RU2283083C2

RU2283083C2 - КОСМЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ, ОСНОВАННЫЙ НА ПРИМЕНЕНИИ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА Chromolaena Odorata

Info

Publication number: RU2283083C2
Application number: RU2003116132/15A
Authority: RU
Inventors: Роберт Марк ДОНОВАН (GB); Роберт Марк ДОНОВАН
Original assignee: Унилевер Н.В.
Priority date: 2000-11-02
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2006-09-10
Also published as: KR20030048451A; ATE355049T1; CN1303972C; PL362209A1; BR0115375A; DE60126992D1; ES2280423T3; AU2002221758B2; CA2423301A1; DE60126992T2; EP1367988A1; EP1367988B1; GB0026828D0; CN1630507A; EP1656929A1; WO2002036091A1; AU2175802A; JP2004512351A; MXPA03003712A; ZA200302244B

Abstract

Изобретение относится к способу улучшения состояния и внешнего вида кожи. Косметический способ основан на применении растительного экстракта Chromolaena Odorata, который присутствует в количестве 0,0001-1 мас.% от массы композиции. Способ предупреждает образование морщин, складок стареющей и/или фотоповрежденной кожи, усиливает продуцирование декорина в коже, усиливает активность типа I и типа III, трансглутаминазы в коже, повышает эластичность роговичного слоя, улучшает отшелушивание кожи и эпидермальную дифференцировку, осветляет цвет лица, смягчает раздраженную и/или чувствительную кожу. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к косметическому способу улучшения состояния и внешнего вида кожи и к применению некоторых растительных экстрактов при получении композиций местного назначения для улучшения состояния и внешнего вида кожи. В частности, изобретение относится к применению экстрактов Chromolaena Odorata (известного так же как Siam Weed или Devils Weed) для лечения морщинистой и/или поврежденной под воздействием света кожи. Изобретение также относится к композициям для местного назначения, содержащим указанные экстракты.

Кожа подвергается повреждению по причине дерматологических нарушений, нарушений, вызываемых вредным воздействием окружающей среды (ветра, кондиционирования воздуха, центрального отопления), или в результате обычного процесса старения (хроностарения), которое может ускоряться воздействием солнца на кожу (фотостарения). В последние годы чрезвычайно выросла потребность в косметических способах улучшения внешнего вида и состояния и, в частности, в восстановлении кожи, снижении или предупреждении видимых признаков появления морщин, старения и/или фотостарения кожи.

Большой популярностью у потребителей пользуется косметическая продукция "против старения", которая направляет процесс в обратную сторону, лечит и замедляет видимые проявления хроностарения или фотостарения кожи, такие как морщины, складки, обвисание, гиперпигментация и возрастные пятна.

Известно, что коллаген, основной матриксный белок кожи, придает коже прочность при растяжении. Из уровня техники известно также, что уровни коллагена в коже с возрастом и/или в связи с фотостарением значительно снижаются. Многими исследованиями показано, что уровни коллагена типа I в коже снижаются с возрастом и/или с ростом фотостарения (смотри, например, Lavker, R.J. Inv.Derm., (1979), 73, 79-66; Griffiths et al. N. Eng. J. med. (1993) 329, 530-535). Следовательно, снижение уровней коллагена в коже соответственно связано со снижением прочности при растяжении кожи, что приводит к образованию морщин и увяданию. Широко признается, что укрепление кожного матрикса путем повышения уровней коллагена в коже обеспечивает направленное против старения и восстанавливающее кожу действие. Известно также, например, из WO 99/47110, что декорин может действовать в качестве индикатора восстановления кожи.

Экстракт Siam weed, включающий экстракт Chromolaena Odorata, является известным экстрактом для обработки кожи, который нашел применение в лечении ран мягких тканей и кожных инфекций, например, во Вьетнаме. Характерной иллюстрацией предшествующего уровня техники является «The Journal of Alternative and Complimentary Medicine», Vol.2, №3, 1996, pp.335-343, Phan et al. В указанной работе описано применение водного экстракта листьев Siam weed в вышеуказанных целях и действие экстракта Siam weed (называемого авторами эвполином (Eupolin)) на сокращение решетки гидратированного коллагена фибробластами кожи человека. Обнаружено, что производимые прежде мази на основе Siam weed содержали флаваноиды (салвигенин, сакуранетин, изосакуранетин, кемпферид, бетуленол, 2-5-7-3-тетра-O-метилкверцетагетин, тамариксетин, халкон 1 и халкон 2), основные масла (гейрен, борнилацетат, бетаэвбеден), сапонинтритерпоноиды, таннины, органические кислоты и микроэлементы. Уровни экстракта Siam weed, in vitro, в композициях местного применения обычно равны 50-200 мкг/мл.

Кроме того, в «Plastic and Reconstructive Surgery», March 1998, «Enhanced proliferation of Fibroplasts and Endothelial Cells Treated with an Extract of the Leaves of Chromolaena Odorata (Eupolin), a Herbal Remedy for Treating Wounds», Phan et al., описано применение экстракта Siam weed для повышения роста клеток фибробласта и эндотелия, вновь в контексте лечения ожогов. В частности, обнаружено, что при использовании трансплантатов кожи применение экстракта Siam weed extract ускоряет образование грануляционной ткани, а также повышает скорость синтеза коллагена. В данном исследовании мазь с экстрактом Siam weed используют при местных концентрациях 10-230 мкг/мл.

Заявителями неожиданно обнаружено, что эффективное лечение и предупреждение обычно вызываемых хроностарением и фотостарением состояний кожи, таких как морщины, складки, обвисание, гиперпигментация и возрастные пятна, может быть достигнуто местным нанесением косметических композиций, содержащих экстракты Chromolaena Odorata. Заявителями также обнаружено, что применение экстрактов Chromolaena Odorata в косметических композициях может обеспечивать дополнительные преимущества вдобавок к предупреждению старения, такие как, например, смягчение чувствительной и/или раздраженной кожи.

Таким образом, согласно первому аспекту, разработан косметический способ, обеспечивающий, по меньшей мере, одно из благотворных воздействий на кожу, выбираемых из лечения или предупреждения образования морщин, складок, обвисания, гиперпигментации и возрастных пятен, усиления продуцирования декорина в коже, усиления активности типа I и типа III трансглутаминазы в коже, повышения эластичности роговичного слоя, улучшения отшелушивания кожи и эпидермальной дифференцировки, осветления цвета кожи, регулирования секреции кожного сала, смягчения раздраженной, покрасневшей и/или чувствительной кожи, улучшения структуры кожи, разглаживания, повышения прочности и общего улучшения качества кожи; способ включает нанесение на кожу композиции местного применения, включающей предпочтительно водный экстракт Chromolaena Odorata.

Согласно другому аспекту, предложена для промышленного производства композиция для лечения, помимо прочего, фотоповрежденной кожи и глубоких складок и морщин, содержащая эффективное количество водного экстракта Chromolaena Odorata.

Согласно еще одному аспекту, предложена композиция местного назначения, предпочтительно композиция местного применения на водной основе, для нанесения на кожу человека, содержащая эффективное количество водного экстракта Chromolaena Odorata.

Предпочтительно композиции местного назначения для применения в способе по изобретению включают экстракт Chromolaena Odorata при уровне 0,00005-10 мас.% от массы композиции местного назначения, более предпочтительны уровни 0,0001-1,0 мас.%, и в некоторых случаях наиболее предпочтительны - 0,001-0,1 мас.% от массы композиции местного применения.

Под термином «водная основа» подразумевается, что композиции местного назначения предпочтительно включают, по меньшей мере, 30 мас.%, более предпочтительно 60 мас.% воды от массы композиции местного назначения. Удобно, чтобы продукция для местного назначения была в форме эмульсии масло-в-воде.

Что касается восстановления фотоповрежденной кожи, общепризнано, что биохимические и биологические процессы, связанные с заживлением ран и реконструкцией дермы, не те же самые, что вовлечены в восстановление фотонарушений. Например, известно, что другие вещества, такие как экстракты календулы и мирриса, которые вызывают заживление ран на коже, не эффективны при восстановлении фотонарушений.

Композиции по изобретению, способы и применения обеспечивают таким образом успех в противодействии старению, который может выражаться в создании гладкой и мягкой кожи с улучшенной эластичностью и снижении или задержке появления морщин и возрастных складок при улучшенном цвете кожи. Может быть также достигнуто общее улучшение внешнего вида, строения и состояния кожи, в частности в отношении блеска, чистоты и в целом молодого внешнего вида кожи. Изобретение может также иметь особое применение в целях обеспечения успешного ухода за кожей.

Термин «лечение», как использован здесь, включает снижение, задержку и/или предотвращение вышеупомянутых нормальных, но косметически нежелательных состояний кожи, вызванных нормальным процессом старения. Видимые проявления старения, такие как морщины, складки и/или обвисание, могут быть задержаны или снижены. Обычно качество кожи может быть улучшено и ее внешний вид и структура могут быть улучшены за счет предупреждения или снижения образования морщин и повышения упругости, прочности, гладкости, мягкости и эластичности кожи.

Композиции, способы и применения по изобретению могут быть полезны для лечения кожи, которая уже покрыта морщинами, состарилась и/или имеет фотоповрежденное состояние, либо для обработки молодой кожи в целях предупреждения или снижения вышеупомянутых нежелательных изменений, связанных с нормальными процессами старения/фотостарения.

Используемая в соответствии с настоящим изобретением композиция включает также дерматологически/косметически приемлемый наполнитель, действующий как разбавитель, диспергатор или носитель для активных компонентов. Наполнители могут включать материалы, обычно используемые в средствах для ухода за кожей, такие как воду, жидкие или твердые мягчители, силиконовые масла, эмульгаторы, растворители, увлажнители, загустители, пудры, пропелленты и тому подобное.

Наполнитель обычно составляет от 5 до 99,9 мас.%, предпочтительно от 25 до 80 мас.% от массы композиции и может в отсутствие других косметических добавок составлять баланс композиции.

Помимо экстракта активного компонента Chromolaena Odorata могут быть включены также другие специфические улучшающие кожу добавки, такие как защищающие от загара, отбеливающие кожу и придающие коже вид загара средства. Наполнитель может также дополнительно включать вспомогательные средства, такие как антиоксиданты, ароматизаторы, замутнители, консерванты, красители и буферные добавки.

Для получения композиции местного назначения, используемой в способе по настоящему изобретению, может быть использован обычный способ получения средств для ухода за кожей. Активные компоненты обычно вводятся в дерматологически/косметически приемлемый носитель общепринятым способом. Активные компоненты первоначально удобно растворять или диспергировать в части воды или другого растворителя или жидкости для включения в композицию. Предпочтительными композициями являются эмульсии масло-в-воде, вода-в-масле или вода-в-масле-в-воде, хотя в некоторых случаях предпочтительны водные или масляные композиции.

Композиция может быть в форме общепринятых средств для ухода за кожей, такой как крем, гель или лосьон, капсулы или тому подобное. Композиция может быть также в форме так называемой «смываемой» продукции, например, геля для ванны или душа, возможно, содержащих систему доставки активных компонентов для усиления сцепления с кожей при споласкивании. Наиболее предпочтительным средством является «неснимаемое» средство, которое является средством, предназначенным для нанесения на кожу без предусмотренной стадии смывания вскоре после нанесения на кожу.

Композиция может быть упакована любым подходящим образом, как, например, в банку, бутылку, тюбик, роликовый баллон или тому подобное, любым общепринятым способом. Еще одной возможной формой является состав, пригодный для доставки в виде спрея, либо из пропеллент-содержащего аэрозоля, либо из снабженного насосом спрея.

Композиция по изобретению может также быть приготовлена в форме, подходящей для перорального приема, такой как капсула, таблетка или тому подобное.

Способ настоящего изобретения может применяться один или несколько раз в день для кожи, требующей лечения. Улучшение внешнего вида кожи обычно становится заметным спустя 3-6 месяцев или, возможно, раньше, в зависимости от состояния кожи, концентрации активных компонентов, используемых в способе по изобретению, количества используемой композиции и частоты нанесения. Обычно небольшое количество композиции, например, от 0,1 до 5 мл, наносят на кожу из подходящего контейнера или аппликатора и растирают по коже и/или втирают в кожу руками или пальцами, либо подходящим устройством. Затем необязательно может следовать стадия споласкивания, в зависимости от того, является ли композиция «смываемым» или «неснимаемым» средством.

Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, представлены следующие примеры исключительно с иллюстративной целью:

ПРИМЕРЫ

Из находящейся одновременно на рассмотрении заявки настоящих авторов на европейский патент №99908956.8 известно, что может быть использована местная обработка ретиноевой кислотой для того, чтобы вызвать повышающую регуляцию проколлагена I и декорина in vivo. В этой связи раздел, озаглавленный как «Идентификация регуляции проколлагена I и декорина in vivo после местной обработки ретиноевой кислотой в целях сравнения», указанной заявки включен в описание в полном объеме в качестве ссылки.

Пример 1

Методика количественной оценки синтеза проколлагена-I и декорина в фибробластах кожи человека

Получение кондиционированной среды для фибробластов кожи.

Первичные фибробласты крайней плоти человека 2 пассажа (Р2) засевают в 12-луночные планшеты при концентрации 10000 клеток/см² и выдерживают в течение 24 часов в атмосфере 5% диоксида углерода и 4% кислорода в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка. После указанного времени клетки промывают средой DMEM без сыворотки и затем инкубируют в свежей среде DMEM без сыворотки еще 60 часов. Монослои фибробластов затем вновь промывают средой DMEM без сыворотки. Исследуемые реагенты и контроли растворителя добавляют к клеткам, выполняя по три повтора, в конечном объеме свежей среды DMEM без сыворотки 0,4 мл/лунка, и инкубируют дополнительно 24 часа. Полученную кондиционированную фибробластами среду либо анализируют сразу либо быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С для последующего анализа. Затем клетки подсчитывают и данные дот-блоттинг анализа впоследствии нормализуют к числу клеток.

Дот-блоттинг анализ на белок проколлагена-I и декорина в кондиционированной фибробластами кожи среде

Образцы кондиционированной среды из фибробластов кожи, обработанных растворителем (в качестве контроля) или исследуемыми реагентами, дополняют 20 мМ дитиотреитола (1:10 разведение 200 мМ основного раствора) и 0,1% додецилсульфатом натрия (1:100 разведение 10% основного раствора), хорошо перемешивают и затем инкубируют при 75°C в течение 2 минут. Стандарт для анализа получают последовательным разведением кондиционированной чистыми фибробластами среды из фибробластов, засеянных при концентрации 10000 клеток/см² во флаконы размером 175 см² и поддерживаемых, как описано выше, в среде DMEM без сыворотки.

Образцы для анализа впоследствии наносят, выполняя по три повтора, на предварительно смоченный лист Immobilon-P мембраны для переноса, используя 96-луночные Bio-Dot аппараты от Bio-Rad, как описано в руководстве изготовителя. Вносят приблизительно 200 мкл среды на лунку. Среде дают профильтроваться через мембрану под действием силы тяжести (30 минут), после чего мембрану дважды промывают PBS (200 мкл). Полученные PBS промывные воды профильтровывают через мембрану под действием силы тяжести (2×15 минут). Затем подключают Bio-Dot аппарат к вакуумной магистрали и третью и последнюю PBS промывную воду отсасывают в вакууме.

Аппарат разбирают, удаляют мембрану и быстро нарезают, как требуется, перед помещением в блокирующий буфер на ночь при 4°С. Мембраны, подготовленные для анализа на декорин, блокируют 3% (м/о) BSA/0,1% (о/о) Tween 20 в PBS, тогда как мембраны для анализа на проколлаген-I блокируют 5% (м/о) обезжиренным сухим порошковым молоком/0,5% Tween в PBS.

На следующий день мембраны обрабатывают первыми антителами либо к человеческому проколлагену-I (MAB1912; крысиные моноклональные; Chemicon Int. Inc., Temecula, CA), либо к человеческому декорину (кроличьи поликлональные; Biogenesis), в разведении 1:10000 в течение 2 часов при комнатной температуре. Мембраны последовательно промывают TBS/0,05% Tween 20 (3×5 минут) и затем инкубируют с 125 конъюгированными F(ab')₂ фрагментами анти-крысиных или анти-кроличьих антител (Amersham), в разведении 1:1000, как требуется, в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем эти Immobilon полоски вновь промывают TBS/Tween 20 (3×5 минут), после чего дают высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

Высушенные мембраны упаковывают в целофан и экспонируют, используя молекулярный динамический люминофорный экран с длительным послесвечением, в течение 16-18 часов. По окончании этого времени экспонированую мембрану сканируют с помощью фосфор-визуализирующей системы (Molecular Dynamics Phosphorimager SF), используя компьютерную программу ImageQuant™. Дот интенсивность оценивают на основе анализа полученного с помощью компьютера изображения, используя руководство для количественного расчета к ImageQuant™ программе, нормализуют к числу клеток и определяют действия различных испытуемых реагентов на синтез декорина и проколлагена-I по отношению к соответствующему значению для обработанного растворителем контроля, принятому за 100 условных единиц.

В приведенной ниже таблице 1 показано действие экстракта Chromdaena Odorata на синтез проколлагена-I и декорина в фибробластах кожи человека и количества, в которых применялся экстракт. С целью нормализации результатов определяют сравнительные данные действия испытуемого вещества по отношению к значению для обработанного растворителем контроля, принятому за 100 условных единиц. Для сравнения выполняют испытание с ретиноевой кислотой, чтобы оценить ее действие на синтез декорина в фибробластах кожи человека. Концентрации реагентов, используемых в испытаниях, не влияют на жизнеспособность клеток.

Экстракт Chromolaena Odorata получают концентрацией водного экстракта, полученного кипячением листьев Siam weed в воде в течение 30 минут.

Экстракт испытывают при уровнях 0,1-1 мкг/мл на модели фибробластов in vitro, содержащей 4% кислород, как указано выше.

Модель анализируют в отношении как проколлагена-I, так и декорина. Полученные для них результаты приведены ниже.

Таблица 1
Обработка Контроль	Проколлаген I 100	Декорин 100
Экстракт Chromolaena Odorata при 0,01 мкг/мл	-	172
0,1 мкг/мл	113	180
1,0 мкг/мл	116	182

Результаты показывают, что синтез декорина на модели является по существу регулируемым даже при сравнительно низких уровнях (например, 0,01 мкг/мл) экстракта. Незначительное, но положительное влияние наблюдается также на синтез проколлагена I, в сравнении с контролем. Проводят также сравнительное тестирование образца 1,0 мг/мл ретиноевой кислотой (1 мкм), показывающее регуляцию декорина, 138±14,0 (p=0,035, n=4), что определено в сравнении со значением для обработанного растворителем контроля, принятым за 100 условных единиц. Результаты также свидетельствуют о значительном росте синтеза декорина в фибробластах кожи человека, вызываемом экстрактом Chromolaena Odorata, по сравнению с действием ретиноевой кислоты.

Пример 2

Анализ на PGE2 фибробласта

Следующий пример демонстрирует, что экстракт Chromolaena Odorata может эффективно снижать базальные уровни Е2 простогландина (PGE2), секретируемого фибробластами in vitro.

Первичные фибробласты крайней плоти человека 2 пассажа (Р2) засевают в 96-луночные планшеты при концентрации 10000 клеток/см² и выдерживают в течение 24 часов в атмосфере 5% диоксида углерода в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка. Экстракт Chromolaena Odorata, растворенный в этаноле, добавляют к свежей клеточной среде (конечная концентрация 1% EtOH в DMEM, с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка) и добавляют к клеткам в ячейки, выполняя по три повтора, и инкубируют дополнительно 24 часа. К субстратам добавляют форбалмиристатацетат (PMA) (Sigma) и клетки инкубируют дополнительно 24 часа. PMA действует как стрессор, который вызывает окислительный стресс и воспалительные реакции в клетках. Фибробласты/среды анализируют затем, как описано ниже, сразу либо быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С для последующего анализа.

Количественное определение E2 простогландина (PGE2)

Объемы культуральной среды в 50 мкл отбирают для PGE2 анализа после осторожного встряхивания пластин для выращивания культур. Уровни PGE2 в среде определяют с помощью Biotrak PGE2 набора для иммунологического анализа (Amersham, UK). Анализ основан на конкуренции между немеченными PGE2 в пробе и фиксированным количеством меченных пероксидазой хрена PGE2 за ограниченное количество иммобилизованных специфичных антител к PGE2. Концентрации немеченных PGE2 в пробе определяют по одновременно получаемой стандартной кривой.

Противовоспалительный потенциал испытуемых соединений определяют по способности соединений снижать базальные уровни секретированного PGE2 по сравнению с контролем. Полученные результаты суммированы в приведенной ниже таблице.

Таблица 2
	Контроли	РМА + EtOH	1 мкг/мл	100 нг/мл	10 нг/мл	1 нг/мл	0,1 нг/мл
PGE2	446,85±117,80	12236,16±1692,51	1459,69±337,33	5190,54±720,27	6584,53±1118,06	5673,89±789,19	4016,008±1186,28
% ингибирования			87,93	56,28	44,46	52,18	66,25
Уровни PGE2 в фибробластах кожи человека, обработанных экстрактом Chromolaena Odorata и стимулированных PMA.

PGE2 является хорошо известным посредником воспалительных процессов кожи, смотри, Greaves et al. «Prostagludus, leukotriemes, phospholipase, platelet actuating factor and cytokines: an integrated approach to inflammation of human skin», Arch. Dermatol. Res. (1988) 280 [supp]: 533-541. Результаты свидетельствуют о том, что фибробласты, обработанные экстрактом Chromolaena Odorata, продуцируют меньше провоспалительного PFE2 простогландина, снижая тем самым воспалительный потенциал кожи.

Пример 3

Методика анализов на основе культуры органа-ТГазы

Материалы

Dettol (Reckitt & Coleman, Hull, UK), DMEM, содержащий глутамакс (среда Игла, модифицированная Дульбекко), ABAM, раствор (антибиотик/противогрибковое средство X100) (50000 единиц пенициллина G, 50,00 мкг стрептомицинсульфата и 125 мкг амфотерицина B/5 мл (Gibco BRL, Paisley, UK)), гидрокортизон-21-гемисукцинат (натриевая соль) (Sigma Co., Poole, UK), чашки Петри 35×10 мм (Nunclon, поставляемые Fisher Scientific, Loughborough, UK), мини- Marbrook пластиковые треножники (подставки) (поставляемые C.A. Hendley Ltd, UK), Nybolt нейлоновая сетка (John Staniar Ltd, UK), стерильные одноразовые 4 мМ пункции биопсии кожи, дерматомы, Steifel Labs Ltd, Bucks, UK).

Биотинилированный монодансилкадаверин, алексафтор-488-стрептавидин, раствор для длительного закрепления окраски (Molecular Probes, поставляемый Cambridge Bioscience, UK), альбумин, бычий (BSA), хлорид кальция CaCl₂, трисгидроксиметиламинометан (TRIZMA основание), этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), пропидийиодид, (Sigma Co., Poole, UK), соляная кислота (HCl), Merck, Poole, Dorset, UK)).

Способ на основе культуры органов

Свиную кожу (со спины) подготавливают тщательным удалением подкожного жира и мышц, получая образец кожи толщиной 3-4 мм. Щетину состригают и кожу промывают водой, удаляя остаточную кровь или грязь. Образец кожи разрезают на квадраты 7 см × 7 см и инкубируют в 5% Dettol (стерильный) в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). Затем образцы инкубируют в DMEM, содержащем ABAM (5 мл/500 мл среды) в течение 1 часа. Гидрокортизон-21-гемисукцинат (100 мкг/мл, стерильно фильтрованный) добавляют к DMEM + ABAM. Подставки и сетки помещают в чашки Петри, содержащие 3 мл среды (DMEM/ABAM/гидрокортизон), создавая отрицательный мениск. Берут пункцию биопсии кожи и помещают на сетку (4 на чашку) и затем инкубируют в течение 24 часа при 37°C, 5% CO₂, перед предстоящей обработкой. Среду меняют ежедневно.

Способ на основе ТГазы in situ (на месте)

Получают основной раствор 10 мМ биотинилированного монодансилкадаверина в 0,013 M HCl и хранят при -20°C. Из основного раствора получают субстратный буфер: 0,1 мМ биотинилированного монодансилкадаверина, 5 мМ CaCl₂ в 100 мМ Трис HCl. Для положительного контроля 5 мМ CaCl₂ заменяют 200 мМ EDTA.

Образцы пункции биопсии свиной кожи быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -20°C. Делают срезы (5-8 микрон толщиной, Brights криостат) и сушат на воздухе в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Срезы инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре с 1% BSA в 0,1 M Трис/HCl, pH 8,4, затем инкубируют в субстратном буфере в течение 2 часов при комнатной температуре. Образцы промывают, чтобы остановить реакцию, в 25 мМ EDTA в PBS в течение 5 минут, с двумя последующими промывками в PBS. Затем образцы инкубируют в алексафтор-488-стрептавидине (1:250) в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего промывают в PBS, как указано выше. Проводят контрастирующее окрашивание образцов с помощью 10 мкг/мл пропидиумиодида в течение 10 секунд, затем промывают в воде и закрепляют в растворе для длительного закрепления окраски. Производят визуализацию срезов, используя микроскоп (Leica, Leitz DMRB, Leitz ploemopak filter block L3, Milton Keynes, Bucks. UK), и изображения увеличивают, используя Image Grabber PC компьютерную программу (Neotech Ltd. Eastleigh, Hampshire, UK).

Культуры свиных органов обрабатывают, как описано выше, при различных концентрациях экстракта Chromolaena odorata в течение 48 часов. Активность ТГазы в полученных в криостате срезах биопсии свиных органов анализируют, как указано выше, результаты анализа на Тгазу приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3 Действие экстракта Chromolaena odorata на активность ТГазы в культуре свиных органов при 48 час
Обработка	Сравнительная экспрессия по отношению к контролю

Контроль		100
Экстракт Chromolaena odorata	10 мкг/мл	150
Экстракт Chromolaena odorata	50 мкг/мл	130

Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что происходит значительный рост активности ТГазы в свиной коже, обработанной экстрактами Chromolaena odorata, по сравнению с контролем. С учетом схожести свиной и человеческой кожи очень вероятно, что экстракты Chromolaena odorata будут оказывать подобное действие на активность ТГазы в коже человека.

Данные демонстрируют, что экстракты Chromolaena odorata стимулируют ключевые ферменты в эпидермальной дифференциации и в барьерном образовании, и таким образом данный растительный экстракт оказывает благотворное воздействие на состояние кожи.

Пример 5

Приведенный ниже состав представляет крем по типу масло-в-воде, отвечающий способу и используемый согласно настоящему изобретению. Указанные проценты являются массовыми процентами относительно композиции.

Таблица 4
	%масс.
Минеральное масло	4
Экстракт Chromolaena Odorata	1,15
Brij 56*	4
Alfol 16RD**	4
Триэтаноламин	0,75
Бутан-1,3-диол	3
Ксантановая камедь	0,3
Отдушка	qs
Бутилированный гидрокситолуол	0,01
Вода	до 100
Brij 56 означает цетиловый спирт POE (10) * Alfol 16RD означает цетиловый спирт

Пример 6

Приведенный ниже состав представляет эмульсионный крем по настоящему изобретению.

Таблица 5
Полное химическое название или CTFA название	Торговое название	%масс.
Экстракт Chromolaena Odorata		2,0
Динатрий EDTA	Sequesterene Na2	0,05
Магнийалюмосиликат	Veegum Ultra	0,6
Метилпарабен	Methyl Paraben	0,15
Симетикон	DC Antifoam Emulsion	0,01
Бутиленгликоль-1,3	Butylene Glycol 1,3	3,0
Гидроксиэтилцеллюлоза	Natrosol 250HHR	0,5
Глицерин, USP	Glycerine USP	2,0
Ксантановая камедь	Keltrol 1000	0,2
Триэтаноламин	Triethanolamine (99%)	1,2
Стеариновая кислота	Pristerene 4911	3,0
Пропилпарабен NF	Propylparaben NF	0,1
Глицерилгидростеарат	Naturechem GMHS	1,5
Стеариловый спирт	Lanette 18 DEO	1,5
Изостеарилпальмитат	Protachem ISP	6,0
Октаноат С12-15-спиртов	Hetester FAO	3,0
Диметикон	Silicone Fluid 200 (5Octs)	1,0
Холестерин NF	Cholesterol NF	0,5
Сорбитанстеарат	Sorbitan Stearate	1,0
Бутилированный гидрокситолуол	Embanox BHT	0,05
Токоферилацетат	Vitamin E Acetate	0,1
Стеарат ПЭГ-100	Myrj 59	2,0
Натрийстеароиллактилат	Pationic SSL	0,5
Гидроксикаприловая кислота	Hydroxycaprylic Acid	0,1
Ретинилпальмитат	Vitamin A Palmitate	0,06
Альфа-бисаболол	Alpha-bisabolol	0,2
Вода, DI		q.s. до 100

Обе вышеуказанные композиции местного назначения по примерам 5 и 6 обеспечивают эффективную косметическую обработку для улучшения внешнего вида морщинистой, состарившейся, фотоповрежденной и/или раздраженной кожи при нанесении на кожу, поврежденную в результате старения или фотостарения, или при нанесении на молодую кожу с целью предупреждения или замедления указанных разрушающих изменений. Композиции могут быть получены общепринятыми способами.

Claims

1. Косметический способ, обеспечивающий, по меньшей мере, одно из благотворных воздействий на кожу, выбираемых из лечения или предупреждения образования морщин, складок стареющей и/или фотоповрежденной кожи, усиления продуцирования декорина в коже, усиления активности типа I и типа III трансглутаминазы в коже, повышения эластичности роговичного слоя, улучшения отшелушивания кожи и эпидермальной дифференцировки, осветления цвета кожи, регулирования секреции кожного сала, смягчения раздраженной, покрасневшей и/или чувствительной кожи, включающей нанесение на кожу косметической композиции, включающей водный экстракт Chromolaena Odorata.

2. Способ по п.1, где экстракт присутствует в количестве 0,0001-1 мас.% от массы композиции.