RU2241752C1 - Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках Download PDFInfo
- Publication number
- RU2241752C1 RU2241752C1 RU2003116170/13A RU2003116170A RU2241752C1 RU 2241752 C1 RU2241752 C1 RU 2241752C1 RU 2003116170/13 A RU2003116170/13 A RU 2003116170/13A RU 2003116170 A RU2003116170 A RU 2003116170A RU 2241752 C1 RU2241752 C1 RU 2241752C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gag
- plasmid
- human immunodeficiency
- immunodeficiency virus
- mod
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к генетической инженерии и иммунологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod. Плазмида содержит в своем составе ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, в последовательности нуклеотидов которого в кодонах с преобладанием аденина и/или тимина аденин и/или тимин частично заменены на гуанин и/или цитозин. Плазмида обеспечивает высокий уровень экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках. Предложенная плазмида может быть использована для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А. 3 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к генетической инженерии и иммунологии, и может быть использовано для иммунизации против вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А в эукариотических клетках.
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pATLG 579, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli гибридного белка, кодируемого фрагментом гена gag Т-лимфотропного вируса человека (HTLV) и обладающего антигенными свойствами по отношению к антителам против указанного вируса I и II типа. Гибридный белок, кодируемый данной плазмидой, состоит из 579 аминоктслот, из которых 234 аминокислоты представляют собой полипептид, кодируемый геном gag HTLV, участок длиной в 341 аминокислоту является фрагментом бета-галактозидазы и еще 4 аминокислоты кодируются полилинкером вектора. Кроме того, в состав данной плазмиды входит фрагмент вектора pUR290 размером 5,2 т.п.н., содержащий служебные последовательности: промотор, обеспечивающий экспрессию гибридного белка в клетках Escherichia coli, бактериальный репликатор и ген устойчивости к ампициллину, используемый в качестве селективного маркера. Для получения данной плазмиды на матрице промежуточной плазмиды pSma 2131 с помощью полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, содержащими на своих концах сайты рестрикции ВамН I и Сlа I, амплифицируют фрагмент гена gag, который очищают при помощи электрофореза в агарозе, гидролизуют рестриктазами ВамН I и Сlа I и лигируют с обработанным данными рестриктазами вектором pUR 290. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli с последующим отбором трансформированных клонов по способности расти на питательной среде с ампициллином. Далее осуществляют культивирование трансформированных клеток Escherichia coli в жидкой питательной среде с последующей очисткой из полученной биомассы гибридного белка, обладающего антигенными свойствами HTLV I/II, см. RU 2149876.
Данное техническое решение позволяет осуществлять синтез полипептида, кодируемого геном gag, в виде гибридного белка в бактериальных клетках. Однако синтез белков, кодируемых геном gag, в клетках высших эукариот не осуществляется.
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pGDN, обеспечивающая синтез в ктетках Escherichia coli гибридного белка, содержащего полипептид, кодируемый фрагментом гена gag вируса HTLV I типа. Данная рекомбинантная плазмидная ДНК содержит NcoI - Sma I фрагмент гена gag вируса HTLV-1, фрагмент гена бета-галактозидазы, служебные последовательности: промотор, обеспечивающий экспрессию гибридного белка в клетках Escherichia coli, бактериальный репликатор, ген устойчивости к ампициллину, используемый в качестве селективного маркера, и уникальные сайты рестрикции BamHI, PstI, Stu I, Tth111-II. Для получения данной плазмиды Nco I - Sma I фрагмент гена gag генома HTLV-I, кодирующего белки матрикса и нуклеокапсида, выделенный из плазмиды рМТ2, содержащей полноразмерную копию генома вируса, встраивают в плазмидный вектор pUR290. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli с последующим отбором трансформированных клонов по способности расти на питательной среде с ампициллином. Далее трансформированные клетки Escherichia coli культивируют известным способом с последующей очисткой гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса HTLV I типа, см. RU, A1, 93058018.
Данное техническое решение позволяет осуществлять синтез полипептида, кодируемого геном gag, в виде гибридного белка в бактериальных клетках. Однако синтез белков, кодируемых геном gag, в клетках высших эукариот также не осуществляется.
Как следует из приведенного выше анализа уровня техники, близких аналогов, которые могли бы быть приняты за прототип настоящего изобретения, не выявлено.
В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания рекомбинантной плазмидной ДНК, которая обеспечивает экпрессию белков р17, р24, р6 и р7, в виде общего белка-предшественника, кодируемого геном gag вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 субтипа А в клетках высших эукариот.
Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках содержит ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.
Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых представлены:
на фиг.1 - последовательность нуклеотидов гена gag российского варианта субтипа А ВИЧ-1;
на фиг.2 - последовательность нуклеотидов в модифицированном гене gag российского варианта субтипа А ВИЧ-1. Замены оснований подчеркнуты;
на фиг.3 - структура плазмидной ДНК pBMC-gag(A)mod-1.
Обозначения на фиг.3: bla - ген бета-лактамазы, ori - репликатор, Р - промотор предранних белков цитомегаловируса, BGH - участок терминации транскрипции и полиаденилирования, gag(A)mod - фрагмент ДНК, содержащий измененные нуклеотиды.
Получение плазмидной ДНК pBMC-gag(A)mod осуществляется следующим образом. Фрагмент ДНК, кодирующий ген gag ВИЧ-1 субтипа А, выделяли при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей в которой служила ДНК из лимфоцитов периферической крови пациента, инфицированного вирусом иммунодефицита человека первого типа субтипа А. Данный фрагмент клонировали в плазмидный вектор рВМС, получив в результате плазмиду pBMCgag(A), содержащую природный ген gag. Далее выделяли полученную плазмиду pBMCgag(A) и вводили в последовательность гена gp120 необходимые замены нуклеотидов известным способом, получив в результате плазмиду pBMCgag(A)-mod. Полученной плазмидой pBMCgag(A)-mod трансформировали клетки Escherichia coli для последующей наработки.
Изучение синтеза белка-предшественника р55 в эукариотических клетках происходит следующим путем. Культуру клеток 3Т3 мыши трансформировали ДНК рекомбинантной плазмиды pBMCgag(A)-mod. В качестве контроля параллельную культуру клеток 3Т3 трансформировали равным количеством ДНК плазмиды pBMCgag(A), в которой замену нуклеотидов не производили. Трансформированные культуры клеток инкубировали в течение 48-72 часов при температуре +37°С и содержании СO2 в воздухе, равном 5%, лизировали и анализировали белки клеточных лизатов с помощью электрофореза в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с сывороткой пациента, инфицированного ВИЧ-1 субтипа А. Интенсивность окраски полос, соответствующих белку-предшественнику белков gag, p55, анализировали с помощью компьютизи-рованной видеосистемы. Установлено, что в культуре клеток, трансформированных плазмидной ДНК pBMCgag(A)-mod, синтез белка p55 в 6-10 раз выше, чем в клетках, трансформированных контрольной плазмидой pBMCgag(A).
Использование плазмидной ДНК pBMCgag(A)-mod для иммунизации организма иллюстрируется следующим примером. Лабораторным мышам линии BALB/c вводили внутримышечно по 10 и 25 микрограмм плазмидной ДНК pBMCgag(A)-mod согласно настоящему изобретению; контрольной группе мышей вводили аналогичные дозы pBMCgag(A) (известная плазмидная ДНК). Через 6 недель в сыворотках крови животных определяли титры антител к белку gag известным способом. Результаты приведены в таблице.
Claims (1)
- Рекомбинантная плазмидная ДНК pBMC-gag(A)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках, характеризующаяся тем, что она содержит ген gag вируса иммунодефицита человека типа 1 субтипа А, представленный на фиг.2.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003116170/13A RU2241752C1 (ru) | 2003-05-22 | 2003-05-22 | Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003116170/13A RU2241752C1 (ru) | 2003-05-22 | 2003-05-22 | Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2241752C1 true RU2241752C1 (ru) | 2004-12-10 |
RU2003116170A RU2003116170A (ru) | 2004-12-10 |
Family
ID=34388149
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003116170/13A RU2241752C1 (ru) | 2003-05-22 | 2003-05-22 | Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2241752C1 (ru) |
-
2003
- 2003-05-22 RU RU2003116170/13A patent/RU2241752C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Database NCBI (MEDLINE) Sequence Viewer AF413987. HIV-1 Isolate 98UA0116 from Ukraine. 18.02.2002. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Braddock et al. | HIV-1 TAT “activates” presynthesized RNA in the nucleus | |
Richins et al. | Sequence of figwort mosaic virus DNA (caulimovirus group) | |
JP4336371B2 (ja) | mRNAの阻害/不安定領域の除去方法 | |
Sathaliyawala et al. | Assembly of human immunodeficiency virus (HIV) antigens on bacteriophage T4: a novel in vitro approach to construct multicomponent HIV vaccines | |
Dorn et al. | Equine infectious anemia virus tat: insights into the structure, function, and evolution of lentivirus trans-activator proteins | |
Ahmed et al. | The HTLV-I Rex response element mediates a novel form of mRNA polyadenylation | |
Delling et al. | The number of positively charged amino acids in the basic domain of Tat is critical for trans-activation and complex formation with TAR RNA. | |
US5821046A (en) | RNA oligonucleotides that bind HIV tat protein | |
Pyper et al. | Sequence homology between cloned caprine arthritis encephalitis virus and visna virus, two neurotropic lentiviruses | |
CN112442514B (zh) | 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒 | |
CN112552413A (zh) | 新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗 | |
AU609725B2 (en) | Recombinant HTLV-III proteins and uses thereof | |
US8685407B2 (en) | Genetic constructs and compositions comprising RRE and CTE and uses thereof | |
RU2241752C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pbmc-gag(a)mod для экспрессии белка gag вируса иммунодефицита человека в эукариотических клетках | |
Miller | Evolutionary relationship between hepadnaviruses and retroviruses | |
Rhim et al. | Exon2 of HIV-2 Tat contributes to transactivation of the HIV-2 LTR by increasing binding affinity to HIV-2 TAR RNA | |
CN113481171B (zh) | 一种携带hiv-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用 | |
RU2345138C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК р-ВМС-gag(A)-hum ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА р55 ВИЧ-1 В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ | |
RU2227161C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвмс-qp120(a)m-1 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека | |
RU2238977C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвмс-rt(a)m-1, используемая для экспрессии обратной транскриптазы (rt) вируса иммунодефицита человека в клетках высших эукариот | |
RU2346044C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-gp140(A)-hum | |
EP1233066B1 (en) | Peptide vector | |
RU2229518C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвмс-nef(a)m-1, экспрессирующая белок nef вируса иммунодефицита человека типа 1 в эукариотических клетках | |
RU2355764C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-RT(А)-hum ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА | |
RU2335540C1 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBMC-nef(A)-hum |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070523 |