RU2317093C1 - Способ выделения биологически активных изомеров дигидрокверцетина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности. Измельченную древесину лиственницы экстрагируют спиртом этиловым 90-95% при температуре 55-66°С в течение 1-2 часов, фильтруют экстракт, добавляют пропиленгликоль, упаривают смесь, полученный остаток обрабатывают 5% раствором натрия хлорида на умягченной воде при температуре 20-30°С, образовавшуюся смолу отделяют, полученный флавоноидный комплекс элюируют с колонны спиртом этиловым 90-95%, упаривают элюат, осаждают охлажденной до 0-+2°С водой, выпавший осадок кристаллизуют, отфильтровывают и высушивают. Полученный продукт, представляющий собой биофлавоноидный комплекс, измельчают с последующим растворением в смеси метиловый спирт - вода (10:90) и хроматографируют в обращенно-фазовом режиме, используя в качестве подвижной фазы раствор β-циклодекстрина в смеси метиловый спирт - вода (10:90) при охлаждении колонки до 0°С, собранные фракции, содержащие индивидуальные энантиомеры, упаривают на роторном испарителе в вакууме при 10-20 мбар остаточного давления и температуре не выше 60°С. Полученные остатки сушат в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 60°С до постоянной массы. Сухие остатки экстрагируют 50 мл абсолютным метанолом при комнатной температуре для отделения целевых продуктов от β-циклодекстрина. Экстракты фильтруют через пористый стеклянный фильтр №3-4, упаривают на роторном испарителе в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 50°С. Сухие остатки сушат в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 50°С. Изобретение позволяет повысить степень очистки комплекса и выделить биологически активные энантиомеры дигидрокверцетина.

Description

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и касается получения индивидуальных биологически активных изомеров (энантиомеров) дигидрокверцетина из древесины лиственницы.

Древесина лиственниц разных видов, например лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb. сем. Pinaceae) или лиственницы Гмелина {Larix gmelinii (Rupr.) Rupr. сем. Pinaceae), служит богатым источником биологически активных веществ, в том числе флавоноидных соединений. В их составе присутствуют представители практически всех классов флавоноидов: флаваноны, флавононолы, бифлавоноиды, конденсированные танины, арабиногалактан. Флавоноиды - одна из самых многочисленных и широко распространенных групп природных соединений, привлекающих внимание, особенно в последние годы, из-за их необычайно широкого спектра биологической активности. Исследование флавоноидных соединений древесины лиственницы было начато в 1970-х г.г., в настоящее же время этот вид сырья является основным при производстве дигидрокверцетина.

Дигидрокверцетин (ДКВ) - (3,3',4',5,7-пентагидроксифлаванон или 3,4',5,7-пентагидроксифлаванонол) - известное антиоксидантное, капилляропротекторное, противовоспалительное и антигистаминное средство.

Молекула дигидрокверцетина может существовать в виде четырех оптических изомеров (энантиомеров). В общем случае, энантиомеры различных соединений проявляют неодинаковую фармакологическую и токсикологическую активность, так что в фармакологической промышленности в настоящее время существует тенденция выделять и использовать энантиомеры с меньшей токсичностью и с большей целевой эффективностью.

Известны многочисленные патенты, описывающие способ получения смесей (комплексов) флавоноидов из лиственницы и очищенного дигидрокверцетина.

Так, патент RU 2206568, 2003.06.20 описывает способ, который включает подготовку древесины путем размельчения, фракционирования и предварительного замачивания с последующей экстракцией природных веществ из древесины в условиях псевдоожиженного состояния компонентов экстракционной массы. В качестве растворителя используют смесь этилового спирта и деионизированной воды. Процесс проводят при температуре 30-40°С. После удаления растворителя из полученных водно-спиртовых экстрактов выделяют смеси флавоноидов, из которых экстрагированием водно-ацетоновыми смесями могут быть выделены индивидуальные компоненты, которые далее перекристаллизовывают из воды.

Известен способ (RU 2236863, 2004.09.27), который включает обработку при нагревании опилок древесины лиственницы экстрагентом, представляющим собой 60-70% водный раствор этилового спирта, упаривание экстракта, отделение смолистых веществ, нагревание экстракта, кристаллизацию, очистку из водного раствора изопропанола или этанола в присутствии активированного угля при нагревании смеси до кипения с последующим выделением целевого продукта охлаждением и отделением выпавшего осадка. Полученный препарат «Флавитекс» представляет собой смесь двух главных компонентов: дигидрокверцетина (94-98 мас.%) и дигидрокемпферола (2-6 мас.%).

В патенте RU 2183966, 2002.06.27 описан способ получения биофлавоноидного комплекса для производства биологически активных добавок, медицинских и химико-фармацевтических изделий, заключающийся в обработке древесины лиственницы рабочим агентом (экстракция) для выделения целевого продукта. Перед обработкой древесину лиственницы измельчают до размеров частиц 1-5 мм, в качестве рабочего агента используют этиловый спирт (96,6%), а обработку осуществляют 5-кратным количеством этилового спирта той же концентрации. Экстракцию проводят при температуре 50-60°С в течение 30-60 мин с постоянным перемешиванием, полученный экстракт фильтруют, в фильтрат добавляют пропиленгликоль, из полученной смеси полностью отгоняют этиловый спирт, затем к полученному остатку приливают 5% раствор хлорида натрия, полученную смесь перемешивают и фильтруют, фильтрат пропускают через полиамидный сорбент для осаждения биофлавоноидного комплекса, затем осуществляют промывку сорбента дистиллированной водой и разбавленным водным раствором этилового спирта для удаления мешающих веществ. После промывки сорбент сушат и элюируют биофлавоноидный комплекс с сорбента этиловым спиртом, полученный элюат упаривают досуха для получения биофлавоноидного комплекса в сухом виде.

Известен способ выделения проантоцианидинов из растительного сырья путем его нагревания в деоксигенированной воде, отделением жидкости, концентрированием ее ультрафильтрацией или обратным осмосом с последующей сушкой продукта. Полученный продукт содержит несколько соединений флавоноидной природы, в том числе транс-изомер дигидрокверцетина (US 5968517, October 19, 1999). Данный источник может быть указан в качестве ближайшего аналога. Однако этот известный способ, как и все предыдущие, не предусматривает выделения индивидуальных энантиомеров.

Задачей данного изобретения является получение индивидуальных оптически активных изомеров (энантиомеров) дигидрокверцетина, проявляющих биологически активные свойства и которые могут быть пригодны для применения в терапии или для скрининга лекарственных препаратов.

Выделение индивидуальных (2R,3R)- и (2S,3S)-энантиомеров 3,3',4',5,7 пентагидроксифлаванона (дигидрокверцетина) из флавоноидного комплекса достигается с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазовом варианте в условиях изократического элюирования в присутствии хирального модификатора - элюента (β-циклодекстрин), причем для уменьшения концентрации хирального модификатора подвижной фазы процесс ведут при охлаждении хроматографической колонки до 0°С.

Известно, что разделение энантиомеров в присутствии хирального модификатора осуществляется за счет обратимого образования комплексов включения. Константы комплексообразования зависят от температуры процесса. Нами было установлено, что если вести процесс при пониженной температуре, то эффективность разделения энантиомеров существенно повышается, что и является сутью предлагаемого способа. Используемый прием позволил впервые разделить энантиомеры 3,3',4',5,7 пентагидроксифлаванона (дигидрокверцетина), выделенного из природного растительного сырья. Достижение аналогичного разделения энантиомеров без охлаждения (при комнатной температуре) возможно только при концентрации β-циклодекстрина не менее 15 ммоль/л и значительно большем содержании метанола в подвижной фазе (25 об.%, вместо 10 об.%).

Технологический процесс, осуществляемый в установке периодического действия, включает в себя следующие стадии:

- подготовка основного сырья - измельчение древесины лиственницы;

- экстракция измельченного сырья спиртом этиловым (90-95%);

- фильтрация полученного экстракта;

- упаривание экстракта до постоянного объема;

- высаливание (отделение смолы);

- фильтрация солевого раствора;

- очистка БФК (биофлавоноидного комплекса) на препаративной хроматографической колонне;

- упаривание спиртового элюата с колонки;

- переосаждение БФК в умягченной воде;

- фильтрация кристаллизата;

- сушка;

- растворение;

- нанесение на колонку;

- элюирование и сбор фракций, содержащих изомеры;

- упаривание и сушка;

- упаковка конечных продуктов.

Исходную древесину лиственницы измельчают на специальной установке до среднего размера частиц 1-5 мм. Измельченное сырье экстрагируют спиртом этиловым 90-95% при температуре 55-66°С в течение 1-2 часов. Экстракт фильтруют. В спиртовой экстракт приливают пропиленгликоль в количестве 1-2 об.% от количества экстрагента. Смесь упаривают, а остаток (пропиленгликолевый раствор БФК) высаливают с использованием 5% раствора натрия хлорида в умягченной воде (при температуре 20-30°С). Смолу отделяют. Солевой раствор наносят на колонну с полиамидным сорбентом. Колонну промывают умягченной водой. Флавоноидный комплекс элюируют с колонны спиртом этиловым 90-95%. Спиртовый элюат упаривают, растворенные вещества осаждают охлажденной (0-+2°С) умягченной водой, осадок оставляют на холоде для полной кристаллизации. Кристаллизаты отфильтровывают и высушивают. После сушки продукт охлаждают до комнатной температуры и измельчают.

Полученный продукт, представляющий собой биофлавоноидный комплекс, растворяют в смеси метиловый спирт - вода (10:90) и хроматографируют в обращенно-фазовом режиме, используя в качестве подвижной фазы раствор β-циклодекстрина (10 ммоль/л) в смеси метиловый спирт - вода (10:90) при охлаждении колонки до 0°С. Собирают раздельно фракции элюата, содержащие (2R,3R)-дигидрокверцетин и (2S,3S)-дигидрокверцетин. Фракции упаривают досуха и сушат конечные продукты.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующим примером конкретного выполнения.

Пример

Исходную древесину лиственницы измельчают на специальной установке. Отмеренное количество древесины лиственницы (70 кг) направляют в экстрактор, заполненный 350 л спирта этилового 90-95% при постоянно включенной мешалке. Процесс экстракции протекает при температуре 60°С и равномерном перемешивании экстрагируемой массы. Время экстракции после достижения рабочей температуры в экстракторе 1-2 часа. Проэкстрагированную массу выгружают через нижний сливной кран экстрактора при постоянно включенной мешалке и подают для фильтрации на вакуумный фильтр. Отфильтрованный раствор перекачивают за счет разрежения в вакуумную выпарную установку. Перед упариванием в спиртовой экстракт приливают 3,5 л пропиленгликоля. Упаривание спирта проводят пофракционно. Упаренный остаток (пропиленгликолевый раствор БФК) собирают в пластиковую емкость и подают в емкость для высаливания, в которую предварительно помещено 70 л 5% раствора натрия хлорида на умягченной воде (температура 20-30°С). После завершения процесса солевой раствор подают для отделения смолы на нутч-фильтр. Полученный фильтрат перекачивают за счет разрежения в накопительную емкость, откуда его подают на сорбционную колонну. После сорбции колонна промывается 40 л умягченной воды. Флавоноидный комплекс элюируют с колонны спиртом этиловым 90-95% (50 л) пофракционно. Первую фракцию - мертвый объем колонны (около 10 л), отбрасывают в сливную емкость. Вторую фракцию - целевой продукт, интенсивно окрашенная зона (около 10 л), собирают в приемную емкость и затем перекачивают в выпарную установку. Третью фракцию - промывка колонны, собирают в приемную емкость для целевого продукта после перекачки второй фракции в выпарную установку и упаривают отдельно. Упаренный остаток второй фракции сливают в пластиковую емкость, заполненную 5 л охлажденной (0-+2°С) умягченной воды, а затем переносят в холодильную установку, в которой его выдерживают до полной кристаллизации БФК. Упаренный остаток третьей фракции сливают в пластиковую емкость, заполненную 2 л охлажденной (0-+2°С) умягченной воды, и затем переносят в холодильную установку, в которой его также выдерживают до полной кристаллизации. Кристаллизаты отфильтровывают и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре +40°С в течение 3-4 часов или при 65-70°С без вакуумирования. Окончательную сушку продукта проводят в вакуумном сушильном шкафу при температуре 80°С в течение 60 мин или при 105°С без вакуумирования. После сушки продукт охлаждают до комнатной температуры и измельчают. Полученный биофлавоноидный комплекс после измельчения растворяют в смеси метиловый спирт - вода (10:90) и хроматографируют в обращенно-фазовом режиме.

Приготовление раствора подвижной фазы для ВЭЖХанализа. Навеску β-циклодекстрина растворяют в воде при нагревании для получения раствора с концентрацией 10 ммоль/л. После охлаждения до комнатной температуры полученный раствор смешивают с метиловым спиртом в соотношении 10:90 по объему, фильтруют и используют как подвижную фазу.

Условия анализа. Хроматограф высокого давления Beckman с УФ-детектором и колонкой Luna C₁₈ 4.6×150 мм (размер частиц сорбента 5 мкм) с предколонкой длиной 20 мм, заполненной тем же сорбентом. Использован режим изократического элюирования элюентом, приготовленным, как указано выше. Для детектирования выбрана длина волны 290 нм. Расход элюента 1.0 мл/мин. Хроматографическую колонку охлаждают до 0°С, помещая лед в термостат колонок. Время цикла разделения в указанных условиях около 30 мин.

Собирают раздельно фракции элюента, содержащие (2R,3R)-дигидрокверцетин и (2S,3S)-дигидрокверцетин. Собранные фракции, содержащие индивидуальные энантиомеры, упаривают на роторном испарителе в вакууме при 10-20 мбар остаточного давления и температуре не выше 60°С. Полученные остатки сушат в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 60°С до постоянной массы. Сухие остатки экстрагируют 50 мл абсолютным метанолом при комнатной температуре для отделения целевых продуктов от β-циклодекстрина. Экстракты фильтруют через пористый стеклянный фильтр №3-4, упаривают на роторном испарителе в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 50°С. Сухие остатки сушат в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 50°С. Величины удельного оптического вращения выделенных энантиомеров [α]_D ²⁰ находятся в соответствии с литературными данными: +20° (2R,3R) и -21° (2S,3S) (G.-J.Nonaka, et al. Chem. Pharm. Bull. 1987. V.35. №3. P.1105-1108.); (Hyang Dok-GO et al. Brain Researsch. 965. (2003). P.130-136); (Wakako Ohmura et al. Hoizforchung. 56. (2002). 493-497).

Таким образом, могут быть получены оптически чистые энантиомеры дигидрокверцетина в количествах до нескольких десятых долей грамма.

Claims (1)

1. Способ выделения (2R,3R)- и (2S,3S)-энантиомеров 3,3',4',5,7 пентагидроксифлаванона (дигидрокверцетина), характеризующийся тем, что измельченную древесину лиственницы экстрагируют спиртом этиловым 90-95% при температуре 55-66°С в течение 1-2 ч, фильтруют экстракт, добавляют пропиленгликоль, упаривают смесь, полученный остаток обрабатывают 5%-ным раствором натрия хлорида на умягченной воде при температуре 20-30°С, образовавшуюся смолу отделяют, полученный флавоноидный комплекс подают на сорбционную колонну с полиамидным сорбентом, затем элюируют с колонны спиртом этиловым 90-95%-ным, упаривают элюат, осаждают охлажденной до 0-+2°С водой, выпавший осадок кристаллизуют, отфильтровывают и высушивают, полученный продукт, представляющий собой биофлавоноидный комплекс, измельчают с последующим растворением в смеси метиловый спирт - вода (10:90) и хроматографируют в обращенно-фазовом режиме, используя в качестве подвижной фазы раствор β-циклодекстрина в смеси метиловый спирт - вода (10:90) при охлаждении колонки до 0°С, собранные фракции, содержащие индивидуальные энантиомеры, упаривают на роторном испарителе в вакууме при 10-20 мбар остаточного давления и температуре не выше 60°С, полученные остатки сушат в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 60°С до постоянной массы, сухие остатки экстрагируют 50 мл абсолютным метанолом при комнатной температуре для отделения целевых продуктов от β-циклодекстрина, экстракты фильтруют через пористый стеклянный фильтр №3-4, упаривают на роторном испарителе в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 50°С, сухие остатки сушат в вакууме при остаточном давлении 10-20 мбар и температуре не выше 50°С.