RU2278163C2 - Способ получения меланина - Google Patents
Способ получения меланина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2278163C2 RU2278163C2 RU2004127970/13A RU2004127970A RU2278163C2 RU 2278163 C2 RU2278163 C2 RU 2278163C2 RU 2004127970/13 A RU2004127970/13 A RU 2004127970/13A RU 2004127970 A RU2004127970 A RU 2004127970A RU 2278163 C2 RU2278163 C2 RU 2278163C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- melanin
- yeast
- hydrochloric acid
- biomass
- temperature
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения меланина - пигмента с высокой антиоксидантной и противоопухолевой активностью. Способ заключается в том, что в результате селекции и отбора получен штамм дрожжей Nadsoniella nigra Б-3, который при глубинном выращивании на питательной среде определенного состава через 96 часов от начала культивирования накапливает до 25 г/л биомассы дрожжей. Меланин выделяют как из биомассы дрожжей (внутриклеточный меланин), так и из культуральной жидкости (внеклеточный меланин). Внутриклеточный меланин выделяют экстракцией раствором щелочи с последующим осаждением меланина соляной кислотой. Для выделения внеклеточного меланина культуральную жидкость обрабатывают этиловым спиртом с последующим осаждением меланина соляной кислотой. Изобретение позволяет повысить эффективность способа.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения меланина - пигмента с высокой антиоксидантной и противоопухолевой активностью.
Меланины - обширная группа коричневых и черных природных пигментов, широко представленных в тканях растений и животных, обладающие широким спектром биологической активности. Клетки живых организмов вырабатывают меланин для защиты организма от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, особенно УФ-лучей. Меланины обладают антимутагенными свойствами (в 2-4 раза снижают хромосомные повреждения клеток костного мозга, возникающими под воздействием мутагенов), существенно подавляют развитие опухолевых клеток и метостаз, обладают радиопротекторными свойствами, ингибируют процессы свободнорадикального окисления (1, 2).
Известен способ получения меланина из растительного сырья - лузги гречихи (3). Лузга гречихи обрабатывается целлюлолитическим ферментом (целлюлобранином Г3х) в течение 48 часов. Далее проводят экстракцию меланина раствором щелочи, затем меланин осаждают соляной кислотой и осадок отделяют фильтрацией. Выход меланина из лузги гречихи составляет 8-10%. Однако применение в технологии дорогостоящего фермента, а также использование растительного сырья, когда погодные условия и действие фитопатогенов могут существенно повлиять на его качество, делают данный способ экономически неэффективным.
Известны примеры получения меланина из довольно редких видов сырья. Так, например, компания "Олигофарм" в качестве сырья для получения меланина использует помор пчел и элитные сорта чая. Применение такого вида сырья не позволяет получать меланин в достаточном количестве.
Решение указанных проблем возможно путем создания биотехнологического способа получения меланина. Меланин синтезируют различные группы микроорганизмы (грибы, актиномицеты, дрожжи) (4).
Наиболее близким к заявленному изобретению являются способы получения меланина, описанные в патентах РФ №№2116036, 2069696 (5, 6). Согласно данным патентам для получения меланина используют штаммы дрожжей Nadsoniella nigra. Дрожжи выращивают на питательной среде следующего состава:
К2HPO4 - 0,1 г/л
CaCl2 - 0,03 г/л
MgSO4 - 0,05 г/л
NaCl - 0,05 г/л
Дрожжевой автолизат - 1%
Глюкоза - 1,5-2%
рН среды 3,0-3,5
Выращивание ведут при температуре 26-28°С в течение 7-10 суток в зависимости от штамма дрожжей.
Для выделения меланина выросшую биомассу отделяют центрифугированием и автоклавируют при 0,5 атм с 0,5 н. NaOH в течение 1-3 часа. Затем клеточную массу удаляют центрифугированием, центрифугат подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1-2. Выпавший осадок меланина отделяют и высушивают.
Недостатком описанных в патентах РФ №№2116036, 2069696 способов получения меланина является большая продолжительность процесса ферментации (7-10 суток), что существенно сказывается на затратах на производство. Кроме того в патентах РФ №№2116036, 2069696 нет количественных характеристик процесса (содержание меланина в биомассе, выход биомассы), что затрудняет оценку эффективности как штаммов дрожжей, так и самого процесса.
Задачей данного изобретения является получение нового высокоэффективного штамма дрожжей - продуцента меланина, разработка более эффективного способа его получения, расширение числа продуцентов, удешевление процесса.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в результате селекции и отбора получен штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3, который при глубинном выращивании на питательной среде определенного состава через 96 часов от начала культивирования накапливает до 20 г/л биомассы дрожжей.
Меланин выделяют как из биомассы дрожжей (внутриклеточный меланин), так и из культуральной жидкости (внеклеточный меланин). Для получения внутриклеточного меланина выросшую биомассу дрожжей отделяют центрифугированием. Далее полученную биомассу гомогенизируют с раствором КОН в течение 10-20 минут при температуре 20-25°С, затем проводят экстракцию меланина в три ступени при следующих условиях: гомогенизат нагревают до температуры кипения раствора в условиях избыточного давления 1 атм и выдерживают в течение 3 часов. После окончания процесса реакционную смесь охлаждают до температуры 35-40°С и фильтруют в атмосфере азота для предотвращения окисления целевого продукта. Полученный осадок промывают раствором едкого калия. Полученный на каждой ступени экстракт меланина объединяют и добавляют 10%-ный раствор соляной кислоты. Полученный раствор выдерживают при постоянном перемешивании в течение 3 часов и температуре реакционной смеси 10-15°С. Полученный осадок меланина отделяют фильтрованием, промывают последовательно 10%-ным раствором соляной кислоты и дистиллированной воды. Промытые кристаллы внутриклеточного меланина сушат при температуре 60-80°С и величине остаточного давления 0,2 атм в течение 3-4 часов.
Для получения внеклеточного меланина в культуральную жидкость, полученную после отделения биомассы дрожжей добавляют этиловый спирт и выдерживают при постоянном перемешивании в течение 20-30 минут при температуре 35-40°С. Затем полученный осадок солей меланина отделяют от водного раствора меланина. Осадок промывают этанолом. Далее к осадку солей меланина добавляют дистиллированную воду. Реакционную смесь выдерживают при постоянном перемешивании в течение 20-30 минут при комнатной температуре. Затем к водному раствору солей меланина приливают 10%-ный раствор соляной кислоты и выдерживают при постоянном перемешивании в течение 20-30 минут при температуре 30-35°С. Полученный осадок внеклеточного меланина отделяют фильтрованием, промывают на фильтре сначала 10%-ным раствором соляной кислоты, затем дистиллированной водой. Полученные кристаллы внеклеточного меланина сушат при температуре 60-80°С и величине остаточного давления 0,2 атм в течение 3-4 часов.
Штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 получен из коллекционного штамма Nadsoniella nigra var. heuselica BKM-F-2137 в результате последовательного применения мутагенных факторов: УФ - лучей, дифениламина и N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина с последующим рассевом на чашки Петри с питательной средой сусло-агар (7°С). Отбор штаммов вели при длительном культивировании в асептических условиях при отьемно-доливном способе выращивания по признаку наибольшей скорости роста на жидкой питательной среде.
По морфологическим признакам штамм Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 не отличается от родительского: клетки имеют овальную форму, диаметром 5-8 мкм. На среде сусло-агар штамм Nadsoniella nigravar. heuselica Б-3 образует выпуклые, гладкие, с ровным краем колонии диаметром 4 мм (на 5 сутки культивирования на агаризованной среде при температуре 26-27°С).
По биотехнологическим показателям штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 значительно превосходит родительский штамм как по скорости роста, так и по уровню накопления биомассы.
При выращивании штамма дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 на жидкой минеральной среде в течение 4 суток концентрация биомассы достигает 25-26 г/л абсолютно сухих дрожжей. Содержание меланина в биомассе - 10%. Родительский штамм Nadsoniella nigra var. heuselica F-2137 в оптимальных для него условиях на жидкой минеральной среде в течение 10 суток накапливал только 2,0 г/л абсолютно сухих дрожжей.
Штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 хранится в коллекции компании ООО "Биосинтез Мт" на скошенном сусло-агаре и в лиофилизированном виде в ампулах.
Пример 1.
Штамм дрожжей Nadsoniella nigra var. heuselica Б-3 выращивали на скошенном сусле-агаре в течение 10 суток при 26-27°С. Далее засевали на минеральную среду следующего состава:
(NH4)2SO4 - 5,8 г/л
К2HPO4 - 5,2 г/л
КН2PO2 - 5,0 г/л
MgSO4·7H2O - 0,34 г/л
CaCl2 - 0,03 г/л
ZnSO4 - 0,01 г/л
CuSO4 - 0,03 г/л
гидрол (отход крахмалопаточного производства) - 30 г/л
пептон - 5%
рН среды 5,5
Выращивание вели при 26-27°С. Через 96 часов от начала ферментации содержание биомассы в среде составило 25,2 г/л абсолютно сухих дрожжей.
Пример 2.
То же, что и в примере №1, но в состав питательной среды вместо пептона вводили дрожжевой автолизат в количестве 5%. Через 96 часов культивирования содержание биомассы в среде составило 23,7 г/л абсолютно сухих дрожжей.
Пример 3.
Полученную со стадии ферментации биомассу в количестве 25 г гомогенизируют в 250 мл 2 н. растворе едкого калия. Гомогенизацию проводят в течение 15 минут при температуре 25°С. Полученный гомогенизат нагревают при избыточном давлении 1 атм. До температуры кипения реакционной смеси и выдерживают в течение 3 часов. Затем полученную смесь охлаждают до температуры 40°С и фильтруют. Осадок на фильтре промывают раствором едкого калия и проводят 2-ую и затем 3-ю ступень экстракции при условиях, описанных выше. Затем к объединенному экстракту меланина, полученному с 3-х ступеней экстракции (82,7 г), добавляют 10%-ный раствор соляной кислоты в количестве 61,5 мл. Раствор выдерживают при постоянном перемешивании в течение 3 часов при температуре 15°С. Далее суспензия подается на фильтр и полученный осадок промывается 10%-ной соляной кислотой, затем дистиллированной водой. Промытые кристаллы меланина сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 3-4 часов. В результате получают 2,3 г меланина.
Пример 4.
Культуральная жидкость, полученной после отделения биомассы дрожжей, в количестве 450 мл смешивается со 1,2 л этилового спирта. Реакционная смесь выдерживается при постоянном перемешивании в течение 30 минут при температуре 40°С. Далее полученный раствор солей меланина фильтруется. Осадок на фильтре промывают этанолом. Затем осадок солей меланина разводят в 10 мл дистиллированной воды и выдерживают при постоянном перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее к водному раствору солей меланина добавляют 2,5 мл 10%-ной соляной кислоты и полученный раствор выдерживают при температуре 35°С в течение 30 минут. Затем полученный раствор фильтруют, осадок промывают 10%-ной соляной кислотой, затем дистиллированной водой. Промытые кристаллы меланина сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 3-4 часов. В результате получают 0,7 г меланина.
Источники информации
1. Борщевская М.И., Васильева С.М. // Вопросы медицинской химии, 1999, №1, стр.13-23.
2. Моссе И.Б., Кострова Л.Н., Дубовник Б.В., Плотнокова С.И., Молофей В.П. // Радиационная биология. Радиоэкология, 1999, №2-3, стр.329-333.
3. Патент РФ №2215761.
4. Лях С.П., Рубан Е.Л. // Микробные меланины. М.: Наука, 1972 г.
5. Прототип - патент РФ №2116036.
6. Прототип - патент РФ №2069696.
Claims (1)
- Способ получения меланина, включающий выращивание дрожжей Nadsoniella nigra на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора, микроэлементы с последующим выделением меланина, отличающийся тем, что в качестве продуцента меланина используют штамм Nadsoniella nigra Б-3.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004127970/13A RU2278163C2 (ru) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | Способ получения меланина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004127970/13A RU2278163C2 (ru) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | Способ получения меланина |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004127970A RU2004127970A (ru) | 2006-03-10 |
RU2278163C2 true RU2278163C2 (ru) | 2006-06-20 |
Family
ID=36115579
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004127970/13A RU2278163C2 (ru) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | Способ получения меланина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2278163C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2675932C1 (ru) * | 2018-03-20 | 2018-12-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) | Стимулятор роста растений |
-
2004
- 2004-09-22 RU RU2004127970/13A patent/RU2278163C2/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2675932C1 (ru) * | 2018-03-20 | 2018-12-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) | Стимулятор роста растений |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2004127970A (ru) | 2006-03-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102102241B1 (ko) | 유글레나속 미세 조류, 다당류의 제조 방법, 및 유기 화합물의 제조 방법 | |
KR101577820B1 (ko) | 종속영양 미세조류의 신규 배양 방법 | |
ITFI20100188A1 (it) | Processo per la produzione di l-fucosio. | |
CN101671632A (zh) | 一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法 | |
US10364446B2 (en) | Streptomyces psammoticus and methods of using the same for vanillin production | |
RU2381270C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ БУТАНОЛА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА | |
DE2939269C2 (de) | Verfahren zur optischen Trennung von DL-2-Amino-4-hydroxy(methyl)phosphinoylbuttersäure | |
CN109906877A (zh) | 一种翘鳞香菇新菌种及其驯化栽培方法与应用 | |
CN1124350C (zh) | 草酸青霉亚美尼亚变种的菌株及其应用 | |
RU2278163C2 (ru) | Способ получения меланина | |
KR100277489B1 (ko) | 칸디다 속의 내염성 돌연변이주 및 이를 이용한 에리트리톨의 생산방법 | |
RU2567672C1 (ru) | ШТАММ ГРИБА Eremothecium ashbyi - ПРОДУЦЕНТ ЭФИРНОГО МАСЛА, АНАЛОГИЧНОГО БОЛГАРСКОМУ РОЗОВОМУ | |
EP3086794B1 (en) | Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues | |
KR102022876B1 (ko) | 폴리히드록시알카노에이트 및 카로티노이드의 동시 생산방법 | |
JPH09154592A (ja) | 微細藻による乳酸の製造方法 | |
RU2161884C1 (ru) | Сообщество микроорганизмов для получения регулятора роста растений, способ получения регулятора и регулятор роста растений | |
SU939549A1 (ru) | Способ получени посевного материала дл производства лимонной кислоты | |
RU2080382C1 (ru) | Штамм бактерий clostridium acetobutylicum-продуцент н-бутилового спирта и ацетона | |
CN105602856B (zh) | 黑曲霉(Aspergillus niger)An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 | |
KR20030015504A (ko) | 감귤농축액을 이용한 버섯균사체의 배양방법 및 그버섯균사체 | |
CN109797122A (zh) | 一类生产l-茶氨酸的菌群及其应用 | |
CN116179402B (zh) | 一株类胡萝卜素合成菌株及其应用 | |
CN102978131A (zh) | 一种Vc二步发酵菌株的筛选方法 | |
RU2646134C2 (ru) | Штамм гриба eremothecium ashbyi - продуцент эфирного масла с запахом цветков розы | |
RU2627182C1 (ru) | Штамм Aneurinibacillus migulanus и его применение для получения грамицидина С |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110923 |