KR20090123115A

KR20090123115A - 오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법

Info

Publication number: KR20090123115A
Application number: KR1020080049034A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 정진웅; 김미선; 윤석란
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2009-12-02
Also published as: WO2009145399A1; US20110305680A1

Abstract

본 발명은 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오스테오폰틴은 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 촉진하고, 자연살해세포의 세포살상 활성을 증가시키므로 자연살해세포 분화용 조성물로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 오스테오폰틴은 암세포 살상 기능이 있는 자연살해세포로의 분화를 조절함으로써 항암 세포 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

오스테오폰틴(Osteopontin; OPN), 자연살해세포, 조혈줄기세포, 분화

Description

오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법{A composition containing osteopontin for differentiating natural killer cell as an active ingredient and a method of differentiation using thereof}

본 발명은 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 분화용 조성물 및 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 방법에 관한 것이다.

자연살해세포(natural killer cell, 이하 "NK 세포"라 약칭함)는 골수에 있는 조혈 줄기세포로부터 분화되어진 면역세포이다(Freud, A. G., et al ., Immunol Rev, 214:56-72, 2006). 상기 NK 세포는 외부 항원에 의해서 감염된 세포를 직접 죽이거나 여러 싸이토카인이나 케모카인 등을 분비하여 다른 면역세포를 끌어들임으로 간접적으로 감염된 세포를 죽일 수 있다. 따라서 NK 세포는 면역반응에 있어 서 자연 면역반응에서 획득 면역반응을 매개하는데 아주 중요하게 작용된다(James P. Di Santo, Annual Review of Immunology , 24:257-286, 2006; Farag, S. S., et al., Blood Rev, 20;123-137, 2006).

NK 세포는 분화되면서 세포 표면에 특정 수용체를 발현시키는데, 이들 수용체를 통해서 NK 세포가 분화되는 단계를 확인할 수 있게 된다. NK 세포 전구체에는 이미 잘 알려져 있는 IL2/IL15 수용체β인 CD122가 존재한다. 상기 CD122 수용체를 통하여 NK 세포의 분화 초기 단계에 NK 세포 분화에 중요하게 영향을 미치는 IL15 싸이토카인의 중요 신호가 전달된다. 상기 신호를 통해서 NK 세포는 분화하면서 NK1.1, DX5와 여러 다양한 기능을 가지고 있는 Ly49들을 발현하게 된다(Williams, N. S., et al ., J Immunol, 163:2648-2656, 1999). 골수는 NK 세포가 분화되는데 좋은 환경으로 여러 성장 요인들과 NK 세포로 분화되는데 중요한 싸이토카인들을 분비하는 세포들이 많이 있다. 대표적으로 기질(stromal) 세포는 NK 세포가 완전히 성숙되는데 기여하고 있다(Van den Brink, M.R., et al ., The Journal of experimental medicine , 172:303-313, 1990; Fukuda T, et al ., Nature, 391:700-703, 1998).

NK 세포는 비특이적으로 암세포를 살상력이 있고, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암(Konjevic G, et al ., Breast Cancer Res . Treat ., 66: 255-263, 2001), 흑색종암(Ryuke Y, et al ., Melanoma Res ., 13: 349-356, 2003), 폐암(Villegas FR, et al ., Lung Cancer , 35: 23-28, 2002) 등 다양한 질병들과 관련되어 있음이 보고되어 이러한 질병들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두하고 있다.

오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)은 당단백질로 골세포인 기질 세포로부터 많은 양이 생성되어지며(Takeshita S, et al ., Bone , 29:236-241, 2001; Leboy, P. S., et al ., Journal of cellular physiology , 146:370-378, 1991; Benayahu. D. et al ., Tissue & cell , 26:661-666, 1994), 다양하게 인산화되어 진다(Sodek J, et al ., Crit Rev Oral Biol Med , 11:279-303, 2000).

오스테오폰틴은 활성된 T 세포 또는 형질세포형 수지상세포(plasmacytoid DC)로부터 발현되어지는데 이것은 전사 인자(transcription factor)인 T-bet으로부터 조절되어 진다(Mari L. Shinohara., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 102:17101-17106, 2005; Mari L Shinohara., et al., Nature immunology , 7:498-506, 2006). T-bet은 CD122의 프로모터(promoter)에 결합하여 cd122의 발현을 조절하게 되는데, 이것은 IL15의 신호가 전달되는 것과 연관이 있고, CD122를 발현하고 있는 CD8+ 기억 세포와 NK 세포에 영향을 준다.

지금까지 오스테오폰틴은 초기에 비교원 골기질(noncollagenous bone matrix) 단백질로 알려졌으나, 후에는 면역시스템에서 싸이토카인 분비 조절이나 세포의 이동 등에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다(Ashkar, S. et al ., Science , 287:860-864, 2000; Iizuka, J., et al ., Laboratory investigation 78:1523-1533, 1998; Weber, G.F., et al ., Cytokine & growth factor reviews, 7:241-248, 1996). 특히, 면역반응에서 CD4 T 세포를 TH1으로 분화시키는데 아주 중요한 요인으로 알려져 있다(A. C. Renkl, et al ., Blood , 106:946-955, 2005; Li, X., et al ., J Interferon Cytokine Res , 23:259-265, 2003). 그러나, 오스테오폰틴이 자연살해세포의 분화에 영향을 미친다는 보고는 전무하다.

이에, 본 발명자들은 오스테오폰틴이 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, 자연살해세포의 살상능력을 증가시킴을 확인하여, 자연살해세포의 분화용 조성물로 이용할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물, 및 이를 이용한 분화 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)을 유효 성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 자연살해세포 전구체에 오스테오폰틴을 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 자연살해세포 전구체에 오스테오폰틴을 투여하는 단계를 포함하는 세포살상능력이 증가된 자연살해세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 세포살상능력이 증가된 자연살해세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 세포살상능력이 증가된 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)은 NK 세포 분화를 촉진하고, NK 세포의 살상능력을 증가시키므로, 상기 오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 오스테오폰틴은 암세포 살상 기능이 있는 자연살해세포의 분화를 조절함으로써 항암 치료에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)을 유효 성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 마우스의 다리뼈로부터 골수세포를 수득한 후, MACS(magnetic activated cell sorting)를 이용하여 CD117+인 조혈줄기 세포(hematopoietic stem 세포, 이하 "HSC 세포"라 약칭함)를 분리하였다. 상기 분리한 HSC 세포를 자연살해세포 전구체 세포(pNK)를 거쳐 성숙한 NK 세포(mNK)로 분화시켰다(도 1 참조).

본 발명자들은 OPN이 NK 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해, 시험관 내(in vitro)에서 HSC로부터 NK 세포의 분화과정 중, pNK(NK 전구체 세포)에 OPN을 처리한 후, mNK(성숙한 NK 세포)세포로 분화시켜 유세포 계수기(FACS)로 분석하였다. 그 결과, OPN 처리군는 처리하지 않은 대조군에 비하여 NK 세포군의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었다(도 2 참조). 또한, 상기 결과가 재조합 OPN에 특이적인 반응인지를 알아보기 위해, 항-OPN 항체를 이용하여 재조합 OPN을 저해함으로써 확인하였다(도 3 참조). 또한, NK에 관련된 분자들인 CD122 및 NK1.1이 재조합 OPN에 의한 발현 변화를 실시간 PCR 방법을 통해 RNA 수준에서 확인하였다. 그 결과, CD122 및 NK1.1은 재조합 OPN을 통해 더 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 4 참조). 따라서 OPN이 NK 분화 과정에 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명자들은 OPN이 NK 세포독성 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 배양한 NK 세포를 표적세포인 ⁵¹Cr-표지된 YAC-1 세포와 함께 배양한 후, 감마-카운터(γ-counter)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 재조합 OPN을 통해 더 많이 늘어난 NK의 세포독성 활성이 더 높은 것을 확인하였다(도 5 참조). 따라서 OPN이 NK의 활성에 관여하고 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 OPN의 결여가 NK 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, OPN 결손 마우스에서 FACS 분석을 수행한 결과, OPN이 결여된 마우스의 비장과 골수에서 NK 세포가 감소되는 것을 알 수 있었다(도 6 참조). 또한, 성숙된 NK 세포에서 많이 발현하는 분자인 LY49 수용체의 발현은 OPN이 결여된 마우스에서 현저히 감소되는 것을 알 수 있었다(도 7 참조). 또한, NK 세포에서 특이적으로 발현되는 분 자들의 발현을 실시간 PCR 방법을 통해 RNA 수준으로 분석한 결과, NK 세포와 관련되어 있는 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)의 발현이 감소되는 것을 알 수 있었다(도 8 참조). 따라서 OPN의 결여가 NK 세포를 저해하는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 생체 내(In vivo) 및 시험관 내(In vitro)에서 얻은 각 분화 단계의 세포에서 OPN의 발현을 확인하기 위해, 실시간 PCR 및 ELISA 방법을 통해 분석하였다. 그 결과, 생체 내에서는 OPN 발현의 차이가 거의 없었으나(도 9 참조), 시험관 내에서는 mNK에서 좀 더 많은 OPN이 확인되었고, 기저(stromal) 세포에서 OPN의 발현은 현저하게 많은 양이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조). 따라서 세포 내의 OPN의 발현은 분화에 큰 영향을 미치지 못하나, 기저 세포 등 NK 세포가 분화되는 환경에 있는 세포에 의해서 분비되는 OPN의 양은 NK 세포가 분화되는데 영향을 미칠 만큼의 많은 양이 분비되고 있음을 알 수 있다.

본 발명자들은 NK 분화과정에 영향을 주는 OPN의 유래를 알아보기 위해, FACS를 통해 NK 세포의 분화 정도를 확인하였다. OPN이 결여된 마우스에서 얻은 HSC는 재조합 OPN에 의해 분화도가 향상되었고(도 11A 참조), OPN이 결여된 기저 세포와 HSC를 같이 배양한 세포는 NK 세포로 분화되는 것이 저해되었으며(도 11B 참조), OPN이 결여된 마우스에 넣은 HSC가 NK 세포로 분화되는 것이 현저하게 감소하는 것을 비장 및 폐에서 확인하였다(도 11C 참조). 그러나 정상 쥐에 OPN이 결여된 쥐에서 얻은 HSC와 대조군 HSC를 찔러 넣어 분화시킨 것은 차이가 없었다(도 11D 참조). 따라서 NK 세포가 분화할 때 외부 환경에 의해서 분비되는 OPN에 의해 영향을 받는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 OPN이 NK 분화에 영향을 주는데 필요한 분자를 알아보기 위해, NK 세포 분화시 OPN과 T-bet의 발현 변화를 실시간 PCR 및 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과, 재조합 OPN을 처리했을 때 T-bet의 발현이 증가하였고(도 12 참조), OPN이 결여된 마우스에서 T-bet의 발현이 감소된 것을 RNA 수준에서 확인하였다(도 13 참조). T-bet 처리에 의한 CD122의 발현이 조절되는 것을 프로모터 분석(promoter assay)를 이용하여 확인함으로써(도 14 참조), OPN에 의해서 증가된 T-bet이 CD122의 발현을 조절하여 NK 세포 분화를 강화하는 것을 추측할 수 있다. 이를 확인하기 위하여, T-bet이 결여된 마우스에서 분리한 HSC를 분화시킨 결과, OPN의 영향은 없었고(도 15 참조), 정상 마우스에서 바로 획득한 분화되지 않은 세포들에서도 OPN의 효과를 볼 수 없었다(도 16 참조). 따라서 OPN은 T-bet을 통해 NK 세포 분화에 영향을 주는 것을 알 수 있으며, OPN은 이미 NK 세포로 분화된 세포에는 영향을 주지 않고 분화되지 않은 세포들에 영향을 주는 것을 알 수 있었다(도 17 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, OPN은 HSC에서 NK 세포로의 분화를 촉진시키고, NK 세포의 세포살상능력을 증가시키므로 NK 세포의 분화용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 암은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 유방암, 흑색종암, 위암, 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

NK 세포의 분화와 활성에 결함이 생기게 되면 다양한 암이 발생하게 되는데, 예를 들어, 유방암(Konjevic G, et al ., Breast Cancer Res . Treat ., 66: 255-263, 2001), 흑색종암(Ryuke Y, et al ., Melanoma Res ., 2003, 13: 349-356) 및 폐암(Villegas FR, et al ., Lung Cancer , 35: 23-28, 2002)이 발생한다고 보고되어 있다. 따라서, 본 발명의 오스테오폰틴이 NK 세포 분화를 촉진시키고, NK 세포의 세포살상능력을 증가시키므로써 이를 포함하는 조성물을 투여하면 암을 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 오스테오폰틴에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직 하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은

1) HSC에 NK 세포 전구체 유도제를 첨가하여 NK 전구체 세포로의 증식을 유도하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 NK 전구체 세포에 OPN을 투여하여 성숙한 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 단계를 포함하는 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 NK 세포 전구체 유도제는 조혈줄기세포를 NK 전구체 세포로 유도 시킬 수 있는 물질은 의미하며, SCF 및 Flt3L인 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 NK 전구체 세포는 IL-15(Interleukin-15)과 함께 배양하는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 살펴본 바와 같이, OPN은 HSC에서 NK 세포로의 분화를 촉진시키고, NK 세포의 세포살상능력을 증가시키므로, 상기 방법은 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, 상기 방법에 의해 분화된 자연살해세포는 세포살상능력이 증가된다.

또한, 본 발명은

2) 상기 단계 1)의 NK 전구체 세포에 OPN을 투여하여 성숙한 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 HSC를 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 세포살상능력이 증가된 NK 세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 세포살상능력이 증가된 NK 세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 세포살상능력이 증가된 NK 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 OPN을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.

상기 OPN은 NK 세포의 분화를 촉진시키고, NK 세포의 세포살상능력을 증가시키므로써 면역을 증강시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명은 OPN을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 OPN을 식품 첨가물로 이용할 경우, 상기 OPN을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다.

유효 성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 OPN은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 OPN은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 첨가할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 OPN 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 골세포로부터 조혈줄기세포의 분리

6 내지 9주령의 C57BL/6 마우스(코아텍, 한국)에서 다리뼈를 얻어 막자사발로 갈아서 분쇄하여 분쇄물을 70 마이크론 세포 스트레이너(strainer)로 통과시킨 다음, 용해용액(Sigma, St. Louse, MO)을 처리하여 적혈구를 제거함으로써 골수세포를 얻었다. 상기 골수세포에서 이미 분화되어진 세포를 제거한 나머지 세포를 얻기 위하여 MACS(magnetic activated cell sorting)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 이용하여 음성 선택(negative selection)하는데, 이에 사용된 항체는 항(anti)-Mac-1, 항-Gr-1, 항-B220, 항-NK1.1, 항-CD2 및 항-TER-119(Becton-Dickinson and PharMingen, San Diego, CA)이다. 상기 음성 선택으로 얻은 세포로부터 항-CD117 항체를 통해 MACS를 이용하여 양성 선택(positive selection)하여 CD117+인 조혈줄기 세포(hematopoietic stem 세포, 이하 "HSC 세포"라 약칭함)를 분리하였다.

< 실시예 2> 조혈줄기세포로부터 NK 세포로의 분화

상기 <실시예 1>에서 골수로부터 분리한 CD117+ 세포를 1x10⁶ 세포수/웰(cells/well)의 농도로 싸이토카인 마우스 SCF(30 ng/ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ), 마우스 Flt3L(50 ng/ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ), 마우스 IL-7(5 ng/ml, PeproTech) 및 항생제[인도메타신(indometacin(2 ug/ml, Sigma), 젠타마이 신(gentamycin, Sigma)(20 ug/ml)]를 함유하는 배지를 사용하여 24-웰 플레이트(well plate)(Falcon, USA)에 접종하였다. 상기 세포를 37℃, 5% CO₂에서 7일 동안 배양하는데, 배양 3일 후 한번 같은 배지로 갈아주었다. 배양 7일 후, FITC 표지된 CD122 항체와 자석 비드가 붙은 항 FITC 항체를 이용하여 MACS로 CD122⁺인 NK 전구체 세포(premature NK 세포, 이하 "pNK 세포"라 약칭함)를 분리하였다.

성숙한 NK 세포(mature NK 세포, 이하 "mNK 세포"라 약칭함)로의 분화를 위해서, 배양 7일 후에 NK 분화에 중요한 싸이토카인 마우스 IL-15(50 ng/ml, PeproTech) 및 항생제[인도메타신(indometacin(2 ug/ml), 젠타마이신(gentamycin)(20 ug/ml)]을 첨가한 RPMI1640배지에서 세포를 다시 6일 추가 배양하였고, 배양 3일 후 배지를 갈아주었다. 배양 13일째, FITC로 표지된 항-NK1.1 항체와 자석 비드(MACS)가 붙은 항-FITC 항체를 이용하여 NK1.1⁺세포를 분리하였다. 성숙한 NK 세포는 항-CD122, NK1.1, DX5, NK 세포 수용체 항체들을 이용하여 FACS(Fluorescence activated cell sorter)(BD Bioscience, Mountainview, CA)로 분석하였다(도 1).

< 실시예 3> OPN 결손 마우스의 준비

미국 특허 제 6414219호에 기재된 바와 같이 제조된 OPN이 결여된 마우스를 젝슨 실험실(Jackson Laboratory, U.S.A)에서 구입하였다.

< 실시예 4> 마우스의 골수 및 비장에서 NK 세포 확인

대조군인 정상 마우스 및 OPN이 결여되어있는 마우스로부터 비장과 뼈를 분리하여, 비장은 스트레이너(strainer)에 넣고 막대로 갈아서 단일세포로 만들고, 뼈는 막자사발을 이용하여 갈아서 단일세포를 만들었다. 비장세포 및 골수세포는 용해 용액(Sigma, St. Louse, MO)을 처리하여 적혈구를 제거하고, PBS로 세척 후 항-NK1.1 항체 등을 이용하여 4℃에서 15분간 염색하였다. 상기 염색이 끝난 후 세척하여 FACS로 분석하여 NK 세포를 확인하였다.

< 실시예 5> 조혈줄기세포의 이식( transplantation )

공여세포를 비교하기 위해서는 공여세포를 대조군 마우스와 OPN이 결여된 마우스에서 HSC를 얻어서 준비하였다. 수여 마우스는 공여세포와의 구별을 위해서 CD45.1 항원을 가진 마우스(Jackson Laboratory, U.S.A)가 사용되었다. 수여 마우스에 Model 109 irradiator(JL Sephered & Associates, San Fernando, CA)로 감마선을 800 rad 조사(r-irradiaiton)하고 1일 후에 공여세포 HSC를 1X10⁶개를 꼬리 정맥으로 찔러 주입하고, 6주 후에 쥐의 비장과 폐에서 NK 세포를 FACS로 확인하였다. 수여 마우스를 비교하기 위해서 수여 마우스로 대조군 마우스 및 OPN이 결여된 마우스에 감마선을 조사한 후 사용되었고, 공여세포는 CD45.1 항원을 갖은 마우스에서 얻은 HSC를 사용하였다. 공여세포를 비교하기 위해서는 수여 마우스를 CD45.1항원을 가진 마우스를 사용하고, 공여세포는 대조군 및 OPN이 결여된 마우스 에서 얻은 HSC를 사용하여 같은 방법으로 실험하였다.

< 실험예 1> 재조합 OPN 이 NK 분화에 미치는 영향 조사

OPN이 NK 세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 시험관 내(in vitro)에서 HSC로부터 NK 세포를 분화시키면서 3일째 재조합 OPN(R&D Systems inc., Minneapolis, MN)을 2 ug/ml로 1x10⁶ HSC 세포에 처리하여 NK 전구체에 특징적으로 발현하는 CD122의 발현, 및 NK 세포에 발현하는 NK1.1의 발현을 FACS로 분석하여 대조군과 비교하였다. 그 결과, 재조합 OPN을 처리하면서 분화를 유도한 세포들이 대조군에 비하여 NK 세포로 분화되는 것이 강화된 것을 확인하였다(도 2).

또한, 상기 결과가 재조합 OPN에 특이적인 반응인지를 알아보기 위해, OPN 항체(ABcam, Cambridge, UK)로 재조합 OPN을 저해함으로 확인하였다(도 3).항체는 HSC로부터 NK 세포로 분화 시키면서 3일째, 재조합 OPN을 처리하기 1시간 전에 1ug/ml 사용하였고, 3일 후에 재조합 OPN의 효과가 저해된 것을 확인하였다.

또한, NK에 관련된 분자들인 CD122 및 NK1.1이 재조합 OPN에 의한 발현 변화를 RT-PCR 방법을 통해 RNA 수준에서 확인하였다. HSC, NK 전구체, mNK 세포에서 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 RNA를 분리하고, 3ug의 RNA를 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Roche)와 함께 37℃에서 1시간 배양하여 cDAN를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Maxime PCR Premix 키트(Intron, 한국)를 이용하여 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로 28회 또는 32회로 PCR을 행하고, 72℃에서 10분 더 확장 반응시킨 다음 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 에티듐 브로마이드 염색으로 확인하였다. 또한, 실시간 PCR 키트인 SYBR Premix Ex Tag(TaKaRa, Tokyo, Japan)을 이용하여 DiceTm TP 800 Thermal Cycler (TaKaRa)로 PCR을 수행하였다. 제조사의 권고에 따라 CD122 및 NK1.1의 RNA를 분리하고, 실시간 PCR 키트(Quiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 권고에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 포함하는 PCR 혼합물을 95℃에서 1분간 가열하고, HSC와 mNK 세포에 대해서는 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로, NK 전구체 세포에 대해서는 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 28회 또는 32회로 PCR을 행하고, 72℃에서 10분 더 확장 반응시킨 다음 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 에티듐 브로마이드 염색으로 확인하였다.

그 결과, CD122 및 NK1.1은 재조합 OPN을 통해 더 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 4). 따라서 OPN이 NK 분화 과정에 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 2> 재조합 OPN 이 NK 세포독성 활성에 미치는 영향 조사

분화시킨 NK 세포에 IL-2(10 u/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 상기 배양시킨 NK 세포를 세척 후 효과세포(Effector cell) : 표적세포(Target cell) 비율에 따라 표적세포인 ⁵¹Cr-표지된 YAC-1 세포(10⁴/웰)와 함께 96 웰 둥근 바닥 플레이트(well round bottom plate, Falcon, USA)에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시 간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 상층액을 취하여 감마-카운터(γ-counter)로 ⁵¹Cr 방출분석(release assay)을 수행하였다.

그 결과, 재조합 OPN을 통해 더 많이 늘어난 NK의 세포독성 활성이 더 높은 것을 확인하였다(도 5). 따라서 OPN이 NK의 활성에 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 3> OPN 결손 마우스에서 NK 세포 분화 확인

대조군 마우스 및 OPN이 결여된 마우스에서 NK1.1+CD3-NK 세포를 FACS 분석을 통해 확인한 결과, OPN이 결여된 마우스의 비장과 골수에서 NK 세포가 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 6).

또한, NK1.1+이면서 성숙된 NK 세포에서 많이 발현하는 분자인 LY49s 분자의 발현을 각 LY49 분자에 대한 항체로 정상 쥐와 OPN이 결여된 마우스의 비장세포와 골수세포에서 FACS로 비교분석한 결과, Ly49 수용체의 발현은 OPN이 결여된 마우스에서 현저히 감소되었다(도 7).

또한, NK 세포에서 특이적으로 발현되는 분자들의 발현을 RT-PCR 방법을 통해 RNA 수준으로 분석하였다. 그 결과, NK 세포와 관련되어 있는 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 8). 따라서 OPN의 결여가 NK 세포를 저해시키는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 4> 파라크린 ( Paracrine ) OPN 이 NK 세포 분화에 미치는 영향

생체 내(In vivo)에서 얻은 각 분화 단계의 세포를 FACSAria를 이용하여 분리한 후, 실시간 PCR 방법을 통해 RNA 수준으로 분석한 결과, OPN 발현의 차이가 거의 없음을 확인하였다(도 9). 그러나 시험관 내(In vitro)에서 분화시켜 얻은 분화 단계별 세포에서 OPN의 발현을 ELISA로 확인한 결과, mNK에서 좀 더 많은 OPN이 확인되었고, 기저(stromal) 세포에서 OPN의 발현은 현저하게 많은 양이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 따라서 세포 내의 OPN의 발현은 분화에 큰 영향을 미치지 못하나, 기저 세포 등 NK 세포가 분화되는 환경에 있는 세포에 의해서 분비되는 OPN의 양은 NK 세포가 분화되는데 영향을 미칠 만큼의 많은 양이 분비되고 있음을 알 수 있었다.

또한, OPN이 결여된 마우스에서 얻은 HSC를 시험관 내에서 분화시켜 대조군과 비교한 결과, 대조군 마우스만큼 NK 세포로 충분히 분화하였고, 여기에 재조합 OPN을 처리하여 NK 세포의 분화를 확인한 결과, 분화 정도가 향상된 것을 확인하였다(도 11A). 반대로, OPN이 결여된 기저 세포와 HSC를 같이 배양하여 기저 세포로부터 나온 OPN의 효과를 확인한 결과, 상기 OPN이 결여된 기저 세포는 NK 세포로 분화되는 것이 저해되었다(도 11B).

또한, 정상 마우스에서 얻은 공여 세포 HSC를 수여 마우스인 정상 마우스와 OPN이 결여된 마우스에 넣은 다음, 6주 동안 분화시킨 후, NK 세포의 분화된 정도를 확인한 결과, OPN이 결여된 마우스에 찔러 넣은 HSC가 NK 세포로 분화되는 것이 현저하게 감소하는 것을 비장 및 폐에서 확인하였다(도 11C).

또한, 정상 마우스와 OPN이 결여된 마우스에서 얻은 공여세포 HSC를 수여 마우스인 정상 마우스에 찔러 넣어서 NK 세포로 분화를 유도시킨 뒤에 NK 세포로 분화된 정도를 확인한 결과, 정상 마우스에 OPN이 결여된 마우스에서 얻은 HSC와 대조군 HSC를 찔러 넣어 분화시킨 것은 차이가 없었다(도 11D). 따라서 NK 세포가 분화할 때 외부 환경에 의해서 분비되는 OPN에 의해 영향을 받는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 5> T- bet 을 통한 OPN 효과 확인

마우스의 골수로부터 얻은 HSC를 시험관 내에서 NK 세포로 분화시키는 과정에서, 재조합 OPN을 처리했을 때 T-bet의 발현을 RT-PCR 및 실시간 PCR로 분석한 결과, T-bet의 발현이 증가하였고(도 12), OPN이 결여된 마우스에서도 T-bet의 발현이 감소하였다(도 13). T-bet에 의한 CD122 발현을 확인하기 위해서 CD122 프로모터에 재조합 되어있는 luciferase 플라스미드와 T-bet이 재조합된 플라스미드를 293T 세포주에 형질전환 시킨 후,세포를 분쇄하여 luciferase의 기질인 luciferin과 반응시켜 확인하였고, 분석한 결과, T-bet은 CD122를 조절하므로(도 14), 이는 OPN에 의해서 증가된 T-bet이 CD122의 발현을 조절하여 NK 세포 분화를 강화하는 것을 추측할 수 있다.

이를 확인하기 위하여 T-bet이 결여된 마우스(Jackson Laboratory, U.S.A)에서 분리한 HSC를 분화시켜서 NK로 분화되는 정도를 대조군과 비교하고, 여기에 재조합 OPN을 처리함으로 OPN의 NK 분화를 유도하는데 T-bet이 기여하는 것을 FACS로 분석한 결과, OPN의 영향을 볼 수 없었다(도 15).

또한, T-bet이 결여된 마우스의 골수에서 직접 분화 단계에 있는 세포를 얻어 CD122의 발현여부를 대조군과 비교하였고, 여기에 재조합 OPN을 처리함으로 OPN의 NK 분화를 유도하는데 T-bet이 기여하는 것을 FACS로 분석한 결과, 정상 마우스에서 바로 획득한 분화되지 않은 세포들에서도 대조군과 다르게 OPN의 효과를 볼 수 없었다(도 16). 따라서 OPN은 T-bet을 통해 NK 세포 분화에 영향을 주는 것을 알 수 있다.

또한, 정상 마우스와 T-bet이 결여된 마우스와 OPN이 결여된 마우스의 비장에서 NK 세포를 분리하여 아직 분화되지 않은 분화단계의 세포들을 각 마우스에서 얻어 CD122 발현을 FACS로 분석한 결과, OPN은 이미 NK 세포로 분화된 세포에는 영향을 주지 않고 분화되지 않은 세포들에 영향을 주는 것을 알 수 있었다(도 17).

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

OPN 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

OPN 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

OPN 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

OPN 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

OPN 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<1-6> 주사액제의 제조

OPN 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 OPN을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃ 에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

< 제조예 2> 식품의 제조

상기 <제조예 1>의 산제, 정제, 캡슐제, 환 및 과립을 식품에 응용하여도 무방하며, 상기의 OPN을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

OPN 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조

OPN 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

OPN 10 중량부를 그라운 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품( dairy products )의 제조

OPN 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

OPN을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 OPN을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

OPN(1 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제조예 3> 음료의 제조

OPN을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5 중량부), 올리고당(2 중량부), 설탕(2 중량부), 식염(0.5 중량부), 물(75 중량부)과 같은 부재료와 OPN(0.5 중량부)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

<3-2> 야채쥬스의 제조

OPN 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

<3-3> 과일쥬스의 제조

OPN 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

도 1은 마우스의 골수 세포로부터 분리한 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell; HSC)를 NK 세포로 성숙시키는 과정을 나타내는 그림이다:

pNK: NK 전구체 세포(premature NK 세포); 및

mNK: 성숙한 NK 세포(mature NK 세포).

도 2는 재조합 단백질인 오스테오폰틴(Osteopontin; OPN)을 처리한 실험군과 OPN을 처리하지 않은 대조군에서 유세포(flow cytometric) 분석을 이용하여 NK 분화 단계에 따른 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 3은 OPN을 처리하여 분화시킨 NK 세포의 활성에 대한 OPN에 대한 항체의 저해 효과를 나타내는 그림이다.

도 4는 OPN을 처리한 실험군과 OPN을 처리하지 않은 대조군에서 NK 분화에 따른 발현 정도를 RT-PCR 및 실시간(real-time) PCR 방법으로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 5는 OPN을 처리하여 분화시킨 NK 세포의 활성을 ⁵¹Cr 방출분석(release assay)을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 6은 OPN이 결여된 마우스의 골수 및 비장 세포에서 NK 세포를 FACS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 7은 성숙된 NK 세포에서 많이 발현하는 분자인 LY49s 분자의 발현을 정상 쥐와 OPN이 결여된 마우스에서 비교분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 8은 NK 세포에서 특이적으로 발현되는 분자들은 실시간(real-time) PCR 방법으로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 9는 마우스에서 NK 세포로 분화하는 과정의 각 분화단계의 세포를 FACSAria를 이용하여 분리한 후, OPN의 발현을 실시간(real-time) PCR로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 10은 마우스의 골수로부터 얻은 HSC를 시험관 내(in vitro)에서 NK 세포로 분화시키는 과정에서 얻은 각 분화단계의 세포를 분리하여 OPN의 발현을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 11A는 OPN이 결여되어있는 마우스에서 얻은 HSC를 시험관 내에서 분화시켜 대조군과 비교하여 분화된 정도를 FACS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 11B는 마우스의 골수에서 얻은 HSC를 정상 마우스에서 얻은 기저세포와 OPN이 결여되어있는 기저세포와 같이 배양하여 기저세포로부터 나온 OPN의 효과를 나타내는 그림이다.

도 11C는 정상 마우스에서 얻은 공여 세포 HSC를 수여 마우스인 정상 마우스와 OPN이 결여된 마우스에 넣은 다음, 6주 동안 분화시킨 후, NK 세포의 분화된 정도를 나타내는 그림이다.

도 11D는 정상 마우스와 OPN이 결여된 마우스에서 얻은 공여세포 HSC를 수여 마우스인 정상 마우스에 찔러 넣어서 NK 세포로 분화를 유도시킨 뒤에 NK 세포로 분화된 정도를 나타내는 그림이다.

도 12는 마우스의 골수로부터 얻은 HSC를 시험관 내에서 NK 세포로 분화시키 는 과정에서 T-bet의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 13은 OPN이 결여된 마우스의 골수에서 T-bet 발현을 RT-PCR 및 실시간(real-time) PCR로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 14는 기존에 알려진 T-bet에 의한 cd122 발현을 프로모터 분석(promoter assay)를 통해 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 15는 T-bet이 결여된 마우스에서 얻은 HSC를 분화시켜서 NK로 분화되는 정도를 대조군과 비교하고, 여기에 재조합 OPN을 처리함으로 OPN의 NK 분화를 유도하는데 T-bet이 기여하는 것을 FACS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 16은 T-bet이 결여된 마우스의 골수에서 직접 분화 단계에 있는 세포를 얻어CD122의 발현여부를 대조군과 비교하였고, 여기에 재조합 OPN을 처리함으로 OPN의 NK 분화를 유도하는데 T-bet이 기여하는 것을 FACS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 17은 정상 마우스와 T-bet이 결여된 마우스와 OPN이 결여된 마우스의 비장에서 NK 세포를 분리하여 아직 분화되지 않은 분화단계의 세포들을 각 마우스에서 얻어 CD122 발현을 FACS로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

Claims

오스테오폰틴(Osteopontin, OPN)을 유효 성분으로 함유하는 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포) 분화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 자연살해세포의 세포살상능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화용 조성물.
오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 암은 유방암, 흑색종암, 위암, 간암 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 조성물.
1) 조혈줄기세포에 자연살해세포 전구체 유도제를 첨가하여 자연살해세포 전구체 세포로의 증식을 유도하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 자연살해세포 전구체 세포에 오스테오폰틴을 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 자연살해세포 전구체 유도제는 SCF, Flt3L 또는 IL-7인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 자연살해세포 전구체 세포를 IL-15(Interleukin-15)과 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
1) 조혈줄기세포에 자연살해세포 전구체 유도제를 첨가하여 자연살해세포 전구체 세포로의 증식을 유도하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 자연살해세포 전구체 세포에 오스테오폰틴을 투여하는 단계를 포함하는 세포살상능력이 증가된 자연살해세포의 분화 방법.
제 9항에 있어서, 상기 단계 1)의 자연살해세포 전구체 유도제는 SCF, Flt3L 또는 IL-7인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 단계 2)의 자연살해세포 전구체 세포를 IL-15(Interleukin-15)과 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항의 방법에 의해 세포살상능력이 증가된 자연살해세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
제 9항의 방법에 의해 세포살상능력이 증가된 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 암은 유방암, 흑색종암, 위암, 간암 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료 방법.
오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강기능식품.
제 15항에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
제 15항에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 자연살해세포의 세포살상능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
오스테오폰틴을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 18항에 있어서, 상기 암은 유방암, 흑색종암, 위암, 간암 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품.