью, предпочтительно более чем восемью, предпочтительно более чем девятью, предпочтительно более чем десятью, предпочтительно более чем одиннадцатью, предпочтительно более чем двенадцатью, предпочтительно более чем тринадцатью, предпочтительно более чем четырнадцатью из следующих ниже аминокислотных остатков, т.е. SEQ ID NO:26: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.Preferably, when compared with the consensus sequence pfam00657, the parent enzyme and / or its variant for use in the compositions / methods of the invention, in comparison with the A. polyphony reference polypeptide sequence, has at least one, preferably more than one, preferably more than two, preferably more than three, preferably more than four, preferably more than five, preferably more than six, preferably more than seven, preferably more than eight, preferably Tel'nykh more than nine, preferably more than ten, preferably more than eleven, preferably more than twelve, preferably more than thirteen, preferably more than fourteen of the following amino acid residues, i.e. SEQ ID NO: 26: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.

Домен GDSX pfam00657 является уникальным идентификатором, отличающим обладающие данным доменом белки от других ферментов.The GDSX domain pfam00657 is a unique identifier that distinguishes proteins with this domain from other enzymes.

Консенсусная последовательность рfam00657 представлена на фигуре 1 как SEQ ID NO:1. Она получена из идентификации семейства pfam 00657, база данных версии 6, которое здесь также может быть обозначено как рfam00657.6.The consensus sequence pfam00657 is shown in FIG. 1 as SEQ ID NO: 1. It is derived from the identification of the pfam 00657 family, version 6 database, which can also be referred to as pfam00657.6 here.

Консенсусная последовательность может быть обновлена при использовании последующих выпусков базы данных pfam.The consensus sequence may be updated using subsequent releases of the pfam database.

Например, на фиг. 33 и 34 показано сравнение pfam семейства 00657 из базы данных версии 11, которое здесь также может быть обозначено как рfam00657.11.For example, in FIG. 33 and 34 show a comparison of the pfam family 00657 from the database version 11, which can also be referred to as pfam00657.11 here.

Наличие участков GDSX, GANDY и HPT выявлено в семействе pfam 00657 с применением обоих выпусков базы данных. Для идентификации семейства pfam 00657 можно применять последующие выпуски базы данных pfam.The presence of GDSX, GANDY, and HPT plots was detected in the pfam 00657 family using both database releases. Subsequent releases of the pfam database can be used to identify the pfam 00657 family.

Предпочтительно исходный фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно охарактеризовать с применением следующих критериев:Preferably, the starting lipid acyltransferase enzyme of the present invention can be characterized using the following criteria:

(iii) фермент содержит His-309 или содержит гистидиновый остаток в положении, соответствующем His-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фиг.2 (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:26).(iii) the enzyme contains His-309 or contains a histidine residue at the position corresponding to His-309 in the lipolytic enzyme Aeromonas hydrophila shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 26).

Предпочтительно аминокислотный остаток мотива GDSX представляет собой L.Preferably, the amino acid residue of the GDSX motif is L.

В SEQ ID NO:26 первые 18 аминокислотных остатков формируют сигнальную последовательность. His-309 полноразмерной последовательности, являющейся белком, включающим в себя сигнальную последовательность, соответствует His-291 зрелой части белка, т.е. последовательности без сигнальной последовательности.In SEQ ID NO: 26, the first 18 amino acid residues form a signal sequence. The His-309 full-length sequence, which is a protein including a signal sequence, corresponds to the His-291 mature portion of the protein, i.e. sequences without signal sequence.

Предпочтительно исходный фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит следующую каталитическую триаду: Ser-16, Asp-116 и His-291 или содержит остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина, соответственно, в положениях, соответствующих Ser-16, Asp-116 и His-291 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фиг.2 (SEQ ID NO:2) или в положениях, соответствующих Ser-34, Asp-134 и His-309 полноразмерной последовательности, показанной на фиг.28 (SEQ ID NO:26). Как указано выше, в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:26, первые 18 аминокислотных остатков формируют сигнальную последовательность. Ser-34, Asp-134 и His-309 полноразмерной последовательности, являющейся белком, включающим в себя сигнальную последовательность, соответствуют Ser-16, Asp-116 и His-291 зрелой части белка, т.е. последовательности без сигнальной последовательности. В консенсусной последовательности рfam00657, как представлено на фиг.1 (SEQ ID NO:1), остатки активного центра соответствуют Ser-7, Asp-157 и His-348.Preferably, the starting lipid acyltransferase enzyme of the present invention contains the following catalytic triad: Ser-16, Asp-116 and His-291 or contains a serine residue, an aspartic acid residue and a histidine residue, respectively, at the positions corresponding to Ser-16, Asp-116 and His -291 in the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) or at the positions corresponding to Ser-34, Asp-134 and His-309 of the full length sequence shown in FIG. 28 (SEQ ID NO: 26 ) As indicated above, in the sequence shown in SEQ ID NO: 26, the first 18 amino acid residues form a signal sequence. Ser-34, Asp-134, and His-309 of a full-length sequence, which is a protein including a signal sequence, correspond to the mature part of Ser-16, Asp-116, and His-291, i.e. sequences without signal sequence. In the consensus sequence pfam00657, as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), the remains of the active center correspond to Ser-7, Asp-157 and His-348.

(i) фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно определить как активность по переносу сложного эфира, где ацильная часть исходной эфирной связи первого липидного донора ацила переносится на акцептор ацила с формированием нового сложного эфира; и(i) the enzyme possesses acyltransferase activity, which can be defined as ester transfer activity, where the acyl portion of the initial ether linkage of the first lipid acyl donor is transferred to the acyl acceptor to form a new ester; and

(ii) фермент содержит, по меньшей мере, Gly-14, Asp-15, Ser-16, Asp-116 и His-191 в положениях, соответствующих ферменту Aeromonas hydrophila на фиг.2 (SEQ ID NO:2), эквивалентных положениям Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и His-309 соответственно на фиг.28 (SEQ ID NO:26).(ii) the enzyme contains at least Gly-14, Asp-15, Ser-16, Asp-116 and His-191 at positions corresponding to the Aeromonas hydrophila enzyme in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) equivalent to the positions Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134, and His-309, respectively, in FIG. 28 (SEQ ID NO: 26).

Таким образом, исходный фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению может быть получен, предпочтительно получен из организмов одного или нескольких из следующих ниже родов: Aeromonas, Corynebacterium, Novosphingobium, Termobifida, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.Thus, the initial lipid acyltransferase enzyme according to the present invention may be prepared, preferably derived from organisms of one or more of the following genera: Aeromonas, Corynebacterium, Novosphingobium, Termobifida , Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter , Vibrionaceae , Xylella , Sulfolobus , Aspergillus , Schizosaccharomyces , Listeria , Neisseria , Mesorhizobium , Ralstonia , Xanthomonas and Candida .

Таким образом, исходный фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может быть получен, предпочтительно получен из одного или нескольких из следующих ниже организмов: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, виды Bacillus, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Corynebacterium efficens, Novosphingobium aromaticivorans, Termobifida fusca и Candida parapsilosis.Thus, the initial lipid acyltransferase enzyme according to the present invention may be prepared, preferably derived from one or more of the following organisms: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus species, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa , Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Corynebacterium efficens , Novosphingobium aroma ticivorans , Termobifida fusca and Candida parapsilosis .

В одном из аспектов исходный фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно может быть получен, предпочтительно получен из одного или нескольких из Aeromonas hydrophila или Aeromonas salmonicida.In one aspect, the parent lipid acyltransferase enzyme of the present invention can preferably be obtained, preferably obtained from one or more of Aeromonas hydrophila or Aeromonas salmonicida .

В одном из аспектов исходная липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может представлять собой лецитин:холестеринацилтрансферазу (LCAT) или ее вариант (например, вариант может представлять собой молекулярное преобразование).In one aspect, the parent lipid acyltransferase of the present invention may be lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) or a variant thereof (for example, the variant may be a molecular transformation).

В данной области известны подходящие LCAT, и их можно получить, например, из одного или нескольких из следующих ниже организмов: млекопитающие, крыса, мышь, куры, Drosophila melanogaster, растения, включающие в себя Arabidopsis и Oryza sativa, нематоды, грибы и дрожжи.Suitable LCATs are known in the art and can be obtained, for example, from one or more of the following organisms: mammals, rat, mouse, chickens, Drosophila melanogaster , plants including Arabidopsis and Oryza sativa , nematodes, fungi and yeast.

Предпочтительно при выполнении способа по настоящему изобретению продукт (т.е. пищевой продукт) получают без увеличения или существенного увеличения свободных жирных кислот в пищевом продукте.Preferably, when performing the method of the present invention, a product (i.e., a food product) is obtained without increasing or substantially increasing free fatty acids in the food product.

Как применяют здесь термин "трансфераза" является взаимозаменяемым с термином "липидацилтрансфераза".As used herein, the term "transferase" is used interchangeably with the term "lipid acyltransferase".

Как применяют здесь термин "галактолипидтрансферазная активность" обозначает способность фермента катализировать перенос ацильной группы с галактолипидного донора на акцепторную молекулу (отличную от воды), например, такую как глицерин.As used herein, the term "galactolipid transferase activity" refers to the ability of an enzyme to catalyze the transfer of an acyl group from a galactolipid donor to an acceptor molecule (other than water), such as glycerol.

Подобным образом, как применяют здесь, термин "фосфолипидтрансферазная активность" обозначает способность фермента катализировать перенос ацильной группы с фосфолипидного донора на акцепторную молекулу (отличную от воды), например, такую как глицерин.Similarly, as used here, the term "phospholipid transferase activity" refers to the ability of an enzyme to catalyze the transfer of an acyl group from a phospholipid donor to an acceptor molecule (other than water), such as glycerin.

Как применяют здесь, термин "повышенное отношение галактолипазной трансферазной активности к фосфолипидтрансферазной активности" обозначает вариант фермента, который по сравнению с исходным ферментом способен к катализу в качестве галактолипидтрансферазы в большей степени по сравнению с катализом в качестве фосфолипидтрансферазы. Это может означать, что и галактолипидтрансферазная активность, и фосфолипидтрансферазная активность увеличены по сравнению с исходным ферментом или что галактолипидтрансферазная активность увеличена, тогда как фосфолипидтрансферазная активность уменьшена по сравнению с исходным ферментом. Важным является конечное отношением между двумя этими видами активности.As used here, the term "increased ratio of galactolipase transferase activity to phospholipid transferase activity" refers to an enzyme variant that, compared to the starting enzyme, is capable of catalysis as galactolipid transferase to a greater extent than catalysis as phospholipid transferase. This may mean that both galactolipid transferase activity and phospholipid transferase activity are increased compared to the parent enzyme, or that galactolipid transferase activity is increased, while phospholipid transferase activity is decreased compared to the parent enzyme. The final relationship between these two activities is important.

Таким образом, как определено здесь, липидацилтрансфераза катализирует одну или несколько из следующих ниже реакций: интерэстерификация, трансэстерификация, алкоголиз, гидролиз.Thus, as defined here, lipid acyltransferase catalyzes one or more of the following reactions: interesterification, transesterification, alcoholysis, hydrolysis.

Термин "интерэстерификация" относится к ферментативно катализируемому переносу ацильных групп между липидным донором и липидным акцептором, где липидный донор не является свободной ацильной группой.The term "interesterification" refers to an enzymatically catalyzed transfer of acyl groups between a lipid donor and a lipid acceptor, where the lipid donor is not a free acyl group.

Как применяют здесь, термин "трансэстерификация" обозначает ферментативно катализируемый перенос ацильной группы с липидного донора (отличного от свободной жирной кислоты) на акцептор ацила (отличного от воды).As used herein, the term “transesterification” refers to an enzymatically catalyzed transfer of an acyl group from a lipid donor (other than free fatty acid) to an acyl acceptor (other than water).

Как применяют здесь, термин "алкоголиз" относится к ферментативному расщеплению ковалентной связи производного кислоты посредством реакции со спиртом ROH так, что один из продуктов соединяется с H спирта, а другой продукт соединяется с группой OR спирта.As used herein, the term “alcoholysis” refers to the enzymatic cleavage of a covalent bond of an acid derivative by reaction with an alcohol ROH such that one of the products combines with H of the alcohol and the other product combines with the OR group of the alcohol.

Как применяют здесь, термин "спирт" относится к алкильному соединению, содержащему гидроксильную группу.As used here, the term "alcohol" refers to an alkyl compound containing a hydroxyl group.

Как применяют здесь, термин "гидролиз" относится к ферментативно катализируемому переносу ацильной группы с липида на OH-группу молекулы воды. Перенос ацила, происходящий вследствие гидролиза, требует разделения молекулы воды.As used herein, the term "hydrolysis" refers to an enzymatically catalyzed transfer of an acyl group from a lipid to the OH group of a water molecule. Acyl transfer resulting from hydrolysis requires the separation of a water molecule.

Термин "галактолипидгидролитическая активность", как применяют здесь, обозначает способность фермента катализировать гидролиз галактолипида посредством переноса ацильной группы с галактолипида на OH-группу молекулы воды.The term "galactolipid hydrolytic activity", as used here, refers to the ability of an enzyme to catalyze the hydrolysis of galactolipid by transferring the acyl group from the galactolipid to the OH group of the water molecule.

Подобным образом, как применяют здесь, термин "фосфолипидгидролитическая активность" обозначает способность фермента катализировать гидролиз фосфолипида посредством переноса ацильной группы с фосфолипида на OH-группу молекулы воды.Similarly, as used herein, the term “phospholipid hydrolytic activity” refers to the ability of an enzyme to catalyze the hydrolysis of a phospholipid by transferring the acyl group from the phospholipid to the OH group of the water molecule.

Как применяют здесь, термин "повышенное отношение галактолипазной трансферазной активности к активности гидролиза галактолипидов" обозначает вариант фермента, который по сравнению с исходным ферментом способен к катализу в качестве галактолипидтрансферазы в большей степени, чем к катализу гидролиза галактолипидов. Это может означать, что и галактолипидтрансферазная активность, и активность гидролиза галактолипидов увеличены по сравнению с исходным ферментом или что галактолипидтрансферазная активность увеличена, тогда как активность гидролиза галактолипидов уменьшена по сравнению с исходным ферментом. Важным является конечное отношением между двумя этими видами активности.As used here, the term "increased ratio of galactolipase transferase activity to the activity of hydrolysis of galactolipids" refers to a variant of the enzyme that, compared to the original enzyme, is capable of catalysis as galactolipid transferase to a greater extent than catalysis of hydrolysis of galactolipids. This may mean that both galactolipid transferase activity and galactolipid hydrolysis activity are increased compared to the starting enzyme, or that galactolipid transferase activity is increased, while galactolipid transferase hydrolysis activity is decreased compared to the starting enzyme. The final relationship between these two activities is important.

Как применяют здесь, термин "без увеличения или без существенного увеличения свободных жирных кислот" обозначает, что предпочтительно липидацилтрансфераза по настоящему изобретению обладает 100% трансферазной активностью (т.е. переносит 100% ацильных групп с донора ацила на акцептор ацила, без гидролитической активности); однако фермент может переносить на акцептор ацила менее чем 100% ацильных групп, присутствующих в липидном доноре ацила. В таком случае ацилтрансферазная активность предпочтительно составляет, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 30%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно 50%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, а более предпочтительно, по меньшей мере 98% общей ферментативной активности. % Трансферазной активности (т.е. трансферазная активность как процент общей ферментативной активности) можно определить посредством следующего протокола:As used herein, the term “without or without a substantial increase in free fatty acids” means that preferably the lipid acyltransferase of the present invention has 100% transferase activity (i.e. transfers 100% acyl groups from an acyl donor to an acyl acceptor, without hydrolytic activity) ; however, the enzyme can transfer to the acyl acceptor less than 100% of the acyl groups present in the acyl lipid donor. In such a case, the acyltransferase activity is preferably at least 5%, more preferably at least 10%, more preferably at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 40%, more preferably 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and more preferably at least 98% total enzymatic activity. % Transferase activity (i.e., transferase activity as a percentage of total enzymatic activity) can be determined using the following protocol:

Протокол для определения % ацилтрансферазной активности:Protocol for determining% acyltransferase activity:

Пищевой продукт к которому добавляли липидацилтрансферазу по настоящему изобретению после ферментативной реакции можно экстрагировать посредством CHCl₃:CH₃OH 2:1 и органическую фазу, содержащую липидное вещество выделяют и анализируют посредством GLC следуя подробно описанной здесь ниже процедуре. Из анализа GLC (и, если необходимо, анализа ВЭЖХ) определяют количество свободных жирных кислот и одного или нескольких из сложных эфиров стерина/станола; сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков; диглицеридов или моноглицеридов. Контрольный пищевой продукт, к которому не добавляли фермент по настоящему изобретению, анализируют тем же способом.The food product to which the lipid acyltransferase of the present invention was added after the enzymatic reaction can be extracted with CHCl ₃ : CH ₃ OH 2: 1 and the organic phase containing the lipid substance is isolated and analyzed by GLC following the procedure described in detail below. From the GLC analysis (and, if necessary, HPLC analysis), the amount of free fatty acids and one or more of sterol / stanol esters are determined; carbohydrate esters, protein esters; diglycerides or monoglycerides. A control food product to which the enzyme of the present invention was not added was analyzed in the same way.

Подсчет:Count:

Из результатов GLC (и, необязательно, анализа ВЭЖХ) можно подсчитать увеличение содержания свободных жирных кислот и сложных эфиров стерина/станола, и/или сложных эфиров углеводов, и/или сложных эфиров белков, и/или диглицеридов, и/или моноглицеридов:From the results of GLC (and, optionally, HPLC analysis), an increase in the content of free fatty acids and sterol / stanol esters and / or carbohydrate esters and / or protein esters and / or diglycerides and / or monoglycerides can be calculated:

Δ % жирной кислоты = % жирной кислоты (фермент) - % жирной кислоты (контроль); Mv жирной кислоты = средняя молекулярная масса жирных кислот;Δ% fatty acid =% fatty acid (enzyme) -% fatty acid (control); Mv fatty acid = average molecular weight of fatty acids;

A = Δ % сложного эфира стерина/Mv сложного эфира стерина (где Δ % сложного эфира стерина = % сложного эфира стерина/станола (фермент) - % сложного эфира стерина/станола (контроль), а Mv сложного эфира стерина = средняя молекулярная масса сложных эфиров стеринов/станолов) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой стерин и/или станол;A = Δ% sterol ester / Mv sterol ester (where Δ% sterol ester =% sterol / stanol ester (enzyme) -% sterol / stanol ester (control), and Mv sterol ester = average molecular weight of the complex sterol / stanol esters) - applicable when the acyl acceptor is sterol and / or stanol;

B = Δ % сложного эфира углевода/Mv сложного эфира углевода (где Δ % сложного эфира углевода = % сложного эфира углевода (фермент) - % сложного эфира углевода (контроль), а Mv сложного эфира углевода = средняя молекулярная масса сложного эфира углевода) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой углевод;B = Δ% carbohydrate ester / Mv carbohydrate ester (where Δ% carbohydrate ester =% carbohydrate ester (enzyme) -% carbohydrate ester (control), and Mv carbohydrate ester = average molecular weight of carbohydrate ester) - applicable when the acyl acceptor is a carbohydrate;

C = Δ % сложного эфира белка/Mv сложного эфира белка (где Δ % сложного эфира белка = % сложного эфира белка (фермент) - % сложного эфира белка (контроль), а Mv сложного эфира белка = средняя молекулярная масса сложного эфира белка) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой белок; иC = Δ% protein ester / Mv protein ester (where Δ% protein ester =% protein ester (enzyme) -% protein ester (control), and Mv protein ester = average molecular weight of the protein ester) - applicable when the acyl acceptor is a protein; and

D = абсолютное значение диглицерида и/или моноглицерида/Mv ди/моноглицерида (где Δ % диглицерида и/или моноглицерида = % диглицерида и/или моноглицерида (фермент) - % диглицерида и/или моноглицерида (контроль), а Mv ди/моноглицерида = средняя молекулярная масса диглицерида и/или моноглицерида) - применимо, когда акцептор ацила представляет собой глицерин.D = absolute value of diglyceride and / or monoglyceride / Mv di / monoglyceride (where Δ% diglyceride and / or monoglyceride =% diglyceride and / or monoglyceride (enzyme) -% diglyceride and / or monoglyceride (control), and Mv di average molecular weight of diglyceride and / or monoglyceride) - applicable when the acyl acceptor is glycerol.

Трансферазную активность подсчитывают как процент общей ферментативной активности:Transferase activity is calculated as a percentage of total enzymatic activity:

* - удалить при необходимости.* - delete if necessary.

Аминокислоты, соответствующие терминам "неполярная", "полярная - незаряженная", "полярная - заряженная", приведены в таблице ниже, как аминокислоты, соответствующие терминам "алифатическая" и "ароматическая". Термин "полярная" относится и к "полярным - незаряженным", и к "полярным - заряженным" аминокислотам.Amino acids corresponding to the terms "non-polar", "polar - uncharged", "polar - charged" are shown in the table below, as amino acids corresponding to the terms "aliphatic" and "aromatic". The term "polar" refers to both "polar - uncharged" and "polar - charged" amino acids.

АЛИФАТИЧЕСКИЕALIPHATIC НеполярныеNon-polar G A PG a p I L VI L V Полярные незаряженныеPolar uncharged C S T MC S T M N QN Q Полярные заряженныеPolar charged D ED e K RK r АРОМАТИЧЕСКИЕAROMATIC H F W YH F W Y

Анализ GLCGLC analysis

Хроматограф Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph, снаряженный колонкой WCOT из расплавленного диоксида кремния 12,5 м × 0,25 мм ID × 0,1 мк толщины пленки 5% фенилметилсиликона (CP Sil 8 CB from Chrompack).A Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph equipped with a 12.5 m × 0.25 mm ID × 0.1 μm WCOT column of molten silica WCOT column 5% phenylmethylsilicone film thickness (CP Sil 8 CB from Chrompack).

Газ-носитель: гелий.Carrier gas: helium.

Инжектор: холодная раздельная инъекция PSSI (исходная температура 50°C с нагревом до 385°C), объем 1,0 мклInjector: cold separate injection of PSSI (initial temperature 50 ° C with heating to 385 ° C), volume 1.0 μl

Детектор FID: 395°CFID Detector: 395 ° C

Программа термостата:Thermostat program: 1one 22 33 Температура термостата, °C:Thermostat temperature, ° C: 9090 280280 350350 Изотерма, время, мин:Isotherm, time, min: 1one 00 1010 Скорость изменения температуры, °C/мин:The rate of change of temperature, ° C / min: 15fifteen 4four

Получение образца: 30 мг образца растворяли в 9 мл гептана:пиридина, 2:1, содержащем внутренний стандарт гептадекан, 0,5 мг/мл. 300 мкл раствора образца переносили в изогнутый флакон, добавляли 300 мкл MSTFA (N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамид) и проводили реакцию в течение 20 минут при 60°C.Sample preparation: 30 mg of the sample was dissolved in 9 ml of heptane: pyridine, 2: 1, containing the internal standard of heptadecane, 0.5 mg / ml. 300 μl of the sample solution was transferred into a curved vial, 300 μl of MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide) was added and the reaction was carried out for 20 minutes at 60 ° C.

Подсчет: факторы отклика для моно-ди-триглицеридов и свободной жирной кислоты определяли на основании стандарта 2 (моно-ди-триглицерид), для холестерина, холестерилпальмитата и холестерилстеарата факторы отклика определяли на основании чистого эталонного вещества (навеска чистого вещества составляла 10 мг).Calculation: response factors for mono-di-triglycerides and free fatty acid were determined on the basis of standard 2 (mono-di-triglyceride), for cholesterol, cholesteryl palmitate and cholesteryl stearate, response factors were determined on the basis of a pure reference substance (10 mg sample of pure substance).

ТЕХНИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫTECHNICAL RESULTS

Настоящее изобретение может обеспечивать один или несколько из следующих ниже неожиданных технических результатов в яичных продуктах, особенно в майонезе: повышенная термоустойчивость в течение пастеризации; улучшенные органолептические свойства, улучшенная консистенция.The present invention can provide one or more of the following unexpected technical results in egg products, especially in mayonnaise: increased thermal stability during pasteurization; improved organoleptic properties, improved texture.

Варианты ферментов с повышенной фосфолипидтрансферазной активностью, особенно с повышенной трансферазной активностью между фосфолипидом и стерином и/или станолом, таким как холестерин, могут быть особенно пригодны в способах получения лизофосфолипидов и/или для ферментативного рафинирования прищевых масел и/или для получения яичных продуктов с улучшенными свойствами эмульсификации и/или пользой для здоровья.Variants of enzymes with increased phospholipid transferase activity, especially with increased transferase activity between phospholipid and sterol and / or stanol, such as cholesterol, may be particularly suitable in methods for producing lysophospholipids and / or for enzymatic refining of cereal oils and / or for egg products with improved emulsification properties and / or health benefits.

Для применения в способах ферментативного рафинирования предпочтительны варианты с повышенной абсолютной фосфолипидтрансферазной активностью для стерина.For use in enzymatic refining methods, variants with increased absolute phospholipid transferase activity for sterol are preferred.

Таким образом, настоящее изобретение может обеспечивать один или несколько из следующих ниже неожиданных технических результатов в яйцах или яичных продуктах: повышенная стабильность эмульсии; термостабильность эмульсии; улучшенный вкус; сниженный неприятный запах; улучшенная способность к загущению, улучшенная консистенция.Thus, the present invention can provide one or more of the following unexpected technical results in eggs or egg products: enhanced emulsion stability; thermal stability of the emulsion; improved taste; reduced unpleasant odor; improved thickening ability, improved consistency.

Настоящее изобретение может обеспечивать один или несколько из следующих ниже неожиданных технических результатов в продуктах из теста и/или выпеченных продуктах: повышенный удельный объем или продуктов из теста или выпеченных продуктов (например, хлеба и/или пирога); повышенная стабильность теста; улучшенное формирование корки (например, более тонкая и/или хрустящая корка хлеба), улучшенное формирование мякоти (например, более гомогенное распределение мякоти и/или более тонкая структура мякоти и/или более мягкая мякоть); улучшенный внешний вид (например, гладкая поверхность без вздутий или отверстий или по существу без вздутий или отверстий); уменьшенное очерствение; улучшенная мягкость; улучшенный запах; улучшенный вкус.The present invention may provide one or more of the following unexpected technical results in dough products and / or baked products: increased specific volume of either dough or baked products (eg, bread and / or cake); increased test stability; improved crust formation (eg, thinner and / or crisp bread crust), improved pulp formation (eg, more homogeneous distribution of pulp and / or finer pulp structure and / or softer pulp); improved appearance (for example, a smooth surface without blisters or holes or essentially without blisters or holes); reduced hardening; improved softness; improved odor; superior taste.

Таким образом, настоящее изобретение может обеспечивать один или несколько из следующих ниже неожиданных технических результатов в пищевом продукте: улучшенный внешний вид, улучшенное ощущение во рту, повышенная стабильность, в частности повышенная термостабильность, улучшенный вкус, повышенная мягкость, улучшенная упругость, улучшенная эмульсификация.Thus, the present invention can provide one or more of the following unexpected technical results in a food product: improved appearance, improved mouth feel, increased stability, in particular increased thermal stability, improved taste, increased softness, improved elasticity, improved emulsification.

Таким образом, настоящее изобретение может обеспечивать один или несколько из следующих ниже неожиданных технических результатов в молочных продуктах, например, таких как мороженное: улучшенное разжевывание (предпочтительно сметанообразное ощущение во рту); улучшенный вкус; улучшенное плавление.Thus, the present invention can provide one or more of the following unexpected technical results in dairy products, for example, such as ice cream: improved chewing (preferably a creamy mouth feel); improved taste; improved melting.

Конкретные технические результаты, ассоциированные с применением липидацилтрансферазы, как определено здесь для получения пищевых продуктов, перечислены в таблице ниже:Specific technical results associated with the use of lipid acyltransferase, as defined here for food, are listed in the table below:

Пищевой продуктFood product РезультатResult 1one Хлеб, сдоба и пончикиBread, Muffin and Donuts Укрепляет тесто и увеличивает механическое сопротивление и увеличивает способность ко впитыванию воды и/или увеличивает объем продуктов хлебопечения и сохраняет мягкость мякоти и/или уменьшает вздутия на хлебной поверхности.Strengthens the dough and increases the mechanical resistance and increases the ability to absorb water and / or increases the volume of bakery products and maintains the softness of the pulp and / or reduces bloating on the bread surface. 22 Замороженное тестоFrozen dough Предотвращает порчу при замораживании.Prevents damage during freezing. 33 Бисквитное пирожноеSponge cake Обеспечивает хороший объем пирожного и/или однородную мягкую структуруProvides good cake volume and / or uniform soft texture 4four Бисквит, крекер и печеньеSponge cake, cracker and cookies Обеспечивает стабильные жировые эмульсии, и/или предотвращает прилипание к устройству, и/или предотвращает потускнение продуктов с высоким содержанием жира.Provides stable fat emulsions, and / or prevents sticking to the device, and / or prevents tarnishing of high fat foods. 55 Бездрожжевое жидкое тесто и панировкаYeast-free batter and breading Улучшает структуру жареных продуктов.Improves the structure of fried foods. 66 ЛапшаNoodles Предотвращает прилипание теста к устройству, и/или увеличивает водосодержание, и/или уменьшает потери при приготовлении.Prevents sticking of the dough to the device, and / or increases water content, and / or reduces cooking losses. 77 Макаронные изделия быстрого приготовленияInstant pasta Предотвращает слипание макаронных изделий друг к другу.Prevents sticking pasta to each other. 88 МакароныPasta Кондиционер теста предотвращает слипание при приготовленииDough conditioner prevents sticking during cooking 99 Яичный кремEgg cream Обеспечивает крахмальную пасту более мягкой и сметанообразной структурой и/или предотвращает обезвоживание.Provides a starch paste with a softer and creamier structure and / or prevents dehydration. 1010 Осветлитель кофеCoffee clarifier Предотвращает разделение масла и воды.Prevents the separation of oil and water. 11eleven Взбитые сливкиWhipped cream Обеспечивает стабильную эмульсию.Provides a stable emulsion. 1212 ШоколадChocolate Предотвращает или уменьшает потускнение.Prevents or reduces tarnishing. 1313 Карамель, леденцы и нугаCaramel, candy and nougat Увеличивает эмульсификацию расплавленного сахара и масла и/или предотвращает отделение масла.Increases the emulsification of molten sugar and butter and / or prevents the separation of butter. 14fourteen Готовое мясное блюдо, колбасыReady meat dish, sausages Увеличивает влагоудерживающую способность колбас и спрессованной ветчины и/или предотвращает разделение масляной фазы паст и паштетов.Increases the water-holding capacity of sausages and pressed ham and / or prevents the separation of the oil phase of pastes and pastes.

Таким образом, настоящее изобретение может обеспечивать один или несколько из следующих ниже неожиданных технических результатов в сыре: уменьшение эффекта обезжиривания в сыре; увеличение образования сыра; улучшение вкуса; уменьшенный неприятный запах; сниженный "мыльный" вкус.Thus, the present invention can provide one or more of the following unexpected technical results in cheese: reducing the effect of degreasing in cheese; increased cheese formation; taste improvement; reduced odor; reduced "soapy" taste.

В одном из аспектов настоящее изобретение частично основано на варианте осуществления, позволяющей получать продукты питания, такие как сыр, которые можно улучшить применением липидацилтрансферазы. Кроме того или альтернативно, можно улучшить вкус, структуру, устойчивость к окислению и/или срок хранения продукта питания. Кроме того или альтернативно, продукт питания может обладать сниженным уровнем холестерина или повышенным содержанием сложных эфиров фитостеринов/станолов.In one aspect, the present invention is based in part on an embodiment capable of producing food products, such as cheese, that can be improved by the use of lipid acyltransferase. In addition or alternatively, the taste, texture, oxidation stability and / or shelf life of the food product can be improved. In addition or alternatively, the food product may have reduced cholesterol or high phytosterol / stanol esters.

Настоящее изобретение в одном из аспектов может относиться к композиции пищевой добавки, содержащей липидацилтрансферазу, как определено здесь.The present invention in one aspect may relate to a food supplement composition comprising a lipid acyltransferase as defined herein.

Настоящее изобретение в другом аспекте может относиться к косметической композиции, содержащей липидацилтрансферазу, как определено здесь.The present invention in another aspect may relate to a cosmetic composition comprising a lipid acyltransferase as defined herein.

Кроме того, настоящее изобретение может относиться к применению ацилтрансферазы, как определено здесь, для получения косметической композиции.In addition, the present invention may relate to the use of acyltransferase, as defined here, to obtain a cosmetic composition.

ПРЕИМУЩЕСТВАADVANTAGES

Варианты трансфераз по настоящему изобретению по сравнению с исходным ферментом обладают одним или несколькими из следующих ниже преимущественных свойств:Compared to the starting enzyme, the transferase variants of the present invention have one or more of the following advantageous properties:

i) повышенной активностью для полярных липидов и/или повышенной активностью для полярных липидов по сравнению с триглицеридами.i) increased activity for polar lipids and / or increased activity for polar lipids compared to triglycerides.

ii) повышенной активностью в отношении галактолипидов (гликолипиды), таких как один или несколько из дигалактозилдиглицерида (DGDG) и/или моногалактозилдиглицерида (MGDG).ii) increased activity against galactolipids (glycolipids), such as one or more of digalactosyl diglyceride (DGDG) and / or monogalactosyl diglyceride (MGDG).

iii) повышенным отношением активности в отношении галактолипидов (гликолипиды) к активности в отношении фосфолипидов и/или триглицеридов.iii) an increased ratio of activity against galactolipids (glycolipids) to activity against phospholipids and / or triglycerides.

Предпочтительно варианты трансфераз по изобретению обладают повышенной активностью в отношении дигалактозилдиглицерида (DGDG) и/или моногалактозилдиглицерида (MGDG).Preferably, the transferase variants of the invention have increased activity with respect to digalactosyl diglyceride (DGDG) and / or monogalactosyl diglyceride (MGDG).

Предпочтительно варианты трансфераз по настоящему изобретению обладают повышенной активностью в отношении DGDG и/или MGDG и уменьшенной активностью для DGMG и/или MGMG.Preferably, the transferase variants of the present invention have increased activity against DGDG and / or MGDG and reduced activity for DGMG and / or MGMG.

Варианты трансфераз по изобретению также могут обладать повышенной активностью в отношении триглицеридов.Variants of transferases according to the invention may also have increased activity against triglycerides.

Варианты трансфераз по изобретению также могут обладать повышенной активностью в отношении фосфолипидов, таких как лецитин, включая сюда фосфатидилхолин.The transferase variants of the invention may also have increased activity against phospholipids, such as lecithin, including phosphatidylcholine.

Варианты трансфераз по настоящему изобретению могут обладать уменьшенной активностью в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов.Transferase variants of the present invention may have reduced activity against triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides.

Термин полярный липид относится к полярным липидам, обычно находящимся в тесте, предпочтительно галактолипидам и фосфолипидам.The term polar lipid refers to polar lipids commonly found in the test, preferably galactolipids and phospholipids.

При применении в получении теста или выпеченного из теста продукта вариант трансферазы по изобретению может приводить к одному или нескольким из следующих ниже неожиданных технических результатов в тесте и/или выпеченных из теста продуктах: повышенный удельный объем теста или выпеченных из теста продуктов (например, хлеб и/или пирог); повышенная стабильность теста; улучшенные свойства корки (например, более тонкая и/или хрустящая хлебная корка), улучшенные свойства мякоти (например, более гомогенное распределение мякоти и/или более тонкая структура мякоти и/или боле мягкая мякоть); улучшенный внешний вид (например, гладкая поверхность без вздутий или отверстий или по существу без вздутий или отверстий); уменьшенное очерствение; улучшенная мягкость; улучшенный запах; улучшенный вкус.When used in the preparation of a dough or a baked product, the transferase variant of the invention can lead to one or more of the following unexpected technical results in the dough and / or baked products: a higher specific volume of dough or baked products (for example, bread and / or cake); increased test stability; improved properties of the crust (for example, a thinner and / or crisp bread crust), improved properties of the pulp (for example, a more homogeneous distribution of the pulp and / or finer structure of the pulp and / or a softer pulp); improved appearance (for example, a smooth surface without blisters or holes or essentially without blisters or holes); reduced hardening; improved softness; improved odor; superior taste.

ВЫДЕЛЕННЫЙALLOCATED

В одном из аспектов полипептид или белок для применения по настоящему изобретению предпочтительно находится в выделенной форме. Термин "выделенный" означает, что последовательность, по меньшей мере, по существу свободна, по меньшей мере, от одного другого компонента, с которым последовательность самопроизвольно ассоциирована в природе и как находят в природе.In one aspect, the polypeptide or protein for use in the present invention is preferably in isolated form. The term "isolated" means that the sequence is at least substantially free of at least one other component with which the sequence is spontaneously associated in nature and as found in nature.

ОЧИЩЕННЫЙPURIFIED

В одном из аспектов полипептид или белок для применения по настоящему изобретению предпочтительно находятся в очищенной форме. Термин "очищенный" означает, что последовательность находится в относительно чистом состоянии, например по меньшей мере приблизительно 51% чистоты, или, по меньшей мере приблизительно 75%, или, по меньшей мере приблизительно 80%, или, по меньшей мере приблизительно 90% чистоты, или, по меньшей мере приблизительно 95% чистоты или, по меньшей мере приблизительно 98% чистоты.In one aspect, the polypeptide or protein for use in the present invention is preferably in purified form. The term "purified" means that the sequence is in a relatively pure state, for example at least about 51% purity, or at least about 75%, or at least about 80%, or at least about 90% purity or at least about 95% purity or at least about 98% purity.

КЛОНИРОВАНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОДИРУЮЩЕЙ ПОЛИПЕПТИД ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮCloning of a nucleotide sequence encoding a polypeptide according to the present invention

Нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий конкретными свойствами, как определено здесь, или полипептид, пригодный для модификации, можно выделять из любой клетки или организма, продуцирующих указанный полипептид. В данной области хорошо известны различные способы выделения нуклеотидных последовательностей.The nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties, as defined here, or a polypeptide suitable for modification, can be isolated from any cell or organism that produces the specified polypeptide. Various methods for isolating nucleotide sequences are well known in the art.

Например, можно сконструировать библиотеку геномной ДНК и/или кДНК с применением хромосомной ДНК или матричной РНК из организма продуцирующего полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида известна, можно синтезировать меченые олигонуклеотидные зонды и применять для идентификации кодирующих полипептид клонов из геномной библиотеки, полученной из организма. Альтернативно для идентификации кодирующих полипептид клонов можно применять меченный олигонуклеотидный зонд содержащий последовательности, гомологичные другому известному гену полипептида. В последнем случае применяют условия гибридизации и отмывки с меньшей строгостью.For example, a library of genomic DNA and / or cDNA can be constructed using chromosomal DNA or template RNA from an organism producing a polypeptide. If the amino acid sequence of the polypeptide is known, labeled oligonucleotide probes can be synthesized and used to identify clones encoding the polypeptide from a genomic library obtained from the body. Alternatively, a labeled oligonucleotide probe containing sequences homologous to another known polypeptide gene can be used to identify clones encoding a polypeptide. In the latter case, hybridization and washing conditions with less stringency are used.

Альтернативно кодирующие полипептид клоны можно идентифицировать посредством вставки фрагментов геномной ДНК в экспрессирующий вектор, такой как плазмида, трансформации отрицательных по ферменту бактерий полученной библиотекой геномной ДНК и затем нанесения трансформированных бактерий на агар, содержащий фермент, ингибируемый полипептидом, обеспечивая, таким образом, идентификацию клонов, экспрессирующих полипептид.Alternatively, clones encoding a polypeptide can be identified by inserting genomic DNA fragments into an expression vector such as a plasmid, transforming the bacteria negative for the enzyme with the resulting genomic DNA library, and then applying the transformed bacteria to agar containing the enzyme that is inhibited by the polypeptide, thus providing clone identification. expressing a polypeptide.

В еще одной альтернативе кодирующую полипептид нуклеотидную последовательность можно получать синтетическим способом посредством общепризнанных стандартных способов, например фосфорамидатным способом, описанным Beucage S.L. et al. (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, или способом, описанным у Matthes et al. (1984) EMBO J. 3, p 801-805. В фосфорамидатном способе олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящие векторы.In yet another alternative, a polypeptide encoding a nucleotide sequence can be obtained synthetically by recognized standard methods, for example, the phosphoramidate method described by Beucage SL et al . (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, or by the method described by Matthes et al . (1984) EMBO J. 3, p 801-805. In the phosphoramidate method, oligonucleotides are synthesized, for example, in an automatic DNA synthesizer, purified, annealed, ligated and cloned into suitable vectors.

Нуклеотидная последовательность может быть смешанного геномного и синтетического происхождения, смешанного синтетического происхождения и происходящей из кДНК или смешанного геномного происхождения и происходящей из кДНК, полученной посредством лигирования фрагментов синтетического, геномного происхождения или происходящих из кДНК (соответственно) стандартными способами. Каждый лигированный фрагмент соответствует различным частям полной нуклеотидной последовательности. Последовательность ДНК также можно получать посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением специфических праймеров, например, как описано в патенте США 4683202 или у Saiki R K et al. (Science (1988) 239, pp 487-491).The nucleotide sequence may be of mixed genomic and synthetic origin, mixed synthetic origin and derived from cDNA or mixed genomic origin and derived from cDNA obtained by ligation of fragments of synthetic, genomic origin or derived from cDNA (respectively) by standard methods. Each ligated fragment corresponds to different parts of the complete nucleotide sequence. The DNA sequence can also be obtained by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers, for example, as described in US patent 4683202 or Saiki RK et al . (Science (1988) 239, pp 487-491).

НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИNUCLEOTIDE SEQUENCES

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды с конкретными свойствами, как определено здесь. Как применяют здесь, термин "нуклеотидная последовательность" относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности и к их варианту, гомологу, фрагментам и производным (таким как их части). Нуклеотидная последовательность может быть геномного, или синтетического, или рекомбинантного происхождения и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, представляя собой смысловую или антисмысловую цепь.The present invention also relates to nucleotide sequences encoding polypeptides with specific properties, as defined here. As used here, the term "nucleotide sequence" refers to an oligonucleotide sequence or polynucleotide sequence and their variant, homologue, fragments and derivatives (such as parts thereof). The nucleotide sequence may be of genomic, or synthetic, or recombinant origin and may be double-stranded or single-stranded, representing a sense or antisense strand.

Термин "нуклеотидная последовательность" относительно настоящего изобретения включает в себя геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Предпочтительно он означает ДНК, более предпочтительно кДНК для кодирующей последовательности.The term "nucleotide sequence" relative to the present invention includes genomic DNA, cDNA, synthetic DNA and RNA. Preferably, it means DNA, more preferably cDNA, for the coding sequence.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, непосредственно кодирующая полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, не покрывает природную нуклеотидную последовательность в ее природном окружении, когда она связана с ассоциированной с ней в природе последовательностью(ями), которая(ые) также находится(ятся) в ее(их) природном окружении. Для простоты ссылки авторы предлагают называть данный предпочтительный вариант осуществления "неприродная нуклеотидная последовательность". В данном отношении термин "природная нуклеотидная последовательность" означает полную нуклеотидную последовательность, находящуюся в ее природном окружении и функционально связанную с полным промотором, с которым она ассоциирована в природе, где этот промотор также находится в его природном окружении. Таким образом, полипептид по настоящему изобретению можно экспрессировать посредством нуклеотидной последовательности в его естественном организме, но где нуклеотидная последовательность находится не под контролем того промотора, с которым она в природе ассоциирована в данном организме.In a preferred embodiment, the nucleotide sequence directly encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, does not cover the natural nucleotide sequence in its natural environment when it is associated with its naturally associated sequence (s) that are also located (are) ) in her (their) natural environment. For ease of reference, the authors propose to call this preferred embodiment "unnatural nucleotide sequence". In this regard, the term "natural nucleotide sequence" means the complete nucleotide sequence located in its natural environment and functionally associated with the complete promoter with which it is associated in nature, where this promoter is also in its natural environment. Thus, the polypeptide of the present invention can be expressed through a nucleotide sequence in its natural organism, but where the nucleotide sequence is not under the control of the promoter with which it is naturally associated in this organism.

Предпочтительно полипептид не является природным полипептидом. В этом отношении термин "природный полипептид" означает полноразмерный полипептид, находящийся в его природном окружении и когда он экспрессирован с его природной нуклеотидной последовательности.Preferably, the polypeptide is not a naturally occurring polypeptide. In this regard, the term "natural polypeptide" means a full-sized polypeptide located in its natural environment and when it is expressed from its natural nucleotide sequence.

Как правило, нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды с конкретными свойствами, как определено здесь, получают с применением способов рекомбинантной ДНК (т.е. рекомбинантная ДНК). Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения нуклеотидную последовательность целиком или полностью можно синтезировать с применением химических способов, хорошо известных в данной области (см. Caruthers MH et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 и Horn T et al. (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).Typically, a nucleotide sequence encoding polypeptides with specific properties, as defined herein, is prepared using recombinant DNA methods (i.e., recombinant DNA). However, in an alternative embodiment of the invention, the entire nucleotide sequence can be synthesized using chemical methods well known in the art (see Caruthers MH et al . (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al . (1980 ) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕMOLECULAR TRANSFORMATION

После выделения кодирующей фермент нуклеотидной последовательности или после идентификации предполагаемой кодирующей фермент нуклеотидной последовательности выбранную нуклеотидную последовательность может быть желательным модифицировать, например, может быть желательным подвергнуть последовательность мутированию для получения фермента по настоящему изобретению.After isolation of the nucleotide sequence encoding the enzyme or after identification of the putative nucleotide sequence encoding the enzyme, the selected nucleotide sequence may be desirable to modify, for example, it may be desirable to mutate the sequence to obtain the enzyme of the present invention.

Мутации можно вносить с применением синтетических олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие желательные участки мутации.Mutations can be made using synthetic oligonucleotides. These oligonucleotides contain nucleotide sequences flanking the desired mutation sites.

Подходящий способ описан у Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Другой способ внесения мутаций в кодирующие фермент нуклеотидные последовательности описан у Nelson и Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p147-151).A suitable method is described by Morinaga et al . (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Another method for introducing mutations in enzyme coding nucleotide sequences is described by Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p147-151).

Вместо сайт-специфического мутагенеза, такого как описан выше, мутации можно вносить случайным образом, например с применением коммерческого набора, такого как набор GeneMorph PCR mutagenesis kit из Stratagene, или набор Diversify PCR random mutagenesis kit из Clontech. К способам оптимизации основанного на ПЦР мутагенеза, который также можно сочетать с применением мутагенных аналогов ДНК, таких как описанные в EP0 866 796, относится EP0 583 265. Для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками подходят технологии подверженной ошибкам ПЦР. К молекулярному преобразованию липаз относится WO0206457.Instead of site-specific mutagenesis, such as described above, mutations can be introduced randomly, for example using a commercial kit such as the GeneMorph PCR mutagenesis kit from Stratagene or the Diversify PCR random mutagenesis kit from Clontech. Methods for optimizing PCR-based mutagenesis, which can also be combined with the use of mutagenic DNA analogues, such as those described in EP0 866 796, include EP0 583 265. Error prone PCR techniques are suitable for producing lipid acyltransferases with preferred characteristics. The molecular transformation of lipases includes WO0206457.

Третий способ получения новых последовательностей состоит во фрагментировании неидентичных нуклеотидных последовательностей, или с применением любого количества рестрикционных ферментов или такого фермента, как ДНКаза I, и повторной сборке полноразмерных нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные белки. Альтернативно можно применять одну или несколько неидентичных нуклеотидных последовательностей и вносить мутации в течение повторной сборки полноразмерной нуклеотидной последовательности. Для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками пригодны технологии перестановки ДНК и перестановки семейств. Пригодные способы для проведения "перестановки" можно найти в EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606. Перестановку также можно сочетать с другими формами мутагенеза ДНК, как описано в патенте США 6180406 и WO 01/34835.A third way to produce new sequences is to fragment non-identical nucleotide sequences, or using any number of restriction enzymes or an enzyme such as DNase I, and reassemble the full-length nucleotide sequences encoding functional proteins. Alternatively, one or more non-identical nucleotide sequences can be used and mutations introduced during the reassembly of the full-length nucleotide sequence. DNA permutation and family permutation technologies are suitable for producing lipid acyltransferases with preferred characteristics. Suitable methods for carrying out the "rearrangement" can be found in EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606. The rearrangement can also be combined with other forms of DNA mutagenesis, as described in US patent 6180406 and WO 01/34835.

Таким образом, в нуклеотидной последовательности можно получать множество участков направленных или случайных мутаций, или in vivo, или in vitro, и далее различными способами исследовать кодируемый вариант полипептида на улучшенную функциональность. Например, с применением рекомбинантных способов in silico и опосредованных exo (см. WO 00/58517, патент США № 6344328, патент США № 6361974) молекулярное преобразование можно проводить, когда полученный вариант обладает очень низкой гомологией с известными ферментами или белками. Такие варианты, полученные таким образом, могут обладать значительной структурной аналогией с известными трансферазными ферментами, но обладать очень низкой гомологией аминокислотных последовательностей.Thus, in the nucleotide sequence, you can get many sections of directed or random mutations, either in vivo or in vitro , and then various ways to explore the encoded version of the polypeptide for improved functionality. For example, using recombinant methods in silico and exo mediated (see WO 00/58517, US patent No. 6344328, US patent No. 6361974) molecular transformation can be carried out when the obtained variant has very low homology with known enzymes or proteins. Such variants, thus obtained, may have significant structural analogy with known transferase enzymes, but have a very low homology of amino acid sequences.

Кроме того, в качестве неограничивающего примера, для получения новых вариантов мутантные или природные варианты полинуклеотидной последовательности можно рекомбинировать с диким типом или с другими мутантными или природными вариантами. Такие новые варианты также можно скринировать на улучшенную функциональность кодируемого полипептида.In addition, as a non-limiting example, to obtain new variants, mutant or natural variants of the polynucleotide sequence can be recombined with the wild type or with other mutant or natural variants. Such new variants can also be screened for improved functionality of the encoded polypeptide.

Применения указанного выше и сходные способы молекулярного преобразования позволяют идентифицировать и выбрать варианты ферментов по настоящему изобретению, обладающие предпочтительными характеристиками, без любого предварительного знания о структуре или функции белка и позволяют получать непредсказуемые, но выгодные мутации или варианты. Существует множество примеров применения молекулярного преобразования в данной области для оптимизации или изменения ферментативной активности, такие примеры включают в себя в качестве неограничивающих примеров один или несколько из следующих ниже: оптимизированная экспрессия и/или активность в клетке-хозяине или in vitro, повышенная ферментативная активность, измененная субстратная специфичность и/или специфичность в отношении продукта, повышенная или уменьшенная ферментативная или структурная стабильность, измененная ферментативная активность/специфичность в предпочтительных условиях окружающей среды, например температура, pH, субстрат.Applications of the above and similar molecular conversion methods allow the identification and selection of enzyme variants of the present invention that have preferred characteristics without any prior knowledge of the structure or function of the protein and allow unpredictable but beneficial mutations or variants. There are many examples of the application of molecular transformations in this field to optimize or change enzymatic activity, such examples include, but are not limited to, one or more of the following: optimized expression and / or activity in a host cell or in vitro , increased enzymatic activity, altered substrate specificity and / or specificity for the product, increased or decreased enzymatic or structural stability, altered enzyme Single activity / specificity in preferred environmental conditions, such as temperature, pH, substrate.

Как понятно специалистам в данной области, с применением средств молекулярного преобразования фермент можно изменять для улучшения функциональности фермента.As will be appreciated by those skilled in the art, using molecular transformants, the enzyme can be modified to improve the functionality of the enzyme.

Таким образом, применяемая по изобретению липидацилтрансфераза может представлять собой вариант, т.е. по сравнению с исходным ферментом может содержать по меньшей мере одну замену, делецию или добавление аминокислоты. Варианты белков сохраняют, по меньшей мере 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% гомологии с исходным ферментом. Пригодные исходные ферменты могут включать в себя любой фермент с эстеразной или липазной активностью. Предпочтительно исходный фермент сравнен с консенсусной последовательностью pfam00657.Thus, the lipid acyltransferase used according to the invention may be an option, i.e. compared to the starting enzyme, it may contain at least one substitution, deletion or addition of an amino acid. Variant proteins retain at least 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% homology with the starting enzyme. Suitable starting enzymes may include any enzyme with esterase or lipase activity. Preferably, the starting enzyme is compared with the consensus sequence pfam00657.

В предпочтительном варианте осуществления вариант фермента липидацилтрансферазы сохраняет или содержит, по меньшей мере, одну или несколько аминокислотных остатков консенсусной последовательности рfam00657, находящихся в участках GDS, GANDY и HPT.In a preferred embodiment, a variant of the lipid acyltransferase enzyme stores or contains at least one or more amino acid residues of the consensus sequence pfam00657 located in the GDS, GANDY and HPT regions.

Ферменты, такие как липазы с отсутствием или низкой липидацилтрансферазной активностью в водной среде, можно подвергать мутированию с применением средств молекулярного преобразования для введения или усиления трансферазной активности, таким образом получая фермент липидацилтрансферазу со значительной трансферазной активностью, пригодный для применения в композициях и способах по настоящему изобретению.Enzymes, such as lipases with no or low lipid acyltransferase activity in an aqueous medium, can be mutated using molecular transformants to introduce or enhance transferase activity, thereby producing a lipid acyltransferase enzyme with significant transferase activity, suitable for use in the compositions and methods of the present invention .

Таким образом, липидацилтрансфераза для применения по изобретению может представлять собой вариант с повышенной ферментативной активностью в отношении полярных липидов, предпочтительно фосфолипидов и/или гликолипидов, по сравнению с исходным ферментом. Предпочтительно такие варианты также обладают низкой активностью или у них нет активности в отношении полярных лизолипидов. Повышенная активность в отношении полярных липидов, фосфолипидов и/или гликолипидов может быть результатом гидролитической и/или трансферазной активности или сочетания обоих.Thus, a lipid acyltransferase for use according to the invention may be a variant with increased enzymatic activity against polar lipids, preferably phospholipids and / or glycolipids, compared with the starting enzyme. Preferably, such variants also have low activity or do not have activity against polar lysolipids. Increased activity against polar lipids, phospholipids and / or glycolipids may result from hydrolytic and / or transferase activity, or a combination of both.

Вариант липидацилтрансферазы для применения по изобретению по сравнению с исходным ферментом может обладать уменьшенной активностью в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов.The lipid acyltransferase variant for use according to the invention as compared with the starting enzyme may have reduced activity with respect to triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides.

Таким образом, вариант фермента может не обладать активностью в отношении триглицеридов, и/или моноглицеридов, и/или диглицеридов.Thus, an enzyme variant may not have activity against triglycerides and / or monoglycerides and / or diglycerides.

Альтернативно вариант фермента для применения по изобретению может обладать повышенной активностью в отношении триглицеридов и/или также может обладать повышенной активностью в отношении одного или несколько из следующих ниже полярных липидов, фосфолипидов, лецитина, фосфатидилхолина, гликолипидов, дигалактозилмоноглицерида, моногалактозилмоноглицерида.Alternatively, an enzyme variant for use according to the invention may have increased activity against triglycerides and / or may also have increased activity against one or more of the following polar lipids, phospholipids, lecithin, phosphatidylcholine, glycolipids, digalactosyl monoglyceride, monogalactosyl monoglyceride.

Варианты липидацилтрансфераз известны, и один или несколько из таких вариантов может быть пригоден для применения в способах и применениях по настоящему изобретению и/или в композициях фермента по настоящему изобретению. В качестве неограничивающих примеров по настоящему изобретению можно применять варианты липидацилтрансфераз, описанные в следующих ниже ссылках: Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al. J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269 (3): 2146-50; Brumlik et al. J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al. Protein Sci. 1998 Mar; 7 (3):587-99.Variants of lipid acyltransferases are known, and one or more of these variants may be suitable for use in the methods and applications of the present invention and / or in the enzyme compositions of the present invention. As non-limiting examples of the present invention, lipid acyltransferase variants described in the following references can be used: Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al . J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269 (3): 2146-50; Brumlik et al . J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al . Protein Sci. 1998 Mar; 7 (3): 587-99.

АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИAMINO ACID SEQUENCES

Настоящее изобретение также относится к аминокислотным последовательностям полипептидов с конкретными свойствами, как определено здесь.The present invention also relates to amino acid sequences of polypeptides with specific properties, as defined here.

Как применяют здесь, термин "аминокислотная последовательность" является синонимом с термином "полипептид" и/или с термином "белок". В некоторых случаях термин "аминокислотная последовательность" является синонимом с термином "пептид".As used here, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "polypeptide" and / or with the term "protein". In some cases, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "peptide".

Аминокислотную последовательность можно получить/выделить из природного источника, или ее можно получить синтетическим способом, или ее можно получить с применением технологий рекомбинантных ДНК.Amino acid sequence can be obtained / isolated from a natural source, or it can be obtained synthetically, or it can be obtained using recombinant DNA technology.

Таким образом, аминокислотные последовательности можно получать из указанных здесь выделенных полипептидов посредством стандартных способов.Thus, amino acid sequences can be obtained from the isolated polypeptides indicated herein by standard methods.

Один из пригодных способов определения аминокислотных последовательностей из выделенных полипептидов представляет собой следующее.One suitable method for determining amino acid sequences from isolated polypeptides is as follows.

Очищенный полипептид можно высушивать замораживанием и 100 мкг высушенного замораживанием вещества можно растворять в 50 мкл смеси 8 М мочевины и 0,4 М кислого углекислого аммония, pH 8,4. Растворенный белок можно денатурировать и восстанавливать в течение 15 минут при 50°C с последующим нанесением азота и добавлением 5 мкл 45 мМ дитиотреитола. После охлаждения до комнатной температуры можно добавлять 5 мкл 100 мМ йодацетамида для дериватизации остатков цистеина в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте в азоте.The purified polypeptide can be freeze dried and 100 μg of the freeze dried substance can be dissolved in 50 μl of a mixture of 8 M urea and 0.4 M acid ammonium carbonate, pH 8.4. The dissolved protein can be denatured and reduced for 15 minutes at 50 ° C, followed by nitrogen deposition and 5 μl of 45 mM dithiothreitol. After cooling to room temperature, 5 μl of 100 mM iodoacetamide can be added to derivatize cysteine residues for 15 minutes at room temperature in the dark in nitrogen.

К указанной выше реакционной смеси можно добавлять 135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы Lys-C в 5 мкл воды и в течение 24 часов можно проводить расщепление при 37°C в азоте.To the above reaction mixture, 135 μl of water and 5 μg of Lys-C endoproteinase in 5 μl of water can be added and cleavage at 37 ° C in nitrogen can be performed within 24 hours.

Полученные пептиды можно разделять посредством ВЭЖХ с обратной фазой на колонке VYDAC C18 (0,46×l5см; 10 мкм; The Separation Group, California, USA) с применением растворителя A: 0,1% TFA в воде и растворителя B: 0,1% TFA в ацетонитриле. До N-концевого определения последовательности выбранные пептиды можно повторно хроматографировать на колонке Develosil C18 с применением той же системы растворителей. Определение последовательности можно проводить с применением секвенатора Applied Biosystems 476A с применением быстрых циклов пульсирующей жидкости по инструкциям производителя (Applied Biosystems, California, USA).The resulting peptides can be separated by reverse phase HPLC on a VYDAC C18 column (0.46 × 5cm; 10 μm; The Separation Group, California, USA) using solvent A: 0.1% TFA in water and solvent B: 0.1 % TFA in acetonitrile. Prior to the N-terminal sequence determination, selected peptides can be rechromatographed on a Develosil C18 column using the same solvent system. Sequencing can be performed using an Applied Biosystems 476A sequencer using fast pulsating fluid cycles according to the manufacturer's instructions (Applied Biosystems, California, USA).

ИДЕНТИЧНОСТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ИЛИ ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE IDENTITY OR HOMOLOGY OF SEQUENCES

Настоящее изобретение также относится к применению последовательностей с определенной степенью идентичности последовательности или гомологии последовательности с аминокислотной последовательностью(ями) полипептида, обладающего конкретными определенными здесь свойствами, или с любой нуклеотидной последовательностью, кодирующей такой полипептид (далее обозначаемых здесь как "гомологичная последовательность(и)"). Здесь термин "гомолог" означает объект, обладающий определенной гомологией с аминокислотными последовательностями по изобретению и нуклеотидными последовательностями по изобретению. Здесь термин "гомология" можно приравнять к "идентичности".The present invention also relates to the use of sequences with a certain degree of sequence identity or sequence homology with the amino acid sequence (s) of a polypeptide having the specific properties defined here, or with any nucleotide sequence encoding such a polypeptide (hereinafter referred to as "homologous sequence (s)" ) As used herein, the term “homologue” means an entity having a defined homology with the amino acid sequences of the invention and the nucleotide sequences of the invention. Here the term "homology" can be equated to "identity".

Гомологичная аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность должна предоставлять и/или кодировать полипептид, сохраняющий функциональную активность и/или усиливающий активность фермента.A homologous amino acid sequence and / or nucleotide sequence should provide and / or encode a polypeptide that retains functional activity and / or enhances the activity of the enzyme.

В настоящем контексте гомологичная последовательность взята так, чтобы содержать аминокислотную последовательность, которая может быть, по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентична, предпочтительно, по меньшей мере на 95 или 98% идентична последовательности по изобретению. Как правило, гомологи содержат те же активные центры и т.д. что и аминокислотная последовательность по изобретению. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства (т.е. аминокислотные остатки со сходными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию в терминах идентичности последовательностей.In the present context, the homologous sequence is taken to contain an amino acid sequence that can be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95 or 98% identical to the sequence of the invention. As a rule, homologues contain the same active centers, etc. as the amino acid sequence of the invention. Although homology can also be considered in terms of similarity (i.e., amino acid residues with similar chemical properties / functions), in the context of the present invention, it is preferable to express homology in terms of sequence identity.

В настоящем контексте гомологичная последовательность взята так, чтобы содержать нуклеотидную последовательность, которая может быть, по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентична, предпочтительно, по меньшей мере на 95 или 98% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по настоящему изобретению (последовательность по изобретению). Как правило, гомологи будут содержать те же последовательности, которые кодируют активные центры и т.д., как и последовательность по изобретению. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства (т.е. аминокислотные остатки со сходными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения предпочтительно выражать гомологию в терминах идентичности последовательностей.In the present context, the homologous sequence is taken to contain a nucleotide sequence that can be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95 or 98% identical to the nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention (sequence according to the invention). Typically, homologues will contain the same sequences that encode active sites, etc., like the sequence of the invention. Although homology can also be considered in terms of similarity (i.e., amino acid residues with similar chemical properties / functions), in the context of the present invention, it is preferable to express homology in terms of sequence identity.

Сравнения гомологии можно проводить на глаз или, как правило, с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. Данные коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитывать % гомологии двух или более последовательностей.Homology comparisons can be made by eye or, as a rule, using readily available sequence comparison programs. Data commercially available computer programs can calculate% homology of two or more sequences.

% Гомологии можно рассчитать у непрерывных последовательностей, т.е. одна последовательность сравнивается с другой последовательностью и каждая аминокислота в одной последовательности непосредственно сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, один остаток за раз. Это называется сравнение "без пропусков". Как правило, такие сравнения без пропусков проводят только для относительно короткого количества остатков.% Homology can be calculated for continuous sequences, i.e. one sequence is compared with another sequence and each amino acid in one sequence is directly compared with the corresponding amino acid in another sequence, one residue at a time. This is called a no-skip comparison. Typically, such comparisons without omissions are made only for a relatively short amount of residues.

Хотя это является очень простым и логичным способом, он не может принимать в расчет, например, то, что в идентичных во всем остальном парах последовательностей инсерция или делеция будет вызывать сдвиг следующих аминокислотных остатков из сравнения, таким образом потенциально приводя к большому уменьшению % гомологии при проведении глобального сравнения. Следовательно, большинство способов сравнения последовательностей разработаны так, чтобы получать оптимальные сравнения, принимающие в расчет возможные инсерции и делеции без чрезмерного ухудшения показателя общей гомологии. Этого достигают посредством вставки в сравнение последовательностей "пробелов", чтобы попытаться максимизировать локальную гомологию.Although this is a very simple and logical way, it cannot take into account, for example, that in the pairs of sequences identical in all other respects, insertion or deletion will cause a shift of the following amino acid residues from the comparison, thus potentially leading to a large decrease in% homology with conducting global comparisons. Therefore, most sequence comparison methods are designed to provide optimal comparisons that take into account possible insertions and deletions without unduly impairing overall homology. This is achieved by inserting “space” sequences in the comparison to try to maximize local homology.

Однако в этих более сложных способах устанавливают "штрафы за пробелы" для каждого пробела, находящегося в сравнении так, что для одного и того же количества идентичных аминокислот сравнение последовательностей с как можно меньшим числом пробелов насколько возможно - отражая большую связанность между двух сравниваемых последовательностей - будет обеспечивать больший показатель, чем с многими пробелами. Применяют, как правило, "цены однородных пробелов", устанавливающие относительно высокую цену за существование пробела и меньший штраф за каждый последующий остаток в пробеле. Это является наиболее часто используемой системой оценки пробелов. Конечно, высокие штрафы за пробел дадут оптимизированные сравнения с меньшим количеством пробелов. Большинство программ сравнения позволяют модифицировать штрафы за пробел. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнений последовательностей предпочтительно использовать значения по умолчанию. Например, при применении пакета GCG Wisconsin Bestfit значение штрафа за пробел для аминокислотных последовательностей по умолчанию составляет -12 за пробел и -4 за каждое продолжение.However, in these more complex methods, “fines for spaces” are set for each space that is compared so that for the same number of identical amino acids, sequence comparison with as few spaces as possible - reflecting the greater connectivity between the two sequences being compared - will be Provide a larger metric than with many spaces. As a rule, “homogeneous gap prices” are used, setting a relatively high price for the existence of a gap and a smaller penalty for each subsequent remainder in the gap. This is the most commonly used gap rating system. Of course, high fines for a space will give optimized comparisons with fewer spaces. Most comparison programs allow you to modify fines for a space. However, when using such software for sequence comparisons, it is preferable to use the default values. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package, the default penalty per space for amino acid sequences is -12 per space and -4 for each continuation.

Таким образом, для подсчета максимума % гомологии, во-первых, необходимо получение оптимального сравнения, принимая в расчет штрафы за пробелы. Подходящая компьютерная программа для проведения такого сравнения представляет собой пакет GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 p. 387). Примеры другого программного обеспечения, способного проводить сравнения последовательностей, включают в себя в качестве неограничивающих примеров пакет BLAST (см. Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed - Chapter 18), FASTA (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410) и набор средств сравнения GENEWORKS. И BLAST, и FASTA доступны для поиска в отключенном и подключенном к сети состоянии (см. Ausubel et al. 1999, страницы с 7-58 до 7-60). Однако для некоторых приложений предпочтительно применять программу GCG Bestfit. Также доступно новое средство для сравнения белка и нуклеотидной последовательности, называемое BLAST 2 Sequences (см. FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 и tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).Thus, to calculate the maximum% homology, firstly, it is necessary to obtain an optimal comparison, taking into account the penalties for spaces. A suitable computer program for such a comparison is the GCG Wisconsin Bestfit package (Devereux et al . 1984 Nuc. Acids Research 12 p. 387). Examples of other software capable of performing sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST package (see Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4 ^th Ed - Chapter 18), FASTA (Altschul et al . 1990 J. Mol. Biol. 403-410) and GENEWORKS Comparison Kit. Both BLAST and FASTA are searchable when disconnected and connected to the network (see Ausubel et al. 1999, pages 7-58 to 7-60). However, for some applications it is preferable to use the GCG Bestfit program. Also available is a new protein and nucleotide sequence comparing tool called BLAST 2 Sequences (see FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm. nih.gov).

Хотя конечный % гомологи можно измерять в терминах идентичности, сам процесс сравнения, как правило, не основывается на категорическом сравнении пар. Вместо этого, как правило, используют матрицу оценки взвешенного подобия, назначающую оценку каждому парному сравнению на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой широко применяемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для набора программ BLAST. В программах GCG Wisconsin, как правило, применяют или общедоступные значения по умолчанию или пользовательскую таблицу сравнения символов, если снабжено (см. руководство пользователя для дальнейших подробностей). Для некоторых применений предпочтительно применять общедоступные значения по умолчанию для пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.Although the final% homologues can be measured in terms of identity, the comparison process itself, as a rule, is not based on a categorical comparison of pairs. Instead, a weighted similarity score matrix is typically used, assigning a score to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. An example of such a widely used matrix is the BLOSUM62 matrix, the default matrix for the BLAST suite of programs. GCG Wisconsin programs typically use either public defaults or a custom character comparison table, if provided (see the user manual for further details). For some applications, it is preferable to use the public default values for the GCG package or, in the case of other software, a default matrix such as BLOSUM62.

Альтернативно процент гомологии можно подсчитать с применением возможности множественного сравнения в DNASIS™ (Hitachi Software) на основе алгоритма, аналогичного CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).Alternatively, homology percent can be calculated using the multiple comparison capability in DNASIS ™ (Hitachi Software) based on an algorithm similar to CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).

После получения с применением программного обеспечения оптимального сравнения можно подсчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательностей. Программное обеспечение, как правило, делает это как часть сравнения последовательностей и выдает численный результат.After obtaining optimal comparison using software,% homology, preferably% sequence identity, can be calculated. Software typically does this as part of a sequence comparison and provides a numerical result.

Последовательности также могут обладать делециями, инсерциями или заменами аминокислотных остатков, дающие молчащее изменение и приводящие к функционально эквивалентному веществу. На основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков можно делать продуманные аминокислотные замены при условии сохранения вторичной активности связывания вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин; а аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, обладающие сходными значениями гидрофильности, включают в себя лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.Sequences can also have deletions, insertions or substitutions of amino acid residues, giving a silent change and leading to a functionally equivalent substance. Based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or amphipathic nature of the residues, thoughtful amino acid substitutions can be made, provided that the secondary activity of the binding of the substance is preserved. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids with uncharged polar terminal groups having similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine and tyrosine.

Могут быть сделаны консервативные замены, например такие, как показаны в таблице ниже. Аминокислоты в одной ячейке во второй колонке и предпочтительно в одной и той же строке третьей колонки могут замещать друг друга.Conservative substitutions can be made, for example, such as those shown in the table below. Amino acids in one cell in the second column and preferably in the same row of the third column can be substituted for each other.

Настоящее изобретение также относится к гомологичной замене (и замену, и замещение здесь используют для обозначения обмена существующего аминокислотного остатка на альтернативный остаток), которую можно провести, т.е. сходную замену, такую как основную на основную, кислая на кислую, полярная на полярную и т.д. Также можно производить негомологичную замену, т.е. с одного класса остатков на другой, или, альтернативно, включающую в себя введение неприродных аминокислот, таких как орнитин (далее здесь обозначаемый как Z), диаминомасляная кислота орнитин (далее здесь обозначаемый как B), норлейцин орнитин (далее здесь обозначаемый как O), пириилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.The present invention also relates to a homologous substitution (both substitution and substitution are used here to indicate the exchange of an existing amino acid residue for an alternative residue) that can be carried out, i.e. similar substitutions, such as basic to basic, acidic to acidic, polar to polar, etc. It is also possible to make a non-homologous change, i.e. from one class of residues to another, or, alternatively, involving the introduction of non-natural amino acids such as ornithine (hereinafter referred to as Z), diaminobutyric acid ornithine (hereinafter referred to as B), norleucine ornithine (hereinafter referred to as O), pyriylalanine, thienylalanine, naphthylalanine and phenylglycine.

Замещения также можно производить неприродными аминокислотами.Substitutions can also be made with unnatural amino acids.

Варианты аминокислотных последовательностей в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина, могут включать в себя подходящие спейсерные группы, которые можно вставлять между любыми двумя аминокислотными остатками в последовательности и которые включают в себя алкильные группы, такие как метильная, этильная или пропильная группы. Дополнительная форма варьирования, включающая в себя присутствие одного или нескольких аминокислотных остатков в пептоидной форме, будет хорошо понятна специалистам в данной области. Во избежание неопределенности "пептоидную форму" применяют для обозначения вариантов аминокислотных остатков, где замещающая группа α-углерода находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способ получения пептидов в пептоидной форме известен в данной области, например, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 и Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.Variants of amino acid sequences in addition to amino acid spacers, such as glycine or β-alanine residues, may include suitable spacer groups that can be inserted between any two amino acid residues in the sequence and which include alkyl groups such as methyl, ethyl or propyl group. An additional form of variation, including the presence of one or more amino acid residues in peptoid form, will be well understood by those skilled in the art. To avoid ambiguity, the "peptoid form" is used to denote variants of amino acid residues where the substituent group of the α-carbon is on the nitrogen atom of the residue, and not on the α-carbon. A method for preparing peptides in peptoid form is known in the art, for example, Simon RJ et al ., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.

Нуклеотидные последовательности для применения по настоящему изобретению или кодирующие полипептид с конкретными определенными здесь свойствами могут содержать внутри себя синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известен ряд различных типов модификаций олигонуклеотидов. Они включают в себя метилфосфонатные и фосфоротиоатные основные цепи и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей на 3'- и/или 5'-концы молекулы. Для целей настоящего изобретения необходимо понимать, что описанные здесь нуклеотидные последовательности можно модифицировать любым доступным в данной области способом. Такие модификации можно проводить для увеличения активности или времени жизни нуклеотидных последовательностей in vivo.Nucleotide sequences for use in the present invention or encoding a polypeptide with the specific properties defined herein may contain synthetic or modified nucleotides. A number of different types of oligonucleotide modifications are known in the art. They include methylphosphonate and phosphorothioate backbones and / or the addition of acridine or polylysine chains at the 3 ′ and / or 5 ′ ends of the molecule. For the purposes of the present invention, it should be understood that the nucleotide sequences described herein can be modified by any method available in the art. Such modifications can be made to increase the activity or lifetime of nucleotide sequences in vivo .

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей, комплементарных описанным здесь последовательностям, или любого производного, фрагмента или его производного. Если последовательность комплементарна их фрагментам, тогда эту последовательность можно применять в качестве зонда для идентификации сходных кодирующих последовательностей в других организмах и т.д.The present invention also relates to the use of nucleotide sequences complementary to the sequences described herein, or any derivative, fragment or derivative thereof. If the sequence is complementary to their fragments, then this sequence can be used as a probe to identify similar coding sequences in other organisms, etc.

Полинуклеотиды, не на 100% гомологичные последовательностям по настоящему изобретению, но находящиеся в пределах объема изобретения, можно получать рядом способов. Другие варианты описанных здесь последовательностей можно получать, например, зондированием библиотек ДНК, полученных из ряда индивидуумов, например индивидуумов из различных популяций. Кроме того, можно получать другие вирусные/бактериальные или клеточные гомологи, особенно клеточные гомологи, находящиеся в клетках млекопитающих (например, крысиные, мышиные, бычьи клетки и клетки приматов), и такие гомологи и их фрагменты в большинстве случаев способны к селективной гибридизации с последовательностями, представленными в перечисленных здесь последовательностях. Такие последовательности можно получать зондированием библиотек кДНК, полученных из других видов животных, или библиотек их геномных ДНК и зондированием таких библиотек зондами, содержащими всю или часть любой последовательности в приложенных списках последовательностей в условиях от средней до высокой строгости. Подобные рассуждения применяют для получения видовых гомологов и аллельных вариантов полипептида или нуклеотидных последовательностей по изобретению.Polynucleotides that are not 100% homologous to the sequences of the present invention, but are within the scope of the invention, can be obtained in a number of ways. Other variants of the sequences described herein can be obtained, for example, by probing libraries of DNA obtained from a number of individuals, for example individuals from various populations. In addition, other viral / bacterial or cellular homologs can be obtained, especially cellular homologs found in mammalian cells (e.g. rat, mouse, bovine and primate cells), and such homologs and fragments thereof are in most cases capable of selective hybridization with sequences presented in the sequences listed here. Such sequences can be obtained by probing cDNA libraries obtained from other animal species, or libraries of their genomic DNA, and probing such libraries with probes containing all or part of any sequence in the attached sequence lists under medium to high stringency conditions. Similar reasoning is used to obtain species homologues and allelic variants of the polypeptide or nucleotide sequences of the invention.

Варианты и штаммовые/видовые гомологи также можно получить с применением вырожденной ПЦР, в которой применяют праймеры, разработанные для соответствия последовательностям в вариантах и гомологах, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности в последовательности по настоящему изобретению. Консервативные последовательности можно предсказывать, например, посредством сравнения аминокислотных последовательностей различных вариантов/гомологов. Сравнения последовательностей можно проводить с применением известного в данной области компьютерного программного обеспечения. Например, широко применяют программу GCG Wisconsin PileUp.Variants and strain / species homologues can also be obtained using degenerate PCR, which uses primers designed to match the sequences in variants and homologues encoding conserved amino acid sequences in the sequence of the present invention. Conservative sequences can be predicted, for example, by comparing amino acid sequences of different variants / homologs. Sequence comparisons can be carried out using computer software known in the art. For example, the GCG Wisconsin PileUp program is widely used.

Применяемые в вырожденной ПЦР праймеры содержат одно или несколько вырожденных положений, и их применяют в условиях строгости, меньшей, чем условия строгости, применяемые для клонирования последовательностей при использовании праймеров с одной последовательностью для известных последовательностей.Primers used in degenerate PCR contain one or more degenerate positions and are used under stringent conditions less than the stringent conditions used for cloning sequences using single-sequence primers for known sequences.

Альтернативно такие полинуклеотиды можно получать посредством сайт-специфического мутагенеза охарактеризованных последовательностей. Это может быть пригодным, например, когда необходимы молчащие изменения последовательности кодонов для оптимизации предпочтительных кодонов для конкретной клетки-хозяина, в которой экспрессируются полинуклеотидные последовательности. Для введения участков распознавания рестрикционных полипептидов или для изменения свойства или функционирования кодируемых полинуклеотидами полипептидов могут быть желательными другие изменения последовательностей.Alternatively, such polynucleotides can be obtained by site-specific mutagenesis of the characterized sequences. This may be suitable, for example, when silent changes in the codon sequence are necessary to optimize the preferred codons for a particular host cell in which polynucleotide sequences are expressed. Other sequences changes may be desirable to introduce restriction polypeptide recognition sites or to alter the property or function of polynucleotide encoded polypeptides.

Полинуклеотиды (нуклеотидные последовательности) по изобретению можно применять для получения праймера, например, праймера для ПЦР, праймера для альтернативной реакции амплификации, зонда, например, меченного выявляемой меткой традиционными способами с применением радиоактивных или нерадиоактивных меток, или полинуклеотиды можно клонировать в векторы. Такие праймеры, зонды и другие фрагменты составляют, по меньшей мере 15, предпочтительно, по меньшей мере 20, например, по меньшей мере, 25, 30 или 40 нуклеотидов в длину и также обозначены термином полинуклеотиды по изобретению, как применяют здесь.The polynucleotides (nucleotide sequences) of the invention can be used to prepare a primer, for example, a PCR primer, an alternative amplification reaction primer, a probe, for example, labeled with a detectable tag using conventional methods using radioactive or non-radioactive tags, or polynucleotides can be cloned into vectors. Such primers, probes, and other fragments are at least 15, preferably at least 20, for example at least 25, 30, or 40 nucleotides in length and are also indicated by the term polynucleotides of the invention as used herein.

Полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды и зонды ДНК по изобретению, можно получать рекомбинантным способом, синтетически или любыми доступными специалистам в данной области способами. Их также можно клонировать посредством стандартных способов.Polynucleotides, such as polynucleotides and DNA probes according to the invention, can be obtained by recombinant methods, synthetically or by any methods available to specialists in this field. They can also be cloned by standard methods.

В большинстве случаев праймеры получают синтетическими способами, включающими в себя пошаговое получение желательной последовательности нуклеиновой кислоты по одному нуклеотиду за один раз. Способы выполнения этого с применением автоматических способов легко доступны в данной области.In most cases, primers are prepared by synthetic methods, including the stepwise preparation of the desired nucleic acid sequence one nucleotide at a time. Methods for accomplishing this using automatic methods are readily available in the art.

Более длинные полинуклеотиды, как правило, получают с применением рекомбинантных способов, например с применением способов клонирования посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция). Это включает в себя получение пары праймеров (например, приблизительно от 15 до 30 нуклеотидов), фланкирующих область направленной к липиду последовательности, которую желательно клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученных из животной или человеческой клетки, проведение полимеразной цепной реакции в условиях, в которых проходит амплификация желательной области, выделение амплифицированного фрагмента (например, посредством очистки реакционной смеси на агарозном геле) и восстановление амплифицированной ДНК. Праймеры можно разработать так, чтобы они содержали подходящие участки распознавания рестрикционными ферментами, так чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящий клонирующий вектор.Longer polynucleotides are typically prepared using recombinant methods, for example, using cloning methods by PCR (polymerase chain reaction). This includes obtaining a pair of primers (for example, from about 15 to 30 nucleotides) flanking the region directed to the lipid sequence that it is desirable to clone, bringing the primers into contact with mRNA or cDNA obtained from an animal or human cell, carrying out a polymerase chain reaction in the conditions under which amplification of the desired region takes place, isolation of the amplified fragment (for example, by purification of the reaction mixture on an agarose gel) and restoration of the amplified DNA. Primers can be designed so that they contain suitable recognition sites by restriction enzymes so that the amplified DNA can be cloned into a suitable cloning vector.

ГИБРИДИЗАЦИЯHYBRIDIZATION

Настоящее изобретение также относится к последовательностям, комплементарным последовательностям по настоящему изобретению, или последовательностям, способным гибридизоваться или с последовательностями по настоящему изобретению или с последовательностями, комплементарными им.The present invention also relates to sequences complementary to the sequences of the present invention, or sequences capable of hybridizing with either sequences of the present invention or sequences complementary to them.

Как применяют здесь, термин "гибридизация" должен включать в себя "процесс, посредством которого цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью посредством спаривания оснований", а также процесс амплификации, как осуществляют в технологиях полимеразной цепной реакции (ПЦР).As used herein, the term “hybridization” should include “a process by which a nucleic acid chain binds to a complementary strand via base pairing”, as well as an amplification process as carried out in polymerase chain reaction (PCR) technologies.

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей, способных к гибридизации с последовательностями, комплементарными с описанными здесь последовательностями по настоящему изобретению, или любых производных, фрагментов или их производных.The present invention also relates to the use of nucleotide sequences capable of hybridization with sequences complementary to the sequences of the present invention described herein, or any derivatives, fragments or derivatives thereof.

Настоящее изобретение также относится к последовательностям, которые комплементарны к последовательностям, способным гибридизоваться с описанными здесь нуклеотидными последовательностями.The present invention also relates to sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein.

Условия гибридизации основаны на температуре плавления (Tm) комплекса связанных нуклеотидов, как указано у Berger и Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), и обладают определенной "строгостью", как указано ниже.Hybridization conditions are based on the melting temperature (Tm) of the complex of linked nucleotides, as described by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), and have a certain "stringency" as indicated below.

Максимальная строгость, как правило, имеет место приблизительно при Tm -5°C (5°C ниже Tm зонда); высокая строгость, приблизительно при температурах от 5°C до 10°C ниже Tm; промежуточная строгость, приблизительно при температурах от 10°C до 20°C ниже Tm; и низкая строгость, приблизительно при температурах от 20°C до 25°C ниже Tm. Как будет понятно специалистам в данной области, гибридизацию с максимальной строгостью можно применять для идентификации или выявления идентичных нуклеотидных последовательностей, тогда как гибридизацию с промежуточной строгостью (или низкой) можно применять для идентификации или выявления сходных или родственных полинуклеотидных последовательностей.Maximum stringency typically occurs at approximately Tm -5 ° C (5 ° C below the Tm probe); high stringency, approximately at temperatures from 5 ° C to 10 ° C below Tm; intermediate stringency, at temperatures between 10 ° C and 20 ° C below Tm; and low stringency, approximately at temperatures from 20 ° C to 25 ° C below Tm. As will be appreciated by those skilled in the art, hybridization with maximum stringency can be used to identify or identify identical nucleotide sequences, while hybridization with intermediate stringency (or low) can be used to identify or identify similar or related polynucleotide sequences.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к последовательностям, которые комплементарны к последовательностям, способным гибридизоваться в условиях с высокой строгостью или в условиях с промежуточной строгостью с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды с конкретными свойствами, как определено здесь.Preferably, the present invention relates to sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing under high stringency conditions or under conditions of intermediate stringency to nucleotide sequences encoding polypeptides with specific properties as defined herein.

Более предпочтительно настоящее изобретение относится к последовательностям, комплементарным к последовательностям, способным к гибридизация в условиях с высокой строгостью (например, 65°C и 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат Na pH 7,0}) с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды с конкретными свойствами, как определено здесь.More preferably, the present invention relates to sequences complementary to sequences capable of hybridization under high stringency conditions (e.g., 65 ° C. and 0.1 × SSC {1 × SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na citrate pH 7, 0}) with nucleotide sequences encoding polypeptides with specific properties, as defined here.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, способным гибридизоваться с описанными здесь нуклеотидными последовательностями (включая сюда последовательности, комплементарные к описанным здесь последовательностям).The present invention also relates to nucleotide sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein (including sequences complementary to the sequences described herein).

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые комплементарны к последовательностям, способным гибридизоваться с описанными здесь нуклеотидными последовательностями (включая сюда последовательности, комплементарные к описанным здесь последовательностям).The present invention also relates to nucleotide sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein (including sequences complementary to the sequences described herein).

Также в объем настоящего изобретения включены полинуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться с описанными здесь нуклеотидными последовательностями в условиях строгости от промежуточной до максимальной.Also included in the scope of the present invention are polynucleotide sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein under stringent to intermediate conditions.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, способным гибридизоваться с описанными здесь нуклеотидными последовательностями или с комплементарными им последовательностями в строгих условиях (например, 50°C и 0,2 × SSC).In a preferred aspect, the present invention relates to nucleotide sequences capable of hybridizing with the nucleotide sequences described herein or with sequences complementary thereto under stringent conditions (e.g., 50 ° C. and 0.2 × SSC).

В более предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, способным гибридизоваться с описанными здесь нуклеотидными последовательностями или комплементарными им последовательностями в условиях с высокой строгостью (например, 65°C и 0,1 × SSC).In a more preferred aspect, the present invention relates to nucleotide sequences that are capable of hybridizing with the nucleotide sequences described here or complementary to them sequences under conditions of high stringency (for example, 65 ° C and 0.1 × SSC).

ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИПЕПТИДОВEXPRESSION OF POLYPEPTIDES

Нуклеотидную последовательность для применения по настоящему изобретению или кодирующая полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, можно вставить в рекомбинантный реплицирующийся вектор. Вектор можно применять для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форму полипептида в совместимой клетке-хозяине и/или из нее. Экспрессию можно контролировать с применением контрольных последовательностей, включающих в себя промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Можно применять прокариотические промоторы и промоторы, функционирующие в эукариотических клетках. Можно применять тканеспецифические или специфичные к стимулам промоторы. Также можно применять химерные промоторы, включающие в себя элементы последовательностей из двух или большего числа различных промоторов, описанных выше.A nucleotide sequence for use in the present invention or an encoding polypeptide with specific properties, as defined herein, can be inserted into a recombinant replicating vector. The vector can be used to replicate and express the nucleotide sequence in the form of a polypeptide in and from or from a compatible host cell. Expression can be controlled using control sequences, including promoters / enhancers and other expression regulation signals. You can apply prokaryotic promoters and promoters that function in eukaryotic cells. Tissue-specific or stimulus-specific promoters may be used. Chimeric promoters may also be used, including sequence elements from two or more different promoters described above.

Полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином при экспрессии нуклеотидной последовательности в зависимости от применяемых последовательности и/или вектора, может быть секретируемым или может содержаться внутриклеточно. Кодирующие последовательности можно разработать так, чтобы они содержали сигнальные последовательности, направляющие секрецию кодирующих вещество последовательностей за конкретную прокариотическую или эукариотическую клеточную мембрану.The polypeptide produced by the recombinant host cell upon expression of the nucleotide sequence depending on the sequence and / or vector used may be secreted or may be contained intracellularly. Coding sequences can be designed to contain signal sequences directing the secretion of substance coding sequences for a particular prokaryotic or eukaryotic cell membrane.

ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОРEXPRESSING VECTOR

Термин "экспрессирующий вектор" означает конструкцию, способную к экспрессии in vivo или in vitro.The term “expression vector” means a construct capable of expression in vivo or in vitro .

Предпочтительно экспрессирующий вектор включен в геном организма. Термин "включен" предпочтительно относится к стабильному включению в геном.Preferably, the expression vector is incorporated into the genome of the body. The term "included" preferably refers to stable incorporation into the genome.

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению или кодирующая полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, может находиться в векторе, в котором нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями так, что регуляторные последовательности способны обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности подходящим организмом-хозяином, т.е. вектор представляет собой экспрессирующий вектор.The nucleotide sequence of the present invention or the coding polypeptide with specific properties, as defined herein, may be in a vector in which the nucleotide sequence is operably linked to regulatory sequences so that the regulatory sequences are capable of providing expression of the nucleotide sequence with a suitable host organism, i.e. the vector is an expression vector.

Векторы по настоящему изобретению можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, как описано ниже, для обеспечения экспрессии полипептида с конкретными свойствами, как определено здесь.The vectors of the present invention can be transformed into a suitable host cell, as described below, to allow expression of a polypeptide with specific properties, as defined here.

Выбор вектора, например плазмидного, космидного, вирусного или фагового вектора, часто зависит от клетки-хозяина, в которую его вводят.The choice of a vector, for example a plasmid, cosmid, viral or phage vector, often depends on the host cell into which it is introduced.

Векторы могут содержать один или несколько селективных маркерных генов, таких как ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотику, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Альтернативно выбор можно проводить посредством совместной трансформации (как описано в WO91/17243).The vectors may contain one or more selective marker genes, such as a gene that provides antibiotic resistance, for example, ampicillin, kanamycin, chloramphenicol or tetracycline resistance. Alternatively, the selection can be made through co-transformation (as described in WO91 / 17243).

Векторы можно применять in vitro, например, для получения РНК или применять для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.Vectors can be used in vitro , for example, to obtain RNA, or used to transfect or transform a host cell.

Таким образом, в дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению или нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды с конкретными свойствами, как определено здесь, посредством введения нуклеотидной последовательности в реплицируемый вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания клетки-хозяина в условиях, в которых осуществляется репликация вектора.Thus, in a further embodiment, the invention relates to a method for producing nucleotide sequences of the present invention or nucleotide sequences encoding polypeptides with specific properties, as defined herein, by introducing a nucleotide sequence into a replicated vector, introducing the vector into a compatible host cell and growing cell the host in the conditions under which the replication of the vector.

Вектор может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, позволяющую вектору реплицироваться в данной клетке-хозяине. Примеры таких последовательностей представляют собой точки начала репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.The vector may further comprise a nucleotide sequence allowing the vector to replicate in the given host cell. Examples of such sequences are replication start points for plasmids pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 and pIJ702.

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИREGULATORY SEQUENCES

В определенных применениях нуклеотидную последовательность для применения по настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, можно функционально связывать с регуляторной последовательностью, способной к обеспечению экспрессии нуклеотидной последовательности, например посредством выбранной клетки-хозяина. В качестве примера настоящее изобретение относится к вектору, включающему в себя нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, функционально связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор представляет собой экспрессирующий вектор.In certain applications, the nucleotide sequence for use in the present invention or the nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined herein, can be operably linked to a regulatory sequence capable of expressing the nucleotide sequence, for example, through a selected host cell. By way of example, the present invention relates to a vector comprising a nucleotide sequence of the present invention operably linked to such a regulatory sequence, i.e. the vector is an expression vector.

Термин "функционально связанный" относится к смежному положению, где описанные компоненты находятся в связи, позволяющей им функционировать предназначенным для них образом. Регуляторная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что в условиях, соответствующих контрольной последовательности, достигается экспрессия кодирующей последовательности.The term “operably linked” refers to an adjacent position where the described components are in a relationship that allows them to function in a manner intended for them. A regulatory sequence “operably linked” to a coding sequence is ligated in such a way that, under conditions appropriate to the control sequence, expression of the coding sequence is achieved.

Термин "регуляторные последовательности" включает в себя промоторы и энхансеры и другие регулирующие экспрессию сигналы.The term "regulatory sequences" includes promoters and enhancers and other expression control signals.

Термин "промотор" применяют в обычном для данной области смысле, например, участок связывания РНК-полимеразы.The term “promoter” is used in the usual sense for a given field, for example, an RNA polymerase binding site.

Повышенной экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент с конкретными свойствами, как определено здесь, также можно достичь посредством выбора гетерологичных регуляторных областей, например, промотора, областей секреторного лидера и терминатора.Increased expression of the nucleotide sequence encoding an enzyme with specific properties, as defined here, can also be achieved by selecting heterologous regulatory regions, for example, a promoter, regions of a secretory leader and a terminator.

Предпочтительно нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть функционально связана, по меньшей мере, с промотором.Preferably, the nucleotide sequence of the present invention may be operably linked to at least a promoter.

Примеры подходящих промоторов для направления транскрипции нуклеотидной последовательности в бактериальном, грибном или дрожжевом хозяине хорошо известны в данной области.Examples of suitable promoters for directing transcription of the nucleotide sequence in a bacterial, fungal, or yeast host are well known in the art.

КОНСТРУКЦИИCONSTRUCTIONS

Термин "конструкция", являющийся синонимом с такими терминами, как "конъюгат", "кассета" и "гибрид", включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующая полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, для применения по настоящему изобретению непосредственно или опосредованно присоединенную к промотору. Пример непрямого присоединения представляет собой предоставление подходящей спейсерной группы, такой как интронная последовательность, такая как интрон Sh1 или интрон ADH, находящейся между промотором и нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. То же самое верно для термина "гибридный" в отношении настоящего изобретения, включающего в себя прямое или непрямое соединение. В некоторых случаях термины не подразумевают природное сочетание кодирующей белок нуклеотидной последовательности, обычным способом ассоциированной с генным промотором дикого типа, и когда они оба находятся в их природном окружении.The term "construct", which is synonymous with terms such as "conjugate", "cassette" and "hybrid", includes a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, for use in the present invention directly or indirectly attached to to the promoter. An example of indirect attachment is the provision of a suitable spacer group, such as an intron sequence, such as the Sh1 intron or ADH intron, between the promoter and the nucleotide sequence of the present invention. The same is true for the term "hybrid" in relation to the present invention, including direct or indirect connection. In some cases, the terms do not imply a natural combination of a protein-encoding nucleotide sequence that is normally associated with the wild-type gene promoter and when they are both in their natural environment.

Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, позволяющий отбор генетической конструкции.The construct may even contain or express a marker allowing selection of the genetic construct.

Для некоторых применений конструкция предпочтительно содержит, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, функционально связанный с промотором.For some applications, the construct preferably contains at least a nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined herein, operably linked to a promoter.

КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВАHOUSING CELLS

Термин "клетка-хозяин" в отношении настоящего изобретения включает в себя клетку, содержащую или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, или экспрессирующий вектор, как описано выше, и которую применяют в рекомбинантном получении полипептида с конкретными свойствами, как определено здесь.The term "host cell" in relation to the present invention includes a cell containing either a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, or expressing a vector, as described above, and which is used in the recombinant preparation of a polypeptide with specific properties, as defined here.

Таким образом, дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, трансформированным или трансфицированным нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению или нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь. Клетки следует выбирать так, чтобы они сочетались с указанным вектором, и они могут быть, например, прокариотическими (например, бактериальными), грибными, дрожжевыми или растительными клетками. Предпочтительно клетки-хозяева не являются человеческими клетками.Thus, an additional embodiment of the present invention relates to host cells transformed or transfected with a nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence expressing a polypeptide with specific properties, as defined here. Cells should be selected so that they combine with the specified vector, and they can be, for example, prokaryotic (e.g. bacterial), fungal, yeast, or plant cells. Preferably, the host cells are not human cells.

Примеры подходящих бактериальных хозяйских организмов представляют собой грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии.Examples of suitable bacterial host organisms are gram-negative bacteria and gram-positive bacteria.

В зависимости от природы нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, и/или желательности дальнейшего процессинга экспрессируемого белка предпочтительными могут являться эукариотические хозяева, такие как дрожжи или другие грибы. В большинстве случаев дрожжевые клетки предпочтительнее клеток грибов, так как ими проще манипулировать. Однако некоторые белки или плохо секретируются из дрожжевой клетки, или в некоторых случаях не подвергаются правильному процессингу (например, гипергликозилирование в дрожжах). В этих случаях следует выбирать другой грибной хозяйских организм.Depending on the nature of the nucleotide sequence encoding the polypeptide with specific properties as defined herein and / or the desirability of further processing the expressed protein, eukaryotic hosts such as yeast or other fungi may be preferred. In most cases, yeast cells are preferable to fungal cells, as they are easier to manipulate. However, some proteins are either poorly secreted from the yeast cell, or in some cases are not properly processed (for example, hyperglycosylation in yeast). In these cases, another fungal host organism should be chosen.

Применение подходящих клеток-хозяев, таких как дрожжи, грибы и растительные клетки-хозяева, может обеспечить посттрансляционные модификации (например, миристоилирование, гликозилирование, укорочение, липидизация и фосфорилирование по тирозину, серину или треонину), как может быть необходимым для обеспечения рекомбинантным продуктам экспрессии по настоящему изобретению оптимальной биологической активности.The use of suitable host cells, such as yeast, fungi, and plant host cells, can provide post-translational modifications (e.g., myristoylation, glycosylation, shortening, lipidization and phosphorylation of tyrosine, serine or threonine), as may be necessary to provide recombinant expression products according to the present invention optimal biological activity.

Клетка-хозяин может быть с дефицитом по протеазе или минус-штаммом по протеазе.A host cell may be protease deficient or a protease deficient strain.

ОРГАНИЗМORGANISM

Термин "организм" по отношению к настоящему изобретению включает в себя любой организм, способный содержать нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, и/или продукты, полученные из него.The term "organism" in relation to the present invention includes any organism capable of containing a nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, and / or products derived from it.

Пригодные организмы могут включать в себя прокариоты, грибы, дрожжи или растения.Suitable organisms may include prokaryotes, fungi, yeast, or plants.

Термин "трансгенный организм" в отношении настоящего изобретения включает в себя любой организм, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, и/или получаемые из него продукты, и/или где промотор может обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, в организме. Предпочтительно нуклеотидная последовательность включена в геном организма.The term "transgenic organism" in relation to the present invention includes any organism that contains a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, and / or products derived from it, and / or where the promoter can provide expression of a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, in the body. Preferably, the nucleotide sequence is included in the genome of the body.

Термин "трансгенный организм" не подразумевает природного нуклеотида, кодирующего последовательности в их природном окружении, когда они находятся под контролем их природного промотора, который также находится в природном окружении.The term "transgenic organism" does not mean a natural nucleotide encoding sequences in their natural environment when they are under the control of their natural promoter, which is also in the natural environment.

Таким образом, трансгенный организм по настоящему изобретению включает в себя организм, содержащий любую из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, конструкции, как определено здесь, векторы, как определено здесь, плазмиды, как определено здесь, клетки, как определено здесь, или их продукты или их сочетания. Например, трансгенный организм также может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, под контролем гетерологичного промотора.Thus, the transgenic organism of the present invention includes an organism containing any of the nucleotide sequences encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, constructs, as defined here, vectors, as defined here, plasmids, as defined here, cells, as defined here, or their products or combinations thereof. For example, a transgenic organism may also contain a nucleotide sequence encoding a polypeptide with specific properties, as defined here, under the control of a heterologous promoter.

ТРАНСФОРМАЦИЯ ХОЗЯЙСКИХ КЛЕТОК/ОРГАНИЗМАTRANSFORMATION OF ECONOMIC CELLS / ORGANISM

Как указано ранее, организм-хозяин может представлять собой прокариотический или эукариотический организм. Примеры подходящих прокариотических хозяев включают в себя E. coli и Bacillus subtilis.As indicated previously, the host organism may be a prokaryotic or eukaryotic organism. Examples of suitable prokaryotic hosts include E. coli and Bacillus subtilis .

Руководства о трансформации прокариотических хозяев хорошо документированы в данной области, например, см. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Если используют прокариотического хозяина, тогда нуклеотидную последовательность перед трансформацией может быть необходимо подходящим образом модифицировать, например, посредством удаления интронов.Guidance on transformation of prokaryotic hosts is well documented in the art, for example, see Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). If a prokaryotic host is used, then the nucleotide sequence before transformation may need to be suitably modified, for example, by removing introns.

В другом варианте осуществления трансгенный организм может представлять собой дрожжи.In another embodiment, the transgenic organism may be a yeast.

Клетки нитчатых грибов можно трансформировать с применением различных известных в данной области способов, таких как способ, включающий в себя формирование протопластов и трансформацию протопластов с последующей регенерации клеточной стенки известным образом. В EP0 238 023 в качестве микроорганизма-хозяина описано применение Aspergillus.Filamentous fungal cells can be transformed using various methods known in the art, such as a method including protoplast formation and protoplast transformation followed by regeneration of the cell wall in a known manner. EP0,238,023 describes the use of Aspergillus as a host microorganism.

Другой организм-хозяин может представлять собой растение. Обзор общих способов, применяемых для трансформации растений, можно найти в статьях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27). Дополнительные способы трансформации растений можно найти в EP-A-0449375.Another host organism may be a plant. An overview of common methods used to transform plants can be found in Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27) . Additional plant transformation methods can be found in EP-A-0449375.

Общие руководства о трансформации грибов, дрожжей и растений представлены в следующих ниже разделах.General guidelines for the transformation of fungi, yeast, and plants are presented in the following sections.

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ БАКТЕРИИTRANSFORMED BACTERIA

Организм-хозяин может представлять собой бактерию, такую как Streptomyces, Bacillus subtilis или E. coli. Пригодные способы гетерологической экспрессии в E. coli описаны в WO04/064537. Пригодные способы гетерологической экспрессии в Bacillus описаны в WO02/214490. Примеры пригодных бактериальных организмов-хозяев представляют собой грамположительные виды бактерий, такие как Bacillaceae, включающие в себя Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium и Bacillus thuringiensis, виды Streptomyces, такие как Streptomyces murinus, бактериальные виды, образующие молочную кислоту, включающие в себя виды Lactococcus, такие как Lactococcus lactis, виды Lactobacillus, включающие в себя Lactobacillus reuteri, виды Leuconostoc, виды Pediococcus и виды Streptococcus. Альтернативно в качестве организма-хозяина можно выбрать штаммы грамотрицательных видов бактерий, принадлежащих к Enterobacteriaceae, включающие в себя E. coli, или к Pseudomonadaceae.The host organism may be a bacterium, such as Streptomyces , Bacillus subtilis or E. coli . Suitable heterologous expression methods in E. coli are described in WO04 / 064537. Suitable heterologous expression methods in Bacillus are described in WO02 / 214490. Examples of suitable bacterial host organisms are gram positive bacterial species such as Bacillaceae, including Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium and Bacillus thuringiensis , Streptomyces species such as Streptomyces murinus , lactic acid bacterial species comprising Lactococcus species such as Lactococcus lactis , Lactobacillus species including Lactobacillus reuteri , Leuconostoc species, Pediococcus species and Streptococcus species. Alternatively, strains of gram-negative bacterial species belonging to Enterobacteriaceae , including E. coli , or Pseudomonadaceae can be selected as the host organism.

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ ГРИБЫTRANSFORMED MUSHROOMS

Организм-хозяин может представлять собой гриб, такой как нитчатый гриб. Примеры таких пригодных хозяев включают в себя любого представителя, принадлежащего родам Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma и т.п.The host organism may be a fungus, such as a filamentous fungus. Examples of such suitable hosts include any member of the Thermomyces , Acremonium , Aspergillus , Penicillium , Mucor , Neurospora , Trichoderma, and the like genera.

Руководства по трансформации нитчатых грибов рассмотрены в US-A-5741665, который указывает, что стандартные способы трансформации нитчатых грибов и культивирования грибов хорошо известны в данной области. Обширный обзор способов в отношении N. crassa находятся, например, у Davis и de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.Guides for transforming filamentous fungi are discussed in US-A-5741665, which indicates that standard methods for transforming filamentous fungi and cultivating fungi are well known in the art. An extensive review of the methods for N. crassa is, for example, in Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

Дополнительные руководства по трансформации нитчатых грибов рассмотрены в US-A-5674707. В одном из аспектов организм-хозяин может быть из рода Aspergillus, такой как Aspergillus niger.Additional guidance on the transformation of filamentous fungi is discussed in US-A-5674707. In one aspect, the host organism may be from the genus Aspergillus , such as Aspergillus niger .

Трансгенный Aspergillus по настоящему изобретению также можно получать, например, по указаниям Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S. D., Kinghorn J. R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666).The transgenic Aspergillus of the present invention can also be obtained, for example, according to the directions of Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli SD, Kinghorn JR (Editors) Aspergillus : 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666).

Экспрессия генов в нитчатых грибах рассмотрена у Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20 (5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4): 273-306.Gene expression in filamentous fungi is examined by Punt et al . (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20 (5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4): 273-306.

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ ДРОЖЖИTRANSFORMED YEAST

Обзор принципов гетерологической экспрессии генов в дрожжах предоставлен, например, в Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, и Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8 (5):554-60.A review of the principles of heterologous gene expression in yeast is provided, for example, in Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54, and Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8 (5): 554-60.

В данном отношении в качестве средства для гетерологической генной экспрессии можно применять дрожжи, такие как виды Saccharomyces cerevisi или Pichia pastoris (см. FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66).In this regard, yeast such as Saccharomyces cerevisi or Pichia pastoris species can be used as a means for heterologous gene expression (see FEMS Microbiol Rev (2000 24 (1): 45-66).

Обзор принципов гетерологической экспрессии генов в Saccharomyces cerevisiae и секреции продуктов генов предоставлен в E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose и J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.).A review of the principles of heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae and the secretion of gene products is provided in E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.).

Для трансформации дрожжей разработано несколько протоколов трансформации. Например, трансгенные Saccharomyces по настоящему изобретению можно получить по указаниям Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104) и Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).For transformation of yeast, several transformation protocols have been developed. For example, the transgenic Saccharomyces of the present invention can be obtained as directed by Hinnen et al ., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, JD (1978, Nature, London, 275, 104) and Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Трансформированные дрожжевые клетки можно отобрать с применением различных селективных маркеров, таких как ауксотрофные маркеры, маркеры доминантной устойчивости к антибиотикам.Transformed yeast cells can be selected using various selective markers, such as auxotrophic markers, markers of dominant antibiotic resistance.

Подходящий дрожжевой организм-хозяин можно выбрать из биологически релевантных видов дрожжей, в качестве неограничивающих примеров, таких как виды дрожжей, выбранных из видов Pichia, видов Hansenula, Kluyveromyces, видов Yarrowinia, видов Saccharomyces, включающих в себя S. cerevisiae или, видов Schizosaccharomyce, включающих в себя Schizosaccharomyce pombe.A suitable yeast host can be selected from biologically relevant yeast species, as non-limiting examples, such as yeast species selected from Pichia spp. , Hansenula spp. , Kluyveromyces spp. , Yarrowinia spp. , Saccharomyces spp . Including S. cerevisiae spp . Or Schizosaccharomyce spp . including Schizosaccharomyce pombe .

В качестве организма-хозяина можно применять штамм вида метилотрофных дрожжей Pichia pastoris.A strain of the methylotrophic yeast Pichia pastoris can be used as the host organism.

В одном из вариантов осуществления организм-хозяин может представлять собой виды Hansenula, такие как H. polymorphа (как описано в WO01/39544).In one embodiment, the host organism may be Hansenula species such as H. polymorph (as described in WO01 / 39544).

ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ РАСТЕНИЯ/КЛЕТКИ РАСТЕНИЙTRANSFORMED PLANTS / PLANT CELLS

Организм-хозяин, пригодный для настоящего изобретения, может представлять собой растение. Обзор общих способов можно найти в статьях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27), или в WO01/16308. Например, трансгенное растение может продуцировать повышенные уровни сложных эфиров фитостеринов и сложных эфиров фитостанолов.A host organism suitable for the present invention may be a plant. An overview of general methods can be found in Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27), or in WO01 / 16308 . For example, a transgenic plant can produce elevated levels of phytosterol esters and phytostanol esters.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенного растения с повышенными уровнями сложных эфиров фитостеринов и сложных эфиров фитостанолов, включающему в себя стадии трансформации растительной клетки липидацилтрансферазой, как определено здесь (в частности экспрессирующим вектором или конструкцией, включающих в себя липидацилтрансферазу, как определено здесь), и выращивания растения из трансформированной растительной клетки.Thus, the present invention also relates to a method for producing a transgenic plant with elevated levels of phytosterol esters and phytostanol esters, comprising the steps of transforming a plant cell with a lipid acyltransferase as defined herein (in particular, an expression vector or construct including a lipid acyltransferase as defined here), and growing a plant from a transformed plant cell.

СЕКРЕЦИЯSECRETION

Часто желательно, чтобы полипептид из экспрессирующего хозяина секретировался в культуральную среду, откуда фермент можно легче восстанавливать. По настоящему изобретению в зависимости от желательного экспрессирующего хозяина можно выбрать секреторную лидерную последовательность. Также в контексте настоящего изобретения можно применять гибридные сигнальные последовательности.It is often desirable that the polypeptide from the expression host is secreted into the culture medium, from where the enzyme can be more easily restored. According to the present invention, depending on the desired expression host, a secretory leader sequence can be selected. Hybrid signal sequences may also be used in the context of the present invention.

Обычные примеры гетерологических секреторных лидерных последовательностей представляют собой последовательности гена амилоглюкозиды (AG) грибов (glaA - версии и из 18, и из 24 аминокислот, например, из Aspergillus), гена a-фактора (дрожжи например, Saccharomyces, Kluyveromyces и Hansenula) или гена α-амилазы (Bacillus).Common examples of heterologous secretory leader sequences are fungal amyloglucoside (AG) gene sequences ( gl aA versions of both 18 and 24 amino acids, for example, Aspergillus), a-factor gene (yeast, for example, Saccharomyces , Kluyveromyces and Hansenula ) or α-amylase gene ( Bacillus ).

ДЕТЕКЦИЯDETECTION

В данной области известно множество протоколов для детекции и измерения экспрессии аминокислотной последовательности. Примеры включают в себя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA) и активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS).Many protocols are known in the art for detecting and measuring the expression of an amino acid sequence. Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) and fluorescence activated cell sorting (FACS).

Специалистам в данной области известно большое множество меток и способов конъюгации, и их можно применять во множестве анализов нуклеиновых кислот и аминокислот.Specialists in this field know a large number of labels and methods of conjugation, and they can be used in a variety of analyzes of nucleic acids and amino acids.

Ряд компаний, таких как Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), и US Biochemical Corp (Cleveland, OH) поставляют коммерческие наборы и протоколы для этих процедур.A number of companies, such as Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), and US Biochemical Corp (Cleveland, OH) supply commercial kits and protocols for these procedures.

Подходящие репортерные молекулы или метки, включают в себя радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные средства, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Патенты, в которых предоставлены руководства по применению таких меток, включают в себя US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 и US-A-4366241.Suitable reporter molecules or labels include radionuclides, enzymes, fluorescent, chemiluminescent, or chromogenic agents, as well as substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and the like. Patents that provide guidance on the use of such labels include US-A-3817837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3996345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 and US-A-4,366,241.

Также можно получать рекомбинантные иммуноглобулины, как указано в US-A-4816567.Recombinant immunoglobulins can also be prepared as described in US-A-4816567.

ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИHYBRID PROTEINS

Полипептид с конкретными свойствами, как определено здесь, можно получать в качестве гибридного белка, например, для облегчения его выделения и очистки. Примеры партнеров для гибридного белка включают в себя глутатион-S-трансферазу (GST), 6×His, GAL4 (связывающие ДНК и/или активирующие транскрипцию домены) и β-галактозидазу. Также может быть удобно вставлять между партнером по гибридному белку и представляющей интерес белковой последовательностью участок протеолитического расщепления для обеспечения удаления гибридной белковой последовательности. Предпочтительно гибридный белок не препятствует активности белковой последовательности.A polypeptide with specific properties, as defined here, can be obtained as a hybrid protein, for example, to facilitate its isolation and purification. Examples of fusion protein partners include glutathione S-transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA binding and / or transcription activating domains) and β-galactosidase. It may also be convenient to insert a proteolytic cleavage site between the fusion protein partner and the protein sequence of interest to ensure removal of the fusion protein sequence. Preferably, the fusion protein does not interfere with the activity of the protein sequence.

Экспрессирующие системы слитых генов у E. coli рассмотрены в Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6 (5):501-6.Expression systems of fusion genes in E. coli are reviewed in Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6 (5): 501-6.

В другом варианте осуществления изобретения аминокислотную последовательность полипептида с конкретными свойствами, как определено здесь, можно лигировать с гетерологичной последовательностью для кодирования гибридного белка. Например, для скрининга пептидных библиотек на средства, способные воздействовать на активность вещества, может быть пригодным кодировать химерные вещества, экспрессирующие гетерологичный эпитоп, узнающийся коммерчески доступным антителом.In another embodiment, the amino acid sequence of a polypeptide with specific properties, as defined herein, can be ligated with a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen peptide libraries for agents that can affect the activity of a substance, it may be useful to encode chimeric substances expressing a heterologous epitope recognized by a commercially available antibody.

В настоящий момент изобретение будет описано посредством неограничивающих примеров со ссылкой к следующим ниже фигурам и примерам.The invention will now be described by way of non-limiting examples with reference to the following figures and examples.

На фиг.1 показана консенсусная последовательность рfam00657 из базы данных версии 6 (SEQ ID NO:1);Figure 1 shows the consensus sequence pfam00657 from the database version 6 (SEQ ID NO: 1);

На фиг.2 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), полученная из организма Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051). Данная аминокислотная последовательность представляет собой эталонный фермент, который может быть исходным ферментом по настоящему изобретению;Figure 2 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) obtained from the body of Aeromonas hydrophila (P10480; GI: 121051). This amino acid sequence is a reference enzyme, which may be the parent enzyme of the present invention;

На фиг.3 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3), полученная из организма Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017);Figure 3 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) obtained from the body of Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI: 9964017);

На фиг.4 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4), полученная из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (инвентарный номер Genbank NP_631558);Figure 4 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) obtained from the organism Streptomyces coelicolor A3 (2) (accession number Genbank NP_631558);

На фиг.5 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5), полученная из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (инвентарный номер Genbank: CAC42140);Figure 5 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) obtained from the organism Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number: CAC42140);

На фиг.6 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6), полученная из организма Saccharomyces cerevisiae (инвентарный номер Genbank P41734);Figure 6 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) obtained from the body of Saccharomyces cerevisiae (Genbank accession number P41734);

На фиг.7 показано сравнение выбранных последовательностей с консенсусной последовательностью рfam00657;7 shows a comparison of selected sequences with the consensus sequence pfam00657;

На фиг.8 показано парное сравнение SEQ ID NO:3 с SEQ ID NO:2, демонстрирующее 93% идентичности аминокислотной последовательности. Сигнальная последовательность подчеркнута. + отмеченные различия. Мотив GDSX, содержащий серин 16 активного центра, и аспарагиновая кислота 116 и гистидин 291 активных центров выделены (см. затененные области). Номера после аминокислот представлены за минусом сигнальной последовательности;On Fig shows a pairwise comparison of SEQ ID NO: 3 with SEQ ID NO: 2, showing 93% amino acid sequence identity. The signal sequence is underlined. + marked differences. The GDSX motif containing the serine 16 of the active center, and aspartic acid 116 and histidine of 291 active centers are highlighted (see shaded areas). Numbers after amino acids are presented minus the signal sequence;

На фиг.9 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Aeromonas hydrophila;Figure 9 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from Aeromonas hydrophila ;

На фиг.10 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:8), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Aeromonas salmonicida;Figure 10 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from the organism Aeromonas salmonicida ;

На фиг.11 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (инвентарный номер Genbank NC_003888.1:8327480..8328367);11 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number NC_003888.1: 8327480..8328367);

На фиг.12 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:10), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (инвентарный номер Genbank AL939131.1:265480..266367);12 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 10) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number AL939131.1: 265480..266367);

На фиг.13 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Saccharomyces cerevisiae (инвентарный номер Genbank Z75034);13 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) encoding a lipid acyltransferase of the present invention obtained from Saccharomyces cerevisiae (Genbank accession number Z75034);

На фиг.14 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12), полученная из организма Ralstonia (инвентарный номер Genbank: AL646052);On Fig shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) obtained from the body of Ralstonia (Genbank accession number: AL646052);

На фиг.15 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Ralstonia;On Fig shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from the organism of Ralstonia ;

На фиг.16 показана SEQ ID NO:14. Консервативный гипотетический белок с кодом доступа NCBI белка Scoe1 CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];On Fig shows SEQ ID NO: 14. Conservative hypothetical protein with access code NCBI protein Scoe1 CAB39707.1 GI: 4539178 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.17 показана нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO:15, кодирующая консервативный гипотетический белок с кодом доступа NCBI белка CAB39707.1 GI:4539178 [Streptomyces coelicolor A3(2)];On Fig shows the nucleotide sequence represented as SEQ ID NO: 15, encoding a conservative hypothetical protein with access code NCBI protein CAB39707.1 GI: 4539178 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.18 показана аминокислотная последовательность, представленная как SEQ ID NO:16. Консервативный гипотетический белок с кодом доступа NCBI белка Scoe2 CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];On Fig shows the amino acid sequence represented as SEQ ID NO: 16. Conservative hypothetical protein with NCBI access code for Scoe2 protein CAC01477.1 GI: 9716139 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.19 показана нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO:17, кодирующая консервативный гипотетический белок с кодом доступа NCBI белка Scoe2 CAC01477.1 GI:9716139 [Streptomyces coelicolor A3(2)];FIG. 19 shows a nucleotide sequence represented as SEQ ID NO: 17 encoding a conserved hypothetical protein with the NCBI access code of Scoe2 protein CAC01477.1 GI: 9716139 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.20 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:18) предполагаемого секретируемого белка с кодом доступа NCBI белка Scoe3 CAB88833.1 GI:7635996 [Streptomyces coelicolor A3(2)];FIG. 20 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) of the putative secreted protein with the NCBI access code of Scoe3 protein CAB88833.1 GI: 7635996 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.21 показана нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO:19, кодирующая предполагаемый секретируемый белок с кодом доступа NCBI белка Scoe3 CAB88833.1 GI:7635996 [Streptomyces coelicolor A3(2)];FIG. 21 shows a nucleotide sequence represented as SEQ ID NO: 19 encoding a putative secreted protein with the NCBI accession code of Scoe3 protein CAB88833.1 GI: 7635996 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.22 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:20) предполагаемого секретируемого белка с кодом доступа NCBI белка Scoe4 CAB89450.1 GI:7672261 [Streptomyces coelicolor A3(2)];FIG. 22 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) of the putative secreted protein with the NCBI access code of Scoe4 protein CAB89450.1 GI: 7672261 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.23 показана нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO:21, кодирующая предполагаемый секретируемый белок с кодом доступа NCBI белка Scoe4 CAB89450.1 GI:7672261. [Streptomyces coelicolor A3(2)];FIG. 23 shows a nucleotide sequence represented as SEQ ID NO: 21 encoding a putative secreted protein with the NCBI access code of Scoe4 protein CAB89450.1 GI: 7672261. [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.24 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:22) предполагаемого липобелка с кодом доступа NCBI белка Scoe5 CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];On Fig shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 22) of the proposed lipoprotein with access code NCBI protein Scoe5 CAB62724.1 GI: 6562793 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.25 показана нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO:23, кодирующая предполагаемый липобелок с кодом доступа NCBI белка Scoe5 CAB62724.1 GI:6562793 [Streptomyces coelicolor A3(2)];On Fig shows the nucleotide sequence, presented as SEQ ID NO: 23, encoding the alleged lipoprotein with access code NCBI protein Scoe5 CAB62724.1 GI: 6562793 [ Streptomyces coelicolor A3 (2)];

На фиг.26 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:24) GDSL-липазы с кодом доступа NCBI белка Srim1 AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];On Fig shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) GDSL lipase with access code NCBI protein Srim1 AAK84028.1 GI: 15082088 [ Streptomyces rimosus ];

На фиг.27 показана нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO:25, кодирующая GDSL-липазу с кодом доступа NCBI белка Srim1 AAK84028.1 GI:15082088 [Streptomyces rimosus];On Fig shows the nucleotide sequence represented as SEQ ID NO: 25 encoding a GDSL lipase with access code NCBI protein Srim1 AAK84028.1 GI: 15082088 [ Streptomyces rimosus ];

На фиг.28 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:26), представляющая собой липидацилтрансферазу из Aeromonas hydrophila (ATCC № 7965);On Fig shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 26), which is a lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (ATCC No. 7965);

На фиг.29 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:27), кодирующая липидацилтрансферазу из Aeromonas hydrophila (ATCC № 7965);On Fig shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 27) encoding a lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (ATCC No. 7965);

На фиг.30 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:28) липидацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida подвида Salmonicida (ATCC № 14174);On Fig shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) of lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida subspecies Salmonicida (ATCC No. 14174);

На фиг.31 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:29), кодирующая липидацилтрансферазу из Aeromonas salmonicida подвида Salmonicida (ATCC № 14174);On Fig shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 29) encoding a lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida subspecies Salmonicida (ATCC No. 14174);

На фиг.32 показано, что гомологи генов Aeromonas можно идентифицировать с применением основного средства поиска локального сравнение сервиса в National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, USA и полных базах данных генома. При поиске в базе данных применяли мотив GDSX и идентифицировали ряд последовательностей/генов, потенциально кодирующих ферменты с липолитической активностью. Гены идентифицированы в родах Streptomyces, Xanthomonas и Ralstonia. В качестве примера ниже Ralstonia solanacearum сравнивали по гену Aeromonas salmonicida (satA). Парное сравнение показало 23% идентичности. Серин активного центра находится на аминоконце, и можно идентифицировать входящие в состав каталитического центра остатки гистидина и аспарагиновой кислоты;On Fig shows that the homologues of the Aeromonas genes can be identified using the main means of searching for local service comparison in the National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, USA and the complete genome databases. When searching the database, the GDSX motif was used and a number of sequences / genes potentially encoding enzymes with lipolytic activity were identified. Genes are identified in the genera Streptomyces , Xanthomonas and Ralstonia . As an example below, Ralstonia solanacearum was compared by the Aeromonas salmonicida (satA) gene. The pairwise comparison showed 23% identity. The serine of the active center is at the amino terminus, and the residues of histidine and aspartic acid that are part of the catalytic center can be identified;

На фиг.33 показаны консенсусная последовательность рfam00657.11 [семейство 00657, база данных версии 11] (ниже здесь обозначаемая как консенсус рfam) и сравнение различных последовательностей с консенсусной последовательностью рfam. Стрелки указывают остатки активного центра, подчеркнутые участки указывают три участка гомологии указанных у [Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Заглавные буквы в консенсусе pfam указывают консервативные у многих представителей семейства остатки. Символ - указывает положение, где по скрытой марковской модели консенсуса рfam ожидали найти остаток, но которого нет, так что вставляют пробел. Символ . указывает остаток без соответствующего остатка в консенсусе рfam. Последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, представленные на фиг.16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30.33 shows the consensus sequence pfam00657.11 [family 00657, database version 11] (hereinafter referred to as consensus pfam) and compares various sequences with the consensus sequence pfam. Arrows indicate the remains of the active center, underlined regions indicate three homology regions indicated by [Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Capital letters in the pfam consensus indicate conservative residues in many members of the family. Symbol - indicates the position where, according to the hidden Markov model of consensus, pfam was expected to find the remainder, but which is not there, so insert a space. Symbol. indicates the remainder without the corresponding remainder in the consensus pfam. The sequences are the amino acid sequences shown in FIGS. 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, and 30.

На фиг.34 показаны консенсусная последовательность рfam00657.11 [семейство 00657, база данных версии 11] (ниже здесь обозначаемая как консенсус pfam) и сравнение различных последовательностей с консенсусной последовательностью рfam. Стрелки указывают остатки активного центра, подчеркнутые участки указывают три участка гомологи указанных у [Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Заглавные буквы в консенсусе pfam указывают консервативные у многих представителей семейства остатки. Символ - указывает положение, где по скрытой марковской модели консенсуса рfam ожидали найти остаток, но которого нет, так что вставляют пробел. Символ . указывает остаток без соответствующего остатка в консенсусе рfam. Последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, представленные на фиг.2, 16, 18, 20, 26, 28 и 30. Выявлено, что все эти белки активны в отношении липидных субстратов.On Fig shows the consensus sequence pfam00657.11 [family 00657, database version 11] (hereinafter referred to as pfam consensus) and a comparison of different sequences with the pfam consensus sequence. The arrows indicate the remains of the active center, the underlined sections indicate the three sections of the homologues indicated by [Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Capital letters in the pfam consensus indicate conservative residues in many members of the family. Symbol - indicates the position where, according to the hidden Markov model of consensus, pfam was expected to find the remainder, but which is not there, so insert a space. Symbol. indicates the remainder without the corresponding remainder in the consensus pfam. The sequences are the amino acid sequences shown in FIGS. 2, 16, 18, 20, 26, 28, and 30. It has been found that all these proteins are active against lipid substrates.

На фиг.35 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:30) гибридной конструкции, применяемой для мутагенеза гена липидацилтрансферазы Aeromonas hydrophila в примере 7. Подчеркнутые аминокислоты представляют собой сигнальный пептид ксиланазы;FIG. 35 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 30) of the hybrid construct used for mutagenesis of the Aeromonas hydrophila lipid acyltransferase gene in Example 7. The underlined amino acids are xylanase signal peptide;

На фиг.36 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:31), кодирующая фермент липидацилтрансферазу Aeromonas hydrophila, включающий в себя сигнальный пептид ксиланазы;36 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 31) encoding an Aeromonas hydrophila lipid acyltransferase enzyme including a xylanase signal peptide;

На фиг.37 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из Streptomyces (SEQ ID NO:32);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from Streptomyces (SEQ ID NO: 32);

На фиг.38 показана полипептидная последовательность фермента липидацилтрансферазы из Streptomyces (SEQ ID NO:33);On Fig shows the polypeptide sequence of the enzyme lipid acyltransferase from Streptomyces (SEQ ID NO: 33);

На фиг.39 показана полипептидная последовательность фермента липидацилтрансферазы из Termobifida (SEQ ID NO:34);On Fig shows the polypeptide sequence of the enzyme lipid acyltransferase from Termobifida (SEQ ID NO: 34);

На фиг.40 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из Termobifida (SEQ ID NO:35);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from Termobifida (SEQ ID NO: 35);

На фиг.41 показана полипептидная последовательность фермента липидацилтрансферазы из Termobifida (SEQ ID NO:36);On Fig shows the polypeptide sequence of the enzyme lipid acyltransferase from Termobifida (SEQ ID NO: 36);

На фиг.42 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 300 а.к. Corynebacterium\effciens\GDSX (SEQ ID NO:37);On Fig shows a polypeptide of the enzyme lipid acyltransferase from 300 A.K. Corynebacterium \ effciens \ GDSX (SEQ ID NO: 37);

На фиг.43 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из 300 а.к. Corynebacterium\effciens\GDSX (SEQ ID NO:38);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from 300 A.K. Corynebacterium \ effciens \ GDSX (SEQ ID NO: 38);

На фиг.44 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 284 а.к. Novosphingobium\aromaticivorans\GDSX (SEQ ID NO:39);On Fig shows the polypeptide of the enzyme lipid acyltransferase from 284 a.k. Novosphingobium \ aromaticivorans \ GDSX (SEQ ID NO: 39);

На фиг.45 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из 284 а.к. Novosphingobium\aromaticivorans\GDSX (SEQ ID NO:40);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from 284 A.K. Novosphingobium \ aromaticivorans \ GDSX (SEQ ID NO: 40);

На фиг.46 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 268 а.к. Streptomyces coelicolor\GDSX (SEQ ID NO:41);On Fig shows a polypeptide of the enzyme lipid acyltransferase from 268 a.k. Streptomyces coelicolor \ GDSX (SEQ ID NO: 41);

На фиг.47 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из 268 а.к. Streptomyces coelicolor\GDSX (SEQ ID NO:42);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from 268 A.K. Streptomyces coelicolor \ GDSX (SEQ ID NO: 42);

На фиг.48 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из 269 а.к. Streptomyces avermitilis\GDSX (SEQ ID NO:43);On Fig shows the polypeptide of the enzyme lipid acyltransferase from 269 a.k. Streptomyces avermitilis \ GDSX (SEQ ID NO: 43);

На фиг.49 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из 269 а.к. Streptomyces avermitilis\GDSX (SEQ ID NO:44);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from 269 A.K. Streptomyces avermitilis \ GDSX (SEQ ID NO: 44);

На фиг.50 показан полипептид фермента липидацилтрансферазы из Streptomyces (SEQ ID NO:45);On Fig shows a polypeptide of the enzyme lipid acyltransferase from Streptomyces (SEQ ID NO: 45);

На фиг.51 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент липидацилтрансферазу из Streptomyces (SEQ ID NO:46);On Fig shows the nucleotide sequence encoding the enzyme lipid acyltransferase from Streptomyces (SEQ ID NO: 46);

На фиг.52 показано ленточное представление кристаллической структуры 1IVN.PDB, обладающей глицерином в активном центре. Фигура сделана с применением программы просмотра Deep View Swiss-PDB;On Fig shows a tape representation of the crystal structure 1IVN.PDB having glycerin in the active center. The figure was made using the Deep View Swiss-PDB viewer;

На фиг.53 показана кристаллическая структура 1IVN.PDB - горизонтальная проекция с применением программы просмотра Deep View Swiss-PDB, с глицерином в активном центре - остатки в пределах 10 Å от глицерина активного центра закрашены черным;On Fig shows the crystal structure 1IVN.PDB - horizontal projection using the viewing program Deep View Swiss-PDB, with glycerin in the active center - residues within 10 Å from the glycerol of the active center are painted black;

На фиг.54 показана кристаллическая структура 1IVN.PDB - вид сверху с применением программы просмотра Deep View Swiss-PDB, с глицерином в активном центре - остатки в пределах 10 Å от глицерина активного центра закрашены черным;On Fig shows the crystal structure 1IVN.PDB - top view using the program viewer Deep View Swiss-PDB, with glycerin in the active center - residues within 10 Å from the glycerol of the active center are painted black;

На фиг.55 показано сравнение 1;On Fig shows a comparison of 1;

На фиг.56 показано сравнение 2;On Fig shows a comparison of 2;

На фиг.57 и 58 показано сравнение 1IVN по P10480 (P10480 представляет собой последовательность базы данных для фермента A. hydrophila), данное сравнение получено из базы данных PFAM и его применяют для процесса построения модели;On Fig and 58 shows a comparison of 1IVN according to P10480 (P10480 is the database sequence for the A. hydrophila enzyme), this comparison is obtained from the PFAM database and is used for the model building process;

На фиг.59 показано сравнение, где P10480 представляет собой последовательность базы данных для Aeromonas hydrophila. Данную последовательность применяют для конструирования модели и выбора участка. Необходимо отметить, что изображен полноразмерный белок, зрелый белок (эквивалентный SEQ ID NO:2) начинается с остатка 19. A. sal представляет собой GDSX-липазу Aeromonas salmonicida (SEQ ID NO:28), A. hyd представляет собой GDSX-липазу Aeromonas hydrophila (SEQ ID NO:26). Консенсусная последовательность содержит * в положении различий между перечисленными последовательностями;On Fig shows a comparison, where P10480 is a database sequence for Aeromonas hydrophila . This sequence is used to construct the model and select the site. It should be noted that depicts the full length protein, mature protein (equivalent to SEQ ID NO: 2) starts at residue 19. A. sal is GDSX-lipase Aeromonas salmonicida (SEQ ID NO: 28), A. hyd is Aeromonas GDSX-lipase hydrophila (SEQ ID NO: 26). The consensus sequence contains * in the position of differences between the listed sequences;

На фиг.60 показан типичный набор из 384 клонов, контроль дикого типа лежит на пересечении 0.9PC, 0.8DGDG; иOn Fig shows a typical set of 384 clones, wild-type control lies at the intersection of 0.9PC, 0.8DGDG; and

На фиг.61 показаны три представляющих интерес области. Область 1 содержит мутантов с повышенным отношением R, но с пониженной активностью в отношении DGDG. Область 2 содержит мутантов с повышенным отношением R и повышенной активностью в отношении DGDG. Область 3 содержит клоны с повышенной активностью в отношении PC или DGDG, но с повышенным отношением R.On Fig shows three areas of interest. Region 1 contains mutants with an increased R ratio, but with reduced activity against DGDG. Region 2 contains mutants with an increased R ratio and increased DGDG activity. Region 3 contains clones with increased activity against PC or DGDG, but with an increased ratio of R.

ПРИМЕР 1EXAMPLE 1

Моделирование GDSX-липазы Aeromonas hydrophila 1IVNSimulation of GDSX lipase Aeromonas hydrophila 1IVN

Сравнение аминокислотной последовательности GDSX-липазы Aeromonas hydrophila (P10480) c аминокислотной последовательностью тиоэстеразы Escherichia coli (1IVN) и аминокислотной последовательностью рамногалактуронанацетилэстеразы Aspergillus aculeatus (1DEO) получали из базы данных PFAM в формате FASTA. Сравнение P10480 и 1IVN вводили в автоматическое средство моделирования 3D-структур (сервер SWISS-MODELLER на www.expasy.org) вместе с файлом координат кристаллической структуры 1IVN.PDB фиг.52). Полученную модель для P10480 структурно сравнивали по координатам кристаллических структур 1IVN.PDB и 1DEO.PDB с применением "программы просмотра Deep View Swiss-PDB" (полученной с www.expasy.org/spdbv/) (фиг.53). Сравнение аминокислоты, полученной из базы данных PFAM (сравнение 1 - (фиг.55)), модифицировали на основе структурного сравнения 1DEO.PDB и 1IVN.PDB. Данное альтернативное сравнение аминокислот называют сравнение 2 (фиг.56).A comparison of the amino acid sequence of the GDSX lipase Aeromonas hydrophila (P10480) with the amino acid sequence of Escherichia coli thioesterase (1IVN) and the amino acid sequence of Aspergillus aculeatus rhamnoglacturonan acetyl esterase (1DEO) was obtained from the PFAM database in FASTA format. Comparison of P10480 and 1IVN was introduced into an automatic tool for modeling 3D structures (SWISS-MODELLER server at www.expasy.org) together with the coordinate structure file of the crystal structure 1IVN.PDB of Fig. 52). The resulting model for P10480 was structurally compared by the coordinates of the crystal structures 1IVN.PDB and 1DEO.PDB using the "Deep View Swiss-PDB viewer" (obtained from www.expasy.org/spdbv/) (Fig. 53). A comparison of the amino acid obtained from the PFAM database (comparison 1 - (FIG. 55)) was modified based on the structural comparison of 1DEO.PDB and 1IVN.PDB. This alternative amino acid comparison is called comparison 2 (FIG. 56).

Структура 1IVN.PDB содержит молекулу глицерина. Полагают, что эта молекула находится в активном центре, так как она находится вблизи входящих в состав каталитического центра остатков. Таким образом, можно провести выбор остатков, находящихся недалеко от активного центра, которые вследствие их близости, вероятно, оказывают влияние на связывание субстрата, высвобождение продукта и/или катализ. В структуре 1IVN.PDB, выбирали все аминокислоты в пределах сферы размером 10 Å, с центром в центральном углеродном атоме молекулы глицерина в активном центре (набор аминокислот 1) (см. фиг.53 и фиг.54).Structure 1IVN.PDB contains a glycerol molecule. It is believed that this molecule is in the active center, since it is close to the residues that make up the catalytic center. Thus, it is possible to select residues close to the active site that, due to their proximity, are likely to affect substrate binding, product release and / or catalysis. In the structure of 1IVN.PDB, all amino acids were selected within a 10 Å sphere, centered on the central carbon atom of the glycerol molecule in the active center (amino acid set 1) (see FIG. 53 and FIG. 54).

Из последовательности P10480 выбирали следующие ниже аминокислоты: (1) все аминокислоты в P10480, соответствующие набору аминокислот 1 в сравнении 1; (2) все аминокислоты в P10480, соответствующие набору аминокислот 1 в сравнении 2; (3) из перекрывания модели P10480 и 1IVN все аминокислоты в модели P10480 в пределахThe following amino acids were selected from the P10480 sequence: (1) all amino acids in P10480 corresponding to the set of amino acids 1 in comparison 1; (2) all amino acids in P10480 corresponding to the set of amino acids 1 in comparison 2; (3) from the overlap of model P10480 and 1IVN, all amino acids in model P10480 are within

12 Å от молекулы глицерина в 1IVN. Все три группы совместно составляют набор аминокислот 2.12 Å from the glycerol molecule in 1IVN. All three groups together form a set of amino acids 2 .

Последовательность P10480 сравнивали по "глицерофосфолипидхолестеринацилтрансферазе AAG09804.1 GI:9964017 [Aeromonas salmonicida]", а остатки в AAG09804, соответствующие набору аминокислот 2 выбирали с получением набора аминокислот 3.The sequence P10480 was compared by “glycerophospholipid cholesterol acyltransferase AAG09804.1 GI: 9964017 [ Aeromonas salmonicida ]”, and the residues in AAG09804 corresponding to amino acid set 2 were selected to obtain amino acid set 3.

Наборы 1, 2, и 3Sets 1, 2, and 3

Набор аминокислот 1:Amino Acid Set 1:

Набор аминокислот 1 (необходимо отметить, что они представляют собой аминокислоты в 1IVN - фиг.57 и фиг.58.)Set of amino acids 1 (it should be noted that they are amino acids in 1IVN - Fig. 57 and Fig. 58.)

Gly8, Asp9, Leu11, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe139, Phe140, Met141, Tyr145, Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158. Gly8, Asp9, Leu11, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72 , Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe13, Met141, Tyr145, Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158.

Высококонсервативные мотивы, такие как GDSX и входящие в состав каталитического центра остатки, исключены из набора 1 (подчеркнутые остатки). Во избежание неопределенности набор 1 определяет аминокислотные остатки в пределах 10 Å от центрального углеродного атома глицерина в активном центре модели 1IVN.Highly conserved motifs such as GDSX and the residues that make up the catalytic center are excluded from set 1 (underlined residues). To avoid ambiguity, set 1 determines amino acid residues within 10 Å of the central carbon atom of glycerol in the active center of model 1IVN.

Набор аминокислот 2:Amino Acid Set 2:

Набор аминокислот 3:Amino Acid Set 3:

Набор аминокислот 3 идентичен набору 2, но относится к кодирующей последовательности Aeromonas salmonicida (SEQ ID NO:28), т.е. номера аминокислотных остатков в наборе 3 на 18 больше, так как это отражает разницу между нумерацией аминокислот в зрелом белке (SEQ ID NO:2) по сравнению с белком, включающим в себя сигнальную последовательность (SEQ ID NO:28).The set of amino acids 3 is identical to set 2, but refers to the coding sequence of Aeromonas salmonicida (SEQ ID NO: 28), i.e. the number of amino acid residues in set 3 is 18 higher, since this reflects the difference between the numbering of amino acids in a mature protein (SEQ ID NO: 2) compared to a protein that includes a signal sequence (SEQ ID NO: 28).

Зрелые белки Aeromonas salmonicida GDSX (SEQ ID NO:28) и Aeromonas hydrophila GDSX (SEQ ID NO:26) отличаются по пяти аминокислотам. Они представляют собой Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-, где остаток salmonicida представлен первым, а остаток hydrophila представлен последним (фиг.59). Белок hydrophila состоит в длину только из 317 аминокислот, и у него остаток в положении 318 отсутствует. Aeromonas salmonicidae GDSX обладает значительно более высокой активностью в отношении полярных липидов, таких как галактолипидные субстраты, чем белок Aeromonas hydrophila. Сканирование участков проводили для всех пяти положений аминокислот.The mature proteins Aeromonas salmonicida GDSX (SEQ ID NO: 28) and Aeromonas hydrophila GDSX (SEQ ID NO: 26) differ in five amino acids. They are Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-, where the salmonicida residue is represented first and the hydrophila residue is the last (Fig. 59). The hydrophila protein consists of only 317 amino acids in length, and it has no residue at position 318. Aeromonas salmonicida e GDSX has significantly higher activity against polar lipids, such as galactolipid substrates, than the Aeromonas hydrophila protein. Scanning sites was performed for all five positions of amino acids.

Набор аминокислот 4:Amino Acid Set 4:

Набор аминокислот 5:Amino Acids Set 5:

Набор аминокислот 6:Amino Acid Set 6:

Нумерация аминокислот в наборе 6 относится к аминокислотным остаткам в P10480 (SEQ ID NO:2) - соответствующие аминокислоты в основных цепях других последовательностей можно определить посредством гомологичного сравнения и/или структурного сравнения с P10480 и/или 1IVN.The amino acid numbering in set 6 refers to the amino acid residues in P10480 (SEQ ID NO: 2) - the corresponding amino acids in the backbones of other sequences can be determined by homologous comparison and / or structural comparison with P10480 and / or 1IVN.

Набор аминокислот 7:Amino Acid Set 7:

Нумерация аминокислот в наборе 7 относится к аминокислотным остаткам в P10480 (SEQ ID NO:2) - соответствующие аминокислоты в основных цепях других последовательностей можно определить посредством гомологичного сравнения и/или структурного сравнения с P10480 и/или 1IVN.The amino acid numbering in set 7 refers to the amino acid residues in P10480 (SEQ ID NO: 2) - the corresponding amino acids in the backbones of other sequences can be determined by homologous comparison and / or structural comparison with P10480 and / or 1IVN.

Из кристаллической структуры можно получить классификацию вторичной структуры. Это означает, что можно классифицировать каждую аминокислоту как являющуюся частью альфа-спирали или бета-слоя. На фиг.57 показано сравнение PFAM 1DEO, 1IVN и P10480 (база данных Aeromonas hydrophila). Добавленная ниже каждая строка последовательности представляет собой структурную классификацию.From the crystal structure, a classification of the secondary structure can be obtained. This means that each amino acid can be classified as being part of an alpha helix or beta layer. On Fig shows a comparison of PFAM 1DEO, 1IVN and P10480 (database Aeromonas hydrophila ). Each line of the sequence added below represents a structural classification.

База данных PFAM содержит сравнения белков с низкой идентичностью последовательностей. Таким образом, эти сравнения не являются очень хорошими. Хотя алгоритмы сравнения (профили HAMMER) хорошо подходят для распознавания консервативных мотивов, алгоритм не очень хорош на подробном уровне. Таким образом, нахождение несоответствия между сравнением PFAM и структурным сравнением не является неожиданным. Как легко поймут специалисты, сравнение PFAM можно модифицировать на основе структурных данных. В смысле того, что можно сравнивать те структурные элементы, которые перекрываются.The PFAM database contains protein comparisons with low sequence identity. Therefore, these comparisons are not very good. Although comparison algorithms (HAMMER profiles) are well suited for recognizing conservative motives, the algorithm is not very good at a detailed level. Thus, finding a mismatch between the PFAM comparison and the structural comparison is not unexpected. As experts will easily understand, PFAM comparisons can be modified based on structural data. In the sense that it is possible to compare those structural elements that overlap.

На фиг.55 показано исходное сравнение PFAM 1DEO, 1IVN и P10480. К сравнению добавлена информация о вторичной структуре из кристаллических структур 1DEO и 1IVN. Сравнение 2 на фиг.56 демонстрирует модифицированное вручную сравнение, где увеличено совпадение между элементами вторичной структуры. На основе консервативных остатков у 1DEO и P10480 или у 1IVN и P10480 сравнение для P10480 также модифицировали. Для легкого различения участков последовательностей идентификаторы последовательностей в сравнении 2 имеют дополнительную m (1DEOm, 1IVNm, P10480m).On Fig shows the initial comparison of PFAM 1DEO, 1IVN and P10480. Information on the secondary structure of the crystal structures 1DEO and 1IVN is added to the comparison. Comparison 2 in FIG. 56 shows a manually modified comparison, where the match between the elements of the secondary structure is increased. Based on the conserved residues of 1DEO and P10480 or of 1IVN and P10480, the comparison for P10480 was also modified. To easily distinguish between sections of sequences, sequence identifiers in Comparison 2 have an additional m (1DEOm, 1IVNm, P10480m).

Сравнение 3 является смесью 1 и 2, оно дает сравнение по участкам.Comparison 3 is a mixture of 1 and 2, it gives a comparison of the plots.

ПРИМЕР 2: EXAMPLE 2: Конструирование библиотек сканирования участковDesigning Site Scan Libraries

Применяли набор Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit из Stratagene по инструкциям производителя. Для каждой библиотеки разрабатывали вырожденный праймер с одним кодоном NNK или NNS (нуклеотидные сокращения). Разработку праймеров проводили с применением средств, доступных на веб-сайте Stratagene. Контроль качества праймера дополнительно проводили с применением стандартных средств анализа, анализирующих праймер на способность к формированию шпилек или к формированию димеров праймеров.We used the Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene according to the manufacturer's instructions. For each library, a degenerate primer with one codon NNK or NNS (nucleotide abbreviations) was developed. The development of primers was carried out using tools available on the Stratagene website. The quality control of the primer was additionally carried out using standard analysis tools analyzing the primer for the ability to form hairpins or to form primer dimers.

Основные концепции способа представляют собой следующее: с применением невытесняющей цепи ДНК-полимеразы с высокой точностью, такой как Pfu-Turbo и одного праймера, линейно амплифицировали матрицу ДНК. Это отличается от обычного процесса экспоненциальной амплификации в реакции ПЦР. Данный процесс линейной амплификации обеспечивает низкую частоту ошибок. Продукт представляет собой одноцепочечную неметилированную ДНК и двухцепочечную полуметилированную ДНК. Если матрица получена из природного организма-хозяина, затем матрица становится двухцепочечной метилированной ДНК. Это означает, что матричная ДНК может быть расщеплена эндонуклеазой Dpn I без расщепления ДНК продукта. Таким образом, при трансформации ДНК в подходящего хозяина только очень низкая частота трансформантов с немутированной плазмидой.The main concepts of the method are as follows: using a non-displacing DNA polymerase chain with high accuracy, such as Pfu-Turbo and one primer, the DNA matrix was linearly amplified. This is different from the usual process of exponential amplification in a PCR reaction. This linear amplification process provides a low error rate. The product is single-stranded unmethylated DNA and double-stranded semi-methylated DNA. If the matrix is obtained from a natural host organism, then the matrix becomes double-stranded methylated DNA. This means that template DNA can be cleaved with Dpn I endonuclease without cleaving the product DNA. Thus, when transforming DNA into a suitable host, only a very low frequency of transformants with a non-mutated plasmid.

ПРИМЕР 3:EXAMPLE 3: Отбор лучших вариантов из библиотеки сканирования участков Selecting the best options from the site scan library

Описаны два альтернативных подхода: определение последовательности библиотеки с последующим анализом уникальных аминокислот или анализ библиотеки с определением последовательности лучших вариантов.Two alternative approaches are described: determining the sequence of the library, followed by analysis of unique amino acids, or analyzing the library to determine the sequence of the best options.

Отбор лучших вариантов способом 1: определение последовательности библиотеки с последующим анализом уникальных аминокислот.Selection of the best options by method 1: determining the sequence of the library, followed by analysis of unique amino acids.

Для получения библиотек/вариантов сканирования участков у E. coli применяли трансформацию/экспрессирующий челночный вектор, а экспрессию вариантов в B. subtilis получали с pDP66S, Penninaga et al., (Biochemistry (1995), 3368-3376), посредством замещения кассеты селекции на кассету селекции канамицином. Вектор применяли для вставки гена варианта ацилтрансферазы вместо гена cgt вниз от промотора P32. Вектор использует промотор P32 для управления экспрессией гена варианта ацилтрансферазы в B. subtilis.To obtain libraries / scan options for sites in E. coli , a transformation / expression shuttle vector was used, and expression of the variants in B. subtilis was obtained with pDP66S, Penninaga et al . (Biochemistry (1995), 3368-3376), by replacing the selection cassette with kanamycin selection cassette. The vector was used to insert the acyltransferase variant gene instead of the cgt gene downstream of the P32 promoter. The vector uses the P32 promoter to control gene expression of the acyltransferase variant in B. subtilis .

Экспрессирующий вектор трансформировали в nprE-, aprA- Bacillus subtillis DB104 (Kawamura и Doi, J. of Bacteriology Oct 1984, p442-444) с применением способов трансформации, как описано в Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus (Ed. C. R. Harwood и S. M. Cutting), 1990. John Wiley & Sons Ltd. Chichester, UK).The expression vector was transformed into nprE-, aprA- Bacillus subtillis DB104 (Kawamura and Doi, J. of Bacteriology Oct 1984, p442-444) using transformation methods as described in Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus (Ed. CR Harwood and SM Cutting), 1990. John Wiley & Sons Ltd. Chichester, UK).

Библиотеки сканирования участков конструировали с применением вырожденного олигонуклеотида, содержащего один кодон NNK, где K означает G или T, а N означает A, C, G или T. Это означает, что набор клонов, конструируемых на основании реакции амплификации с применением праймера NNK (также известные как "библиотека сканирования участков"), в принципе содержит 32 уникальных кодона (4×4×2 = 32 возможных комбинации). Не предполагая смещения ожидаемого, количество клонов, которые необходимо выбрать, чтобы иметь 95% шанс отбора каждого из 32 кодонов, по меньшей мере, один раз составляет 95. Это можно подсчитать с применением следующей формулы:Site scan libraries were constructed using a degenerate oligonucleotide containing one NNK codon, where K is G or T, and N is A, C, G or T. This means that a set of clones are constructed based on the amplification reaction using the NNK primer (also known as the "site scan library"), in principle, contains 32 unique codons (4 × 4 × 2 = 32 possible combinations). Without assuming the expected bias, the number of clones that must be selected in order to have a 95% chance of selecting each of the 32 codons at least once is 95. This can be calculated using the following formula:

формула 1Formula 1

n = {log (1-c)} / {log (1-f)}n = {log (1-c)} / {log (1-f)}

где n представляет собой количество клонов, c представляет собой относительное значение доверительного интервала, например 95% доверительный интервал имеет значение 0,95, а 99% доверительный интервал имеет относительное значение 0,99, и f представляет собой частоту с которой появляется каждый кодон, которая для праймера NNK составляет 1/32 или 0,03125. Решение формулы для n дает 94,36 или 95 клонов. Если полагают, что 95% доверительный интервал является слишком маленьким или если невозможно избежать смещения на одной или нескольких стадий процесса конструирования библиотеки, можно принять решение анализировать или определять последовательность большего количества клонов. Например, в формуле 1, если n составляет 384, f составляет 1/32 или 0,03125, тогда доверительный интервал c будет значительно больше, чем 99%. Даже если 60% клонов содержат одинаковую мутацию или кодон дикого типа, то 363 клона дадут 99% уверенность получения всех 32 кодонов. Из этого можно заключить, что 384 клона дадут 99% уверенность содержания каждого из 32 кодонов, по крайней мере, один раз.where n represents the number of clones, c represents the relative value of the confidence interval, for example, 95% confidence interval has a value of 0.95, and 99% confidence interval has a relative value of 0.99, and f is the frequency with which each codon appears, which for primer, NNK is 1/32 or 0.03125. The solution of the formula for n gives 94.36 or 95 clones. If it is believed that the 95% confidence interval is too small or if it is not possible to avoid biasing at one or more stages of the library construction process, you may decide to analyze or determine the sequence of more clones. For example, in formula 1, if n is 384, f is 1/32 or 0.03125, then the confidence interval c will be significantly greater than 99%. Even if 60% of the clones contain the same mutation or wild-type codon, 363 clones will give 99% confidence in obtaining all 32 codons. From this we can conclude that 384 clones will give 99% confidence in the content of each of the 32 codons at least once.

Для амплификации фрагмента из плазмиды внутри бактерии проводили ПЦР колоний (реакция ПЦР на бактериальной колонии или на жидкой бактериальной культуре), а последующее определение последовательности той части фрагмента, которую подвергали мутированию, является разработанным способом. ПЦР колоний можно проводить обычным способом для наборов из 96 образцов вследствие доступности заранее изготовленного материала (также известного как наборы) для ПЦР колоний, определения последовательностей и очистки последовательностей. Данная полная процедура предлагается как услуга несколькими коммерческими компаниями, такими как AGOWA GmbH, Glienicker weg 185, D-12489 Berlin, Germany.To amplify a fragment from a plasmid inside the bacterium, PCR of the colonies was carried out (PCR reaction on a bacterial colony or on a liquid bacterial culture), and the subsequent determination of the sequence of that part of the fragment that was mutated was a developed method. Colony PCR can be carried out in the usual way for kits of 96 samples due to the availability of prefabricated material (also known as kits) for colony PCR, sequencing and purification of sequences. This complete procedure is offered as a service by several commercial companies such as AGOWA GmbH, Glienicker weg 185, D-12489 Berlin, Germany.

После анализа 96 реакций определения последовательности выбирали отдельные клоны, представляющие собой каждый кодон, доступный в наборе из 96 последовательностей. Затем каждый из клонов, представляющих собой мутантов, инокулировали в 5 мл бульона LB (ферментативно расщепленный казеин, 10 г/л; дрожжевой экстракт с низким содержанием натрия, 5 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; инертные таблетированные вспомогательные средства, 2 г/л) дополненные 50 мг/л канамицина и инкубировали при 33°C в течение 6 часов при 205 об/мин 0,7 мл этой культуры использовали для инокуляции в 50 мл субстрата SAS (K₂HPO₄, 10 г/л; MOPS (3-морфолинопропансульфоновая кислота), 40 г/л; хлорида натрия, 5 г/л; пеногасителя (Sin 260), 5 капель/л; обезжиренной соевой муки, 20 г/л; Biospringer 106 (100% dw YE), 20 г/л), дополненного 50 мг/л канамицина и раствором высокомолекулярных гидролизатов мальтозного крахмала (60 г/л). Инкубацию продолжали в течение 40 часов при 33°C и 180 об/мин после чего супернатант культуры отделяли центрифугированием при 19000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку и непосредственно применяли для анализа.After analysis of the 96 sequence determination reactions, individual clones were selected representing each codon available in a set of 96 sequences. Then, each of the mutant clones was inoculated in 5 ml of LB broth (enzymatically cleaved casein, 10 g / l; low sodium yeast extract, 5 g / l; sodium chloride, 5 g / l; inert tablet excipients, 2 g / l) supplemented with 50 mg / l kanamycin and incubated at 33 ° C for 6 hours at 205 rpm, 0.7 ml of this culture was used to inoculate 50 ml of SAS substrate (K ₂ HPO ₄ , 10 g / l ; MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid), 40 g / l; sodium chloride, 5 g / l; antifoam (Sin 260), 5 drops / l; fat-free soy flour, 20 g / l; Biospringer 106 (100% dw YE), 20 g / l), supplemented with 50 mg / l kanamycin and a solution of high molecular weight maltose starch hydrolysates (60 g / l). Incubation was continued for 40 hours at 33 ° C and 180 rpm, after which the culture supernatant was separated by centrifugation at 19000 rpm for 30 minutes. The supernatant was transferred to a clean tube and directly used for analysis.

Отбор лучших вариантов способом 2: скрининг библиотек и затем секвенирование лучших вариантов.Selecting the best options in Method 2: screening the libraries and then sequencing the best options.

Хотя можно выбрать определение последовательностей 384 клонов, их также можно анализировать и перед определением последовательностей выбрать лучшие варианты.Although you can choose the definition of the sequences of 384 clones, they can also be analyzed and before determining the sequences to choose the best options.

При скрининге такого ряда образцов необходимо принять в рассмотрение ряд проблем. Не являясь исчерпывающим, несмотря на то что можно выбрать варианты с измененной активностью для одного субстрата, различия в уровне экспрессии между 384 культурами могут быть существенными, даже если применять 384-луночный планшет для титрования, приводящий к высокому фоновому уровню. Таким образом, измерение двух видов активности и отбор лучших вариантов на основе изменения отношения является предпочтительным способом. В качестве иллюстрации, если два вида активности обладают определенным отношением R, тогда вне зависимости от присутствующего абсолютного количества фермента отношение между двумя видами активности всегда будет R. Изменение значения R указывает на мутацию, изменяющую один вид активности относительно второго вида активности.When screening such a series of samples, a number of problems need to be considered. Not being exhaustive, although it is possible to choose variants with altered activity for one substrate, differences in expression level between 384 cultures can be significant, even if a 384-well titration plate is used leading to a high background level. Thus, measuring two types of activity and selecting the best options based on a change in attitude is the preferred method. As an illustration, if two types of activity have a certain ratio of R, then regardless of the absolute amount of enzyme present, the ratio between the two types of activity will always be R. A change in the value of R indicates a mutation that changes one type of activity relative to the second type of activity.

На фиг.60 показан набор данных, полученный из библиотеки сканирования участков. Все клоны тестировали на активность в отношении фосфатидилхолина (PC) и дигалактозилдиглицерида (DGDG). Все клоны, которые могут быть мутантными или нет, не демонстрирующие изменения значения R, лежат на прямой линии с определенной величиной ошибки. Не учитывая эти клоны на фиг.61 существуют три представляющих интерес группы.On Fig shows a data set obtained from the library scanning plots. All clones were tested for activity against phosphatidylcholine (PC) and digalactosyl diglyceride (DGDG). All clones that may be mutant or not, not showing changes in the value of R, lie on a straight line with a certain amount of error. Without considering these clones in FIG. 61, there are three groups of interest.

Область 1 на фиг.61 содержит все те клоны, которые обладают значительно большим R, чем дикий тип (без мутации), но меньшей общей активностью для DGDG. Область 2 содержит те клоны, которые обладают и большим значением R, и большей активностью для DGDG, чем у дикого типа. Область 3 содержит клоны, которые не обладают повышенным значением R, но обладающие значительно большей активностью для DGDG или PC.Region 1 in FIG. 61 contains all those clones that have significantly higher R than the wild type (without mutation), but lower overall activity for DGDG. Region 2 contains those clones that have both a large R value and greater activity for DGDG than in the wild type. Region 3 contains clones that do not have an increased R value, but have significantly greater activity for DGDG or PC.

Если интерес представляют варианты с повышенной активностью для DGDG, тогда область 2 содержит наиболее интересные варианты и область 3 также содержит представляющие интерес варианты. Варианты в области 3, демонстрирующие большое увеличение гидролитической активности, могут сочетать уменьшение трансферазной активности.If variants with increased activity for DGDG are of interest, then region 2 contains the most interesting variants and region 3 also contains variants of interest. Options in region 3, showing a large increase in hydrolytic activity, may combine a decrease in transferase activity.

Необходимо отметить один факт, если затронут определяющий специфичность остаток, большинство из 20 возможных аминокислот могут давать очень различные значения R. Однако, если в библиотеке присутствует большое смещение к одной аминокислоте (например, 60% представляет собой тирозин), тогда все такие варианты все еще будут лежать на прямой линии.One fact should be noted, if the specificity-determining residue is affected, most of the 20 possible amino acids can give very different values of R. However, if there is a large bias to one amino acid in the library (for example, 60% is tyrosine), then all such options are still will lie in a straight line.

ПРИМЕР 4EXAMPLE 4 : Анализы на активность для PC и DGDG в 384-луночном планшете для микротитрования: Activity assays for PC and DGDG in a 384-well microtiter plate

Исходный материалRaw material

Среды EMEM environments

Планшет для трансформантовTablet for transformants

Планшет для дикого типаWild Type Tablet

384-луночные планшеты384 well plates

сборщик колонийcolony picker

Набор Waco NEFA-CWaco NEFA-C Kit

Растворы PC и DGDG в 384-луночном планшетеPC and DGDG solutions in 384 well plate

Часть 1 - сбор колонийPart 1 - colony collection

Сбор колоний в 384-луночный планшет заполненный средой EMColony collection in 384 well plate filled with EM medium

Пропуск 4 лунок и инокуляция их колониями, содержащими основную цепь без мутацииSkip 4 holes and inoculate them with colonies containing the main chain without mutation

Рост в течение ночи при 30°C при скорости перемешивания 200 об/мин.Growth overnight at 30 ° C with a stirring speed of 200 rpm.

Часть 2 - Инкубация на субстратеPart 2 - Incubation on the substrate

Центрифугирование планшетов после роста в течение ночи; 2500 об/мин, 20 мин.Centrifuging tablets after growth overnight; 2500 rpm, 20 min.

Перенос 10 мкл супернатанта из каждой лунки в 2 пустых 384-луночных планшетаTransfer 10 μl of supernatant from each well to 2 empty 384-well plates

Добавление 5 мкл 12,5 мМ DGDG в один из планшетов, добавление 5 мкл 12,5 мМ PC в другой планшетAdding 5 μl of 12.5 mm DGDG to one of the tablets, adding 5 μl of 12.5 mm PC to another tablet

Инкубация обоих планшетов в течение 2 часов при 37°C, перемешивание на старте для смешивания, а затем остановка перемешиванияIncubation of both plates for 2 hours at 37 ° C, stir at the start for mixing, and then stop stirring

Продолжение с применением процедуры NEFA-CContinued using the NEFA-C procedure

Часть 3 - процедура NEFA-CPart 3 - NEFA-C Procedure

Добавление 10 мкл раствора AAddition of 10 μl of solution A

Инкубация 10 мин. при 37°C, 300 об/минIncubation 10 min. at 37 ° C, 300 rpm

Добавление 20 мкл раствора BAddition of 20 μl of solution B

Чтение планшета при 550 нмReading a tablet at 550 nm

Состав субстрата - в мМThe composition of the substrate is in mm

25 мМ PC или DGDG25 mm PC or DGDG

10 мМ CaCl₂ 10 mM CaCl ₂

60 мМ Triton X 10060 mm Triton X 100

15 мМ NaN₃ 15 mm NaN ₃

20 мM Briton Robinson pH 5,020 mM Briton Robinson pH 5.0

ПРИМЕР 5EXAMPLE 5 Выбранные варианты Selected Options

Определение ферментативной активностиDetermination of enzymatic activity

Для определения ферментативной активности для различных субстратов 4 мкл раствора фермента инкубировали с 11 мкл субстрата в течение 60 минут при 37°C. Затем с применением набора WACO NEFA-C определяли количество свободных жирных кислот. К 15 мкл смеси фермента и субстрата добавляли 75 мкл раствора A NEFA и инкубировали в течение 15 минут при 37°C. Затем добавляли 150 мкл раствора B NEFA и инкубировали в течение 15 минут. Затем измеряли оптическую плотность (OD) образца при 550 нм.To determine the enzymatic activity for various substrates, 4 μl of the enzyme solution was incubated with 11 μl of the substrate for 60 minutes at 37 ° C. Then, using the WACO NEFA-C kit, the amount of free fatty acids was determined. To 15 μl of a mixture of enzyme and substrate, 75 μl of A NEFA solution A was added and incubated for 15 minutes at 37 ° C. Then 150 μl of NEFA solution B was added and incubated for 15 minutes. Then, the optical density (OD) of the sample was measured at 550 nm.

В качестве контроля из каждого варианта 4 мкл раствора фермента инкубировали с 11 мкл буфера HEPES в течение 60 мин при 37°C. Затем определяли количество свободных жирных кислот, как описано выше. Значения OD данного контрольного образца вычитали из наблюдаемого для каждого субстрата OD для получения скорректированной активности.As a control from each option, 4 μl of the enzyme solution was incubated with 11 μl of HEPES buffer for 60 min at 37 ° C. Then, the amount of free fatty acids was determined as described above. The OD values of this control were subtracted from the OD observed for each substrate to obtain corrected activity.

Применяли четыре различных субстрата, где состав в целом составлял 30 мг липида, 4,75 мл 50 мМ буфера HEPES pH 7, 42,5 мкл 0,6 М CaCl₂, 200 мкл 10% Triton X-100 без H₂O₂. 30 мг липида представляли собой или фосфатидилхолин (PC), PC с холестерином в отношении 9 к 1, дигалактозилдиглицерид (DGDG), или DGDG с холестерином в отношении 9 к 1.Four different substrates were used, where the composition as a whole was 30 mg lipid, 4.75 ml of 50 mM HEPES pH 7 buffer, 42.5 μl of 0.6 M CaCl ₂ , 200 μl of 10% Triton X-100 without H ₂ O ₂ . 30 mg of the lipid was either phosphatidylcholine (PC), PC with a cholesterol ratio of 9 to 1, digalactosyl diglyceride (DGDG), or DGDG with cholesterol in a ratio of 9 to 1.

Отбор улучшенных вариантовSelection of improved options

Варианты с повышенной активностью для PCHigh activity options for PC

Те варианты, которые продемонстрировали увеличение OD по отношению к дикому типу фермента, при инкубации на PC выбирали как варианты с повышенной фосфолипазной активностью.Those variants that showed an increase in OD relative to the wild type of the enzyme, when incubated on PC, were selected as variants with increased phospholipase activity.

Варианты с повышенной активностью для DGDGHigh Activity Options for DGDG

Те варианты, которые продемонстрировали увеличение OD по отношению к дикому типу фермента, при инкубации на DGDG выбирали как варианты с повышенной активностью для DGDG.Those variants that showed an increase in OD relative to the wild type of the enzyme, when incubated on DGDG, were selected as variants with increased activity for DGDG.

Варианты с повышенной специфичностью для DGDGDGDG specificity options

Специфичность для DGDG представляет собой отношение активности для DGDG к активности для фосфатидилхолина (PC). Те варианты, которые продемонстрировали повышенное отношение DGDG к PC, по сравнению с диким типом отбирали как варианты с улучшенной специфичностью для DGDG.Specificity for DGDG is the ratio of activity for DGDG to activity for phosphatidylcholine (PC). Those variants that showed an increased ratio of DGDG to PC compared to the wild type were selected as variants with improved specificity for DGDG.

Варианты с повышенной трансферазной активностью для PC в качестве донора ацилаVariants with increased transferase activity for PC as an acyl donor

Различие в количестве свободных жирных кислот, образуемое при инкубации фермента на PC и на PC с холестерином представляет собой указание на степень трансферазной активности относительно степени гидролитической активности. Трансферазная активность не приводит к образованию свободных жирных кислот. Преимущество трансферазы представляет собой отношение свободных жирных кислот, образуемых, когда в качестве субстрата используют PC, к свободным жирным кислотам, образуемым когда в качестве субстрата используют PC с холестерином. Те варианты, которые демонстрируют увеличение преимущества трансферазы и демонстрируют большую, чем у дикого типа активность для PC, отбирают в качестве обладающих повышенной трансферазной активностью.The difference in the amount of free fatty acids formed during the incubation of the enzyme on PC and on PC with cholesterol is an indication of the degree of transferase activity relative to the degree of hydrolytic activity. Transferase activity does not lead to the formation of free fatty acids. The advantage of transferase is the ratio of free fatty acids formed when PC is used as a substrate to free fatty acids formed when PC with cholesterol is used as a substrate. Those variants that demonstrate an increase in the transferase advantage and exhibit greater PC activity than the wild-type are selected as those with increased transferase activity.

Варианты с повышенной трансферазной активностью для DGDG в качестве донора ацилаVariants with increased transferase activity for DGDG as an acyl donor

Различие в количестве свободных жирных кислот образуемое при инкубации фермента на DGDG и на DGDG с холестерином представляет собой указание на степень трансферазной активности относительно степени гидролитической активности. Трансферазная активность не приводит к образованию свободных жирных кислот. Преимущество трансферазы представляет собой отношение свободных жирных кислот, образуемых когда в качестве субстрата используют DGDG к свободным жирным кислотам, образуемым когда в качестве субстрата используют DGDG с холестерином. Те варианты, которые демонстрируют увеличение преимущества трансферазы и демонстрируют большую, чем у дикого типа активность для DGDG, отбирают в качестве обладающих повышенной трансферазной активностью.The difference in the amount of free fatty acids formed during the incubation of the enzyme on DGDG and on DGDG with cholesterol is an indication of the degree of transferase activity relative to the degree of hydrolytic activity. Transferase activity does not lead to the formation of free fatty acids. The advantage of transferase is the ratio of free fatty acids formed when DGDG is used as a substrate to free fatty acids formed when DGDG with cholesterol is used as a substrate. Those variants that demonstrate an increase in the transferase advantage and exhibit greater DGDG activity than the wild-type are selected as exhibiting increased transferase activity.

Выбранные вариантыSelected Options

Для каждого из четырех критериев отбора, приведенных выше, отбирали ряд вариантов.For each of the four selection criteria above, a number of options were selected.

Фермент "дикого типа" в данном примере представляет собой фермент A. salmonicida (SEQ ID NO:28).The wild-type enzyme in this example is A. salmonicida (SEQ ID NO: 28).

ПРИМЕР 6:EXAMPLE 6: Анализ трансферазной активности для фосфолипида:холестерина Analysis of transferase activity for phospholipid: cholesterol

Фосфолипид можно заменить на DGDG для обеспечения анализа трансферазы для галактолипида. Также в этом же анализе можно использовать другие акцепторы, например, глицерин, глюкозу, гидроксикислоты, белки или мальтозу.The phospholipid can be replaced by DGDG to provide a transferase assay for galactolipid. Other acceptors may also be used in the same assay, for example, glycerol, glucose, hydroxy acids, proteins, or maltose.

300 мг фосфатидилхолина (Avanti №441601):холестерина (Sigma C8503) 9:1 помещали в пробирку Уитона. Добавляли 10 мл 50 мМ буфера HEPES pH 7,0 и перемешиванием при 40°C распределяли субстрат.300 mg of phosphatidylcholine (Avanti No. 441601): cholesterol (Sigma C8503) 9: 1 was placed in a Wheaton tube. 10 ml of 50 mM HEPES pH 7.0 buffer was added and the substrate was distributed by stirring at 40 ° C.

0,5 мл субстрата переносят в 4 мл флакон и помещают в нагревательное устройство при 40°C. Добавляют 0,05 мл раствора трансферазы, а также тем же способом анализируют контроль с 0,050 мл воды. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 часов при 40°C. Затем образец замораживают и лиофилизируют и анализируют посредством GLC.0.5 ml of the substrate is transferred to a 4 ml vial and placed in a heating device at 40 ° C. 0.05 ml of transferase solution is added, and the control with 0.050 ml of water is analyzed in the same way. The reaction mixture was stirred for 4 hours at 40 ° C. The sample is then frozen and lyophilized and analyzed by GLC.

Подсчет:Count:

На основании анализа GLC подсчитывают содержание свободных жирных кислот и сложного эфира холестерина.Based on the GLC analysis, the content of free fatty acids and cholesterol ester is calculated.

Ферментативную активность подсчитывают как:Enzymatic activity is calculated as:

Отношение трансферазной активности/гидролиза = % трансферазной активности/% гидролитической активностиThe ratio of transferase activity / hydrolysis =% transferase activity /% hydrolytic activity

гдеWhere

Δ % сложного эфира холестерина = % сложного эфира холестерина (образец)-% сложного эфира холестерина (контроль).Δ% cholesterol ester =% cholesterol ester (sample) -% cholesterol ester (control).

Δ % жирной кислоты = % жирной кислоты (образец) - % жирной кислоты (контроль).Δ% fatty acid =% fatty acid (sample) -% fatty acid (control).

Анализ трансферазной активности для галактолипида:холестерина.Analysis of transferase activity for galactolipid: cholesterol.

300 мг дигалактозилдиглицерида (DGDG) (чистота > 95% галактолипида, применяемый DGDG очищали из пшеничных липидов. DGDG из Sigma D4651 также пригоден для применения):холестерин (Sigma) 9:1 помещали в пробирку Уитона. Добавляли 10 мл 50 мМ буфера HEPES pH 7,0 и перемешиванием при 40°C распределяли субстрат.300 mg of dihalactosyl diglyceride (DGDG) (purity> 95% galactolipid used by DGDG was purified from wheat lipids. DGDG from Sigma D4651 is also suitable): cholesterol (Sigma) 9: 1 was placed in a Wheaton tube. 10 ml of 50 mM HEPES pH 7.0 buffer was added and the substrate was distributed by stirring at 40 ° C.

Подсчет:Count:

гдеWhere

Δ % сложного эфира холестерина = % сложного эфира холестерина (образец) - % сложного эфира холестерина (контроль).Δ% cholesterol ester =% cholesterol ester (sample) -% cholesterol ester (control).

ПРИМЕР 7EXAMPLE 7 : Варианты липидацилтрансферазы для Aeromonas hydrophila (SEQ ID NO:26): Lipid Acyltransferase Options for Aeromonas hydrophila (SEQ ID NO: 26)

Мутации вносили с применением набора QuikChange™ Multi-Site Directed Mutagenesis из Stratagene, La Jolla, CA92037, USA по инструкциям, предоставленным Stratagene.Mutations were introduced using the QuikChange ™ Multi-Site Directed Mutagenesis kit from Stratagene, La Jolla, CA92037, USA according to the instructions provided by Stratagene.

Варианты с Tyr256 продемонстрировали повышенную активность для фосфолипидов.Tyr256 variants showed increased activity for phospholipids.

Варианты с Tyr256 и с Tyr260 продемонстрировали повышенную активность для галактолипидов.Tyr256 and Tyr260 variants showed increased activity for galactolipids.

Варианты с Tyr265 продемонстрировали повышенную трансферазную активность с галактолипидами в качестве донора ацила.Options with Tyr265 showed increased transferase activity with galactolipids as an acyl donor.

Номера указывают положения на следующей последовательности: фермент из Aeromonas hydrophila, аминокислотная последовательность которого представлена как SEQ ID NO:26. Нуклеотидная последовательность является такой, как представленная как SEQ ID NO:27.Numbers indicate positions in the following sequence: an enzyme from Aeromonas hydrophila, the amino acid sequence of which is represented as SEQ ID NO: 26. The nucleotide sequence is as presented as SEQ ID NO: 27.

ПРИМЕР 8EXAMPLE 8 : Скрининг мутантов глицерофосфолипид:холестеринацилтрансферазы GCAT из Aeromonas salmonicida.: Screening of glycerophospholipid mutants: cholesterol acyltransferase GCAT from Aeromonas salmonicida .

Мутанты с точковыми мутациями глицерофосфолипид:холестеринацилтрансферазы GCAT из Aeromonas salmonicida скринировали на трансферазную активность с применением фосфатидилхолина или дигалактозилдиглицерида в качестве донора и холестерина в качестве акцептора с целью отбора мутанта с улучшенной активностью для дигалактозилдиглицерида по сравнению с фосфатидилхолином.Mutants with point mutations of the glycerophospholipid: GCAT cholesterol acyltransferase from Aeromonas salmonicida were screened for transferase activity using phosphatidylcholine or digalactosyldiglyceride as a donor and cholesterol as an acceptor for the selection of the compared with the increased ratio to the increased ratio.

Мутанты GCAT скринировали на трансферазную активность с применением дигалактозилдиглицерида (DG) и фосфатидилхолина (PC) в качестве донора и холестерин в качестве акцептора.GCAT mutants were screened for transferase activity using digalactosyl diglyceride (DG) and phosphatidylcholine (PC) as a donor and cholesterol as an acceptor.

DG (чистота > 95% дигалактозилдиглицерида (применяемый DGDG очищали из липидов пшеницы. DGDG из Sigma D4651 также пригоден для применения из Signma D4651) и холестерин (Sigma C8503) помещали в отношении 9:1 и растворяли в хлороформе и выпаривали до сухости.DG (purity> 95% of dihalactosyl diglyceride (the applied DGDG was purified from wheat lipids. DGDG from Sigma D4651 is also suitable for use from Signma D4651) and cholesterol (Sigma C8503) was placed in a 9: 1 ratio and dissolved in chloroform and evaporated to dryness.

Субстрат получали растворением 3% DG:холестерина 9:1 в 50 мМ буфере HEPES pH 7.The substrate was prepared by dissolving 3% DG: 9: 1 cholesterol in 50 mM HEPES pH 7 buffer.

0,250 мл субстрата переносили в 3 мл пробирку с закручивающейся крышкой. Добавляли 0,025 мл супернатанта из культуры мутанта GCAT и инкубировали при 40°C в течение 2 часов. Также получали эталонный образец с водой вместо фермента. Ферментативную реакцию останавливали нагреванием реакционной смеси в бане с кипящей водой в течение 10 минут.0.250 ml of the substrate was transferred into a 3 ml tube with a screw cap. Added 0.025 ml of the supernatant from the GCAT mutant culture and incubated at 40 ° C for 2 hours. A reference sample was also obtained with water instead of the enzyme. The enzymatic reaction was stopped by heating the reaction mixture in a boiling water bath for 10 minutes.

Добавляли 2 мл 99% этанола и подвергали анализу на холестерин, а также анализу на свободную жирную кислоту.Added 2 ml of 99% ethanol and subjected to analysis for cholesterol, as well as analysis for free fatty acid.

Анализ на холестерин.Analysis for cholesterol.

100 мкл субстрата, содержащего: 1,4 Ед/мл холестериноксидазы (SERVA Electrophoresis GmbH кат. № 17109), 0,4 мг/мл ABTS (Sigma A-1888), 6 Ед/мл пероксидазы (Sigma 6782) в 0,1 М буфере TRIS, HCl буфер pH 6,6 и 0,5% Triton X 100 (Sigma X-100) инкубировали при 37°C в течение 5 минут. Добавляли 5 мкл образца холестерина и перемешивали. Реакционную смесь инкубировали в течение дополнительных 5 минут и измеряли OD при 405 нм. Содержание холестерина подсчитывали на основании анализа стандартных растворов холестерина, содержащих 0,4 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,20 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0 мг/мл.100 μl of a substrate containing: 1.4 U / ml cholesterol oxidase (SERVA Electrophoresis GmbH Cat. No. 17109), 0.4 mg / ml ABTS (Sigma A-1888), 6 U / ml peroxidase (Sigma 6782) in 0.1 M TRIS buffer, HCl buffer pH 6.6 and 0.5% Triton X 100 (Sigma X-100) were incubated at 37 ° C for 5 minutes. 5 μl of a cholesterol sample was added and mixed. The reaction mixture was incubated for an additional 5 minutes and the OD was measured at 405 nm. Cholesterol content was calculated based on the analysis of standard cholesterol solutions containing 0.4 mg / ml, 0.3 mg / ml, 0.20 mg / ml, 0.1 mg / ml, 0.05 mg / ml and 0 mg / ml .

Анализ на свободную жирную кислоту.Free fatty acid analysis.

Свободные жирные кислоты в образце измеряли с применением набора NEFA-C (WAKO Chemicals GmbH)Free fatty acids in the sample were measured using the NEFA-C kit (WAKO Chemicals GmbH)

75 мкл реагента A NEFA инкубировали в течение 10 минут при 37°C. Добавляли 15 мкл образца фермента и перемешивали. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 минут. Добавляли 150 мкл реагента B NEFA, перемешивали и инкубировали в течение дополнительных 10 минут и измеряли OD при 540 нм. Свободную жирную кислоту подсчитывали на основании стандартных растворов 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 и 0 мМ жирной кислоты.75 μl of NEFA reagent A was incubated for 10 minutes at 37 ° C. 15 μl of the enzyme sample was added and mixed. The reaction mixture was incubated for 10 minutes. 150 μl of NEFA reagent B was added, mixed and incubated for an additional 10 minutes, and OD was measured at 540 nm. Free fatty acid was calculated on the basis of standard solutions of 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 and 0 mm fatty acid.

Анализ трансферазной активности с применением фосфатидилхолина в качестве донора проводили тем же способом, но с применением фосфатидилхолина (Avanti №441601) вместо DG (DGDG).Analysis of transferase activity using phosphatidylcholine as a donor was performed in the same way, but using phosphatidylcholine (Avanti No. 441601) instead of DG (DGDG).

Трансферазную активность выражали как % этерифицированного холестерина, подсчитанный на основании разницы свободного холестерина в эталонном образце и свободного холестерина в образце с ферментом. Transferase activity was expressed as% esterified cholesterol , calculated on the basis of the difference between free cholesterol in the reference sample and free cholesterol in the sample with the enzyme.

Гидролитическую активность выражали как % образуемой свободной жирной кислоты, подсчитанный на основании разницы свободной жирной кислоты в образце с ферментом и свободной жирной кислоты в эталонном образце. Hydrolytic activity was expressed as% of free fatty acid formed , calculated on the basis of the difference between the free fatty acid in the sample and the enzyme and the free fatty acid in the reference sample.

Относительную трансферазную активность для DG и PC подсчитывали как %T_DG/T_PC.Relative transferase activity for DG and PC was calculated as% T _DG / T _PC .

Для мутантов подсчитывали трансферазную активность T_DG относительно гидролитической активности H_DG для DG For mutants, the transferase activity of T _DG relative to the hydrolytic activity of H _DG for DG was calculated

где 386 = MW холестерина, а 280 = MW жирной кислоты.where 386 = MW cholesterol, and 280 = MW fatty acid.

Мутанты с T_DG > 50% и T_DG/T_PC > 3 и Mutants with T _DG > 50% and T _DG / T _PC > 3 and

выбирали как улучшенные мутанты.selected as improved mutants.

Данные, полученные из указанного выше примера, можно анализировать статистическими методами для идентификации и определения ключевых участков и/или конкретных аминокислотных замен, обеспечивающих желательный профиль активности, такой как повышенное отношение T_DG к T_PC. Например, предложена следующая надежная модель:Data obtained from the above example can be analyzed by statistical methods to identify and identify key regions and / or specific amino acid substitutions that provide the desired activity profile, such as an increased ratio of T _DG to T _PC . For example, the following robust model is proposed:

Варианты с повышенным T_DG/T_PC Options with increased T _DG / T _PC Варианты с повышенной трансферазной активностью T_DG для DGDGOptions with increased transferase activity T _DG for DGDG Варианты с повышенной активностью T_DG/H_DG Options with increased activity T _DG / H _DG K22E, K
G40 L
N87 R, D, E, M
Y117 A, N, E, H,
Т
Q182K, T
M209K, M
L210 N
R211 G
N215 H
Y230 I
-318Y, H или S
N215 H
L210D, Q или T
E 309S, Q или R
H180K или Q
N 80 N, R или D
L210 G, I, H, E,
M, S, W, V, A, R,
N,
S310A, P, T, H, M,
K или G
V112C
Y30 G, I, L, S, E,
M, A или R
V290R, E, H или A
Q289R или N
K22E
G40L
Y179V
M209 L, К, М
L211 G, Q, K или D
Y230 V
S310 P
Y179 R
H180 T
Q289 T или D
G40 Q, L или V
N88 W
N87 R или DK22E, K
G40 L
N87 R, D, E, M
Y117 A, N, E, H,
T
Q182K, T
M209K, M
L210 N
R211 G
N215 H
Y230 I
-318Y, H or S
N215 H
L210D, Q or T
E 309S, Q or R
H180K or Q
N 80 N, R or D
L210 G, I, H, E,
M, S, W, V, A, R,
N
S310A, P, T, H, M,
K or G
V112C
Y30 G, I, L, S, E,
M, A or R
V290R, E, H or A
Q289R or N
K22E
G40l
Y179V
M209 L, K, M
L211 G, Q, K or D
Y230 V
S310 P
Y179 R
H180 T
Q289 T or D
G40 Q, L or V
N88 w
N87 R or D N80P, G или E
S310Q, H или S
S3 E, A, G, K, M, Y,
R, P, N, T, или Q
-318 R, S, E, H, Q,
N или D
N215 L, G, V, R или
Y
K82SN80P, G or E
S310Q, H or S
S3 E, A, G, K, M, Y,
R, P, N, T, or Q
-318 R, S, E, H, Q,
N or D
N215 L, G, V, R or
Y
K82S Y179E, R, N, Q
N215 G
L210 D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R,T, W, I, V или S
N80 G
Y30 L
N87 G
H180 I, T
M209Y
R211D, T или G
S18G, M или T
G40 R или M
N88 W
N87 С, D, R, E или GY179E, R, N, Q
N215 G
L210 D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V or S
N80 G
Y30 L
N87 g
H180 I, T
M209Y
R211D, T or G
S18G, M or T
G40 R or M
N88 w
N87 C, D, R, E or G

ПРИМЕР 9EXAMPLE 9 : Отбор улучшенных мутантов глицерофосфолипид:холестеринацилтрансферазы GCAT из Aeromonas salmonicida : Selection of improved glycerophospholipid mutants: cholesterol acyltransferase GCAT from Aeromonas salmonicida

"Исходный" фермент в данном примере представляет собой фермент A. salmonicida (SEQ ID NO:28).The “starting” enzyme in this example is A. salmonicida (SEQ ID NO: 28).

32 положения GCAT из Aeromonas salmonicida (230 Туr, 182 Lys, 3 Thr, 157 Asp, 310 Thr, 318 Gly, 309 Glu, 17 Leu, 111 Trp, 117 Туr, 179 Туr, 118 Leu, 215 Asn, 22 Lys, 290 Val, 289 Gln, 285 Met, 18 Ser, 23 Met, 180 His, 284 Lys, 181 Asn, 209 Met, 210 Leu, 211 Arg, 40 Gly, 81 Pro, 112 Val, 80 Asn, 82 Lys, 88 Asn, 87 Asn скринировали по схеме эксперимента из примера 8.32 GCAT positions from Aeromonas salmonicida (230 Tur, 182 Lys, 3 Thr, 157 Asp, 310 Thr, 318 Gly, 309 Glu, 17 Leu, 111 Trp, 117 Tur, 179 Tur, 118 Leu, 215 Asn, 22 Lys, 290 Val, 289 Gln, 285 Met, 18 Ser, 23 Met, 180 His, 284 Lys, 181 Asn, 209 Met, 210 Leu, 211 Arg, 40 Gly, 81 Pro, 112 Val, 80 Asn, 82 Lys, 88 Asn, 87 Asn was screened according to the experimental scheme of Example 8.

На основании результатов скринирования и трех критериев отбора отобрали следующих мутантов, перечисленных в таблице 1Based on the results of the screening and three selection criteria, the following mutants were selected, listed in table 1

Таблица 1Table 1

ПРИМЕР 10EXAMPLE 10 : Отбор конкретных представляющих интерес аминокислотных областей для внесения мутаций глицерофосфолипид:холестеринацилтрансферазы GCAT из Aeromonas salmonicida : Selection of specific amino acid regions of interest for introducing glycerophospholipid: GCAT cholesterol transferase from Aeromonas salmonicida

На основании сравнения pfam (сравнение 2; фиг.56) и перекрывания модель P10480 и 1IVN выбирали все аминокислоты в областях, окружающих молекулу глицерина в активном центре 1IVN, и использовали для определения областей особенного интереса (петли). (Номера относятся к аминокислотам в зрелой последовательности P10480 (SEQ ID NO:2)):Based on pfam comparison (Comparison 2; FIG. 56) and overlapping, the P10480 and 1IVN models selected all amino acids in the regions surrounding the glycerol molecule in the 1IVN active center and used to determine areas of special interest (loops). (Numbers refer to amino acids in the mature sequence P10480 (SEQ ID NO: 2)):

Thr 20-Arg 41 (Петля 1, L1)Thr 20-Arg 41 (Loop 1, L1)

Ile 77 - Leu 89 (Петля 2, L2)Ile 77 - Leu 89 (Loop 2, L2)

Leu 118 - Asp 127 (Петля 3, L3)Leu 118 - Asp 127 (Loop 3, L3)

Gly 146 - Val 176 (Петля 4, L4)Gly 146 - Val 176 (Loop 4, L4)

Glu 208 - Trp 287 (Петля 5, L5)Glu 208 - Trp 287 (Loop 5, L5)

Промежуточные области (IVR) назвали следующим образом:Intermediate areas (IVR) were named as follows:

Ala 1 - Asp 19 (IVR1)Ala 1 - Asp 19 (IVR1)

Phe 42 - Lys 76 (IVR2)Phe 42 - Lys 76 (IVR2)

Asp 90 - Tyr 117 (IVR3)Asp 90 - Tyr 117 (IVR3)

Ala 128 - Asn 145 (IVR4)Ala 128 - Asn 145 (IVR4)

Ser 177 - Ala 207 (IVR5)Ser 177 - Ala 207 (IVR5)

Asp 288 - His 317 (IVR6)Asp 288 - His 317 (IVR6)

Следующая таблица суммирует распределение предпочтительных положений для внесения мутаций глицерофосфолипид:холестеринацилтрансферазы GCAT из Aeromonas salmonicida. Результаты основаны на экспериментальных схемах, приведенных в примерах 8-10.The following table summarizes the distribution of preferred positions for introducing glycerophospholipid mutations: GCAT cholesterol transferase from Aeromonas salmonicida . The results are based on the experimental schemes given in examples 8-10.

Положения аминокислот в P10480 (SEQ ID NO:2)The positions of amino acids in P10480 (SEQ ID NO: 2) Предпочтительные участки для получения вариантов с повышенным T_DG/T_PC Preferred Plots for Higher T _DG / T _PC Options 10 Е10 E Предпочтительные области для способов по изобретениюPreferred Areas for the Methods of the Invention IVR1IVR1 1-191-19 L17, S18L17, S18 Петля1Loop1 20-4120-41 К22, G40,
Y 30K22, G40,
Y 30 К22, М23, G40K22, M23, G40 Петля 1Loop 1 IVR2IVR2 42-7642-76 Петля 2Loop 2 77-8977-89 N80, N87, N88 N80, N87, N88 N80, P81, K82, N87, N88N80, P81, K82, N87, N88 Петля 2Loop 2 IVR3IVR3 90-11790-117 Y117,
V112,
W111,
A114Y117,
V112,
W111,
A114 W111, V112, A114, Y117W111, V112, A114, Y117 IVR3IVR3 IVR3 и 10А из активного центраIVR3 and 10A from the active center Петля 3Loop 3 118-127118-127 L118L118 IVR4IVR4 128-145128-145 Петля 4Loop 4 146-176146-176 P156P156 IVR5IVR5 177-207177-207 N181,
Q182,
H180,
Y179N181,
Q182,
H180,
Y179 Y179, H180, N181Y179, H180, N181 IVR5IVR5 IVR5 и 10А из активного центраIVR5 and 10A from the active center Петля 5Loop 5 208-287208-287 M209,
L210,
R211,
N215,
Y230M209,
L210,
R211,
N215,
Y230 M209, L210,
R211, N215,
K284, M285,
Q289, V290M209, L210,
R211, N215,
K284, M285,
Q289, V290 Петля 5Loop 5 Петля 5 и 10А из активного центраLoop 5 and 10A from the active center IVR6IVR6 288-317288-317 Q 289,
V290, E309, S310, -318Q 289
V290, E309, S310, -318 IVR6IVR6

Все публикации, указанные в предоставленном выше описании, включены сюда в качестве ссылки. Специалистам в данной области будут очевидны различные модификации и вариации описанных способов и систем по настоящему изобретению без отклонения от области и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано применительно к конкретным предпочтительным вариантам изобретения следует понимать, что заявленное изобретение, не следует излишне ограничивать такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в области биохимии и биотехнологии или связанных областях, должны находиться в пределах объема следующей ниже формулы изобретения.All publications cited in the above description are incorporated herein by reference. Various modifications and variations of the described methods and systems of the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the present invention. Although the present invention has been described with reference to specific preferred embodiments of the invention, it should be understood that the claimed invention should not be unnecessarily limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described methods of carrying out the invention, which are obvious to experts in the field of biochemistry and biotechnology or related fields, should be within the scope of the following claims.

Claims

1. A method of obtaining a variant of the enzyme glycolipid acyltransferase,
which has increased activity against galactolipids, including:
(i) selecting a parent enzyme that is a lipid acyltransferase enzyme, characterized in that the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S;
(ii) modifying one or more amino acids to produce a lipid acyltransferase variant;
(iii) testing a variant of lipid acyltransferase for transferase activity and, optionally, hydrolytic activity against a galactolipid substrate and, optionally, a phospholipid substrate and / or, optionally, a triglyceride substrate;
(iv) selecting a variant of the enzyme with increased activity against galactolipids compared to the starting enzyme and, optionally,
(v) obtaining the required amount of enzyme,
where stage (ii) of the method further comprises one or more of the following stages:
mapping structural homology or comparing sequence homology;
where mapping structural homology includes one or more of the following stages:
a) comparing the original sequence with the structural model P 10480 obtained by structural comparison of the coordinates of the crystal structure of P 10480 with 1IVN.PDB;
b) selection of one or several amino acids within a 10 Å sphere centered on the central carbon atom of a glycerol molecule in the active center;
c) determining whether one or more amino acid residues selected in accordance with step (b) are highly conserved, in particular whether they are active center residues and / or part of the GDSX motif and / or part of the GANDY motif; and a) a modification of one or more amino acids selected in accordance with stage (b), with the exception of the conservative regions identified in accordance with stage (c) in the specified source sequence;
and where the comparison of sequence homology includes one or more of the following steps:
i) selection of a first parent lipid acyltransferase;
ii) identification of a second related lipid acyltransferase with the desired activity;
iii) comparing said first parent lipid acyltransferase and a second related lipid acyltransferase;
iv) identification of amino acid residues that differ in the two sequences;
v) determining whether one or more amino acid residues selected in accordance with step (iv) are highly conserved, in particular whether they are active center residues and / or part of the GDSX motif and / or part of the GANDY motif); and
vi) a modification of one or more of the amino acid residues identified in accordance with stage (iv), with the exception of conservative regions identified in accordance with stage (v) in the specified source sequence, where one or more of the following amino acid residues identified by comparison with the sequence of SEQ ID NO: 2, modified in comparison with the original sequence: Ser3; Leu 17; Lys22; Met23; Gly40; Asn80; Pro81; Lys82; Asn87; Asn88; Trp111; Val112; Ala114; Tyr117; Leu118; Pro156; Gly159; Gln160; Asn161; Pro162; Ser163; Ala164; Arg165; Ser166; Gln167; Lys168; Val169; Val170; Glu171; Ala172; Tyr179; His180; Asn181; Gln182; Met209; Leu210; Arg211; Asn215; Lys284; Met285; Gln289; Val290; Glu309; Ser310; -318; Y30X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; Y226X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; Y230X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; S18X, where X is selected from A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W or Y; D157X, where X is selected from A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W or Y.

2. The method according to claim 1, where stage (iii) includes testing a variant of lipid acyltransferase for:
(a) transferase activity against a galactolipid substrate and
(b) transferase activity against a phospholipid substrate; and step (iv) comprises selecting an enzyme variant which, compared to the starting enzyme, has an increased ratio of transferase activity with respect to galactolipids to transferase activity with respect to phospholipids.

3. The method according to claim 2, where the ratio of transferase activity against galactolipids to transferase activity against phospholipids is at least 3.

4. The method according to claim 1, where stage (iii) includes testing a variant of lipid acyltransferase for:
(a) transferase activity against a galactolipid substrate and
(b) hydrolytic activity against a galactolipid substrate; and step (iv) comprises selecting an enzyme variant with an increased ratio of transferase activity for galactolipids to its hydrolytic activity against galactolipids compared to the starting enzyme.

5. The method according to claim 4, where the increased ratio of transferase activity against galactolipids to hydrolytic activity against galactolipids is at least 1.5.

6. The method according to claim 1, in which the starting enzyme contains the amino acid sequence represented as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 43, or an amino acid sequence that is at least 70% identical to her.

7. The method according to claim 1, where the starting enzyme is an enzyme containing the amino acid sequence represented as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28.

8. The method according to claim 1, in which the starting lipid acyltransferase enzyme encodes any of the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46 or a nucleotide sequence that is at least 75% or more identical to any of the sequences presented as SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46.

9. The method according to claim 1, where X in the GDSX motif is L.

10. The method according to claim 1, comprising modifying one or more of the following amino acid residues: -318; N215; L210; S310; E309; H180; N80; V112; Y30X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; V290; Q289; K22; G40; Y179; M209; R211; P81; N87; Y117; N181; Y230X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; Q182, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

11. The method of claim 10, comprising modifying one or more of the following amino acid residues: -318, N215, L210, E309, H180, N80, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence represented as SEQ ID NO: 2 .

12. The method according to any one of claims 1 to 9, comprising modifying one or more of the following amino acid residues: -318; N215; L210; S310; E309; H180; N80; V112; Y30X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; V290; Q289; K22; G40; Y179; M209; R211; P81; N87; Y117; N181; Y230X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; Q182; S3; K82, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

13. The method according to any one of claims 1 to 9, comprising modifying one or more of the following amino acid residues: Y230X, where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P Q, R, S, T, V or W; S310; Y179; H180; Q289; G40; N88; N87, where the numbering of amino acid residues obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

14. The method according to any one of claims 1 to 9, comprising modifying one or more of the following amino acid residues: Y179; N215; L210; N80; Y30X; where X is selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; N87, where the numbering of amino acid residues obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

15. The method according to any one of claims 1 to 9, comprising modifying one or more of the following amino acid residues: Y179; N215; L210; N80; Y30X, wherein X is specifically selected from A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V or W; N87; H180; M209; R211; S18X, wherein X is specifically selected from A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W or Y; G40; N88; N87, where the numbering of amino acid residues obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

16. A variant of the glycolipid acyltransferase enzyme, characterized in that the enzyme contains the GDSX amino acid motif, where X represents one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S, where the variant has increased activity against galactolipids compared to the original enzyme and where the variant of the enzyme contains one or more modifications of amino acids compared to the original sequence in any one or more of the amino acid residues, S3 E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T or Q;
S18G, M or T;
K22 E or K;
Y30 G, I, L, S, E, M, A or R;
G40 L, R, M, Q or V;
N80 R, D, P, G or E;
K82S;
N87 R, D, E, M, C or G;
N88W;
V112C;
Y117 A, N, E, H or T;
D157C;
Y179V, E, R, N or Q;
H180 T, K, Q or I;
Q182 K, D or T;
M209 Y, L, K or M;
L210 N, D, H, R, E, A, Q, P, K, G, T, W, I, V, S or M;
R211 G, Q, K or D or T;
N215H, L, G, V, R or Y;
Y230 V, I, T, G, R or M;
Q289 R, N, T or D;
V290 R, E, H or A;
E309 S, A, P, Q or R;
S310 Q, H, S, A, P, T, M, K or G;
-318 R, I, S, E, H, Q, N, D or Y
where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

17. A variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to clause 16, wherein the variant enzyme contains an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is represented as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6 : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 , SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 43, for the exception of one or more modifications of amino acids in any one or more of the amino acid residues:
S3 E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T, or Q;
S18 G, M or T;
K22 E or K;
Y30 G, I, L, S, E, M, A or R;
G40 L, R, M, Q or V;
N80 R, D, P, G or E;
K82S;
N87 R, D, E, M, C or G;
N88W;
V112C;
Y117 A, N, E, H or T;
D157C;
Y179 V, E, R, N or Q;
H180 T, K, Q or I;
Q182 K, D or T;
M209 Y, L, K, or M;
L210 N, D, H, R, E, A, Q, P, K, G, T, W, I, V, S or M;
R211 G, Q, K or D or T;
N215H, L, G, V, R or Y;
Y230 V, I, T, G, R or M;
Q289 R, N, T or D;
V290 R, E, H or A;
E309 S, A, P, Q or R;
S310 Q, H, S, A, P, T, M, K or G;
-318 R, I, S, E, H, Q, N, D or Y
where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

18. The variant glycolipid acyltransferase enzyme according to clause 16, wherein the initial lipid acyltransferase enzyme can encode any of the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46, or a nucleotide sequence that is at least 75% or more identical to any of the sequences presented as SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SE Q ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 46.

19. A variant of the glycolipid acyltransferase according to any one of claims 16-18, wherein the enzyme contains one or more modifications of amino acids for any or several of the following amino acids: -318; N215; L210; S310; E309; H180; N80; V112; Y30X; where X is selected from A, E, G, I, L, M, R or S; V290; Q 289; K22; G40; Y179; M209; R211; N87; Y117; Y230X, where X is selected from G, I, M, R, T, or W; Q182, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

20. The variant glycolipid acyltransferase according to claim 19, where the enzyme contains one or more modifications of amino acids for any or several of the following amino acid residues: -318, N215, L210, E309, H180, N80, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference the sequence represented as SEQ ID NO: 2.

21. The glycolipid acyltransferase variant according to any one of claims 16 to 18, wherein the enzyme contains one or more modifications of amino acids for any or several of the following amino acids: -318; N215; L210; S310; E309; H180; N80; V112; Y30X, where X is selected from A, E, G, I, L, M, R or S; V290; Q 289; K22; G40; Y179; M209; R211; N87; Y117; N181; Y230X, where X is selected from G, I, M, R, T, or V; Q182; S3; K82, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

22. The glycolipid acyltransferase variant according to any one of claims 16 to 18, wherein the enzyme contains one or more modifications of amino acids for any or several of the following amino acids: Y230X, where X is selected from G, I, M, R, T or V; S310; Y179; H180; Q289; G40; N88; N87, where the numbering of amino acid residues obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

23. The glycolipid acyltransferase variant of any one of claims 16-18, wherein the enzyme contains one or more modifications of amino acids for any or several of the following amino acids: Y179; N215; L210; N80; Y30X, where X is selected from A, E, G, I, L, M, R or S; N87, where the numbering of amino acid residues obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

24. The glycolipid acyltransferase variant of any one of claims 16-18, wherein the enzyme contains one or more modifications of amino acids for any or several of the following amino acids: Y179; N215; L210; N80; Y30X, wherein X is specifically selected from A, E, G, I, L, M, R or S; N87; H180; M209; R211; S18X, where X is specifically selected from M or T; G40; N88, where the numbering of amino acid residues obtained by comparing the original sequence and the reference sequence presented as SEQ ID NO: 2.

25. The glycolipid acyltransferase enzyme variant according to any one of claims 16-18, wherein the enzyme variant has an increased ratio of galactolipid activity to phospholipid and / or triglyceride activity compared to the starting enzyme.

26. The glycolipid acyltransferase variant according to any one of claims 16 to 18, wherein the enzyme variant has increased galactolipid transferase activity compared to its galactolipid hydrolytic activity compared to the starting enzyme.

27. A variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16-18, wherein the enzyme variant is an enzyme comprising an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is represented as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 28, with the exception of one or more modifications of Ser3 amino acids ; Leu17; Lys22; Met23; Gly40; Asn80; Lys82; Asn87; Asn88; Tyr117; Tyr179; His180; Gln182; Met209; Leu210; Arg211; Asn215; Gln289; Val290; Glu309; Ser310; -318; Y30X, where X is selected from A, E, G, I, L, M, R or S; Y230X, where X is selected from G, I, M, R, T or V; S18X, where X is selected from M or T; or D157, where the numbering of amino acid residues is obtained by comparing the original sequence and the reference sequence represented as SEQ ID NO: 2.

28. The use of a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any of claims 1 to 15 in a substrate for the production of a lysoglycolipid, for example digalactosyl monoglyceride (DGMG) or monogalactosyl monoglyceride (MGMG), for example DGDG) or monogalactosyl diglyceride (MGDG)) a variant of the lipolytic enzyme of the present invention or obtained by the method of the present invention to obtain a partial hydrolysis product, i.e. lysoglycolipid.

29. The use of claim 28, wherein the substrate is a food product.

30. A method of obtaining a food product, where the method comprises adding a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any of claims 1 to 15 to one or more ingredients of the food product.

31. A method for producing a product baked from a dough, wherein the method comprises adding a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16-27 or obtained by the method according to any one of claims 1 to 15 in the dough.

32. The use of a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any of claims 1 to 15 in a method for processing egg or egg-based products to produce lysophospholipids.

33. A method for enzymatically refining vegetable or edible oils, comprising treating edible or vegetable oil with a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any of claims 1 to 15 so as to hydrolyze the bulk of the polar lipids (e.g. phospholipid and / or glycolipid).

34. The use of a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any of claims 1 to 15 in a method for reducing the phospholipid content in edible oil, comprising treating the oil with said lipolytic enzyme variant so as to hydrolyze most of the phospholipids, and separation of the aqueous phase containing hydrolyzed phospholipids from the oil.

35. The use of a variant of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any of claims 1 to 15 for bioconversion of polar lipids (preferably glycolipids) to produce high-value products such as carbohydrate esters and / or esters proteins, and / or esters of protein subunits, and / or esters of hydroxy acids.

36. An immobilized version of the glycolipid acyltransferase enzyme according to any one of claims 16 to 27 or obtained by the method according to any one of claims 1 to 15.