RU2189833C2

RU2189833C2 - Method of immunoglobulin preparation preparing

Info

Publication number: RU2189833C2
Application number: RU2000126310A
Authority: RU
Inventors: А.В. Зорик; В.А. Алешкин; А.Г. Лютов; И.В. Борисова
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2002-09-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: invention relates to protein substance-containing medicinal preparations. Invention is performed by the successive treatment of extract of the precipitate B (fraction III by Cohn's method) with chloroform in concentration from 0.1 to 3% and copper sulfate in concentration from 0.1 to 2% at pH value 6-8. The isolation of the end product is carried out by ultrafiltration method in the presence of chelating compounds. The advantage of the invention involves the enhancement of biological activity of the end product due to increase content of immunoglobulin of class M and decreased content of lipoproteids impurity. EFFECT: improved method of preparing, simplified technological process. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и может быть использовано при получении комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения. The invention relates to medicine, namely to medicines containing protein substances, and can be used to obtain complex immunoglobulin preparation for enteral use.

Препараты, содержащие несколько классов иммуноглобулинов, а именно IgA, IgM, IgG - высокоэффективные средства лечения и профилактики различных инфекционных заболеваний, представляющие собой концентраты антител, опсонизирующая, нейтрализующая и комплементсвязывающая активность которых является основным фактором их клинической эффективности. Preparations containing several classes of immunoglobulins, namely IgA, IgM, IgG, are highly effective agents for the treatment and prevention of various infectious diseases, which are antibody concentrates whose opsonizing, neutralizing and complementing activity is the main factor in their clinical effectiveness.

В настоящее время в мире выпускаются и применяются в клинике иммуноглобулиновые препараты, обогащенные IgM и IgA, для профилактики и лечения тяжелых бактериальных инфекций, сепсиса, иммунодефицитных заболеваний. Такие препараты применяются энтерально, так как энтеральный способ введения имеет ряд преимуществ перед парэнтеральным, а именно простота применения; непосредственная доставка препарата в очаг поражения; возможность увеличения объема вводимого препарата; хорошая переносимость; возможность добавления в пищу. В России таким препаратом является комплексный иммуноглобулиновый препарат, который содержит иммуноглобулины трех основных классов IgA (15-25%), IgM (15-25%), IgG (50-75%)/ФС N 42-3347-97/. Currently, immunoglobulin preparations enriched with IgM and IgA are produced and used in the clinic in the world for the prevention and treatment of severe bacterial infections, sepsis, and immunodeficiency diseases. Such drugs are administered enterally, since the enteral route of administration has several advantages over parenteral administration, namely ease of use; direct delivery of the drug to the lesion; the possibility of increasing the volume of the drug administered; good tolerance; the possibility of adding to food. In Russia, such a drug is a complex immunoglobulin preparation that contains immunoglobulins of the three main classes of IgA (15-25%), IgM (15-25%), IgG (50-75%) / FS N 42-3347-97 /.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата с использованием фосфата кальция и каприловой кислоты с дальнейшей обработкой на DEAE-Sephadex А-50 и бета-пропиолактоном. A known method of obtaining a complex immunoglobulin preparation using calcium phosphate and caprylic acid with further processing on DEAE-Sephadex A-50 and beta-propiolactone.

Такой способ получения является сложным, многостадийным, требующим специализированного оборудования, а его использование возможно в основном только в лабораторных условиях /US 5.075.425/. This method of obtaining is complex, multi-stage, requiring specialized equipment, and its use is possible mainly only in laboratory conditions / US 5.075.425 /.

В 1995 г. был запатентован метод получения иммуноглобулинового препарата, содержащего более чем 5% IgM и 10% IgA, с помощью ионообменной хроматографии /US 5.410.025/. In 1995, a method for obtaining an immunoglobulin preparation containing more than 5% IgM and 10% IgA was patented using ion exchange chromatography / US 5.410.025 /.

Недостатками данного метода являются: низкое содержание IgM и IgA; высокая трудоемкость; возможность использования метода только в лабораторных условиях. The disadvantages of this method are: low IgM and IgA; high labor input; the possibility of using the method only in laboratory conditions.

Существует способ получения иммуноглобулин-обогащенной фракции, содержащей IgG, IgM, IgA с использованием сульфата меди из сыворотки животных. Этот метод позволяет получить только коллоидный раствор, который может быть использован в ветеринарии /US 5.087.695/. There is a method for producing an immunoglobulin-enriched fraction containing IgG, IgM, IgA using copper sulfate from animal serum. This method allows you to get only a colloidal solution, which can be used in veterinary medicine / US 5.087.695 /.

Известен метод получения фракции иммуноглобулинов G, М, А путем непрерывного электрофореза с предварительным спиртовым фракционированием плазмы крови. Он является трудоемким, его проведение возможно только при наличии специального оборудования, а полученный препарат является частично комбинированным /US 4.246.085/. A known method of obtaining a fraction of immunoglobulins G, M, A by continuous electrophoresis with preliminary alcohol fractionation of blood plasma. It is time-consuming, its implementation is possible only with special equipment, and the resulting preparation is partially combined / US 4.246.085 /.

В литературе имеются сведения о получении фракции, содержащей иммуноглобулины А, М и G спиртовым осаждением сыворотки или плазмы крови с последующей обработкой гидроксидом алюминия /Патент DE 2.404.265/. Недостатком этого способа является то, что при фракционировании большая часть иммуноглобулинов удаляется с балластными примесями, а использование гидроoкиси алюминия требует трудоемкой работы по ее удалению из получаемого препарата. Кроме того, фракционирование этанолом оказывает денатурирующее воздействие на белковый раствор и вызывает дополнительную агрегацию иммуноглобулинов. In the literature there is information about obtaining a fraction containing immunoglobulins A, M and G by alcohol precipitation of serum or blood plasma, followed by treatment with aluminum hydroxide / Patent DE 2.404.265 /. The disadvantage of this method is that during fractionation, most of the immunoglobulins are removed with ballast impurities, and the use of aluminum hydroxide requires laborious work to remove it from the resulting preparation. In addition, ethanol fractionation has a denaturing effect on the protein solution and causes additional aggregation of immunoglobulins.

Существует метод получения гамма-глобулиновых препаратов с увеличенным содержанием IgA или IgM из осадка Б /III фракция по Кону/. Метод предусматривает обработку ацетатного экстракта осадка Б раствором соли цинка и этанола с последующим двойным осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем и диализом для удаления солей цинка /US 3.808.189/. There is a method for producing gamma-globulin preparations with an increased content of IgA or IgM from sediment B / III Cohn fraction /. The method involves treating the acetate extract of precipitate B with a solution of zinc and ethanol salts, followed by double precipitation of the immunoglobulin fraction with polyethylene glycol and dialysis to remove zinc salts / US 3.808.189 /.

Препараты, полученные указанным способом, не являются комплексными, так как обогащены только IgM или IgA. The preparations obtained in this way are not complex, since only IgM or IgA are enriched.

Известен способ получения комплексного препарата, содержащего (40-50%) IgG, (15-20%) IgA и (20-25%) IgM (M. Steinbuch, 1973). Препарат получают из осадка Б /III фракция по Кону/ каприлатно-спиртовым фракционированием. Недостатком данного метода является то, что конечный продукт содержит значительную примесь бета-глобулинов, содержание которых превышает 3%, т.е. выше уровня их содержания в обычных препаратах иммуноглобулинов по принятым техническим условиям. A known method for producing a complex preparation containing (40-50%) IgG, (15-20%) IgA and (20-25%) IgM (M. Steinbuch, 1973). The drug is obtained from sediment B / III fraction according to Cohn / caprolate-alcohol fractionation. The disadvantage of this method is that the final product contains a significant admixture of beta-globulins, the content of which exceeds 3%, i.e. above the level of their content in conventional immunoglobulin preparations according to accepted technical conditions.

Следует также отметить, что применение этанола оказывает денатурирующее воздействие на белковый раствор и требует специального оборудования, обеспечивающего возможность работы при минусовых температурах. It should also be noted that the use of ethanol has a denaturing effect on the protein solution and requires special equipment that provides the ability to work at sub-zero temperatures.

Наиболее близким к заявленному является способ получения КИП для энтерального применения /RU 2084229/, включающий получение солевого экстракта из осадка Б /III фракции по Кону/ в 0,9%-ном растворе хлорида натрия (в десятикратном объеме), обработку экстракта хлороформом (конечная концентрация 10%) с целью удаления липопротеидов и последующее осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем (конечная концентрация - 12%). Препарат, полученный по этому способу, содержит (50-75%) IgG, (15-25%) IgA и (15-25%) IgM, в нем обнаружены повышенные титры антител против ряда энтеробактерий и вирусов /ФС N 42-3347-97/. Closest to the claimed is a method of obtaining instrumentation for enteral use / RU 2084229 /, including obtaining a salt extract from a precipitate of B / III fraction according to Cohn / in a 0.9% solution of sodium chloride (in a tenfold volume), treatment of the extract with chloroform (final concentration of 10%) in order to remove lipoproteins and subsequent precipitation of the immunoglobulin fraction with polyethylene glycol (final concentration - 12%). The preparation obtained by this method contains (50-75%) IgG, (15-25%) IgA and (15-25%) IgM, it contains elevated antibody titers against a number of enterobacteria and viruses / FS N 42-3347- 97 /.

Однако комплексный иммуноглобулиновый препарат, получаемый по методу, в котором в качестве основного фракционирующего агента используется хлороформ, экономически невыгоден. Длительная обработка хлороформом иммуноглобулиновой фракции неприемлема, так как приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, снижению титра антител и полимеризации. Необходимо также отметить, что использование хлороформа требует специального оборудования, а высокая концентрация хлороформа оказывает токсическое действие на персонал. Поэтому целесообразно уменьшение концентрации и времени обработки иммуноглобулиновой фракции хлороформом, а при возможности и полная замена данного фракционирующего агента. However, a complex immunoglobulin preparation, obtained by the method in which chloroform is used as the main fractionating agent, is economically disadvantageous. Long-term treatment with chloroform of the immunoglobulin fraction is unacceptable, as it leads to loss of effector functions of immunoglobulins, a decrease in antibody titer and polymerization. It should also be noted that the use of chloroform requires special equipment, and a high concentration of chloroform has a toxic effect on personnel. Therefore, it is advisable to reduce the concentration and processing time of the immunoglobulin fraction with chloroform, and if possible, completely replace this fractionating agent.

Задачей изобретения является повышение биологической активности целевого продукта путем увеличения содержания иммуноглобулина класса М, уменьшения примеси липопротеинов, сокращения времени контакта хлороформа и иммуноглобулинов; упрощение технологического процесса за счет уменьшения действующей концентрации токсичного агента - хлороформа и отсутствия процесса осаждения фракции иммуноглобулинов ПЭГом. The objective of the invention is to increase the biological activity of the target product by increasing the content of class M immunoglobulin, reducing lipoprotein impurities, reducing the contact time of chloroform and immunoglobulins; simplification of the process by reducing the current concentration of a toxic agent - chloroform and the absence of the process of precipitation of the immunoglobulin fraction with PEG.

Поставленная задача осуществляется путем последовательной обработки экстракта осадка Б /III фракция по Кону/ 0,1-3%-ным хлороформом и сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при величине pH 6-8, а выделение целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. The task is carried out by sequential processing of the extract of sediment B / III fraction according to Cohn / 0.1-3% chloroform and copper sulfate in a concentration of 0.1 to 2% at a pH of 6-8, and the selection of the target product is carried out by ultrafiltration in the presence of complexing compounds.

Преимущества предлагаемого способа получения комплексного иммуноглобулинового препарата доказаны в специальной серии экспериментов. The advantages of the proposed method for producing a complex immunoglobulin preparation are proved in a special series of experiments.

Образцы препарата были проанализированы методами электрофореза, иммуноэлектрофореза. Содержание иммуноглобулинов определяли с помощью реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии согласно методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. и соавт., 1984. Количество ионов меди определяли в соответствии с ГФ XI. Определение титра антител против сальмонелл и шигелл осуществляли методом РПГА согласно ФС 422-3347-97. Для определения токсичности препарата использовали 5 белых мышей массой 18-20 г, которым вводили по 0,5 мл раствора препарата внутрижелудочно. Наблюдение за животными вели в течение 5 дней /ФС 42-3347-97/. Содержание общих липидов определяли с помощью "Bio-la-test" Lachema. Samples of the drug were analyzed by electrophoresis, immunoelectrophoresis. The content of immunoglobulins was determined using the precipitation reaction and the method of radial immunodiffusion according to the methodological recommendations of Chernokhvostova EV et al., 1984. The amount of copper ions was determined in accordance with GP XI. Determination of the titer of antibodies against salmonella and shigella was carried out by the method of RPGA according to FS 422-3347-97. To determine the toxicity of the drug used 5 white mice weighing 18-20 g, which were injected with 0.5 ml of a solution of the drug intragastrically. Observation of the animals was carried out for 5 days / FS 42-3347-97 /. The content of total lipids was determined using the "Bio-la-test" Lachema.

Установлено, что активность полученного препарата выше в 2-3 раза по сравнению с прототипом, в нем полностью отсутствуют следы фосгена и полиэтиленгликоля, так как содержание хлороформа снижено при проведении технологического процесса в 5-10 раз и полностью отсутствует полиэтиленгликоль как реагент. Содержание общих липидов в готовом препарате снизилось в 2-3 раза. Введение комплексообразующих соединений, таких как натриeвая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) или тритоном Х-100 позволяет полностью связать и удалить ионы меди, что приводит к повышению стабильности целевого продукта, разрушению возможно присутствующих вирусов. It was found that the activity of the obtained drug is 2-3 times higher compared to the prototype, it completely lacks traces of phosgene and polyethylene glycol, since the chloroform content is reduced by 5-10 times during the process and polyethylene glycol as a reagent is completely absent. The content of total lipids in the finished product decreased by 2-3 times. The introduction of complexing compounds, such as sodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or Triton X-100 allows you to completely bind and remove copper ions, which leads to increased stability of the target product, the destruction of possible viruses.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат получают следующим образом. Осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. После полной экстракции осадка осуществляется осаждение липопротеидов обработкой раствором 0,1-3%-ного хлороформа при перемешивании смеси в течение 5-10 мин. Снижение концентрации хлороформа и уменьшение времени его воздействия позволяет снизить негативные влияния этого агента на иммуноглобулины. A complex immunoglobulin preparation is prepared as follows. Precipitate B was extracted in a ten-fold volume of a 0.9% sodium chloride solution at room temperature with constant stirring. After complete extraction of the precipitate, lipoproteins are precipitated by treatment with a solution of 0.1-3% chloroform with stirring for 5-10 minutes. A decrease in the concentration of chloroform and a decrease in the time of its exposure can reduce the negative effects of this agent on immunoglobulins.

Балластные примеси удаляют методом центрифугирования в режиме 3000-6000 об/мин в течение 15-20 мин. Далее осуществляют обработку фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2% в смеси, рН которой составляет 6-8. Ballast impurities are removed by centrifugation in the mode of 3000-6000 rpm for 15-20 minutes. Next, the fraction of immunoglobulins is treated with copper sulfate with a final concentration of 0.1-2% in a mixture whose pH is 6-8.

Раствор центрифугируют и обрабатывают раствором ЭДТА в конечной концентрации (1-0,2)% для предотвращения влияния экстрагирующих агентов на белок и его стабилизации. Диализ для удаления низкомолекулярных примесей и концентрирования до содержания белка 6% осуществляют методом ультрафильтрации на ультрафильтрационной установке. В концентрат добавляют стабилизаторы, такие как глицин, глюкоза, мальтоза, для восстановления молекулярного биэлектрического слоя иммуноглобулинов, который может быть частично разрушен вследствие химического и физического воздействия. Стабилизированный препарат подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации, сублимационной сушке согласно производственному регламенту на комплексный иммуноглобулиновый препарат, сухой для энтерального применения (КИП) (введен 30 мая 1996 г.). The solution is centrifuged and treated with a solution of EDTA in a final concentration of (1-0.2)% to prevent the effect of extracting agents on the protein and its stabilization. Dialysis to remove low molecular weight impurities and concentrate to a protein content of 6% is carried out by ultrafiltration in an ultrafiltration unit. Stabilizers, such as glycine, glucose, maltose, are added to the concentrate to restore the molecular bioelectric layer of immunoglobulins, which can be partially destroyed due to chemical and physical effects. The stabilized preparation is subjected to clarifying and sterilizing filtration, freeze-drying according to the production schedule for a complex immunoglobulin preparation, dry for enteral use (CIP) (introduced May 30, 1996).

Обоснование выбранных параметров способа
Концентрация хлороформа 0,1-3% выбрана вследствие того, что последовательная обработка экстракта двумя различными осадителями позволяет значительно уменьшить содержание хлороформа в смеси. Диапазон содержания ионов меди в растворе объясняется тем, что при более низкой концентрации сульфата меди в растворе происходит неполное осаждение липопротеидов, при более высокой концентрации - частичная или полная денатурация белка, уменьшение выхода и снижение титра антител.Justification of the selected method parameters
A chloroform concentration of 0.1-3% was selected due to the fact that sequential treatment of the extract with two different precipitants can significantly reduce the chloroform content in the mixture. The range of the content of copper ions in the solution is explained by the fact that at a lower concentration of copper sulfate in the solution, incomplete deposition of lipoproteins occurs, at a higher concentration, partial or complete denaturation of the protein, a decrease in the yield and a decrease in the titer of antibodies.

Анализ качества препарата, проведенный согласно ГФ XI и ФС 42-3347-97 на препарат КИП, доказывает преимущество заявленного способа (см. таблицу). Analysis of the quality of the drug, carried out according to the Global Fund XI and FS 42-3347-97 on the drug KIP, proves the advantage of the claimed method (see table).

Анализ полученных препаратов позволяет выявить преимущества заявляемого способа получения КИП. Так, биологическая специфическая активность препарата была выше в 2 раза по сравнению с прототипом; содержание иммуноглобулина класса М увеличено в 2 раза; содержание общих липидов в готовом продукте более чем в 5 раз меньше по сравнению с прототипом. Analysis of the obtained drugs allows you to identify the advantages of the proposed method for obtaining instrumentation. So, the biological specific activity of the drug was 2 times higher compared to the prototype; the content of class M immunoglobulin is increased 2 times; the content of total lipids in the finished product is more than 5 times less compared to the prototype.

Пример 1. К 400 г спиртового осадка Б (III фракция по Кону) добавляют 4000 мл раствора хлорида натрия с концентрацией 0,9% при постоянном перемешивании. После растворения объем суспензии составляет 4400 мл, а содержание белка 2,2%. Example 1. To 400 g of an alcoholic precipitate B (Cohn III fraction), 4000 ml of a 0.9% sodium chloride solution were added with a constant stirring. After dissolution, the volume of the suspension is 4400 ml, and the protein content is 2.2%.

К суспензии осадка Б добавляют хлороформ до конечной концентрации 1% в суспензии. Смесь перемешивают в течение 10 мин и центрифугируют. To the suspension of sediment B, chloroform is added to a final concentration of 1% in the suspension. The mixture was stirred for 10 minutes and centrifuged.

Объем центрифугата I составляет 3600 мл. The volume of the centrifugate I is 3600 ml.

Центрифугат I титруют до рН 6-8. Centrifugate I is titrated to pH 6-8.

Для более полной очистки иммуноглобулиновой фракции к центрифугату I добавляют сульфат меди до конечной концентрации 0,5% в смеси. Осадок липопротеидов отделяют центрифугированием. Объем центрифугата II составляет 3200 мл. For a more complete purification of the immunoglobulin fraction, copper sulfate is added to the centrifugate I to a final concentration of 0.5% in the mixture. The sediment of lipoproteins is separated by centrifugation. The volume of the centrifugate II is 3200 ml.

Для связывания ионов металла в центрифугат II вводят ЭДТА до конечной концентрации в растворе 0,5%. После этого проводят концентрирование иммуноглобулиновой фракции методом ультрафильтрации до содержания белка 6%. К концентрату добавляют стабилизаторы: глицин 1%, глюкозу 2%. Препарат подвергается осветляющей и стерилизующей фильтрации на мембранах фирмы Millipoer с диаметром пор 0,8-0,45-0,22 нм. To bind metal ions, EDTA is introduced into a centrifugate II to a final concentration in solution of 0.5%. After that, the immunoglobulin fraction is concentrated by ultrafiltration to a protein content of 6%. Stabilizers are added to the concentrate: glycine 1%, glucose 2%. The preparation is subjected to clarifying and sterilizing filtration on Millipoer membranes with a pore diameter of 0.8-0.45-0.22 nm.

Объем полученного препарата составляет 400 мл с концентрацией белка 6,1%. The volume of the preparation obtained is 400 ml with a protein concentration of 6.1%.

Соотношение иммуноглобулинов при этом составляет: IgG - 56%, IgM - 27%, IgA - 27%, титр антител к сальмонеллам и шигеллам - 1:1280, электрофоретическая чистота препарата - 99%. Общее содержание липидов - 0,137 г/л. The ratio of immunoglobulins in this case is: IgG - 56%, IgM - 27%, IgA - 27%, antibody titer to salmonella and shigella - 1: 1280, electrophoretic purity of the drug - 99%. The total lipid content is 0.137 g / l.

Пример 2. 800 г спиртового осадка Б (III фракция по Кону) экстрагировали в растворе хлорида натрия с концентрацией 0,9% в соотношении 1:10. Example 2. 800 g of an alcoholic precipitate B (Cohn III fraction) was extracted in a sodium chloride solution with a concentration of 0.9% in a ratio of 1:10.

После полной экстракции раствор обрабатывался хлороформом в концентрации 0,1% в течение 10-15 мин. After complete extraction, the solution was treated with chloroform at a concentration of 0.1% for 10-15 minutes.

В суспензии установлен рН 7,5, добавлен сульфат меди 2% при постоянном перемешивании в течение 10 мин, методом центрифугирования выделена иммуноглобулиновая фракция. A pH of 7.5 was established in the suspension, copper sulfate 2% was added with constant stirring for 10 min, an immunoglobulin fraction was isolated by centrifugation.

Раствор иммуноглобулиновой фракции обработан тритоном Х-100 с конечной концентрацией 0,01% и раствором ЭДТА конечной концентрацией 1% в смеси, а затем очищен от ионов меди с помощью метода ультрафильтрации и сконцентрирован. The solution of the immunoglobulin fraction was treated with X-100 triton with a final concentration of 0.01% and an EDTA solution with a final concentration of 1% in the mixture, and then purified from copper ions using the ultrafiltration method and concentrated.

Концентрат был стабилизирован мальтозой в конечной концентрации 2%, осветлен, стерилизован и лиофилизирован. The concentrate was stabilized with maltose at a final concentration of 2%, clarified, sterilized and lyophilized.

Полученный препарат имел следующие характеристики. Объем полученного препарата составляет 300 мл с концентрацией белка 6,5%. The resulting preparation had the following characteristics. The volume of the preparation obtained is 300 ml with a protein concentration of 6.5%.

Соотношение иммуноглобулинов при этом составляет IgG 55,15%, IgM 28,45%, IgA 16,5%, активность против сальмонел и шигелл 1:1280, электрофоретическая чистота препарата 98%. Общее содержание липидов 0,308 г/л. The ratio of immunoglobulins in this case is IgG 55.15%, IgM 28.45%, IgA 16.5%, activity against salmonella and shigella 1: 1280, electrophoretic purity of the drug 98%. The total lipid content of 0.308 g / L.

Пример 3. 400 г спиртового осадка Б (III фракция по Кону) экстрагировали в растворе хлорида натрия с концентрацией 0,9% в соотношении 1:10. Example 3. 400 g of alcohol precipitate B (III Cohn fraction) was extracted in a solution of sodium chloride with a concentration of 0.9% in a ratio of 1:10.

После полной экстракции раствор подвергался обработке хлороформом в концентрации 3% в течение 10-15 мин. After complete extraction, the solution was treated with chloroform at a concentration of 3% for 10-15 minutes.

Суспензия отцентрифугирована и разделена на фракции. The suspension is centrifuged and divided into fractions.

К жидкой иммуноглобулиновой фракции добавлен сульфат меди 0,1% при постоянном перемешивании после предварительного титрования рН до 6,5 и методом центрифугирования иммуноглобулиновая фракция очищена от балластных примесей. Copper sulfate 0.1% was added to the liquid immunoglobulin fraction with constant stirring after preliminary titration of the pH to 6.5 and the immunoglobulin fraction was purified from ballast impurities by centrifugation.

Иммуноглобулиновая фракция обработана раствором ЭДТА с конечной концентрацией 1% в смеси, подвергнута ультрафильтрации и концентрированию. The immunoglobulin fraction was treated with an EDTA solution with a final concentration of 1% in the mixture, ultrafiltered and concentrated.

Концентрат стабилизирован глюкозой 2%, осветлен, стерилизован и лиофилизирован. The concentrate is stabilized with glucose 2%, clarified, sterilized and lyophilized.

Полученный препарат имел следующие характеристики. The resulting preparation had the following characteristics.

Объем полученного препарата составляет 350 мл с концентрацией белка 5,8%. Соотношение иммуноглобулинов при этом составляет IgG 52,4%, IgM 30,55%, IgA 18,5%, активность против сальмонелл и шигелл 1:1280, электрофоретическая чистота препарата 97,5%. Общее содержание липидов 0,117 г/л. The volume of the preparation obtained is 350 ml with a protein concentration of 5.8%. The ratio of immunoglobulins in this case is IgG 52.4%, IgM 30.55%, IgA 18.5%, activity against salmonella and shigella 1: 1280, electrophoretic purity of the drug 97.5%. The total lipid content of 0.117 g / L.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. BIBLIOGRAPHY.

RU (11) 2051054 (13) C1
RU (11) 2110279 (13) C1
RU (11) 2060034 (13) С1
RU (11) 93032577 (13) А
RU (11) 2073525 (13) C1
RU (11) 2084229 (13) C1
RU (11) 94025645 (11) А1
RU (11) 95119174 (13) А
US 3.808.189
US 5.075.425
US 5.410.025
US 5.087.695
US 4.246.085
DE 2.404.265
М.: Государственная фармакопея, Медицина, 1968. Х издание.RU (11) 2051054 (13) C1
RU (11) 2110279 (13) C1
RU (11) 2060034 (13) C1
RU (11) 93032577 (13) A
RU (11) 2073525 (13) C1
RU (11) 2084229 (13) C1
RU (11) 94025645 (11) A1
RU (11) 95119174 (13) A
US 3.808.189
US 5.075.425
US 5.410.025
US 5.087.695
US 4.246.085
DE 2.404.265
M.: State Pharmacopoeia, Medicine, 1968. X edition.

Фармакопейная статья на препарат КИП N 42-3347-97. Pharmacopoeia article on the drug KIP N 42-3347-97.

Производственный регламент на комплексный иммуноглобулиновый препарат, сухой для энтерального применения (КИП) (введен 30 мая 1996 г.). Production schedule for a complex immunoglobulin preparation, dry for enteral use (CIP) (introduced May 30, 1996).

Claims

A method for producing a complex immunoglobulin preparation, comprising the step of extracting sediment B (Cohn III fraction) with sodium chloride solution, removing ballast impurities and isolating the target product, characterized in that the ballast impurities are removed by sequential treatment of the extract with chloroform in a concentration of from 0.1 to 3 % and centrifugation, and subsequent processing of the immunoglobulin fraction to remove lipoproteins with copper sulfate in a concentration of from 0.1 to 2% at a pH of 6-8, and the selection of the target product carry out ultrafiltration in the presence of complexing compounds.