RU2352358C1

RU2352358C1 - Method of preparation of virus-inactivated solutions of immunoglobulins

Info

Publication number: RU2352358C1
Application number: RU2007136861/15A
Authority: RU
Inventors: Наталия Васильевна Зубкова (RU); Наталия Васильевна Зубкова; Валентин Васильевич Анастасиев (RU); Валентин Васильевич Анастасиев; Татьяна Владимировна Короткова (RU); Татьяна Владимировна Короткова
Original assignee: Наталия Васильевна Зубкова; Валентин Васильевич Анастасиев; Татьяна Владимировна Короткова
Priority date: 2007-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2009-04-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention concerns process of obtaining of medical preparations of blood plasma, namely, the method of clearing of preparations of the immunoglobulins received in the industrial way of a spirituous fractionating, from impurity of a dissolvent and a detergent applied at the stage of an additional inactivation of viruses. The given method includes solvent processing and clearing of impurity of virus-inactivated solutions of immunoglobulins. Thus, the solutions are processed using a sterile solvent-detergent admixture in quantity, sufficient for creation of a virus-inactivating dose of reagents in a solution. Clearing of impurity is performed by sedimentation by the solution of the acid with the subsequent extraction of a solvent and a detergent cocoa butter. Oil is preliminary process ad by boilding in a solution of 0.1N a hydrochloric acid, wash out the distilled water and sterilise. Extraction of a solvent and detergent cocoa butter is performed at active hashing at temperature 37-45°C, then an admixture is cooled to 8°C and left for oil hardening then the oil and the formed deposit are removed.

EFFECT: invention allows to improve technologies of obtaining of virus-inactivated solutions of immunoglobulins with the kept physical and chemical properties and specific activity with use of simple techniques safe for the patients.

2 cl, 3 ex, 3 tbl

Description

Предлагаемое изобретение относится к процессу получения лечебных препаратов из плазмы крови, а именно к способу очистки препаратов иммуноглобулинов (IgG, IgM и IgA), получаемых промышленным способом спиртового фракционирования, от примесей растворителя и детергента, применяемого на стадии дополнительной инактивации вирусов.The present invention relates to a process for producing therapeutic preparations from blood plasma, and in particular to a method for purifying immunoglobulins (IgG, IgM and IgA) preparations obtained by the industrial method of alcohol fractionation from solvent and detergent impurities used in the additional virus inactivation stage.

Несмотря на тщательный отбор доноров и скрининговые исследования индивидуальных донаций, использование препаратов, произведенных из плазмы крови, связано с проблемой передачи вирусов. Традиционные схемы спиртового фракционирования и его модификации [Cohn E.J. et all. Preparation and properties of serum and plasma proteii // J.Am Chem Soc. - 1946. - 68. - P.459-475; Onclay J.L. et all. The separation of the antibodies, isoagglutinins, plasminogen and B-lipoprotein into subtractions of human plasma // J.Am Chem Soc.-1949. -71. -P.541-550] существенно снижают риск вирусных трансмиссий. Известно, что в процессе спиртового фракционирования происходит уменьшение концентрации вирусов, однако распределение вирусных частиц по белковым фракциям происходит неравномерно [Yei S., Yu M.W., Tankersley D.L. Partitioning of hepatitis С virus during Cohn-Oncley fraction of plasma // Transfusion. - 1992. - 32(9). - Р.824-828]. Чтобы гарантировать вирусную безопасность, препараты иммуноглобулинов для клинического применения должны быть получены с применением дополнительных стадий обработки, направленных на инактивацию вирусов, но не оказывающих неблагоприятного воздействия на качество продукта. Одним из таких способов является сольвент-детергентная (СД) обработка. В качестве вируцидного раствора обычно используют смесь растворителя трибутилфосфата (ТБФ) с ионными детергентами натрием холатом или натрием дезоксихолатом в конечной концентрации в растворе иммуноглобулина 0,3% и 0,2% соответственно [Horowitz В., Wiebe M.E., Lippin A. Inactivation of viruses in labile blood derivatives // Transfusion. - 1985 - 25(6). - P.516-522]. Можно применять и другие комбинации вирусинактивирующих агентов: 0,3% ТБФ, 1% твин-80; 1% ТБФ, 1% тритон Х-100), а также использовать растворитель без детергентов (2% ТБФ) [Horowitz В., Prince A.M., Horowitz M.S.Viral safety of solvent-detergent treated blood products // Dev Biol Stand. - 1993. - 81. - P.147-161]. В качестве вирусинактивирующих агентов могут использоваться также другие триалкилфосфаты как вместе с детергентом или поверхностно-активным веществом, так и без них.Despite careful selection of donors and screening studies of individual donations, the use of drugs produced from blood plasma is associated with the problem of transmission of viruses. Traditional schemes of alcohol fractionation and its modifications [Cohn E.J. et all. Preparation and properties of serum and plasma proteii // J. Am Chem Soc. - 1946. - 68. - P.459-475; Onclay J.L. et all. The separation of the antibodies, isoagglutinins, plasminogen and B-lipoprotein into subtractions of human plasma // J. Am Chem Soc. -1949. -71. -P.541-550] significantly reduce the risk of viral transmissions. It is known that in the process of alcohol fractionation, a decrease in the concentration of viruses occurs, however, the distribution of viral particles in protein fractions occurs unevenly [Yei S., Yu M.W., Tankersley D.L. Partitioning of hepatitis C virus during Cohn-Oncley fraction of plasma // Transfusion. - 1992 .-- 32 (9). - P.824-828]. To guarantee viral safety, immunoglobulin preparations for clinical use should be obtained using additional processing steps aimed at inactivating viruses, but not adversely affecting product quality. One such method is solvent-detergent (DM) treatment. A mixture of tributyl phosphate (TBP) solvent with ionic detergents sodium cholate or sodium deoxycholate in a final concentration in an immunoglobulin solution of 0.3% and 0.2%, respectively [Horowitz B., Wiebe ME, Lippin A. Inactivation of viruses, is usually used as a virucidal solution. in labile blood derivatives // Transfusion. - 1985 - 25 (6). - P.516-522]. Other combinations of virus-activating agents can be used: 0.3% TBP, 1% tween-80; 1% TBP, 1% Triton X-100), and also use a solvent without detergents (2% TBP) [Horowitz B., Prince A.M., Horowitz M.S. Viral safety of solvent-detergent treated blood products // Dev Biol Stand. - 1993. - 81. - P.147-161]. Other trialkyl phosphates can also be used as virus-inactivating agents, both with or without a detergent or surfactant.

Сольвент-детергентная обработка является признанной и надежной технологией, высокоэффективной против вирусов с липидной оболочкой. В эту категорию попадает большинство клинически значимых вирусов, передающихся при трансфузии, как например, вирусы гепатитов В и С, а также ВИЧ.Solvent-detergent treatment is a recognized and reliable technology that is highly effective against lipid-coated viruses. Most clinically significant viruses transmitted by transfusion, such as hepatitis B and C viruses, as well as HIV, fall into this category.

Преимуществом сольвент-детергентной обработки перед другими технологиями инактивации вирусов является тот факт, что можно добиться таких условий обработки, при которых не повреждается структура белковых молекул. Однако при инактивации вирусов с помощью химических добавок возникает серьезная проблема эффективного удаления последних из растворов. Присутствие остаточных количеств реагентов в препаратах может оказывать негативное воздействие на физико-химические свойства и функциональную активность антител.The advantage of solvent-detergent treatment over other technologies of inactivation of viruses is the fact that it is possible to achieve processing conditions under which the structure of protein molecules is not damaged. However, inactivation of viruses using chemical additives poses a serious problem of the effective removal of the latter from solutions. The presence of residual amounts of reagents in the preparations can have a negative effect on the physicochemical properties and functional activity of antibodies.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу является патент США №5648472 (Gehringer Werner, Selosse Patrick), где описан процесс приготовления вирусинактивированного раствора иммуноглобулина, характеризующийся тем, что иммуноглобулин, обработанный смесью ТБФ и тритона, очищают от примесей путем экстракции реагентов касторовым или соевым маслом, а остаточные количества реагентов удаляют обратнофазовой хроматографией на гидрофобном носителе.The closest technical solution to the proposed method is US patent No. 5648472 (Gehringer Werner, Selosse Patrick), which describes the process of preparing a virus-activated immunoglobulin solution, characterized in that the immunoglobulin treated with a mixture of TBP and triton is purified from impurities by extraction of the reagents with castor or soybean oil and residual amounts of reagents are removed by reverse phase chromatography on a hydrophobic carrier.

Использование касторового или соевого масел нетехнологично. Для удаления последних из растворов необходимы стадия центрифугирования или сепарации на специальных установках. Хроматографическая очистка на гидрофобном носителе усложняет технологический процесс и повышает его стоимость. При этом не улучшается качество очистки от вирусинактивирующих реагентов, а прохождение гидрофильных белков через колонку с гидрофобным носителем может оказать влияние на физико-химические свойства молекул и вызвать повреждение их структуры.The use of castor or soybean oils is not technologically advanced. To remove the latter from solutions, a centrifugation or separation step is necessary in special plants. Chromatographic purification on a hydrophobic medium complicates the process and increases its cost. At the same time, the quality of purification from virus-activating reagents does not improve, and the passage of hydrophilic proteins through a column with a hydrophobic carrier may affect the physicochemical properties of the molecules and cause damage to their structure.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является усовершенствование технологии получения безопасных для пациентов вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов с сохраненными физико-химическими свойствами и специфической активностью.The problem to which the present invention is directed is to improve the technology for obtaining patient-friendly virus-inactivated immunoglobulin solutions with preserved physicochemical properties and specific activity.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения - упрощение способа получения препарата иммуноглобулина и повышение экономичности.The technical result from the use of the present invention is a simplification of the method for producing an immunoglobulin preparation and increased efficiency.

Указанный результат достигается тем, что в способе приготовления вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов, включающих сольвент-детергентную обработку и очистку от примесей вирусинактивирующих реагентов, сольвент-детергентную обработку проводят стерильной сольвент-детергентной смесью в количестве, достаточном для создания вирусинактивирующей дозы реагентов в растворе, а очистку от примесей вирусинактивирующих реагентов проводят путем осаждения раствором кислоты с последующей экстракцией сольвента и детергента растительным маслом с температурой затвердевания не ниже 8°С, например маслом какао, предварительно обработанным раствором соляной кислоты, промытым дистиллированной водой до постоянного значения рН и простерилизованным.The specified result is achieved by the fact that in the method of preparing virus-activated immunoglobulin solutions, including solvent-detergent treatment and purification of impurities of virus-activating reagents, solvent-detergent treatment is carried out with a sterile solvent-detergent mixture in an amount sufficient to create a virus-inactivating dose of reagents in the solution, and purification from impurities of virus-activating reagents are carried out by precipitation with an acid solution followed by extraction of the solvent and the detergent of the plant nym oil with solidification temperature of not lower than 8 ° C, for example cocoa butter pretreated with hydrochloric acid, washed with distilled water until constant pH and sterilized.

Обработку масла какао раствором соляной кислоты проводят при температуре кипения.Cocoa butter is treated with hydrochloric acid at the boiling point.

Сольвент-детергентную обработку проводят при концентрации белка в растворе 2,5-10% при рН 4,5-7,5 в присутствии стабилизатора глицина в концентрации 1,0-3,0% для стабилизации молекул IgG, IgA, IgM.The solvent-detergent treatment is carried out at a protein concentration in solution of 2.5-10% at a pH of 4.5-7.5 in the presence of a glycine stabilizer in a concentration of 1.0-3.0% to stabilize IgG, IgA, IgM molecules.

Экстракцию сольвента и детергента маслом какао проводят при активном перемешивании при повышенной температуре 37-45°С, а затем смесь выдерживают до укрупнения и осаждения мицелл с последующим их удалением из раствора.Extraction of the solvent and detergent with cocoa butter is carried out with active stirring at an elevated temperature of 37-45 ° C, and then the mixture is maintained until the micelles become larger and precipitate, followed by their removal from the solution.

Сущность метода заключается в следующем.The essence of the method is as follows.

Согласно настоящему изобретению в качестве исходного материала для обработки используются фракции, содержащие иммуноглобулины. Конкретными примерами таких фракций являются: фракция II (паста иммуноглобулина G), очищенная от других плазменных белков путем дополнительной стадии спиртового осаждения и диа/ультрафильтрации, а также комплексный иммуноглобулиновый препарат из фракции III, содержащий иммуноглобулины классов G, А, М. При этом можно использовать как свежевыделенные фракции, так и замороженные при низких температурах, предварительно растворив их в воде апирогенной (воде для инъекций) или подходящем буферном растворе. Перед внесением вирусинактивирующих агентов в растворы иммуноглобулинов желательно провести различные предварительные этапы очистки растворов с целью снижения уровня опалесценции и количества агрегатов, которые влияют на вируцидное действие трибутилфосфата и детергентов. При этом процедура обработки растворов иммуноглобулинов не должна изменять структуру белковых молекул, а также изменять их специфическую активность.According to the present invention, fractions containing immunoglobulins are used as starting material for processing. Specific examples of such fractions are: fraction II (immunoglobulin paste G), purified from other plasma proteins by an additional step of alcohol deposition and dia / ultrafiltration, as well as a complex immunoglobulin preparation from fraction III containing immunoglobulins of classes G, A, M. use both freshly isolated fractions and frozen at low temperatures, after dissolving them in pyrogen-free water (water for injection) or in a suitable buffer solution. Before introducing virus-activating agents into immunoglobulin solutions, it is desirable to carry out various preliminary stages of solution purification in order to reduce the level of opalescence and the number of aggregates that affect the virucidal effect of tributyl phosphate and detergents. Moreover, the procedure for processing solutions of immunoglobulins should not change the structure of protein molecules, as well as change their specific activity.

Наиболее предпочтительно для СД-обработки использовать смесь трибутилфосфата (ТБФ) с натрием холатом или натрием дезоксихолатом в конечной концентрации в растворе иммуноглобулина 0,3% и 0,2% соответственно. Это обусловлено тем, что натрия холат и дезоксихолат являются солями желчной кислоты и относятся к категории малотоксичных для человека продуктов. Но можно применять и другие комбинации вирусинактивирующих агентов. Сольвент-детергентную смесь готовят заранее, используя соответствующие реагенты и воду очищенную апирогенную (для инъекций), проводят корректировку рН и стерилизацию стандартным способом. 1 мл готовой сольвент-детергентной смеси должен содержать действующие вещества в таких пропорциях, чтобы при внесении в раствор иммуноглобулина можно было бы получить конечную концентрацию растворителя и детергента, как описано выше.Most preferably, a mixture of tributyl phosphate (TBP) with sodium cholate or sodium deoxycholate in a final concentration of 0.3% and 0.2% in an immunoglobulin solution, respectively, is used for DM treatment. This is due to the fact that sodium cholate and deoxycholate are salts of bile acid and are classified as low toxic products for humans. But other combinations of virus-activating agents can also be used. The solvent-detergent mixture is prepared in advance using appropriate reagents and purified pyrogen-free water (for injection), pH adjustment and sterilization are carried out in a standard way. 1 ml of the finished solvent-detergent mixture should contain the active substances in such proportions that when introduced into the solution of immunoglobulin, it would be possible to obtain a final concentration of solvent and detergent, as described above.

Во время обработки иммуноглобулины должны находиться в водной среде или подходящем буферном растворе при рН от 4,5 до 7,5 при концентрации белка от 2,5 до 10% в присутствии стабилизатора глицина в концентрации 1-3%. Снижение рН среды менее 4,5 приводит к фрагментации IgG, а повышение рН более 7,5 - к агрегации молекул. Снижение концентрации белка менее 2,5% технологически нецелесообразно, а при концентрации белка более 10% возрастают потери иммуноглобулинов на стадиях очистки. Присутствие стабилизатора предохраняет лабильные молекулы иммуноглобулинов G, А, М от повреждающего действия реагентов в процессе обработки. Однако при концентрации глицина менее 1% стабилизирующее действие его ослабляется, а добавление глицина более 3% нецелесообразно из-за отсутствия усиления стабилизирующего эффекта. Раствор иммуноглобулина должен быть стерильным.During processing, the immunoglobulins must be in an aqueous medium or in a suitable buffer solution at a pH of 4.5 to 7.5 at a protein concentration of 2.5 to 10% in the presence of a glycine stabilizer at a concentration of 1-3%. A decrease in pH below 4.5 leads to fragmentation of IgG, and a rise in pH above 7.5 leads to aggregation of molecules. A decrease in protein concentration of less than 2.5% is technologically impractical, and at a protein concentration of more than 10%, the loss of immunoglobulins at the stages of purification increases. The presence of a stabilizer protects the labile molecules of immunoglobulins G, A, M from the damaging effects of the reagents during processing. However, when the concentration of glycine is less than 1%, its stabilizing effect is weakened, and the addition of glycine more than 3% is impractical due to the lack of strengthening of the stabilizing effect. The immunoglobulin solution must be sterile.

При температуре менее 37°С снижается эффективность экстракции реагентов маслом, а при температуре более 45°С повышается риск денатурации белка.At temperatures below 37 ° C, the efficiency of extraction of reagents with oil decreases, and at temperatures above 45 ° C the risk of protein denaturation increases.

К стерильному раствору иммуноглобулина добавляют стерильную сольвент-детергентную смесь в количестве, достаточном для создания вирусинактивирующей концентрации в растворе, например, 0,3% ТБФ и 0,2% натрия холата (натрия дезоксихолата), или 0,3% ТБФ и 1% твина-80, или 1% трибутилфосфата и 1% тритона X-100 и инкубируют смесь стандартным способом с целью инактивации вирусов при температуре 37°С в течение 6 часов. Затем добавляют 0,1 N раствор соляной кислоты до появления белого осадка и фармакопейное масло какао. Масло какао перед добавлением в раствор иммуноглобулина подвергают специальной обработке, которая включает кипячение в растворе 0,1 N соляной кислоты, двух-трехкратную промывку в воде для инъекций до постоянного значения рН промывных вод рН 5,0-7,0 и стерилизацию.A sterile solvent-detergent mixture is added to a sterile immunoglobulin solution in an amount sufficient to create a virus-inactivating concentration in the solution, for example, 0.3% TBP and 0.2% sodium cholate (sodium deoxycholate), or 0.3% TBP and 1% tween -80, or 1% tributyl phosphate and 1% Triton X-100 and incubate the mixture in a standard way to inactivate viruses at 37 ° C for 6 hours. A 0.1 N hydrochloric acid solution is then added until a white precipitate and cocoa butter are found. Cocoa butter before being added to the immunoglobulin solution is subjected to a special treatment, which includes boiling in a solution of 0.1 N hydrochloric acid, two to three times washing in water for injection to a constant pH value of washing water, pH 5.0-7.0, and sterilization.

Стерильное масло какао добавляют в обработанный растворителем и детергентом раствор иммуноглобулина в конечной концентрации 5-10%, предпочтительно 5%, и инкубируют смесь, активно перемешивая, при 37-45°С в течение 30-60 минут, предпочтительно 45 минут, для экстракции в масляную фазу ТБФ и детергентов. Затем раствор охлаждают до 2-8°С и оставляют на 10-500 часов для затвердевания масла, укрупнения мицеллярных структур и выпадения их в осадок. В конце инкубации температуру раствора можно понизить до 1,5-2,0°С, что создает благоприятные условия для лучшего удаления полученного осадка из раствора иммуноглобулина при минимальном снижении концентрации белка. Удаление масла производят на грубых капроновых фильтрах, а осадка - на осветляющих и стерилизующих глубинных фильтрах. При этом полученный раствор должен быть прозрачным и без опалесценции. При наличии опалесценции стерильный раствор необходимо выдерживать дополнительно в течение не менее 48 часов.Sterile cocoa butter is added to a solution of immunoglobulin treated with a solvent and detergent in a final concentration of 5-10%, preferably 5%, and the mixture is incubated, actively mixing, at 37-45 ° C for 30-60 minutes, preferably 45 minutes, for extraction into TBF oil phase and detergents. Then the solution is cooled to 2-8 ° C and left for 10-500 hours to solidify the oil, enlarge the micellar structures and precipitate them. At the end of incubation, the temperature of the solution can be lowered to 1.5-2.0 ° C, which creates favorable conditions for better removal of the obtained precipitate from the immunoglobulin solution with a minimum decrease in protein concentration. Oil removal is carried out on coarse nylon filters, and sediment is removed on clarifying and sterilizing depth filters. In this case, the resulting solution should be transparent and without opalescence. If opalescence is present, the sterile solution must be maintained for an additional period of at least 48 hours.

Окончательную очистку препаратов иммуноглобулинов проводят обычным способом путем диализа против воды для инъекций или соответствующего буфера, ультрафильтрации или спиртового переосаждения. В полученном растворе иммуноглобулинов корректируют содержание белка, рН, добавляют необходимые стабилизаторы. Затем раствор подвергают стерилизующей фильтрации и разливают во флаконы.The final purification of immunoglobulin preparations is carried out in the usual way by dialysis against water for injection or an appropriate buffer, ultrafiltration or alcohol reprecipitation. In the resulting immunoglobulin solution, the protein content and pH are adjusted, and the necessary stabilizers are added. Then the solution is subjected to sterilizing filtration and poured into vials.

Как видно из представленных данных (табл.1, 2), при получении иммуноглобулинов по заявленному способу не выявлено ухудшения физико-химических и биологических свойств препаратов, снижения концентрации антибактериальных и противовирусных антител. Эффективность очистки, которую оценивали по остаточному содержанию ТБФ, как более токсичного по сравнению с натрием холатом реагента, соответствовала необходимым требованиям (менее 2 мкг/мл в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи, 5-е издание) и не уступала качеству других аналогичных препаратов (Octagam 5%, менее 1 мкг/мл). При этом показано (табл.3), что использование предлагаемого способа в отличие от способа-прототипа позволяет получать препарат без образования агрегатов и изменения молекулярного состава.As can be seen from the presented data (Tables 1, 2), upon receipt of immunoglobulins by the claimed method, no deterioration in the physicochemical and biological properties of the preparations, nor a decrease in the concentration of antibacterial and antiviral antibodies were revealed. The cleaning efficiency, which was evaluated by the residual content of TBP, as a more toxic reagent compared with sodium cholate, met the necessary requirements (less than 2 μg / ml in accordance with the requirements of the European Pharmacopoeia, 5th edition) and was not inferior to the quality of other similar preparations (Octagam 5%, less than 1 μg / ml). It was shown (Table 3) that the use of the proposed method, in contrast to the prototype method, allows to obtain the drug without the formation of aggregates and changes in molecular composition.

Пример 1. 5 кг пасты иммуноглобулина G (фракция II), полученной в результате спиртового фракционирования, растворяют в воде для инъекций при рН 6,8-7,2. Нерастворившиеся белки отделяют от иммуноглобулина осветляющей и стерилизующей фильтрацией. Корректируют концентрацию белка до 2,5%, добавляют глицин до конечной концентрации 1%. Полученный раствор иммуноглобулина подвергают стерилизующей фильтрации и используют в дальнейшем для сольвент-детергентной обработки.Example 1. 5 kg of immunoglobulin G paste (fraction II) obtained by alcohol fractionation is dissolved in water for injection at a pH of 6.8-7.2. Insoluble proteins are separated from immunoglobulin by clarifying and sterilizing filtration. The protein concentration is adjusted to 2.5%, glycine is added to a final concentration of 1%. The resulting immunoglobulin solution is subjected to sterilizing filtration and is used subsequently for solvent-detergent treatment.

Готовят сольвент-детергентную смесь, состоящую из ТБФ, натрия холата и воды для инъекций. Указанные компоненты берут в следующих соотношениях: 40 г натрия холата растворяют в 500 мл воды для инъекций, корректируют рН до 7,0±0,1, затем прибавляют 60 г (61 мл) ТБФ, доводят объем до 1000 мл, тщательно перемешивают, дозируют и стерилизуют.A solvent-detergent mixture is prepared consisting of TBP, sodium cholate and water for injection. These components are taken in the following proportions: 40 g of sodium cholate is dissolved in 500 ml of water for injection, pH is adjusted to 7.0 ± 0.1, then 60 g (61 ml) of TBP are added, the volume is adjusted to 1000 ml, mixed thoroughly, dosed and sterilized.

Фармакопейное масло какао кипятят в растворе 0,1 N соляной кислоты в течение 20-30 минут, промывают дистиллированной водой при кипячении до постоянного значения рН промывных вод 5,0-7,0. Масло охлаждают, дозируют по флаконам, укупоривают и стерилизуют.Pharmacopoeia cocoa butter is boiled in a solution of 0.1 N hydrochloric acid for 20-30 minutes, washed with distilled water while boiling to a constant pH value of the wash water from 5.0 to 7.0. The oil is cooled, dispensed in bottles, sealed and sterilized.

В подготовленный раствор иммуноглобулина добавляют сольвент-детергентную смесь из расчета 50 мл/л и инкубируют при 37°С в течение 6 часов при постоянном перемешивании. Затем добавляют соляную кислоту (0,1 N раствор) до появления белого осадка и подготовленное стерильное масло какао до конечной концентрации 5% и инкубируют, активно перемешивая при температуре 37°С в течение 45 минут.A 50 ml / l solvent-detergent mixture is added to the prepared immunoglobulin solution and incubated at 37 ° C for 6 hours with constant stirring. Then add hydrochloric acid (0.1 N solution) until a white precipitate appears and the prepared sterile cocoa butter to a final concentration of 5% and incubate, actively mixing at a temperature of 37 ° C for 45 minutes.

Затем температуру смеси понижают до 8°С и выдерживают стерильный раствор иммуноглобулина в течение 16 часов для укрупнения и выпадения в осадок мицеллярных структур. В последние 1-1,5 часа инкубации температуру понижают до 1,5-2,0°С. Масло какао удаляют механически на капроновых фильтрах, а образовавшийся осадок путем глубинной фильтрации.Then the temperature of the mixture is lowered to 8 ° C and the sterile immunoglobulin solution is maintained for 16 hours to enlarge and precipitate micellar structures. In the last 1-1.5 hours of incubation, the temperature is lowered to 1.5-2.0 ° C. Cocoa butter is removed mechanically on nylon filters, and the precipitate formed by depth filtration.

Контролируют рН и концентрацию белка, разбавляют полученный раствор в 30 раз и подвергают ультрафильтрации на установке с использованием мембран 30 кДа до концентрации белка 7-15%.The pH and concentration of the protein are monitored, the resulting solution is diluted 30 times and ultrafiltered in a plant using 30 kDa membranes to a protein concentration of 7-15%.

Полученный раствор стабилизируют мальтозой до конечной концентрации 8-10%, корректируют рН до 4,0-4,5 и белок до 4,5-5,5%, подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам.The resulting solution is stabilized with maltose to a final concentration of 8-10%, the pH is adjusted to 4.0-4.5 and protein to 4.5-5.5%, sterilized by filtration and poured into vials.

Пример 2. Фракцию II+III растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида в соотношении 1:18. Температуру раствора снижают до 0°С и проводят осаждение этанолом до конечной концентрации 26%, при ионной силе 0,15, рН 6,8-7,2. Температуру снижают до -10°С. Раствор центрифугируют. Полученный осадок растворяют в ацетатном буфере рН 5,25-5,40 с ионной силой до 0,01 в соотношении 1:20. Температуру устанавливают 0°С. В раствор добавляют этанол до конечной концентрации 17%. Температуру раствора снижают до -5°С. Затем раствор центрифугируют. Осадок фракции III используют для получения комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП). В центрифугате устанавливают рН 6,8-7,4, добавляют этанол до концентрации его в растворе 26%. Температуру снижают до -10°С. Затем раствор центрифугируют и получают осадок пасты, фракции II (иммуноглобулина G). 5 кг пасты, растворяют в водном растворе с ионной силой 0,01-0,05 при рН 6,8-7,2 до концентрации белка 10%. Нерастворившиеся белки отделяют от иммуноглобулина осветляющей фильтрацией. Добавляют глицин до концентрации 1% и проводят стерилизующую фильтрацию.Example 2. Fraction II + III is dissolved in a 0.9% sodium chloride solution in a ratio of 1:18. The temperature of the solution is reduced to 0 ° C and ethanol precipitation is carried out to a final concentration of 26%, with an ionic strength of 0.15, pH 6.8-7.2. The temperature is reduced to -10 ° C. The solution is centrifuged. The resulting precipitate was dissolved in acetate buffer pH 5.25-5.40 with an ionic strength of up to 0.01 in a ratio of 1:20. The temperature is set to 0 ° C. Ethanol is added to the solution to a final concentration of 17%. The temperature of the solution is reduced to -5 ° C. Then the solution is centrifuged. The precipitate of fraction III is used to obtain a complex immunoglobulin preparation (CIP). The centrifuge is adjusted to pH 6.8-7.4, ethanol is added to a concentration of 26% in the solution. The temperature is reduced to -10 ° C. Then the solution is centrifuged and a precipitate of paste, fraction II (immunoglobulin G) is obtained. 5 kg of paste, dissolved in an aqueous solution with an ionic strength of 0.01-0.05 at a pH of 6.8-7.2 to a protein concentration of 10%. Insoluble proteins are separated from immunoglobulin by clarification filtration. Glycine is added to a concentration of 1% and sterilizing filtration is carried out.

Добавляют стерильную сольвент-детергентную смесь к раствору иммуноглобулина из расчета 50 мл на литр раствора и инкубируют при 37°С в течение 6 часов.A sterile solvent-detergent mixture is added to the immunoglobulin solution at a rate of 50 ml per liter of solution and incubated at 37 ° C for 6 hours.

Добавляют раствор соляной кислоты (0,1 N) до появления белого осадка и подготовленное стерильное масло какао до конечной концентрации 5% и инкубируют, активно перемешивая при температуре 45°С в течение 45-60 минут. Затем понижают температуру смеси до 2-8°С и удаляют затвердевшее масло.A solution of hydrochloric acid (0.1 N) is added until a white precipitate appears and the prepared sterile cocoa butter to a final concentration of 5% and incubated, actively stirring at a temperature of 45 ° C for 45-60 minutes. Then lower the temperature of the mixture to 2-8 ° C and remove the hardened oil.

Стерильный раствор иммуноглобулина инкубируют при температуре 2-8°С в течение 500 часов для укрупнения и выпадения в осадок мицеллярных структур. Образовавшийся осадок удаляют путем глубинной фильтрации.A sterile immunoglobulin solution is incubated at a temperature of 2-8 ° C for 500 hours to enlarge and precipitate micellar structures. The precipitate formed is removed by depth filtration.

Затем в растворе устанавливают рН 7,0-7,4, ионную силу 0,015, концентрацию этанола 26%, температуру до -10°С. Раствор центрифугируют и выделяют осадок иммуноглобулинов. Осадок иммуноглобулинов растворяют в водном растворе с ионной силой 0,01-0,05 до концентрации белка 1,0-1,5% и подвергают процедуре ультрафильтрации на установке с использованием мембран 30 кДа, белок концентрируют до 10-15%.Then, a pH of 7.0-7.4, an ionic strength of 0.015, an ethanol concentration of 26%, and a temperature of -10 ° C are adjusted in the solution. The solution is centrifuged and an immunoglobulin precipitate is isolated. The precipitate of immunoglobulins is dissolved in an aqueous solution with an ionic strength of 0.01-0.05 to a protein concentration of 1.0-1.5% and subjected to ultrafiltration in an installation using 30 kDa membranes, the protein is concentrated to 10-15%.

Полученный раствор стабилизируют мальтозой до конечной концентрации 10%, корректируют рН до 4,0-4,5 и белок до 9,5-10,5% подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам.The resulting solution is stabilized with maltose to a final concentration of 10%, the pH is adjusted to 4.0-4.5, and the protein is subjected to sterilization filtration to 9.5-10.5% and poured into vials.

Пример 3. 5 кг пасты комплексного иммуноглобулинового препарата, полученного в результате спиртового фракционирования фракции III (Анастасиев В. В., Пискарева Ю.К., Змачинская Т.Е., Крайнева Т.А., Гольговская С.А., Короткова Т.В. Способ получения иммуноглобулинового препарата. Патент на изобретение №2199343. зарегистрирован 27.03.2003) и состоящего в основном из смеси иммуноглобулинов G, А, М, растворяют в водном растворе глицина (концентрация около 3%), рН 4,5-5,5 до концентрации белка 5-6%. Нерастворившиеся белки отделяют от иммуноглобулина осветляющей и стерилизующей фильтрацией. К раствору добавляют стерильную сольвент-детергентную смесь из расчета 50 мл на литр раствора и инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Добавляют раствор соляной кислоты (0,1 N) до появления белого осадка и подготовленное стерильное масло какао до конечной концентрации 5% и инкубируют, активно перемешивая при температуре 37°С в течение 45-60 минут. Затем понижают температуру смеси до 2-8°С, инкубируют смесь в течение 240 часов и удаляют затвердевшее масло. Взвесь отделяют от иммуноглобулина осветляющей и стерилизующей фильтрацией. Раствор препарата разбавляют в 20-30 раз дистиллированной водой апирогенной (водой для инъекций), концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембран 50 кДа до концентрации белка 5-6%. Затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, розлив препарата во флаконы и лиофилизацию.Example 3. 5 kg of paste of an integrated immunoglobulin preparation obtained as a result of alcohol fractionation of fraction III (Anastasiev V.V., Piskareva Yu.K., Zmachinskaya T.E., Kraineva T.A., Golgovskaya S.A., Korotkova T .B. A method for producing an immunoglobulin preparation. Patent for invention No. 2199343, registered on March 27, 2003) and consisting mainly of a mixture of immunoglobulins G, A, M, is dissolved in an aqueous solution of glycine (concentration of about 3%), pH 4.5-5-5 5 to a protein concentration of 5-6%. Insoluble proteins are separated from immunoglobulin by clarifying and sterilizing filtration. A sterile solvent-detergent mixture was added to the solution at the rate of 50 ml per liter of solution and incubated at 37 ° C for 6 hours. A solution of hydrochloric acid (0.1 N) was added until a white precipitate appeared and the prepared sterile cocoa butter to a final concentration of 5% and incubated, stirring vigorously at 37 ° C for 45-60 minutes. Then lower the temperature of the mixture to 2-8 ° C, incubate the mixture for 240 hours and remove the hardened oil. The suspension is separated from the immunoglobulin by clarifying and sterilizing filtration. The solution of the drug is diluted 20-30 times with distilled pyrogen-free water (water for injection), concentrated by ultrafiltration using 50 kDa membranes to a protein concentration of 5-6%. Then, clarifying and sterilizing filtration is carried out, the drug is bottled and lyophilized.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что разработанная технология получения растворов иммуноглобулинов позволяет получать вирусбезопасные препараты с сохраненными физико-химическими и биологическими свойствами, а также специфической активностью. Высокая эффективность очистки достигается простыми технологическими приемами путем осаждения, масляной экстракции при повышенной температуре и выдерживания смеси в прохладном месте с целью укрупнения мицеллярных структур. Очистка проводится без использования дорогостоящих хроматографических сорбентов, благодаря чему упрощается технология получения вирусбезопасных препаратов и повышается экономичность.Thus, on the basis of the data obtained, it can be concluded that the developed technology for the preparation of immunoglobulin solutions allows one to obtain virus-safe preparations with preserved physicochemical and biological properties, as well as specific activity. High cleaning efficiency is achieved by simple technological methods by precipitation, oil extraction at elevated temperatures and keeping the mixture in a cool place in order to enlarge the micellar structures. Purification is carried out without the use of expensive chromatographic sorbents, which simplifies the technology of obtaining virus-safe drugs and increases efficiency.

Таблица 1Table 1 Изменение физико-химических и биологических свойств иммуноглобулина G, полученного по заявленному способу (n=20)The change in the physico-chemical and biological properties of the immunoglobulin G obtained by the claimed method (n = 20) № п/пNo. p / p Наименование показателейThe name of indicators До обработкиBefore processing Готовый препаратFinished product Допустимые содержания по НТДAllowed content on NTD 1one ПрозрачностьTransparency 0,015-0,0270.015-0.027 0,011-0,0210.011-0.021 ОП* не более 0,05OP * not more than 0.05 22 ЦветностьColor 0,001-0,0040.001-0.004 0,001-0,0030.001-0.003 ОП* не более 0,05OP * not more than 0.05 33 Фракционный составFractional composition 2-32-3 22 Дуга преципитации IgG и не более одной дополнительной дугиIgG precipitation arc and not more than one additional arc 4four Антикомплементарная активностьAnti-complementary activity 0,50.5 0,3-0,60.3-0.6 1 мг белка IgG не должен потреблять более 1 ед. (СН₅₀) комплемента1 mg of IgG protein should not consume more than 1 unit. (CH ₅₀ ) complement 55 ТоксичностьToxicity не токсиченnon toxic Должен быть нетоксичнымMust be non-toxic 66 Специфическая активность: -антиальфастафилолизинSpecific Activity: -anti-fastaphylolysin 3МЕ**/мл3ME ** / ml 3МЕ**/мл3ME ** / ml не менее 2 МЕ/млnot less than 2 IU / ml - антитела к вирусу кори- antibodies to measles virus 25ME**/мл25ME ** / ml 25МЕ**/мл25ME ** / ml не менее 25 МЕ/мл
не менее 0,5 ME в 1 гnot less than 25 IU / ml
not less than 0.5 ME in 1 g - антитела к HBsAg- antibodies to HBsAg 6,9-12,7 МЕ/г6.9-12.7 IU / g 7,5-16,6 МЕ/г7.5-16.6 IU / g иммуноглобулинаimmunoglobulin - антитела к вирусу
гепатита А- antibodies to the virus
hepatitis A 43210-69395 мМЕ/мл43210-69395 mIU / ml 42360-95145 мМЕ/мл42360-95145 mIU / ml не нормируетсяnot standardized 77 Остаточное содержание ТБФThe residual content of TBP -- 0,2-0,6 мкг/мл0.2-0.6 mcg / ml менее 2 мкг/млless than 2 mcg / ml ОП* - оптическая плотность; * * ME - Международные единицыOP * is the optical density; * * ME - International units

Таблица 2table 2 Изменение физико-химических и биологических свойств иммуноглобулинового комплексного препарата для энтерального применения (смесь иммуноглобулинов G, А, М), полученного по заявленному способу (n=10)Changes in the physicochemical and biological properties of an immunoglobulin complex preparation for enteral use (a mixture of immunoglobulins G, A, M) obtained by the claimed method (n = 10) № п/пNo. p / p Наименование показателейThe name of indicators До обработкиBefore processing Готовый препаратFinished product Допустимые содержания по НТДAllowed content on NTD 1one РастворимостьSolubility 4 мин4 min 4 мин4 min В 5 мл очищенной воды в течение не более 5 мин.In 5 ml of purified water for no more than 5 minutes. 22 ПрозрачностьTransparency 0,01-0,020.01-0.02 0,01-0,020.01-0.02 ОП* не более 0,05OP * not more than 0.05 33 ЦветностьColor 0,025-,0320.025-, 032 0,015-0,0300.015-0.030 ОП* не более 0,1OP * not more than 0.1 4four Количественное определение quantitation IgG-66,4-68,4%, IgG-66.4-68.4%, IgG-68,5-69,2%, IgG-68.5-69.2%, IgG-50-70%, IgG-50-70%, классовgrades IgA-15,6-16,4%,IgA-15.6-16.4%, IgA-14,2-15,5%,IgA-14.2-15.5%, IgA-15-25%,IgA-15-25%, иммуноглобулиновimmunoglobulins IgM- 15,2-18,0%IgM- 15.2-18.0% IgM-15,3-17,3%IgM-15.3-17.3.3% IgM-15-25%IgM-15-25% 55 ТоксичностьToxicity не токсиченnon toxic не токсиченnon toxic Должен быть нетоксичнымMust be non-toxic 66 Специфическая активность: - титр антител против сальмонелл и шигеллSpecific activity: - titer of antibodies against salmonella and shigella 1:3201: 320 1:3201: 320 Титр антител против сальмонелл и шигелл не менее 1:320A titer of antibodies against salmonella and shigella is not less than 1: 320 77 Остаточное содержание ТБФThe residual content of TBP 00 1,5 мкг/мл1.5 mcg / ml менее 2 мкг/млless than 2 mcg / ml ОП* - оптическая плотность;OP * is the optical density;

Таблица 3Table 3 Изменение молекулярного состава иммуноглобулинов G, полученных по заявляемому способу и прототипуThe change in the molecular composition of immunoglobulins G obtained by the present method and prototype № п/пNo. p / p Способ полученияProduction method СтадияStage Молекулярный состав, %Molecular Composition,% РR полимерыpolymers димерыdimers мономерыmonomers фрагментыfragments 1one заявленный способ (n=20)claimed method (n = 20) до обработкиbefore processing 1,9±0,21.9 ± 0.2 18,7±0,518.7 ± 0.5 78,1±0,478.1 ± 0.4 1,3±0,11.3 ± 0.1 95%95% очищенный препаратpurified preparation 0,9±0,30.9 ± 0.3 13,8±0,613.8 ± 0.6 82,6±0,682.6 ± 0.6 2,7±0,72.7 ± 0.7 95%95% 22 прототип (n=10)prototype (n = 10) До обработкиBefore processing 2,4±0,82.4 ± 0.8 10,6±1,310.6 ± 1.3 85,0±2,285.0 ± 2.2 2,0±0,52.0 ± 0.5 95%95% очищенный препаратpurified preparation 11,6±1,211.6 ± 1.2 12,8±0,912.8 ± 0.9 69,6±1,869.6 ± 1.8 6,0±1,36.0 ± 1.3 95%95%

Claims

1. The method of preparation of virus-activated solutions of immunoglobulins, including solvent-detergent treatment and purification of impurities of virus-activating reagents with vegetable oil, characterized in that the solvent-detergent treatment is carried out with a sterile solvent-detergent mixture in an amount sufficient to create a virus-inactivating dose of reagents in the solution, and cleaning from impurities of virus-activating reagents is carried out by precipitation with an acid solution followed by extraction of the solvent and the detergent of the plant oil with a solidification temperature not lower than 8 ° C, which is used cocoa butter, pre-treated by boiling in a solution of 0.1 N hydrochloric acid, washed with distilled water to a constant pH value of washing water 5.0-7.0 and sterilized, extraction solvent and detergent cocoa butter is carried out with vigorous stirring at a temperature of 37-45 ° C for 30-60 minutes, then the mixture is cooled to 2-8 ° C and left for 10-500 hours to solidify the oil, after which the oil and the precipitate formed are removed .

2. The method according to claim 1, characterized in that the solvent-detergent treatment is carried out at a protein concentration in the solution of 2.5-10% at a pH of 4.5-7.5 in the presence of a glycine stabilizer in a concentration of 1.0-3.0% to stabilize the molecules of IgG, IgA, IgM.