RU2346044C2 - ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum - Google Patents
ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2346044C2 RU2346044C2 RU2006145779/13A RU2006145779A RU2346044C2 RU 2346044 C2 RU2346044 C2 RU 2346044C2 RU 2006145779/13 A RU2006145779/13 A RU 2006145779/13A RU 2006145779 A RU2006145779 A RU 2006145779A RU 2346044 C2 RU2346044 C2 RU 2346044C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hum
- protein
- pbmc
- gene
- expression
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии. Предлагается экспрессионная плазмида ДНК pBMC-gp140(A)-hum, содержащая искусственный ген gp140(A)-hum, для экспрессии белка Gp140(A)-hum в клетках эукариот, что позволяет в 6-8 раз повысить выход синтетического белка Gp140(A)-hum no сравнению с прототипом. Изобретение может быть использовано в медицине и смежных отраслях для повышения экспрессии белков, в частности кодируемого геном gp140 белка Gp140 или его фрагментов в эукариотических клетках. 3 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения вакцинных препаратов с помощью методов генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано в медицине и смежных отраслях для повышения экспрессии белков, в частности белка Gp140 как фрагмента белка Env вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А или его фрагментов и синтетических аналогов в эукариотических клетках.
Одной из глобальных проблем, стоящих перед биотехнологией, является повышение выхода веществ, продуцируемых клетками прокариот и эукариот. Для решения указанных задач, как правило, клетки подвергают воздействию различных внешних факторов: повышению температуры выше 42°С, уменьшению количества питательных веществ, например фосфатов или азота, до уровня, лежащего ниже того, который требуется для выживания микроорганизмов, токсическое воздействие - например использование красителей, кислот или эксудатов растений, метаболическое разрушение клеток в результате изменения уровня содержания ионов, воздействующих на способность микроорганизмов к осморегуляции, или введение витаминов или кофакторов, которые способны вызвать прекращение метаболизма (RU 2179980, 2002).
Однако, т.к. воздействие вышеперечисленных факторов на выход конкретных продуцентов характеризуется высокой видоспецифичностью, то для каждого конкретного случая необходимо проведение большого объема исследований.
Наиболее сложно вопросы стимулирования экспрессии решаются в случае получения вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), для изготовления которых необходимо научиться добиваться экспрессии вирусных белков в клетках эукариот без введения вируса, что позволило бы выработать в организме необходимый иммунный ответ. Проблема связана с особенностями последовательностей генов вируса иммунодефицита человека, в частности с использованием в вирусных генах кодонов, не характерных для интенсивно экспрессирующихся генов млекопитающих, в частности человека, а также большая вариабельность вирусной популяции, выраженная в генетической дивергенции.
Одним из подходов к решению этой проблемы является использование геномов ретро-вирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов в качестве стимуляторов для экспрессии протективных антигенов патогенных вирусов в клетках млекопитающих.
Наиболее детально исследования проводились с использованием вируса осповакцины (ВОВ). В частности, были сконструированы рекомбинантные ВОВ, экс-прессирующие отдельно индивидуальные белки ВИЧ-1: gp160, gp120. Tat и обратную транскриптазу (Moss В., and Flexner С. // Ann. Rev. Immunol, 1987, v.5, p.305; Moss В. // Seminars in Virology, 1992, v.3, p.277; Falkner F.G., et al. // Virology, 1988, v.164, p.450; Flexner C., et al. // Virology, 1988, v.166, p.339; Takahashi H., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.3105; Walker B.D, et al. // Science, 1988, v.240, p.64; Willey R.L., et al. // J.Virol, 1988, v.62, p.139). Полученные рекомбинантные BOB были использованы для иммунизации лабораторных животных и выявления белков ВИЧ-1, способных вызывать индукцию нейтрализующих вирус антител. Однако с помощью рекомбинантных ВОВ не удалось индуцировать полноценный протективный иммунный ответ против ВИЧ-инфекции. По-видимому, это обусловлено низкой иммуногенностью индивидуальных вирусных белков (RU 2194075, 2002).
Для решения проблемы получения иммунного ответа на белки ВИЧ был создан белок TBI, который включает в свой состав несколько клеточных эпитопов ВИЧ-1. Однако при его использовании не удается получить весь спектр целевых продуктов. Кроме того, степень экспрессии получаемых белков недостаточно высока (RU 2237089, 2005).
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pUE 41, содержащая BamHI - Hin-dIII фрагмент плазмидной ДНК pUR292, Bg1II-HindIII фрагмент плазмидной ДНК рВН292, уникальный сайт рестрикции HindIII, а также следующие гены и генетические маркеры:
- ген bla, обеспечивающий синтез β-лактамазы,
- ген lacZ, обеспечивающий синтез α частицы β-галактозидазы,
- фрагмент гена env ВИЧ-1, обеспечивающий синтез полипептида, обладающего антигенным свойством белков оболочки вируса иммунодефицита человека первого типа. Данная плазмидная ДНК обеспечивает синтез в клетках E.coli гибридного полипептида, способного связывать антитела к белкам оболочки ВИЧ-1 gp120 и gp41. При этом образуется слитый белок, N-концевая часть которого содержит β-галактозидазу, а С-конец - искомый фрагмент гена env (SU 1766070).
Известна также рекомбинантная плазмидная ДНК pESG, которая используется для экспрессии фрагмента гена env Т-лимфотропного вируса человека первого типа (HTLV-1) в клетках E.coli. Как и в предыдущем случае, в бактериальных клетках образуется слитый белок, N-конец которого содержит β-галактозидазу, а С-конец - часть гена env HTLV-1. Структура плазмиды сходна с описанной в предыдущем случае (RU 2081172, 2000).
Однако экспрессия гена env ВИЧ-1 или других ретровирусов, а также его фрагментов, например белков gp120 или gp140, в клетках высших эукариот с помощью таких конструкций обеспечиваться не может.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является стимулирование экспрессии гена env в виде белка Gp120, введением в клетку высших эукариот экспрессионной плазмидной ДНК pBMC-gp120(A)m-1, содержащей модифицированный ген gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А (пат. РФ №2229518, 2002). Недостатком указанного стимулятора являлся: невысокий выход целевого продукта, низкая иммунологическая представленность некоторых аминокислот синтезируемого белка Gp120, в популяции ВИЧ-инфицированных индивидуумов на территории России и потеря важных иммунологических эпитопов, представленных в области белка Gp41.
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание стимулятора синтеза белка Gp140, позволяющего повысить его выход и иммуногенность.
Технический результат был получен при использовании в качестве стимулятора экспрессионной плазмидной ДНК, содержащей модифицированный ген gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, названный gp120(A)m-1, последовательность которого представлена на фиг.1а-1в.
В основу изобретения были положены представления о том, что в генах вируса имеются так называемые ингибирующие участки (INS), в которых много аденина и тимина и редко встречаются гуанин и цитозин. Содержание в составе мРНК таких участков приводит к преждевременному распаду мРНК в клеточном ядре. Для транспорта вирусных мРНК из ядра в цитоплазму вирус использует свой вирусный белок - Rev. Пока Rev не синтезировался и не проник в ядро, вирусные мРНК будут находиться в ядре и там подвергаться деградации. Появившийся в ядре Rev связывается со специфической последовательностью RRE (Rev Responsible Element) в мРНК вируса, переносит мРНК в цитоплазму, где затем синтезируются вирусные белки, в том числе Env. В результате проведенных авторами исследований было установлено, что при устранении из гена gp120 ингибирующих участков удается в 10-15 раз повысить выход белка gp120.
Согласно настоящему изобретению новый стимулятор был получен по следующей методике.
Был осуществлен анализ кодонов в составе фрагмента гена env, кодирующего белок Gp140 ВИЧ-1 субтипа А. Все кодоны с высоким содержанием аденина и тимина были заменены на синонимичные кодоны со сниженным содержанием аденина и тимина и, соответственно, более высоким содержанием гуанина и цитозина, при этом в состав гена предпочтительно включали кодоны, характерные для интенсивно экспрессирующихся генов человека. Кроме того, в последовательность гена включили последовательность Козака, инициирующий и два терминирующих трансляцию кодоны. Также были выявлены кодоны, соответствующие редко встречаемым аминокислотам в иммунологически важных областях белка Gp120, и заменены на кодоны аминокислот, часто встречающихся в популяции ВИЧ-1 на территории России и стран СНГ. Кроме того, к последовательности белка Gp120 были добавлены две иммунологически важные области белка Gp41 и заменена последовательность природного сигнального пептида на последовательность, кодирующую сигнальный пептид тканевого активатора плазминогена человека. В результате с помощью автоматизированного химического синтеза был получен искусственный ген gp140(A)-hum, кодирующий синтетический белок Gp140(A)-hum, который был вставлен в вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-gp140(A)-hum.
Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:
На фиг.1а-1в - последовательность нуклеотидов гена gp140(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов гена gp120(A)m-1 (прототип);
На фиг.2а-2г - последовательность нуклеотидов гена gp140(A)-hum в сравнении с последовательностью нуклеотидов природного гена env(A);
На фиг.3а-3б - последовательность аминокислот белка Gp140(A)-syn в сравнении с последовательностью аминокислот белка Env(A) (прототип).
Нуклеотиды и аминокислоты, одинаковые для представленных генов, отмечены в сравниваемой последовательности точкой (.), отсутствующие в последовательностях - тильдой (~), различающиеся - приведены соответствующей буквой. Ген gp140(A)-hum длиной 1830 нуклеотидов отличается от прототипа Gp120(A)m-1 по 809 нуклеотидам и по 1325 нуклеотидам отличается от природного гена env (A). Белок Gp140(A)-hum длиной 608 аминокислот отличается от прототипа Env(A) по 309 аминокислотам.
Промышленная применимость заявляемого стимулятора синтеза белка и синтетического белка иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение плазмидной ДНК, обеспечивающий экспрессию синтетического белка Gp140(A)-hum с использованием искусственного гена gp140(A)-hum
Искусственный ген gp140(A)-hum, последовательность которого представлена на фиг.1, получали при помощи химического синтеза перекрывающихся фрагментов с последующим отжигом и лигированием. Собранный ген вставляли известным способом в плазмидный вектор рВМС с получением экспрессионной плазмиды pBMC-gp140(A)-hum. Полученной плазмидой pBMC-gp140(A)-hum трансформировали клетки Escherichia coli для ее последующей наработки.
Пример 2. Изучение синтеза синтетического белка Gp140(A)-hum в эукариотических клетках
Культуру клеток человека линии 293 трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды pBMC-gp140(A)-hum. В качестве контроля параллельную культуру клеток 293 трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMC-gp120(A)m-1. Трансформированные культуры клеток инкубировали в питательной среде в течение 48 часов при температуре +37°С и содержании СО2 в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белкам Gp120 и Gp140, анализировали с помощью компьютизированной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК pBMC-gp140(A)-hum, уровень синтетического белка Gp140(A)-hum не менее чем 6-8 раз выше, чем синтез белка Gp120(A) в клетках, трансформированных контрольной плазмидой рВМС-gp120(A)m-1.
Пример 3. Использование плазмидной ДНК pBMC-gp140(A)-hum для иммунизации
Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно трехкратно по 10 микрограмм плазмидной ДНК pBMC-gp140(A)-hum, контрольной группе мышей вводили аналогичную дозу pBMC-gp120(A)m-1. Через 6 недель в сыворотках крови животных определяли титры антител к природному вирусному белку Gp120 известным способом. Результаты приведены в таблице 1.
Титры антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных плазмидными ДНК pBMC-RT(A)-hum и pBMC-RT(A)m-1 | |
Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-gp140(A)-hum | 1:4096 |
Титры антител при введении ДНК плазмиды pBMC-gp120(A)m-1 | 1:1024 |
Полученные результаты показали, что использование в качестве стимулятора синтеза белка Gp140(A)hum в клетках эукариот искусственного гена gp140(A)-hum позволяет примерно в 6-8 раза повысить выход целевого продукта.
Claims (1)
- Экспрессионная плазмида ДНК pBMC-gp140(A)-hum для экспрессии белка Gp140(A)-hum в клетках эукариот, отличающаяся тем, что она содержит искусственный ген gp140(A)-hum, имеющий последовательность нуклеотидов, представленную на фиг.1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006145779/13A RU2346044C2 (ru) | 2006-12-25 | 2006-12-25 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006145779/13A RU2346044C2 (ru) | 2006-12-25 | 2006-12-25 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006145779A RU2006145779A (ru) | 2008-06-27 |
RU2346044C2 true RU2346044C2 (ru) | 2009-02-10 |
Family
ID=39679760
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006145779/13A RU2346044C2 (ru) | 2006-12-25 | 2006-12-25 | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2346044C2 (ru) |
-
2006
- 2006-12-25 RU RU2006145779/13A patent/RU2346044C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2006145779A (ru) | 2008-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sathaliyawala et al. | Assembly of human immunodeficiency virus (HIV) antigens on bacteriophage T4: a novel in vitro approach to construct multicomponent HIV vaccines | |
EP1240186B1 (en) | Improvements in or relating to immune responses to hiv | |
CN105263506B (zh) | 稳定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚体疫苗及其使用方法 | |
CN111603557A (zh) | 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 | |
Gherardi et al. | Interleukin-12 (IL-12) enhancement of the cellular immune response against human immunodeficiency virus type 1 env antigen in a DNA prime/vaccinia virus boost vaccine regimen is time and dose dependent: suppressive effects of IL-12 boost are mediated by nitric oxide | |
CN110494159A (zh) | 在接受抗逆转录病毒治疗的对象中诱导针对人类免疫缺陷病毒感染的免疫应答的方法 | |
RU2747762C1 (ru) | Вакцина для профилактики или лечения коронавирусной инфекции на основе генетической конструкции | |
CN112442514B (zh) | 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒 | |
He et al. | Self-assembling nanoparticles presenting receptor binding domain and stabilized spike as next-generation COVID-19 vaccines | |
Kardani et al. | B1 protein: a novel cell penetrating protein for in vitro and in vivo delivery of HIV-1 multi-epitope DNA constructs | |
US8685407B2 (en) | Genetic constructs and compositions comprising RRE and CTE and uses thereof | |
RU2346044C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum | |
RU2345138C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК р-ВМС-gag(A)-hum ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА р55 ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ | |
US20220380412A1 (en) | Compositions comprising v2 opt hiv envelopes | |
RU2355764C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-RT(А)-hum ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2335540C1 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-nef(A)-hum | |
Wang et al. | DNA inoculation induces cross clade anti-HIV-1 responses | |
RU2241752C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках | |
RU2227161C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвмс-qp120(a)m-1 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека | |
RU2238977C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвмс-rt(a)m-1, используемая для экспрессии обратной транскриптазы (rt) вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот | |
RU2194075C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTBI-HBsAg, СОДЕРЖАЩАЯ ХИМЕРНЫЙ ГЕН TBI-HBsAg ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА p7.5K ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, И ШТАММ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРОТИВ ВИЧ И ГЕПАТИТА B ЧЕЛОВЕКА В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ | |
Zabihollahi et al. | Introducing a frameshift mutation to the POL sequence of HIV-1 provirus and evaluation of the immunogenic characteristics of the mutated virions (RINNL4-3) | |
Aghasadeghi et al. | Production and evaluation of immunologic characteristics of mzNL4-3, a non-infectious HIV-1 clone with a large deletion in the pol-Sequence | |
CN117586422A (zh) | 一种鸭坦布苏病毒核酸疫苗及应用 | |
Aghasadeghia et al. | CELL MOLECULAR BIOLOGY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081226 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20110410 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111226 |