RU2350649C2 - Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента - Google Patents
Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента Download PDFInfo
- Publication number
- RU2350649C2 RU2350649C2 RU2006129921/13A RU2006129921A RU2350649C2 RU 2350649 C2 RU2350649 C2 RU 2350649C2 RU 2006129921/13 A RU2006129921/13 A RU 2006129921/13A RU 2006129921 A RU2006129921 A RU 2006129921A RU 2350649 C2 RU2350649 C2 RU 2350649C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- protein
- cells
- differentiation
- receptor
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 138
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 104
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 claims description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 14
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 claims description 8
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 8
- 102000000033 Purinergic Receptors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010080192 Purinergic Receptors Proteins 0.000 claims description 8
- HLXRWTJXGMHOFN-XJSNKYLASA-N Verbenalin Chemical compound O([C@@H]1OC=C([C@H]2C(=O)C[C@H](C)[C@H]21)C(=O)OC)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HLXRWTJXGMHOFN-XJSNKYLASA-N 0.000 claims description 8
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 102100022406 60S ribosomal protein L10a Human genes 0.000 claims description 7
- 102000004315 Forkhead Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000852 Forkhead Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 7
- 102100040903 Gamma-parvin Human genes 0.000 claims description 7
- 101710102444 Gamma-parvin Proteins 0.000 claims description 7
- 101000755323 Homo sapiens 60S ribosomal protein L10a Proteins 0.000 claims description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 101710099785 Ferritin, heavy subunit Proteins 0.000 claims description 6
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 6
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 6
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 6
- 102000011721 Matrix Metalloproteinase 12 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010076501 Matrix Metalloproteinase 12 Proteins 0.000 claims description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 claims description 5
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 claims description 5
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 101000763474 Homo sapiens Transmembrane protein 140 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 5
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108700015928 Mitogen-activated protein kinase 13 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 claims description 5
- 108050008598 Phosphoesterases Proteins 0.000 claims description 5
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 5
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 5
- 102100032420 Protein S100-A9 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710156990 Protein S100-A9 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027030 Transmembrane protein 140 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 102000044166 interleukin-18 binding protein Human genes 0.000 claims description 5
- 108010070145 interleukin-18 binding protein Proteins 0.000 claims description 5
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 5
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710129000 Arginase-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000053028 CD36 Antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 101000969689 Mus musculus Macrophage-expressed gene 1 protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 4
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010084438 Oncogene Protein v-maf Proteins 0.000 claims description 4
- 102000015623 Polynucleotide Adenylyltransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010024055 Polynucleotide adenylyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 4
- HLXRWTJXGMHOFN-UHFFFAOYSA-N Verbenalin Natural products C12C(C)CC(=O)C2C(C(=O)OC)=COC1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HLXRWTJXGMHOFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 4
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 claims description 4
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 4
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003147 reserpine Drugs 0.000 claims description 4
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 108010059841 serine carboxypeptidase Proteins 0.000 claims description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108090000839 GABA-A Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004300 GABA-A Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 101000625256 Homo sapiens Protein Mis18-beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025034 Protein Mis18-beta Human genes 0.000 claims description 3
- 102100032795 Semaphorin-6A Human genes 0.000 claims description 3
- 101710199479 Semaphorin-6A Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000802 Galectin 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022905 Keratin, type II cytoskeletal 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070514 Keratin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 108010085074 Brevican Proteins 0.000 claims 2
- 102100032312 Brevican core protein Human genes 0.000 claims 2
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 claims 2
- 102100022681 40S ribosomal protein S27 Human genes 0.000 claims 1
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 claims 1
- 102000014303 Amyloid beta-Protein Precursor Human genes 0.000 claims 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims 1
- 101000797286 Dictyostelium discoideum Alpha-actinin A Proteins 0.000 claims 1
- 101000678466 Homo sapiens 40S ribosomal protein S27 Proteins 0.000 claims 1
- 101001019502 Homo sapiens Alpha-L-iduronidase Proteins 0.000 claims 1
- 101000659223 Homo sapiens Dual specificity protein kinase TTK Proteins 0.000 claims 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims 1
- 101000984191 Mus musculus Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 3 Proteins 0.000 claims 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000278713 Theora Species 0.000 claims 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims 1
- 108010017007 glucose-regulated proteins Proteins 0.000 claims 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 210000001939 mature NK cell Anatomy 0.000 description 53
- 238000003196 serial analysis of gene expression Methods 0.000 description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 23
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 21
- 102000043296 Lipoprotein lipases Human genes 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 11
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 description 4
- 102000006940 Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases Human genes 0.000 description 4
- 108010072621 Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases Proteins 0.000 description 4
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 description 4
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 4
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 101100181099 Mus musculus Klra1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 4
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 4
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 4
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 4
- 102100024036 Tyrosine-protein kinase Lck Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 4
- 102000023852 carbohydrate binding proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 3
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 description 3
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 3
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010087705 Proto-Oncogene Proteins c-myc Proteins 0.000 description 3
- 102000009092 Proto-Oncogene Proteins c-myc Human genes 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 description 2
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 101100181101 Mus musculus Klra3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 description 2
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 2
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000003509 immature nk cell Anatomy 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010002084 Apoferritins Proteins 0.000 description 1
- 102000000546 Apoferritins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091008927 CC chemokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005674 CCR Receptors Human genes 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100027642 DNA-binding protein inhibitor ID-2 Human genes 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 1
- 101710088213 Forkhead box protein F1 Proteins 0.000 description 1
- 102100020856 Forkhead box protein F1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028685 H(+)/Cl(-) exchange transporter 7 Human genes 0.000 description 1
- 101000766971 Homo sapiens H(+)/Cl(-) exchange transporter 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101150094197 KLRD1 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000823783 Mus musculus Y-box-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000010648 Natural Killer Cell Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108050003978 Semaphorin Proteins 0.000 description 1
- 102000014105 Semaphorin Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 208000024389 cytopenia Diseases 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- VLYUGYAKYZETRF-UHFFFAOYSA-N dihydrolipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC(S)CCS VLYUGYAKYZETRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000000998 lymphohematopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 108091016215 tumor necrosis factor binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E02—HYDRAULIC ENGINEERING; FOUNDATIONS; SOIL SHIFTING
- E02D—FOUNDATIONS; EXCAVATIONS; EMBANKMENTS; UNDERGROUND OR UNDERWATER STRUCTURES
- E02D29/00—Independent underground or underwater structures; Retaining walls
- E02D29/02—Retaining or protecting walls
- E02D29/0225—Retaining or protecting walls comprising retention means in the backfill
- E02D29/0241—Retaining or protecting walls comprising retention means in the backfill the retention means being reinforced earth elements
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E02—HYDRAULIC ENGINEERING; FOUNDATIONS; SOIL SHIFTING
- E02D—FOUNDATIONS; EXCAVATIONS; EMBANKMENTS; UNDERGROUND OR UNDERWATER STRUCTURES
- E02D29/00—Independent underground or underwater structures; Retaining walls
- E02D29/02—Retaining or protecting walls
- E02D29/0258—Retaining or protecting walls characterised by constructional features
- E02D29/0266—Retaining or protecting walls characterised by constructional features made up of preformed elements
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E02—HYDRAULIC ENGINEERING; FOUNDATIONS; SOIL SHIFTING
- E02D—FOUNDATIONS; EXCAVATIONS; EMBANKMENTS; UNDERGROUND OR UNDERWATER STRUCTURES
- E02D29/00—Independent underground or underwater structures; Retaining walls
- E02D29/06—Constructions, or methods of constructing, in water
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E02—HYDRAULIC ENGINEERING; FOUNDATIONS; SOIL SHIFTING
- E02D—FOUNDATIONS; EXCAVATIONS; EMBANKMENTS; UNDERGROUND OR UNDERWATER STRUCTURES
- E02D2600/00—Miscellaneous
- E02D2600/20—Miscellaneous comprising details of connection between elements
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E02—HYDRAULIC ENGINEERING; FOUNDATIONS; SOIL SHIFTING
- E02D—FOUNDATIONS; EXCAVATIONS; EMBANKMENTS; UNDERGROUND OR UNDERWATER STRUCTURES
- E02D2600/00—Miscellaneous
- E02D2600/40—Miscellaneous comprising stabilising elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Paleontology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- Mining & Mineral Resources (AREA)
- Civil Engineering (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описано средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, содержащее в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов. Гены, используемые в изобретении, описаны в материалах заявки. Изобретение позволяет получить новое средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров. 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к средству, регулирующему дифференцировку, содержащему ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента, и к способу скрининга на предмет обнаружения указанного гена.
Предшествующий уровень техники
Стволовые клетки обладают мультипотентностью в плане возможности дифференцировки в клетки тканей различных органов и имеют способность к самообновлению, и они обнаружены у эмбрионов и взрослых. Стволовые клетки обеспечивают дифференцировку клетки в специфическую клетку или орган, так что внимание сфокусировано на возможности применения стволовых клеток для трансплантации органов или клеточной терапии.
Кроветворные стволовые клетки, вид стволовых клеток взрослых, представляют собой клетки, которые могут дифференцироваться в каждый из видов кровеобразующих клеток, например в эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и лимфоциты. Клетки, вовлеченные в иммунную систему, постоянно самообновляются из кроветворных стволовых клеток в костном мозге. Кроветворные стволовые клетки до сих пор использовали для лечения различных заболеваний крови, включая злокачественные опухоли, посредством трансплантации костного мозга. По последним сообщениям, кроветворные стволовые клетки могут дифференцироваться в другие типы клеток, такие как мышечные, нервные, костные, и т.д., в организме экспериментальных животных. Если кроветворные стволовые клетки можно применять в отношении человека, они могут использоваться для лечения различных заболеваний, включая диабет, болезнь Паркинсона, травму спинного мозга и т.д., поскольку они могут успешно заместить другие клетки и органы.
В частности, клетки-природные киллеры (здесь и далее обозначенные как «NK») неспецифично разрушают раковые клетки. Благодаря своей цитотоксичной способности NK-клетки в настоящее время используют для лечения солидной опухоли с использованием LAK (активируемая лимфокинами клетка-киллер) и TIL (инфильтрирующие опухоль лимфоциты) и для иммунотерапии (J Immunol., 1986, 36(10): 3910-3915; Hematologia, 1999, 84: 1110-1149), применяя вливание лимфоцитов донора, что указывает на путь к новой клеточной терапии, направленной на снижение отторжения после транплантации костного мозга или органа. Также сообщали, что дефект в дифференцировке и активации NK-клеток связан с различными заболеваниями, включая рак молочной железы (Breast Cancer Res Treat., 2003, 66(3):255-263), меланому (Melanoma Res., 2003, 13(4):349-356) и рак легких (Lung Cancer, 2002, 35(1):23-18), так что терапия NK-клетками привлекает внимание авторов изобретения в плане лечения указанных заболеваний.
Таким образом, авторы настоящего изобретения идентифицировали новый ген, регулирующий дифференцировку стволовых клеток в NK-клетки, с использованием SAGE (серийного анализа экспрессии генов), и осуществляли данное изобретение, подтверждая то, что дифференцировка NK-клеток регулируется указанным выше геном, и в дальнейшем указанный ген может оказывать большую помощь при лечении заболеваний, включая злокачественные опухоли.
Описание
Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является предоставление средства, регулирующего дифференцировку NK-клеток, содержащего ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента, и способа скрининга на предмет обнаружения указанного гена с использованием SAGE.
Техническое решение
Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры.
Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры.
Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры.
Настоящее изобретение также относится к противораковому средству, разработанному с использованием регулирующего дифференцировку средства по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на предмет гена, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, основанному на SAGE.
Согласно изобретению ген, регулирующий дифференцировку, означает каждый ген, который регулирует дифференцировку их стволовых клеток в клетки-природные киллеры, то есть, такие гены могут ускорять или ингибировать дифференцировку. Более конкретно, регулирующий дифференцировку ген согласно изобретению может ускорять дифференцировку, так что он способствует прогрессу на следующую стадию. Между тем он также может функционировать по поддержанию каждой стадии или ингибируя прогресс на следующую стадию.
Согласно изобретению «SAGE» означает «серийный анализ генной экспрессии». SAGE может выполняться общепринятым способом или по протоколу производителя (InvitrogenТМ life technologies) (http://www. invitrogen. com).
Отметка в квадратных скобках после названия гена означает ID GenBank, подразумевающий последовательность каждого гена, и ID GenBank может быть легко найден и применен специалистами в данной области.
Тип II фермента рестрикции, использованный согласно изобретению, представляет собой общепринятый фермент, широко распространенный в области генной инженерии. Он требует присутствия ионов магния для активации и распознавания конкретной нуклеотидной последовательности ДНК, так что он может расщеплять точно в требуемой области или соседней области от распознаваемой нуклеотидной последовательности. Фермент рестрикции типа II S, применяемый согласно изобретению, означает Nlalll (распознает и расщепляет область CATG каждые 250 пар оснований).
Здесь и далее настоящее изобретение описано подробно.
Настоящее изобретение относится к регулирующему дифференцировку средству для клеток-природных киллеров, которое характеризуется тем, что оно содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573), пре-про-протеиназы 3 (U97073), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449), кислого кератинового комплекса 1, гена 13 (NM_010662), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966), гамма-парвина (ВС011200), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744), белка c-myc (Х01023), рибосомного белка L10A (АК002613) , гена Oct 2b (Х53654), микролита (АК015601), дигидролипоамиддегидрогеназы (ВС003368), трикла (U81030), лизоцима (ВС002069), цепи Н ферритина (ВС012314), бревикана (Х87096), матриксной металлопротеиназы 12 (ВС019135), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524), S100 кальций-связывающего белка А9 (ВС027635), белка MPS1 (L20315), трансглутаминазы 2 (ВС016492), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639), кДНК RIKEN 5830413L19 (ВС027496), индуцируемого интерфероном белка (ВС003804), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172), аргиназы 1 (ВС050005), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052), гомолога FLJ11000 (ВС023802), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803), канала ионов хлора 7 (АК009435), антигена CD36 (ВС010262), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186), связывающего углевод белка 35 (J03723), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218), липопротеинлипазы (NM_008509), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256), рецептор интерлейкина 7 (NM_008372), рецептора хемокина (С-С) 1 (ВС011092), нейрофиллина (MGDIMGI: 106206) (АК002673), серпина A3G (ХМ-127137), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986), LAPTm5 (U51239), регулятора сигнала G-белка (ВС049968), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366), белка Y-бокса 3 (АК019465), предшественника остеопонтина (J04806), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM_009480), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM_146714), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056), ингибитора рака остеокластов (АВ013898), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872), актинсвязывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВС015245), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001) , гамма-цепи Т-клеточного рецептора (X03802), поли-А-полимеразы альфа (NM_011112), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825) и аналога митоген-активируемой протеинкиназы 1 (ВС006708).
Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры, которое характеризуется тем, что содержит один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573), пре-про-протеиназы 3 (U97073), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449), гена 13 кислого комплекса кератина 1 (NM_010662), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966), гамма-парвина (ВС011200), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744), белка c-myc (Х01023), рибосомного белка L10A (АК002613), гена Oct 2b (X53654), микролита (АК015601), дигидролипоамиддегидрогеназы (ВС003368) и тракла (U81030), в качестве эффективного ингредиента.
Настоящее изобретение далее относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры, которое характеризуется тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из лизоцима (ВС002069), цепи ферритина Н (ВС012314), бревикана (Х87096), матриксной металлопротеиназы 12 (BC019135), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635), белка MPS1 (L20315), трансглутаминазы 2 (BC016492), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496), индуцируемого интерфероном белка (BC003804), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (BC018577), гликопротеина клеточной поверхности p91 (U83172), аргиназы 1 (BC050005), рецептора фактора некроза опухолей 1 (M59378), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052), гомолога FLJ11000 (BC023802), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803), канала ионов хлора 7 (AK009435), антигена CD36 (BC010262), гомолога белка цинковых пальцев (BC030186), связывающего углевод белка 35 (J03723), кальций-зависимого углевода C-типа (BC003218), липопротеинлипазы (NM_008509), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (BC038256), рецептор интерлейкина 7 (NM_008372), рецептора хемокина (C-C) 1 (BC011092) и нейрофиллина (MGD|MGI: 106206).
Настоящее изобретение далее относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку зрелых клеток-природных киллеров, которое характеризуется тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из серпина A3G (XM_127137), субъединицы 6 рецептора GABA-A (X51986), LAPTm5 (U51239), регулятора сигнала G-белка (BC049968), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366), белка Y-бокса 3 (AK019465), предшественника остеопонтина (J04806), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM009480), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM_46714), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056), ингибитора рака остеокластов (АВ013898), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872), актин-связывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВС015245), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802), поли-А-полимеразы альфа (NM_011112), родственного ОРА белка-аналога 0IP5 (АК017825) и аналога митоген-активируемой протеинкиназы 1 (ВС006708).
Ген, входящий в состав регулирующего дифференцировку средства согласно изобретению, имеет функции: 1) регуляции дифференцировки из стволовых клеток в ранние NK-клетки, 2) регуляции дифференцировки из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, и 3) регуляции дифференцировки зрелых NK-клеток, и регулирующий дифференцировку ген, функционирующий на каждой стадии, может независимо применяться в качестве средства, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в NK-клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дифференцировку из стволовых клеток в ранние NK-клетки и в зрелые NK-клетки индуцируют культивированием HSC клеток с обработкой цитокином (фиг.1a - фиг.1c). С каждой стадии выделяли цельную РНК и проводили SAGE, как показано на схематичной диаграмме фиг.2. Посредством SAGE на каждой стадии дифференцировки выделяли гены, характеризовавшиеся специфичным повышением экспрессии (фиг.3a - фиг.3f). Данные гены сравнивали с другими, находящимися в GenBank. В результате данные гены не соответствовали тем, о которых сообщалось, что они имеют функцию регуляции дифференцировки из стволовых клеток в pNK-клетки (см. таблицу 3), из pNK-клеток в mNK-клетки (см. таблицу 4) и mNK-клеток (см. таблицу 5).
Поэтому гены согласно изобретению являются новой находкой, предоставляющей новый механизм дифференцировки, и фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько таких генов, могут использоваться для регуляции дифференцировки клеток. В частности, регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку из стволовых клеток в ранние NK-клетки, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 3, и также регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 4. Регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку зрелых NK-клеток, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 5. Все гены, перечисленные в таблице 3, 4 и 5, имеют функции регуляции дифференцировки из стволовых клеток в NK-клетки, так что регулирующее дифференцировку средство, которые регулирует дифференцировку клеток-природных киллеров, может быть получено с использованием одного или нескольких указанных выше генов.
Средство, регулирующее дифференцировку клеток, согласно изобретению может также использоваться для лечения злокачественных опухолей. Регулирующее дифференцировку средство согласно изобретению, предпочтительно, может использоваться для лечения таких злокачественных опухолей, как рак молочной железы, меланома и рак легких. Дефекты дифференцировки и активации NK-клеток приводят к различным злокачественным опухолям, например, к раку молочной железы (Breast Cancer Res Treat., 2003, 66(3):255-263), меланоме (Melanoma Res., 2003, 13 (4):349-356) и раку легких (Lung Cancer, 2002, 35(1):23-18). Таким образом, указанные злокачественные опухоли можно эффективно лечить путем регуляции дифференцировки NK-клеток регулирующим дифференцировку NK-клеток средством согласно изобретению. Регулирующее клеточную дифференцировку средство согласно изобретению может вводиться орально или парентерально и применяться в основных формах фармацевтического препарата. Регулирующее клеточную дифференцировку средство согласно изобретению может быть подготовлено для орального или парентерального введения путем смешивания с обычно используемыми наполнителями, связующими средствами, увлажняющими средствами, дезинтегрирующими средствами, растворителями, такими как поверхностно-активное вещество, или с наполнителями. Твердые препараты для орального введения представляют собой таблетки, пилюли, порошки, гранулы и капсулы. Данные твердые препараты получают смешиванием с одним или несколькими подходящими наполнителями, такими как крахмал, карбонат кальция, сахароза или лактоза, желатин и т.д. Кроме простых наполнителей, могут использоваться смазки, например стеарат магния, тальк, и т.д. Жидкие препараты для орального введения представляют собой суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, и указанные выше препараты могут содержать различные наполнители, такие как увлажняющие средства, подсластители, ароматизаторы, и консерванты в дополнение к обычно применяемым простым растворителям, таким как вода и жидкий парафин. Препараты для парентерально введения представляют собой стерилизованные водные растворы, нерастворимые в воде наполнители, суспензии, эмульсии и суппозитории. Нерастворимые в воде наполнители и суспензии могут содержать, в дополнение к активному соединению или соединениям, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растворимое масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолат, и т.д. Суппозитории могут содержать, в дополнение к активному соединению или соединениям, witepsol, macrogol, tween 61, масло какао, лауриновое масло, глицерин, желатин, и т.д.
Эффективная дозировка средства согласно изобретению составляет 0,1-0,2 мг/кг, и предпочтительно 0,15 мг/кг. Время введения средства согласно изобретению может представлять собой от одного до трех раз в сутки.
Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на предмет гена, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, включающего следующие стадии:
1) синтеза кДНК после выделения из клеток цельной РНК;
2) выделения метки после расщепления кДНК стадии 1;
3) связывания каждой метки, выделенной на стадии 2, и последующего анализа ее нуклеотидной последовательности; и
4) количественного анализа экспрессии гена, основанного на проанализированной выше последовательности нуклеотидов, с использованием программы анализа SAGE.
На стадии 1 клетки предпочтительно отбирают с каждой стадии дифференцировки из стволовых клеток в клетки-природные киллеры. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кроветворные стволовые клетки (HSC) применяют в качестве стволовых клеток, и ранние клетки-природные киллеры и зрелые клетки-природные киллеры применяли в качестве клеток-природных киллеров.
Может использоваться любой общепринятый способ, если только с его помощью можно выделить цельную РНК из образца с высоким выходом и с предотвращением контаминации РНКазами (Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning). В общем, для выделения РНК с использованием средства выделения РНК проще всего следовать протоколу производителя. Для синтеза кДНК с цельной РНК к цельной РНК присоединяют олиго-dT-праймер, но это не единственный способ синтеза кДНК, и может использоваться любой другой способ синтеза кДНК. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения олиго-dT-праймер присоединяют к цельной РНК для синтеза кДНК, и в то же время олиго-dT-праймер должен встроить поли-A-последовательность для синтеза мРНК. Предпочтительно, чтобы в олиго-dT-праймере повторялись последовательности из 20-30 T. И также допустимо, что к одному из концов олиго-dT-праймера присоединялись магнитные гранулы, поскольку так метка может успешно выделяться без контаминации с использованием магнитных гранул.
На стадии 2 процесс отделения метки после расщепления кДНК состоит из следующих стадий:
a) получения метки путем расщепления кДНК ферментом рестрикции типа IIS 1;
b) соединения двух видов адаптеров, каждый из которых включает в себя участок распознавания фермента рестрикции типа IIS 1, в одном конечном участке связывания метки, полученной на стадии a;
c) выделения метки путем отщепления метки, связанной с адаптером на стадии b посредством фермента рестрикции типа IIS 2, и отщепления магнитных гранул с олиго-dT от метки;
d) получения двойной метки путем соединения друг с другом меток, полученных на стадии c; и
e) получения только двойной метки путем расщепления двойной метки, полученной на стадии d, ферментом рестрикции типа IIS 1 и отщепления адаптера.
На стадии a синтезированную кДНК расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 1 по той причине, что участок расщепления данным ферментом, мог быть получен в виде участка связывания метки, и фактически было легко применять данную область для связывания с меткой, поскольку участок расщепления образовывал 5'-концевые свисания. В качестве фермента рестрикции типа IIS 1 возможно применение любого подходящего фермента, и предпочтителен фермент рестрикции NlaIII. Причиной для этого является то, что кДНК имеет участки распознавания ферментом рестрикции NlaIII каждые 250 п.н., так что регулярно расположенная метка может быть легко получена расщеплением кДНК данным ферментом.
На стадии b два вида адаптеров, подлежащие соединению с участком расщепления метки, имеют последовательности длиной примерно 40 п.н., которые комплементарно связанных друг с другом. Адаптеры включают в себя участок распознавания ферментом рестрикции NlaIII (CATG) с одного конца, с которым связана метка и образуют свисания, которые упрощают связывание метки.
На стадии c метку, связанную с адаптером, расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 2. Фермент рестрикции типа IIS 2 связан с участком фермента рестрикции адаптера для расщепления области, расположенной в 10-14 п.н. ниже участка расщепления фермента рестрикции, что приводило к отделению метки длиной примерно 50 п.н., содержащей конец размером 4 п.н., свисающий с 5′-конца. В качестве фермента рестрикции типа IIS 2 предпочтительно применяли BsmFI.
На стадии d метки соединяли друг с другом с образованием двойной метки. Точнее, образовывали свисающий конец на каждом 5'-конце меток, так что двойная метка могла легко образоваться соединением данных концов. Полученная в результате двойная метка составляла примерно 100 п.н. в длину.
На стадии e двойную метку расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 1 для отщепления адаптера, что приводило только к образованию чистой двойной метки. Точнее, область связывания, в которой соединялись конец метки и адаптер, содержала участок распознавания фермента рестрикции типа IIS, так что адаптер мог отщепляться с использованием фермента рестрикции типа IIS 1. В результате получали чистую двойную метку длиной примерно 26 п.н.
Между тем на стадии 3, 10-20 фрагментов-меток, полученных на стадии 2, связывали, и исследовали их нуклеотидную последовательность. И процесс исследования состоял из следующих стадий:
a) клонирование двойной метки типа конкатемера, полученной путем связывания двойных меток, полученных на стадии 2, в вектор; и
b) исследование нуклеотидной последовательности метки вектора, использованного для клонирования на стадии a.
На стадии a двойные метки связывали с образованием конкатемера. Точнее, оба конца двойной метки включали в себя участок распознавания ферментом рестрикции типа IIS 1, что указывало на возможность образования свисания. Такие двойные метки могут легко связываться, и так примерно 20-50 меток соединяли с образованием конкатемера. Полученную метку типа конкатемера встраивали в обычный вектор для клонирования с целью исследования нуклеотидной ее последовательности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для клонирования применяли вектор pZerO-1. Указанный экспрессирующий вектор включен в набор (Invitrogen Life Science), предоставленный для анализа SAGE, и он очень удобен.
На стадии 4 экспрессию подвергали количественному анализу, полученному путем исследования нуклеотидной последовательности, полученной выше, посредством программы анализа SAGE. Точнее, полученную нуклеотидную последовательность сравнивали с другими последовательностями генов, которые находятся в GenBank, для их идентификации. Затем программу анализа SAGE использовали для классификации последовательностей с высоким уровнем экспрессии и с низким уровнем экспрессии. Их отмечали красным, желтым, зеленым и синим цветом после кластеризации, что ясно показывало уровень экспрессии. И уровень экспрессии может оцениваться численным значением. Программа анализа SAGE может предоставляться компанией или являться одной из программ, предоставляемых через Интернет.Согласно изобретению применяли обычную программу (компьютерная программа кластеризации и построения «деревьев», http://rana.lbl.gov), широко используемую для кластеризации результатов SAGE.
Способ скрининга согласно изобретению основан на анализе SAGE. Каждую стадию способа проводили, отдавая предпочтение обычному анализу SAGE, или ее могли проводить модифицированными способами по инструкции производителя. План способа согласно изобретению показан на схематической диаграмме фиг.2.
Описание фигур
На фиг.1a - фиг.1c показано сравнение экспрессии поверхностных молекул в процессе дифференцировки из кроветворных стволовых клеток мыши (HSC) через ранние NK-клетки (pNK) в зрелые NK-клетки (mNK) в присутствии (+OP9) или в отсутствие (-OP9) интерстициальных клеток OP9.
Фиг.1a представляет собой набор графиков, на которых показана чистота клеток на каждой стадии дифференцировки NK-клеток, что представлено двумя разными цветами и определено путем проточной цитометрии. Числа в каждом квадранте указывают на процент соответствующих клеток.
Lin-c-kit+:(96%), CD122+NK1.1-: (95%),
CD122+NK1.1+: (94%, 95% соответственно)
Фиг.1b представляет собой набор графиков, на которых показана экспрессия связанных с NK-клетками поверхностных маркеров (NK1.1, DX5, CD94, NKG2A), индуцированных во время дифференцировки из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, причем в культуру добавляли интерстициальные клетки OP9.
Фиг.1c представляет собой набор фотографий, на которых показаны результаты ОТ-ПЦР. Цельную цитоплазматическую РНК выделяли из клеток на каждой стадии дифференцировки NK-клеток для исследования того, экспрессировались ли CD122, представительно связанных с NK-клетками генов, и перфорин.
Фиг.2 представляет собой схематичную диаграмму, на которой показан процесс SAGE для выявления регулирующего дифференцировку гена согласно изобретению.
На фиг.3a - фиг.3f показана кластеризация профиля генной экспрессии, полученного во время дифференцировки NK-клеток, путем анализа SAGE.
На фиг.3a показана группа генов, наиболее экспрессированных в HSC-клетках, фиг.3b представляет группу генов, наиболее экспрессированных в pNK-клетках, на фиг.3c показана группа генов, наиболее экспрессированных в mNK(-OP9)-клетках, и фиг.3d представляет группу генов, наиболее экспрессированных в mNK(+OP9)-клетках.
На фиг.3e показаны гены, ингибирующие активацию NK-клеток, и на фиг.3f показаны гены, способствующие активации NK-клеток.
На описанных выше фиг.3a - фиг.3f в кластеризации, основанной на анализе SAGE, когда частота кластера превышала 80, его маркировали красным, когда частота составляла 50-79, его маркировали желтым, когда частота составляла 30-49, его маркировали зеленым, а когда частота была ниже 29, его маркировали синим.
На фиг.4a - фиг.4d показаны результаты ОТ-ПЦР для исследования того, действительно ли экспрессируется ген, который, по данным SAGE, регулировал дифференцировку NK-клеток. Экспрессию подвергали количественному анализу по сравнению с контрольным геном бета-актина.
На фиг.4a показаны гены, специфично экспрессированные в HSC-клетках во время дифференцировки NK-клеток, фиг.4b представляет гены, специфично экспрессированные в pNK-клетках, на фиг.4c показаны гены, специфично экспрессированные в mNK-клетках, и на фиг.4d показано, как NK-клетки обрабатывали LPL в разных концентрациях (250 нг/мл и 500 нг/мл) для исследования эффекта LPL на дифференцировку NK-клеток, и в результате обеспечивалась дифференцировка в mNK-клетки.
Способ изобретения
Практические и предпочтительные в настоящее время варианты осуществления настоящего изобретения иллюстрируются следующими примерами.
Однако, понятно, что специалисты в данной области при рассмотрении данного описания могут сделать модификации и улучшения по сущности и в объеме настоящего изобретения.
Пример 1. Выделение стволовых клеток из костного мозга
Все кости, включая большеберцовые и бедренные кости, мыши C57BL/6 (Dae Han Biolink), в возрасте 6-9 недель, пульверизовали. Пульверизованные кусочки пропускали через 70-микронный клеточный фильтр, и эритроциты удаляли обработкой раствором для лизиса (Sigma, St.Louse, Миссури) для получения одних клеток костного мозга. Клетки костного мозга взаимодействовали с антителами-маркерами, меченными биотином, на предмет системных маркеров (CD11b: маркер макрофагов, Gr-1: маркер гранулоцитов, B220: маркер B-клеток, NK1.1: маркер NK-клеток, CD2: маркер T-клеток, TER-119: маркер эритроцитов), с последующей промывкой. Затем клетки взаимодействовали с меченными стрептавидином магнитными гранулами (Miltenyi Biotec, Auburn, Калифорния). Магнитно-меченные клетки Lin+выделяли пропусканием через колонку CS (Miltenyi Biotec) в магнитном поле MACS (Miltenyi Biotec). Остальные Lin-, пропущенные через колонку, взаимодействовали с магнитными гранулами, связанными с c-kit, и затем их пропускали через колонку MACS (Miltenyi Biotec), что приводило к задержке c-kit+клеток на колонке. Чистоту полученных Lin- c-kit+кроветворных стволовых клеток (обозначенных здесь и далее как “HSC-клетки”) измеряли путем FACS (BD Bioscience, Mountainview, Калифорния). В результате подтверждали, что клетки характеризовались чистотой свыше 96%.
Пример 2. Индукция дифференцировки из стволовых клеток в NK-клетки
HSC-клетки, выделенные из костного мозга в примере 1, в полной среде RPMI, дополненной мышиным SCF (30 нг/мл, BioSource, Camarillo, Калифорния), мышиным Flt3L (50 нг/мл, PeproTech, Rocky Hill, Нью-Джерси), мышиным IL-7 (0,5 нг/мл, PeproTech), индометацином (2 мкг/мл, Sigma), гентамицином (20 мкг/мл) и 10% фетальной сывороткой теленка, инокулировали в 6-луночный планшет (Falcon) в концентрации 2×106 клеток/лунку. Клетки культивировали при 37°C, 5% CO2 в инкубаторе в течение 6 суток. После 3 суток культивирования половину надосадочной жидкости отбрасывали и добавляли свежую среду, дополненную цитокинами в той же композиции, как указано выше. Через 6 суток CD122+ранние NK-клетки (обозначенные здесь и далее как “pNK-клетки”) отделяли посредством MACS с использованием меченного FITC антитела против CD122 и магнитных гранул, конъюгированных с антителом против FITC. Чистоту ранних NK-клеток измеряли путем FACS и в результате подтверждали, что клетки имели чистоту свыше 92%.
Для индукции дифференцировки в зрелые NK-клетки (обозначенные здесь и далее как mNK-клетки), HSC-клетки получали через 6 суток из культуры и затем культивировали их отдельно или со стромальными клетками OP9 (Science 1994, 265 (5175):1098-1101; Nakano T, Kodama H, Honjo T.: Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture) в присутствии мышиного IL-15 (20 нг/мл, PeproTech). Через 3 суток половину среды заменяли свежей с той же композицией. На 12 сутки NK1.1+клетки отделяли с использованием меченного FITC антитела против NK1.1 и магнитных гранул, конъюгированных с антителом против FITC. Зрелые NK-клетки исследовали путем проточной цитометрии с использованием антител против CD122, NK1.1, DX5 и антител против NK-клеточного рецептора.
Пример 3. Исследование фенотипа очищенных NK-клеток, специфичного в отношении стадий дифференцировки
Для сбора специфичных NK-клеток с каждой стадии дифференцировки Lin-c-kit+HSC (>95%) клетки, выделенные из костного мозга мыши, культивировали в присутствии SCF, Fit-3L и IL-7 в течение 6 суток. Затем CD122+pNK-клетки выделяли и анализировали путем проточной цитометрии. В случае mNK-клеток (-OP9 или+OP9) IL-15 клетки культивировали отдельно или со стромальными клетками OP9 в течение еще одних 6 суток. Полученные клетки анализировали путем проточной цитометрии (фиг.1a). Когда клетки культивировали вместе со стромальными клетками OP9, число mNK-клеток повышалось (-OP9; 94% и+OP9;>95%). Рецепторы Ly49 на поверхности mNK-клеток играют важную роль в функционировании mNK-клеток, и их экспрессия регулируется путем трансдукции сигнала за счет коммуникации с другими иммунными клетками. Для подтверждения того, является ли совместное культивирование HSC-клеток, происходящих из костного мозга и стромальных клеток, существенным для экспрессии Ly49-рецепторов mNK-клеток, mNK-клетки культивировали отдельно или вместе с клетками OP9 в присутствии IL-15 и затем исследовали экспрессию Ly49 (фиг.1b). Когда клетки культивировали вместе с клетками ОР9 (+OP9), в mNK-клетках экспрессировались Ly49C/I и Ly49G2. С другой стороны, когда клетки культивировали независимо (-OP9), ни Ly49C/I, ни Ly49G2 не экспрессировались. Данные результаты показывают, что совместное культивирование HSC-клеток и OP9-клеток существенно для созревания NK-клеток. После исследования экспрессии генов CD122 и перфорина по стадиям дифференцировки NK-клеток доказывали, что HSC-клетки созревали в NK-клетки во время дифференцировки (фиг.1c).
Пример 3. SAGE (серийный анализ генной экспрессии)
Цельную РНК выделяли из HSC-клеток, полученных в примере 2 и из NK-клеток, специфичных для стадий дифференцировки (pNK и mNK). мРНК выделяли и очищали из 5 мкг цельной РНК с использованием магнитных гранул (dT)25 (Dynal A.S., Осло, Норвегия). мРНК, выделенную и очищенную олиго-dT-гранулами, использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК посредством набора для синтеза кДНК (Invitrogen, Life Technologies) с использованием олиго-(dT)-праймера, который был 5′-биотинилирован и связан с 3′-конца. По инструкциям производителя (Invitrogen, Life Technologies) метку для SAGE получали из кДНК способом, который объясняется на схематической диаграмме фиг.2. кДНК расщепляли ферментом рестрикции NIaIII и 3′-область связывали с магнитными гранулами (Dynal), покрытыми стрептавидином. Метку разделяли на две фракции, которые связывали с линкерами (Invitrogen, Life Technologies), имеющими участок распознавании NIaIII, соответственно. Связывающуюся с линкером метку расщепляли BsmFI. Выделенную метку и линкер обрабатывали ДНК-полимеразой Pfu для получения тупого конца. Тупые концы связывали вместе с образованием двойной метки. Проводили ПЦР для амплификации двойной метки с использованием меченного биотином праймера для SAGE (Invitrogen, Life Technologies). Затем двойную метку расщепляли NIaIII для отделения от линкера. Ее обрабатывали ДНК-лигазой T4 с образованием конкатемера.
Полученный конкатемер клонировали в предварительно расщепленный SphI вектор pZero-1 (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) (фиг.2). Затем продукт клонирования амплифицировали путем ПЦР с использованием прямого праймера M13, представленного SEQ ID NO:1, и обратного праймера M13, представленного SEQ ID NO:2. Амплифицированную позитивную колонию собирали и затем последовательность исследовали с использованием набора для секвенирования (набор для секвенирования Big-Dye) и нуклеотидного секвенатора (секвенатор ABI377, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Branchburg, Нью-Джерси). Последовательность метки идентифицировали посредством программного обеспечения SAGE 300.
Пример 4. Анализ данных SAGE
4-1. Биоинформационный анализ
Базу данных сравнения SAGE-меток получали из мышиной базы данных UniGene, содержащей большую часть последовательностей, экспрессированных в мыши, которую подавали в GenBank. Метку SAGE определяли по (i) направлению каждого транскрипта, (ii) наличию или отсутствию поли(A)-сигнала (AATAAA или ATTAAA), (iii) наличию или отсутствию поли-A-хвоста, и (iv) наличию или отсутствию последнего участка расщепления CATG в последовательности. Все метки SAGE, полученные из последовательностей сравнения, использовали для конструирования базы данных сравнения SAGE. Экспериментальная метка SAGE совпадала с базой данных сравнения SAGE (http://www.hpc1.cs. uchicago. edu/gist). Для идентификации гена, соответствующего каждой метке SAGE, использовали компьютерную программу SAGEmap (Lash A. E et al., 2000).
4-2. Анализ кластеров согласно количественному распределению профиля SAGE
Компьютерную программу кластеризации (компьютерная программа кластеризации и визуализации деревьев, http://rana.lbl.gov) использовали для исследования кластеризации данных SAGE, полученных в примере 4-1, основываясь на других профилях экспрессии и функциональных профилях, показанных во время процессов дифференцировки NK-клеток. Коротко, на каждой стадии различными цветами, такими как синий, зеленый, желтый и красный, метки маркировали по частоте (скрипт PERL доступен по запросу). Среднюю точку включали в соответствующее значение RGB. По данным цветным результатам некоторые метки, характеризовавшиеся четкой и высокой экспрессией, выбирали и помещали их на панели отдельно друг от друга. Остальные метки пересортировали, помещая линии, показывающую сходные профили экспрессии, рядом друг с другом упорядоченно, для получения постепенного изменения цвета в целом.
Повышение или снижение генной экспрессии во время дифференцировки NK-клеток исследовали на основе профилей SAGE HSC-, pNK-, mNK(-OP9)- и mNK (+OP9)-клеток. В результате, как показано на фиг.3a - фиг.3f, гены-мишени были классифицированы на 4 группы. Точнее, фиг.3a представляет группу генов, экспрессия которых повышена в HSC, но снижена при дифференцировке NK-клеток, на фиг.3b показана группа генов, экспрессия которых была высокой в pNK-клетках, а фиг.3c представляет группу генов, экспрессия которых была высокой в mNK(-OP9). На фиг.3d показана группа генов, экспрессия которых постепенно повышалась до достижения максимума в mNK(+OP9)-клетках. В частности, группа генов (фиг.3b), показывающая наилучшую экспрессию в pNK-клеток, включает в себя много генов регуляции иммунитета, таких как антитело дифференцировки лимфоцитов, C-C-хемокиновый рецептор, фактор некроза опухолей и интерлейкин-18-связывающий белок, и т.д., и это указывает на то, что регулирующие иммунитет факторы играют важную роль в дифференцировке pNK-клеток. Далее, основываясь на информационной базе данных, гены классифицировали по функции регуляции активности NK-клеток. На фиг.3e и фиг.3f показаны гены, ингибирующие и стимулирующие активность NK-клетки, соответственно. В большинстве случаев данные гены экспрессированы на поздней стадии дифференцировки. Гены, вовлеченные в активацию клетки, включают в себя многие сигнальные факторы, такие как митоген-активированная протеинкиназа, фосфолипаза A2, рецептор IL-2, хемокиновый рецептор, и т.д.
Пример 5. Анализ генов, регулирующих каждую стадию дифференцировки NK-клетки
5-1. Конструкция SAGE библиотеки, в соответствии с каждой стадией дифференцировки NK-клетки
На основании результатов SAGE в примере 4, сконструировали 4 различные SAGE библиотеки, в соответствии с каждой стадией дифференцировки NK-клетки (HSC, pNK, mNK(-OP9), mNK(+OP9)). Из SAGE библиотеки HSC идентифицировали 19830 уникальных транскриптов из общего количества меток 44998 и, из них, идентифицировали 12899 специфичных генов. Из SAGE библиотеки pNK идентифицировали 17745 уникальных транскриптов из общего количества меток 40771 и, из них, идентифицировали 11684 специфичных генов. Аналогично, из SAGE библиотеки mNK идентифицировали, соответственно, 20803 и 20791 уникальных транскриптов из 42160 (mNK(-OP9)) и 42535 (mNK(+OP9)) меток и, из них, идентифицировали 3650 и 14335 специфичных генов. В целом, 170464 меток идентифицировали из указанных выше четырех SAGE библиотек, из которых идентифицировали 59657 уникальных транскриптов и 35385 специфичных генов. Из 59657 уникальных транскриптов 77,9% были единичными копиями, 16,8% имели 2-4 копии, 3,2% имели 5-9 копий, 1,9% имели 10-99 копий и только 0,2% имели более 100 копий (таблица 1).
Таблица 1 | |||
Результат SAGE, в соответствии с каждой стадией дифференцировки NK-клетки | |||
Клетки, в соответствии с каждой стадией дифференцировки | Количество меток | Количество уникальных транскриптов | Количество специфичных генов |
HSC | 44998 | 19830 | 12899 |
pNK | 40771 | 17745 | 11684 |
mNK(-OP9) | 42160 | 20803 | 13650 |
mNK(+OP9) | 42535 | 20791 | 14335 |
Всего | 170464 | 59657 | 35385 |
Также изучали, на основании приведенного выше результата SAGE, отражение экспрессии участков генов, известных, как имеющих эффект на дифференцировку NK-клетки. В результате, как и ожидали, количества рецепторов mNK-клетки, таких как гранзим (GenBank ID NM_013542), NKG2A (GenBank ID AF106008), 2B4 (GenBank ID L19057), Ly49Q (GenBank ID AB033769) и CD94 (GenBank ID AF057714), были велики в mNK-клетках, но не подсчитывались ни в HSC, ни в pNK-клетках. IL-15 (GenBank ID U14332) определяли только в HSC и pNK-клетках. Экспрессия ID2 (GenBank ID BC006951) начиналась со стадии pNK-клеток (таблица 2).
Таблица 2 | ||||
SAGE результат дифференцировки соответствующих генов | ||||
Ген | HSC | pNK | mNK(-OP9) | mNK(+OP9) |
Гранзим | 0 | 0 | 508 | 664 |
NKG2A | 0 | 0 | 6 | 3 |
NK рецептор 2B4 | 1 | 0 | 17 | 17 |
NK рецептор Ly-49Q | 0 | 1 | 2 | 6 |
CD94 | 0 | 0 | 3 | 1 |
IL-15 | 3 | 3 | 0 | 0 |
Ly49G2 | 0 | 0 | 1 | 0 |
ID-2 | 0 | 7 | 5 | 9 |
5-2. Анализ генов, специфичных для стадии дифференцировки, экспрессируемых на каждой стадии дифференцировки NK-клетки
Сообщалось, что различные гены экспрессировались в соответствии со стадиями дифференцировки NK-клетки, так что в настоящем изобретении идентифицировали гены, специфичные для стадии дифференцировки. Для статистической достоверности гены, по меньшей мере, с 4-кратным увеличением экспрессии, группировали и представили в таблице.
В результате 15 генов признали имеющими высокую экспрессию в HSC (таблица 3). В частности, интерлейкин-1-рецептор-связанная киназа (IRAK), вовлечена в активацию и передачу сигнала NK-клетки. В соответствии с сообщением, что способность индуцировать цитотоксичность в NK-клетке вызвана IL-18 и образование IFN-y активированной NK-клеткой серьезно нарушается и снижается у IRAK-дефицитных мышей, анализ согласно изобретению был проведен корректно.
Таблица 3 | |||||
Ген | GenBank ID | HSC | pNK | mNK(-ОP9) | mNK(+ОP9) |
Гомеобокс-белок MIX | AF154573 | 28 | 0 | 0 | 0 |
Пре-про-протеиназа 3 | U97073 | 28 | 0 | 0 | 0 |
Онкоген миелобластоза (Myb) | М16449 | 11 | 1 | 0 | 1 |
Комплекс 1 кератина, кислый, ген 13 | NM_010662 | 9 | 0 | 0 | 0 |
РА-фосфатаза-ассоциированная фосфоэстераза | АК002966 | 8 | 0 | 1 | 1 |
Интерлейкин-1-рецептор-связанная киназа | АК009132 | 7 | 0 | 0 | 0 |
Гамма-парвин | ВС011200 | 6 | 0 | 0 | 0 |
Forkhead-ассоциированный фактор транскрипции 1С | AF339105 | 4 | 1 | 1 | 0 |
Ген RIKEN кДНК 5730501N20 | АК017744 | 4 | 1 | 0 | 0 |
Белок с-myc | Х01023 | 4 | 0 | 0 | 1 |
Рибосомный белок L10A | АК002613 | 4 | 0 | 1 | 0 |
Ген oct 2b | Х53654 | 4 | 0 | 0 | 0 |
Микролит | АК015601 | 4 | 0 | 0 | 0 |
Дигидролипоамид дигидрогеназа | ВС003368 | 4 | 0 | 0 | 0 |
Тракл | U81030 | 4 | 0 | 0 | 0 |
Также, 30 других генов были в значительной степени экспрессированы на клеточной стадии pNK (таблица 4). Среди них, лиганд c-kit признали специфичным для полной дифференцировки в mNK-клетки и, таким образом, развитие от незрелых NK-клеток в зрелые NK-клетки подавлялся в отсутствие передачи сигнала c-kit. Также сообщалось, что 2-микроглобулин вовлечен в начальные стадии экспрессии рецептора Ly49 и в некоторые рецепторы NK-клеток, которые являются важными регуляторами дифференцировки NK-клеток. Экспрессия трансформированного рецептора Fc отрицательно влияет на развитие и функционирование NK-клеток, приводя к снижению количества CD56+CD3- NK-клеток и, в дальнейшем, к цитопении и другим критически иммунодефицитным синдромам. В соответствии с полученными данными о том, что гены, известные как регулирующие дифференцировку NK-клеток, были экспрессированы в определенных, ожидавшихся, стадиях, анализ согласно изобретению был проведен корректно.
Таблица 4 | |||||
Ген | GenBank ID | HSC | pNK | mNK(-OP9) | mNK(+OP9) |
Лизоцим | BC002069 | 14 | 1321 | 2 | 3 |
Ферритина Н цепь | BC012314 | 25 | 962 | 7 | 18 |
Бревикан | X87096 | 7 | 259 | 1 | 1 |
Матричная металлопротеиназа 12 | BC019135 | 0 | 69 | 0 | 0 |
EIA-стимулируемый генный клеточный ингибитор | AF084524 | 5 | 45 | 7 | 1 |
Лиганд c-kit | M64262 | 0 | 62 | 0 | 0 |
S100 кальций-связывающий белок А9 | BC027635 | 1 | 42 | 0 | 1 |
Белок MPS1 | L20315 | 1 | 35 | 0 | 0 |
Трансглютаминаза 2 | BC016492 | 0 | 25 | 1 | 1 |
Сывороточная и глюкокортикоид-регулируемая протеинкиназа | AF139639 | 0 | 20 | 0 | 0 |
RIKEN кДНК 5830413L19 | BC027496 | 0 | 18 | 0 | 0 |
Бета 2-микроглобулин мРНК | M10416 | 0 | 17 | 0 | 0 |
Интерферон-индуцируемый белок | BC003804 | 0 | 17 | 0 | 0 |
Глобулярный мембранный белок молочного жира фактора EGF 8 | BC018577 | 3 | 16 | 0 | 1 |
Fc гамма рецептор | M14215 | 3 | 15 | 1 | 1 |
Клеточный поверхностный гликопротеин р91 | U83172 | 0 | 13 | 0 | 1 |
Аргиназа 1 | BC050005 | 0 | 12 | 0 | 0 |
Рецептор 1 фактора некроза опухолей | M59378 | 1 | 12 | 0 | 2 |
Ретиноид-индуцируемая сериновая карбоксипептидаза | AF330052 | 2 | 11 | 0 | 0 |
Неидентифицированный гомолог белка FLJ11000 | BC023802 | 0 | 11 | 2 | 0 |
Предшественник интерлейкин-18 связывающего белка d | AF110803 | 0 | 10 | 0 | 0 |
Хлоридный канал 7 | AK009435 | 0 | 9 | 1 | 0 |
Антиген CD36 | BC010262 | 0 | 8 | 0 | 0 |
Гомолог цинкосодержащего белка | BC030186 | 1 | 8 | 1 | 0 |
Углевод-связывающий белок 35 | J03723 | 0 | 7 | 3 | 0 |
Кальций-зависимый углевод С-типа | BC003218 | 0 | 7 | 0 | 0 |
Липопротеинлипаза | NM_008509 | 0 | 7 | 0 | 0 |
Онкоген фибросаркомы v-maf lacertus | BC038256 | 0 | 6 | 0 | 0 |
Рецептор интерлейкина 7 | NM_008372 | 0 | 5 | 0 | 0 |
Рецептор 1 хемокина (С-С) | BC011092 | 0 | 5 | 0 | 0 |
Нейрофиллин (MGD| MGI:106206) | AK002673 | 0 | 5 | 0 | 0 |
Между тем, 27 генов идентифицировали на клеточной стадии mNK (таблица 5). Среди них - тирозинкиназа `Fyn' семейства Src, о которой известно, что она вовлечена в активацию NK-клетки.
Таблица 5 | |||||
Ген | GenBank ID | HSC | pNK | mNK(-OP9) | mNK(+OP9) |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
SERPINA3G | XM_127137 | 2 | 0 | 29 | 45 |
Субъединица 6 рецептора GABA-A | X51986 | 0 | 0 | 16 | 44 |
LAPTm5 | U51239 | 5 | 4 | 18 | 25 |
Регулятор сигнала G-белка | BC049968 | 0 | 0 | 0 | 17 |
мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI | L41366 | 0 | 0 | 0 | 12 |
Y-бокс-белок 3 | AK019465 | 0 | 0 | 10 | 17 |
Предшественник остеопонтина | J04806 | 0 | 1 | 2 | 14 |
Представитель семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) | AK021331 | 2 | 0 | 5 | 12 |
Аналог бета субъединицы Т-клеточного рецептора | U63547 | 0 | 0 | 8 | 11 |
Иммуноассоциированный нуклеотид 1 | BC005577 | 0 | 0 | 9 | 0 |
Фактор транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки | NM_009480 | 0 | 1 | 0 | 8 |
Обонятельный рецептор MOR267-7 | NM_146714 | 0 | 0 | 0 | 8 |
продолжение Таблицы 5 | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа | М12056 | 0 | 0 | 7 | 1 |
Ингибитор рака остеокластов | АВ013898 | 1 | 1 | 0 | 7 |
Гомолог активного рецептора тромбоцитов | ВС024054 | 0 | 1 | 3 | 7 |
Белок 2-А1 клеток-природных киллеров | AF106008 | 0 | 0 | 3 | 6 |
Неидентифицированный белок MGC36662 | ВС023851 | 0 | 1 | 2 | 6 |
Гомолог предшественника семафорина 6А | АК004390 | 0 | 0 | 6 | 2 |
Протоонкоген Fyn | ВС032149 | 0 | 0 | 5 | 5 |
Полипептид, гомолог нейрофиламента | ВС025872 | 0 | 0 | 2 | 5 |
Гомолог корнина, актин-связывающий белок 2А | ВС026634 | 1 | 1 | б | 2 |
Белок семейства переносчиков растворимых веществ 6 | ВС015245 | 1 | 1 | 6 | 5 |
Гомолог временного пуринового рецептора P2Y10 | АК020001 | 0 | 0 | 5 | 4 |
Гамма цепь рецептора Т клетки | Х03802 | 0 | 1 | 5 | 4 |
Поли А полимераза альфа | NM_011112 | 0 | 0 | 5 | 3 |
Аналог ОРА-ассоциированного белка 0IP5 | АК017825 | 0 | 0 | 5 | 1 |
Аналог митоген-активируемой протеинкиназы 1 | ВС006708 | 1 | 0 | 5 | 4 |
Пример 6. Исследование участков экспрессии генов с помощью OT- ПЦР
Полуколичественную ОТ-ПЦР использовали для изучения участков экспрессии других генов, на основе данных SAGE. Праймеры для ОТ-ПЦР получали в соответствии с генами-мишенями. Все смеси подвергали тепловой обработке при 95°С в течение 1 минуты, а другие условия ПЦР были следующими; ПЦР с клетками HSC и mNK проводили при 95°С в течение 1 минуты, при 55°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, а ПЦР с незрелыми NK-клетками проводили при 95°С в течение 1 минуты, при 60°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 2 минут, которые повторяли 28 или 32 цикла, с последующим удлинением при 72°С в течение 10 минут. Амплифицированные продукты ПЦР разделяли электрофорезом и окрашивали этидия бромидом.
Гамма-парвин: SEQ ID NO:3 и NO:4,
Forkhead-ассоциированный фактор транскрипции 1c (Foxp1c): SEQ ID NO:5 и NO:6,
Белок c-myc: SEQ ID NO:7 и NO:8,
Комплекс кератина (KC) 1: SEQ ID NO:9 и NO:10,
РА-фосфатаза-ассоциированная фосфоэстераза (PA-PRP): SEQ ID NO:11 и NO:12,
Интерлейкин-1-рецептор-связанная киназа (IPAK): SEQ ID NO:13 и NO:14,
Рибосомный белок L10A: SEQ ID NO:15 и NO:16,
Пре-про-протеиназа 3: SEQ ID NO:17 и NO:18,
Онкоген миелобластоза: SEQ ID NO:19 и NO:20,
Углевод-связывающий белок (CBP) 35: SEQ ID NO:21 и NO:22,
IL-7 рецептор: SEQ ID NO:23 и NO:24,
Липопротеинлипаза (LPL): SEQ ID NO:25 и NO:26,
Ферритина Н цепь: SEQ ID NO:27 и NO:28,
Матричная металлопротеиназа (MMP) 12: SEQ ID NO:29 и NO:30,
Регулятор G-белковых сигналов (RGS): SEQ ID NO:31 и NO:32,
Серпин 3G: SEQ ID NO:33 и NO:34,
Пуринэргический рецептор P2Y: SEQ ID NO:35 и NO:36,
Лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа (PTK): SEQ ID NO:37 и NO:38,
Предшественник семафорина 6А: SEQ ID NO:39 и NO:40,
CD122: SEQ ID NO:41 и NO:42,
Перфорин: SEQ ID NO:43 и NO:44,
Бета-актин: SEQ ID NO:45 и NO:46
В результате 9 генов, например, гамма-парвин, forkhead-ассоциированный фактор транскрипции 1c (Foxp1c), c-myc, пре-про-протеиназа 3 и др., были специфично экспрессированы в HSC (фиг.4а). IL-7R и матричная металлопротеиназа 12 (MMP12) были экспрессированы исключительно в клетках pNK (фиг.4b). Пуринэргический рецептор P2Y10 и лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа (PTK) были необычно экспрессированы в клетках mNK (фиг.4c).
Пример 7. Эффект LPL на стадии дифференцировки NK-клетки
В приведенном выше примере 4 было подтверждено, что липопротеинлипаза (обозначенная здесь и далее «LPL»), представленная SEQ ID NO:47, была суперэкспрессирована в клетках pNK в продолжении дифференцировки NK-клетки, в числе многих других генов, специфичных для стадии дифференцировки. LPL способствовала пролиферации NK-клетки, но подавляла спонтанную цитотоксичность и активность лимфокин-активируемых киллеров (LAK). С целью уточнить, была ли pNK-специфичная экспрессия LPL необходима для дифференцировки в mNK-клетки, HSC-клетки культивировали в течение 6 дней, а затем обрабатывали IL-15 и LPL в отсутствии ОР9 стромальных клеток, с последующим измерением процента NK-клеток.
В результате, процент NK-клеток возрастал в большей степени, когда HSC обрабатывали IL-15 и LPL вместе, чем когда HSC обрабатывали только IL-15 (NK1.1+NKG2A/C/E+клетка; 50%, когда HSC обрабатывали только IL-15 против 71% и 86%, когда HSC обрабатывали IL-15 вместе с 250 нг/мл LPL и когда HSC обрабатывали IL-15 вместе с 500 нг/мл LPL, соответственно) (фиг.4d). Приведенные выше результаты показывают, что LPL играет важную роль в дифференцировки от pNK-клеток в mNK-клетки, и поиск генов, регулирующих дифференцировку NK-клеток, был корректно проведен в настоящем изобретении.
Промышленная применимость
Как объяснялось здесь выше, способ согласно изобретению для поиска генов, вовлеченных в регуляцию дифференцировки из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в дополнение к SAGE, может использоваться для идентификации нового гена, имеющего необычные функции.
Описание списка последовательностей
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:1 и NO:2, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ПЦР в примере 3.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:3 и NO:4, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с гамма-парвином в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:5 и NO:6, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с forkhead-родственным фактором транскрипции 1 с в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:7 и NO:8, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с белком c-myc в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:9 и NO:10, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с кератиновым комплексом 1 (КС) в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:11 и NO:12, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с родственной РА-фосфатазой фосфоэстеразой (PA-PRP) в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:13 и NO:14, представляют собой праймерные последовательности, использованные для ОТ-ПЦР с ассоциированной с рецептором интерлейкина-1 киназой (IRAK) в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:15 и NO:16, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с рибосомным белком L10A в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:17 и NO:18, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР пре-про-протеиназой 3 в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:19 и NO:20, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с онкогеном миелобластоза в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:21 и NO:22, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с углевод-связывающим белком (CBP) 35 в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:23 и NO:24, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с рецептором IL-7 в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:25 и NO:26, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с липопротеинлипазой (LPL) в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:27 и NO:28, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с H-цепью ферритина в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:29 и NO:30, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с матриксной металлопротеиназой (MMP) 12 в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:31 и NO:32, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с регулятором передачи сигнала G-белком (RGS) в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:33 и NO:34, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с серпином 3G в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:35 и NO:36, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с пуринергическим рецептором P2Y в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:37 и NO:38, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с лимфоцит-специфичной протеинтирозинкиназой (PTK) в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:39 и NO:40, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с предшественником семафорина 6A в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:41 и NO:42, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с CD122 в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:43 и NO:44, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с перфорином в примере 6.
Нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO:45 и NO:46, представляют собой праймерные последовательности, используемые для ОТ-ПЦР с бета-актином в примере 6.
Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:47, представляет собой нуклеотидную последовательность липопротеинлипазы.
Нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:48, представляет собой аминокислотную последовательность белка мыши.
Специалистам в данной области понятно, что концепции и конкретные варианты осуществления, приведенные в последующем описании, могут легко использоваться в качестве основы для модификации или конструирования других вариантов осуществления для воплощения тех же целей настоящего изобретения. Специалистам в данной области также понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не уклоняются от сущности и объема изобретения, как указано в прилагаемой формуле изобретения.
Claims (6)
1. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, содержащее в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573, SEQ ID NO:49), пре-про-протеиназы 3 (U97073, SEQ ID NO:50), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449, SEQ ID NO:51), гена 13 кислого кератинового комплекса 1 (NM-010662, SEQ ID NO:52), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966, SEQ ID NO:53), гамма-парвина (ВС011200, SEQ ID NO:54), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105, SEQ ID NO:55), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744, SEQ ID NO:56), белка c-myc (Х01023, SEQ ID NO:57), рибосомного белка L10A (АК002613, SEQ ID NO:58), гена Oct 2b (Х53654, SEQ ID NO:59), микролита (AK015601, SEQ ID NO:60), дигидролипоамиддегидрогеназы (BC003368, SEQ ID NO:61), трикла (U81030, SEQ ID NO:62), лизоцима (BC002069, SEQ ID NO:63), цепи H ферритина (BC012314, SEQ ID NO:64), бревикана (X87096, SEQ ID NO:65), матриксной металлопротеиназы 12 (BC019135, SEQ ID NO:66), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524, SEQ ID NO:67), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635, SEQ ID NO:68), белка MPS1 (L20315, SEQ ID NO:69), трансглутаминазы 2 (BC016492, SEQ ID NO:70), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639, SEQ ID NO:71), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496, SEQ ID NO:72), индуцируемого интерфероном белка (BC003804, SEQ ID NO:73), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577, SEQ ID NO:74), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172, SEQ ID NO:75), аргиназы 1 (BC050005, SEQ ID NO:76), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378, SEQ ID NO:77), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052, SEQ ID NO:78), гомолога FLJ11000 (ВС023802, SEQ ID NO:79), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803, SEQ ID NO:80), канала ионов хлора 7 (АК009435, SEQ ID NO:81), антигена CD36 (ВС010262, SEQ ID NO:82), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186, SEQ ID NO:83), связывающего углевод белка 35 (J03723, SEQ ID NO:84), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218, SEQ ID NO:85), липопротеинлипазы (NM-008509, SEQ ID NO:47), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256, SEQ ID NO:86), рецептора интерлейкина 7 (NM-008372, SEQ ID NO:87), рецептора хемокина (С-С) 1 (ВС011092, SEQ ID NO:88), нейрофиллина (MGDlMGI: 106206) (АК002673, SEQ ID NO:89), серпина A3G (ХМ-127137, SEQ ID NO:90), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986, SEQ ID NO:91), LAPTm5 (U51239, SEQ ID NO:92), регулятора сигнала G-белка (BC049968, SEQ ID NO: 93), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366, SEQ ID NO:94), белка Y-бокса 3 (АКО19465, SEQ ID NO:95), предшественника остеопонтина (J04806, SEQ ID NO:96), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331, SEQ ID NO:97), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547, SEQ ID NO:98), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577, SEQ ID NO:99), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM-009480, SEQ ID NO:100), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM-146714, SEQ ID NO:101), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (M12056, SEQ ID NO:102), ингибитора рака остеокластов (АВ013898, SEQ ID NO:103), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054, SEQ ID NO:104), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008, SEQ ID NO:105), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851, SEQ ID NO:106), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390, SEQ ID NO:107), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872, SEQ ID NO:108), актинсвязывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634, SEQ ID NO:109), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВСО15245, SEQ ID NO:110), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001, SEQ ID NO:111), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802, SEQ ID NO:112), поли-А-полимеразы альфа (NM-011112, SEQ ID NO:113), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825, SEQ ID NO:114) и аналога митогенактивируемой протеинкиназы 1 (ВС006708, SEQ ID NO:115).
2. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.1, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры, где ген выбран из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF 154573, SEQ ID NO:49), пре-про-протеиназы 3 (U97073, SEQ ID NO:50), онкогена миелобластоза (Myb) (Ml6449, SEQ ID NO:51), гена 13 кислого комплекса кератина 1 (NM-010662, SEQ ID NO:52), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966, SEQ ID NO:53), гамма-парвина (BC011200, SEQ ID NO:54), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105, SEQ ID NO:55), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (AK017744, SEQ ID NO:56), белка c-myc (X01023, SEQ ID NO:57), рибосомного белка L10A (AK002613, SEQ ID NO:58), гена Oct 2b (X53654, SEQ ID NO:59), микролита (AK015601, SEQ ID NO:60), дигидролипоамиддегидрогеназы (BC003368, SEQ ID NO:61) и трикла (U81030, SEQ ID NO:62).
3. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.1, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры, где ген выбран из группы, состоящей из лизоцима (ВС002069, SEQ ID NO:63), цепи ферритина Н (ВС012314, SEQ ID NO:64), бревикана (Х87096, SEQ ID NO:65), матриксной металлопротеиназы 12 (ВС019135, SEQ ID NO:66), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524, SEQ ID NO:67), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635, SEQ ID NO:68), белка MPS1 (L20315, SEQ ID NO:69), трансглутаминазы 2 (BC016492, SEQ ID NO:70), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639, SEQ ID NO:71), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496, SEQ ID NO:72), индуцируемого интерфероном белка (BC003804, SEQ ID NO:73), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577, SEQ ID NO:74), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172, SEQ ID NO:75), аргиназы 1 (ВС050005, SEQ ID NO:76), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378, SEQ ID NO:77), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052, SEQ ID NO:78), гомолога FLJ11000 (ВС023802, SEQ ID NO:79), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF 110803, SEQ ID NO:80), канала ионов хлора 7 (АК009435, SEQ ID NO:81), антигена CD36 (ВС010262, SEQ ID NO:82), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186, SEQ ID NO:83), связывающего углевод белка 35 (J03723, SEQ ID NO:84), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218, SEQ ID NO:85), липопротеинлипазы (NM_008509, SEQ ID NO:47), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256, SEQ ID NO:86), рецептора интерлейкина 7 (NM-008372, SEQ ID NO:87), рецептора хемокина (C-C) 1 (BC011092, SEQ ID NO:88) и нейрофиллина (MGDlMGI: 106206, SEQ ID NO:89).
4. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.1, которое регулирует дифференцировку зрелых клеток-природных киллеров, где ген выбран из группы, состоящей из серпина A3G (XM-27137, SEQ ID NO:90), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986, SEQ ID NO:91), LAPTm5 (U51239, SEQ ID NO:92), регулятора сигнала G-белка (BC049968, SEQ ID NO:93), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366, SEQ ID NO:94), белка Y-бокса 3 (АК019465, SEQ ID NO:95), предшественника остеопонтина (J04806, SEQ ID NO:96), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331, SEQ ID NO:97), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547, SEQ ID NO:98), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577, SEQ ID NO:99), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM-009480, SEQ ID NO:100), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM-146714, SEQ ID NO:101), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056, SEQ ID NO:102), ингибитора рака остеокластов (АВ013898, SEQ ID NO:103), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054, SEQ ID NO:104), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008, SEQ ID NO:105), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851, SEQ ID NO:106), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390, SEQ ID NO:107), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872, SEQ ID NO:108), актин-связывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634, SEQ ID NO:109), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВСО15245, SEQ ID NO:110), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001, SEQ ID NO:111), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802, SEQ ID NO: 112), поли-А-полимеразы альфа (NM-011112, SEQ ID NO:113), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825, SEQ ID NO:114) и аналога митогенактивируемой протеинкиназы 1 (ВС006708, SEQ ID NO:115).
5. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по любому из пп.1-4, где регулирующее дифференцировку средство используют для лечения злокачественных опухолей.
6. Средство, регулирующее дифференцировку клеток-природных киллеров, по п.5, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, меланомы и рака легких.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2004-0004308 | 2004-01-20 | ||
KR10-2004-0004308A KR100535326B1 (ko) | 2004-01-20 | 2004-01-20 | 줄기 세포로부터 자연살해 세포로의 분화 조절용 유전자를유효성분으로 포함하는 분화 조절제 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006129921A RU2006129921A (ru) | 2008-02-27 |
RU2350649C2 true RU2350649C2 (ru) | 2009-03-27 |
Family
ID=36869789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006129921/13A RU2350649C2 (ru) | 2004-01-20 | 2005-01-20 | Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070042344A1 (ru) |
EP (1) | EP1711608A4 (ru) |
JP (1) | JP4614975B2 (ru) |
KR (1) | KR100535326B1 (ru) |
CN (1) | CN1910283B (ru) |
AU (1) | AU2005205408B2 (ru) |
CA (1) | CA2553790A1 (ru) |
RU (1) | RU2350649C2 (ru) |
WO (1) | WO2005068633A1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012170979A1 (en) * | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Zhenglun Zhu | Human homeobox gene ventx and macrophage terminal differentiation and activation, compositions and methods thereof |
RU2639277C2 (ru) * | 2012-02-29 | 2017-12-20 | Сангамо Байосайенсиз, Инк. | Способы и составы лечения болезни хантингтона |
RU2712833C2 (ru) * | 2009-10-22 | 2020-01-31 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Конструируемые белки с цинковыми пальцами, направленные на гены растений, вовлеченные в биосинтез жирных кислот |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006058486A1 (en) * | 2004-12-03 | 2006-06-08 | Bio-Cancer Treatment International Limited | Use of arginase in combination with 5fu and other compounds for treatment of human malignancies |
EP3712258A1 (en) | 2006-04-14 | 2020-09-23 | Astellas Institute for Regenerative Medicine | Hemangio-colony forming cells |
CN100479863C (zh) * | 2006-09-06 | 2009-04-22 | 中国医学科学院北京协和医院 | Cofilin 1与癌症的紫杉烷类化疗药物耐药性的相关性 |
KR100851039B1 (ko) * | 2006-11-28 | 2008-08-12 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Oct-4, Cripto-1, ABCG2 또는 에스트로겐 수용체를 마커로 이용한, 줄기세포 또는 종양줄기세포의 검출방법 및 항암물질의 스크리닝 방법 |
KR20090123115A (ko) * | 2008-05-27 | 2009-12-02 | 한국생명공학연구원 | 오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법 |
CN101638653A (zh) * | 2008-08-01 | 2010-02-03 | 浙江赛尔生物医学研究有限公司 | 破骨细胞质子泵亚基a3的RNA干扰靶点及其应用 |
EP2934555B1 (en) | 2012-12-21 | 2021-09-22 | Astellas Institute for Regenerative Medicine | Methods for production of platelets from pluripotent stem cells |
TWI777195B (zh) * | 2013-08-05 | 2022-09-11 | 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 | 新穎肽類,細胞及其用於治療多種腫瘤的用途,其製造方法及包含其等之醫藥組成物(三) |
JP7033601B2 (ja) * | 2017-01-05 | 2022-03-10 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 抗コチニンキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01186820A (ja) * | 1988-01-19 | 1989-07-26 | Teijin Ltd | 悪性腫瘍治療剤 |
JPH07135969A (ja) * | 1993-11-18 | 1995-05-30 | Rikagaku Kenkyusho | ナチュラルキラー細胞の前駆細胞及びその分化増殖法 |
-
2004
- 2004-01-20 KR KR10-2004-0004308A patent/KR100535326B1/ko active IP Right Grant
-
2005
- 2005-01-20 EP EP05721830A patent/EP1711608A4/en not_active Withdrawn
- 2005-01-20 AU AU2005205408A patent/AU2005205408B2/en not_active Ceased
- 2005-01-20 RU RU2006129921/13A patent/RU2350649C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-01-20 JP JP2006550937A patent/JP4614975B2/ja active Active
- 2005-01-20 CN CN2005800027713A patent/CN1910283B/zh active Active
- 2005-01-20 WO PCT/KR2005/000188 patent/WO2005068633A1/en active Application Filing
- 2005-01-20 CA CA002553790A patent/CA2553790A1/en not_active Abandoned
- 2005-01-20 US US10/597,305 patent/US20070042344A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GUO W. et al. A human Mix-like homeobox gene MIXL shows functional similacity to Xenopus Mix.1. - In. Blood, 2002, vol.100(1), pp.89-95, Гилберт С. Биология развития. - Москва, МИР, 1993, том 1, с.212-221. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2712833C2 (ru) * | 2009-10-22 | 2020-01-31 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Конструируемые белки с цинковыми пальцами, направленные на гены растений, вовлеченные в биосинтез жирных кислот |
WO2012170979A1 (en) * | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Zhenglun Zhu | Human homeobox gene ventx and macrophage terminal differentiation and activation, compositions and methods thereof |
RU2639277C2 (ru) * | 2012-02-29 | 2017-12-20 | Сангамо Байосайенсиз, Инк. | Способы и составы лечения болезни хантингтона |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005205408A1 (en) | 2005-07-28 |
AU2005205408B2 (en) | 2008-12-11 |
CA2553790A1 (en) | 2005-07-28 |
JP2007526246A (ja) | 2007-09-13 |
KR100535326B1 (ko) | 2005-12-09 |
KR20050076355A (ko) | 2005-07-26 |
WO2005068633A1 (en) | 2005-07-28 |
JP4614975B2 (ja) | 2011-01-19 |
EP1711608A1 (en) | 2006-10-18 |
RU2006129921A (ru) | 2008-02-27 |
CN1910283A (zh) | 2007-02-07 |
CN1910283B (zh) | 2010-07-14 |
EP1711608A4 (en) | 2008-03-19 |
US20070042344A1 (en) | 2007-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2350649C2 (ru) | Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента | |
Strandberg et al. | Lipopolysaccharide and lipoteichoic acid induce different innate immune responses in bovine mammary epithelial cells | |
Fu et al. | Cloning of DLM-1, a novel gene that is up-regulated in activated macrophages, using RNA differential display | |
Goetz et al. | Analysis of genes isolated from lipopolysaccharide-stimulated rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) macrophages | |
JP7191377B2 (ja) | マクロファージの分化及び免疫を改変する方法 | |
US11566226B2 (en) | Natural killer cells | |
JP6449148B2 (ja) | 免疫抑制細胞作成方法、及び、免疫抑制細胞を含む組成物の使用方法 | |
US20230330145A1 (en) | Natural killer cells | |
JP7235259B2 (ja) | Gvhd又は腫瘍を治療するための骨髄系由来サプレッサー細胞のインフラマソーム活性化の調節 | |
Stratton et al. | Macrophages and associated ligands in the aged injured nerve: a defective dynamic that contributes to reduced axonal regrowth | |
HUE028190T2 (en) | SAA containing pharmaceutical composition for use in the treatment of acute and chronic inflammatory diseases and conditions | |
Bayever et al. | Selective cytotoxicity to human leukemic myeloblasts produced by oligodeoxyribonucleotide phosphorothioates complementary to p53 nucleotide sequences | |
Shi et al. | Genome-wide analysis of molecular changes in IL-12-induced control of mammary carcinoma via IFN-γ-independent mechanisms | |
CN1216069A (zh) | 用持久的生物标记测定对电离辐射剂的暴露 | |
Kang et al. | Stage-dependent gene expression profiles during natural killer cell development | |
CN109891238A (zh) | 免疫治疗剂的剂量确定 | |
Lin et al. | Aged Callus Skeletal Stem/Progenitor Cells Contain an Inflammatory Osteogenic Population With Increased IRF and NF-κB Pathways and Reduced Osteogenic Potential | |
US20230002732A1 (en) | Natural killer cells | |
KR100729284B1 (ko) | Vitamin D3를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포분화제 및 분화 방법 | |
Ali et al. | BATF controls IFN I production via DC-SCRIPT in plasmacytoid dendritic cells | |
CN113933508A (zh) | 人batf基因的用途及相关产品 | |
ドシダユウタ et al. | The study of senescent cells using the single cell RNA sequencing | |
Simon et al. | The T Cell Specific Serine Proteinase TSP-1: Biochemical Characterization, Genetic Analysis, and Functional Role | |
Hartgers et al. | Identification of a putative DC-specific transcription factor, DC203, by differential display PCR | |
Medina | Molecular Cloning and Regulation of Expression of an NK Cell Receptor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20100812 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110121 |