RU2276602C2 - Аналоги жирных кислот для лечения пролиферативных кожных расстройств - Google Patents

Abstract

Предложено: кислород, серо- или селенсодержащие аналоги жирных кислот для лечения пролиферативных кожных расстройств, или для подавления пролиферации и/или индукции дифференциации кератиноцитов и способ лечения пролиферативных кожных расстройств. Изобретение отличается тем, что указанные аналоги жирных кислот (в частности, тетрадецилтиоуксусная кислота и тетрадецилселеноуксусная кислота) сильно подавляют пролиферацию клеток NKH и вызывают сильную экспрессию генов-маркеров дифференциации кератиноцитов. Способ обеспечивает улучшение при десквамации и эритеме, уменьшение поражения кожи, прекращение зуда. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к аналогам жирных кислот, которые могут быть использованы для лечения и/или предупреждения пролиферативных кожных заболеваний. Более конкретно изобретение относится к применению аналогов жирных кислот для лечения и/или предупреждения заболеваний, связанных с регуляцией дифференциации и пролиферации кератиноцитов.

Предшествующий уровень техники

Пролиферативные кожные заболевания широко распространены во всем мире и поражают миллионы людей и домашних животных. Пролиферативные кожные заболевания характеризуются пролиферацией, или делением, клеток кератиноцитов, а также могут быть ассоциированы с неполной дифференциацией эпидермиса. Псориаз представляет собой наиболее опасное из пролиферативных кожных заболеваний, которое данное изобретение и затрагивает.

Псориаз представляет собой генетически обусловленное заболевание кожи, которое характеризуется двумя биологическими критериями. Во-первых, наблюдается сильная гиперпролиферация эпидермиса, связанная с ускоренной и неполной дифференциацией. Во-вторых, наблюдается заметное воспаление как эпидермиса, так и дермы с увеличением численности Т-лимфоцитов и, в некоторых случаях, образование нейтрофильных микроабсцессов. Многие патологические особенности псориаза могут быть объяснены изменениями роста и созревания эпидермальных кератиноцитов с повышенной пролиферацией эпидермальных клеток, которые располагаются в пределах 0,2 мм от поверхности кожи. Традиционные исследования патогенеза псориаза сосредоточены на повышенной пролиферации и гиперплазии эпидермиса. Для нормальной кожи время передвижения клетки из базального слоя через зернистый слой составляет от 4 до 5 недель. При псориазных поражениях это время уменьшается в семь-десять раз вследствие укороченного времени клеточного цикла, увеличения количества клеток, способных к пролиферации, и возросшей доли клеток, которые фактически делятся. Также выражено явление гиперпролиферации, хотя в существенно меньшей степени, для клинически неповрежденной кожи у пациентов с псориазом.

Обычная форма псориаза, обыкновенный псориаз, характеризуется четко ограниченными эритематозными бляшками, покрытыми плотными серебристыми чешуйками. Характерным признаком является изоморфная реакция (феномен Кебнера), при которой новые псориазные поражения возникают в местах травмы кожи. Поражения часто локализуются на разгибательных поверхностях конечностей, а также обычно поражаются ногти и кожа головы.

Терапевтические усилия при псориазе направлены на уменьшение скорости пролиферации эпидермиса либо путем непосредственного воздействия на деление клеток, либо косвенно путем снижения иммунологической реакции. Для пациентов с локализованным ограниченным псориазом введение местных кортикостероидов является наиболее приемлемым амбулаторным лечением. При таком подходе может наблюдаться быстрое улучшение, но непродолжительный целебный эффект ограничен, и длительное лечение местными кортикостероидами не рекомендуется. Побочные действия при длительной терапии местными кортикостероидами могут включать в себя атрофию кожи, развитие толерантности к используемому агенту (тахифилаксии) и серьезное обострение заболевания после прекращения лечения. Супрессия гипофизарно-надпочечниковой системы является потенциальным и серьезным осложнением при сильнодействующей терапии местными кортикостероидами, в частности, когда агент наносят на большой участок поверхности тела и используют под окклюзионные повязки.

Ретиноиды, в частности этретинат, либо по отдельности, либо в сочетании с PUVA (фотохимиотерапией) также являются эффективным лечением псориаза. Этретинат особенно полезен при эксфолиативной и пустулезной разновидностях псориаза. Однако следует контролировать несколько основных потенциальных осложнений у пациентов, которых лечат с использованием ретиноидов. Как класс, ретиноиды являются сильными тератогенами, и их не следует прописывать женщинам детородного возраста, которые не используют соответствующую контрацепцию. Этретинат подобно другим ретиноидам может вызывать повышения уровней холестерина и триглицеридов, поэтому при их приеме может быть необходима диета. Кроме того, поскольку этретинат может обладать гепатотоксичностью, следует осуществлять функциональные пробы печени перед использованием этого лекарственного средства и во время его использования через определенные промежутки времени.

В ЕР 0273202, являющемся наиболее близким аналогом, описаны композиции, включающие гидроксикарбоновые кислоты, которые использованы для усиления терапевтических эффектов других агентов для лечения кожного заболевания, входящих в эти композиции. Применение анелогов жирных кислот для лечения или предупреждения пролиферативных кожных расстройств в данном документе не упоминается.

Принимая во внимание осложнения и побочные действия, сопутствующие применению различных лекарственных средств и фотохимиотерапии, используемых в настоящее время при лечении пролиферативного кожного заболевания, такого как псориаз, существует потребность в новом способе и новой композиции для подавления пролиферации кератиноцитов, чтобы частично снять симптомы пролиферативных кожных заболеваний.

Подробное описание изобретения

Эпидермис представляет собой многослойный чешуйчатый эпителий, у которого базальный слой состоит из клеток-предшественников, которые подвергаются строго последовательной операции дифференциации, когда они мигрируют через супрабазальные слои. Каждая стадия дифференциации характеризуется экспрессией специфических генов-маркеров. Пролиферирующие базальные клетки экспрессируют гены кератина, такие как К5 и К14, тогда как перемещение базальных клеток из базального слоя в шиповидный слой связано с активацией маркеров ранней дифференциации кератин 1 (К1) и кератин 10 (К10). Перемещение из шиповидного слоя в зернистый слой сопровождается активацией генов, кодирующих структурные белки рогового слоя, такие как инволюкрин (IVL) и поздняя трансглютаминаза (TGM1).

Эпидермис представляет собой ткань с высокой скоростью метаболизма жирных кислот и холестерина, где накопление и отложение холестерина, жирных кислот и сфинголипидов составляют неотъемлемую часть терминальной операции дифференциации эпидермиса, завершающейся образованием прочного эпидермального барьера.

Предполагают, что семейство PPAR (рецепторы, активированные пролифератором пероксисом) играет роль в дифференциации кератиноцитов, и в настоящем исследовании авторы изобретения сравнили действие известных лигандов PPAR с действием, оказываемым ТТА, соединением по настоящему изобретению.

В настоящем исследовании авторы изобретения детально проанализировали экспрессию PPAR во время дифференциации кератиноцитов человека ex vivo в выделенных базальных и супрабазальных клетках и на участках кожи человека. Используя концентрации селективных лигандов подтипа PPAR, которые нацелены исключительно на соответствующий подтип PPAR, авторы изобретения обнаружили, что селективные лиганды PPARα и PPARγ оказывают незначительное воздействие на экспрессию генов-маркеров кератиноцитов (данные не приведены). Интересно, что селективный лиганд PPARδ L165041 вызывал дозозависимую экспрессию инволюкрина. Все три селективные лиганда подтипа PPAR либо по отдельности, либо в сочетании лишь ограниченно влияли на пролиферацию кератиноцитов.

Однако в настоящей патентной заявке показано, что соединение по изобретению, то есть тиозамещенная жирная кислота, тетрадецилтиоуксусная кислота (ТТА), интенсивно вызывала экспрессию генов-маркеров дифференциации кератиноцитов и оказывала сильное антипролиферативное действие на указанные кератиноциты.

Таким образом, ТТА обещает быть интересным соединением для лечения различных эпидермальных расстройств, характеризующихся аберрантной дифференциацией.

Следовательно, в настоящем изобретении описано, что модифицированные аналоги жирных кислот в нецитотоксичных концентрациях можно использовать для лечения и/или предупреждения пролиферативных кожных расстройств.

Настоящее изобретение относится к применению аналогов жирных кислот общей формулы (I):

где R₁ представляет собой:

- С₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, и/или

- С₁-С₂₄алкин, и/или

- С₁-С₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₂-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил, и

- где R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил, и

- где n представляет собой целое число от 1 до 12, и

- где i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂, и

- где X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂, и

- при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является СН₂, и

- при условии, что если R_i представляет собой алкин или алкен, то углерод-углеродная тройная связь или двойная связь расположена между (ω-1)-углеродом и (ω-2)-углеродом, или между (ω-2)-углеродом и (ω-3)-углеродом, или между (ω-3)-углеродом и (ω-4)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплекса для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или предупреждения пролиферативных кожных расстройств.

Более конкретно изобретение относится к применению соединений для регуляции дифференциации и пролиферации кератиноцитов.

В настоящее время предпочтительные воплощения настоящего изобретения относятся к соединениям тетрадецилтиоуксусной кислоты (ТТА) и тетрадецилселеноуксусной кислоте (TSA).

Другой аспект изобретения относится к способу лечения и/или подавления пролиферативных кожных заболеваний, при котором осуществляют стадию введения нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества аналогов жирных кислот общей формулы (I):

где R₁ представляет собой:

- С₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, и/или

- С₁-С₂₄алкин, и/или

- С₁-С₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₂-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил, и

- где R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил, и

- где n представляет собой целое число от 1 до 12, и

- где i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂, и

- где X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и CH₂, и

- при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является CH₂, и

- при условии, что если R₁ представляет собой алкин или алкен, то углерод-углеродная тройная связь или двойная связь расположена между (ω-1)-углеродом и (ω-2)-углеродом, или между (ω-2)-углеродом и (ω-3)-углеродом, или между (ω-3)-углеродом и (ω-4)-углеродом,

либо их соли, пролекарства или комплексы.

Предпочтительное воплощение изобретения включает в себя местное введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективной концентрации соединения по настоящему изобретению.

Подписи к графическим материалам

На Фиг.1 показана индукция специфических генов дифференциации эпидермиса и CD36.

На Фиг.2 показана морфология и экспрессия специфических генов дифференциации кератиноцитов, обработанных ТТА и селективными лигандами PPAR.

На Фиг.3 показано, что ТТА индуцирует поздний маркер Tg-1 дифференциации эпидермиса и подавляет пролиферацию кератиноцитов.

Введение соединений по настоящему изобретению

В качестве фармацевтического лекарственного средства соединения по настоящему изобретению можно вводить непосредственно млекопитающему с использованием любого подходящего способа, в том числе парентерально, интраназально, перорально или посредством абсорбции через кожу. Их можно вводить местно или системно. Конкретный путь введения каждого агента будет зависеть, например, от истории болезни млекопитающего.

Предпочтительно соединения по настоящему изобретению вводят местно.

Соединения по настоящему изобретению могут быть введены в виде дисперсий, приготовленных в кремах, мазях, масле или другом подходящем носителе и/или разбавителе, таком как глицерин, жидкие полиэтиленгликоли и/или их смеси.

Фармацевтические формы, подходящие для местного применения, включают в себя стерильные водные растворы (в тех случаях, когда они водорастворимые) или дисперсии и порошки для приготовления для немедленного приема раствора или дисперсии для местного применения. Во всех случаях эта форма предпочтительно является стерильной, хотя это не является неопровержимым требованием, и стабильной в условиях производства и хранения. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и им подобные), их подходящие смеси и растительные масла. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования сурфактантов. Предупреждение воздействия микроорганизмов можно осуществлять путем использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тирмеросала (thirmerosal) и им подобных. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара или хлорид натрия.

Растворы для местного применения приготавливают путем введения соединений по настоящему изобретению в требуемом количестве в соответствующий растворитель с различными другими вышеперечисленными ингредиентами, если требуется, с последующей стерилизацией фильтрацией, если необходимо.

При использовании здесь, термин «фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители» включает в себя любой и все растворители, дисперсионные среды, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и им подобные. Применение таких сред и агентов для фармацевтических активных веществ хорошо известно в данной области техники. Их применение в фармацевтических композициях рассматривается, кроме тех случаев, когда любые общепринятые среды или агент несовместимы с активным ингредиентом.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению соответствующим образом вводят в сочетании с другими способами лечения для борьбы или предупреждения пролиферативных кожных заболеваний.

Изобретение можно понять более основательно при обращении к следующим примерам. Их не следует, однако, истолковывать как ограничение объема изобретения.

Экспериментальный раздел

Пример 1. Получение и характеристика соединений

Синтез аналогов жирных кислот, замещенных по положению 3

Соединения, используемые согласно настоящему изобретению, где заместитель Х_i=3 представляет собой атом серы или атом селена, можно получить согласно следующей общей методике.

Х представляет собой атом серы:

Тиозамещенное соединение, используемое согласно настоящему изобретению, можно получить с использованием общей методики, указанной ниже:

Соединение, содержащее серу, а именно тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА), (СН₃-(СН₂)₁₃-S-СН₂-СООН), получали, как показано в ЕР-345038.

Х представляет собой атом селена:

Селенозамещенное соединение, используемое согласно настоящему изобретению, можно получить с использованием следующей общей методики:

1. Алкил-Гал + KseCN → Алкил-SeCN...

2. Алкил-SeCN + ВН₄ ^- → Алкил-Se^-

3. Алкил-Se^- + O₂ → Алкил-Se-Se-Алкил

Это соединение тщательно очищали посредством кристаллизации из этанола или метанола.

4.

5. Алкил-Se^- + Гал-СН₂-СООН → Алкил-Se-СН₂-СООН

Конечное соединение, например, когда алкил представляет собой тетрадецил, (СН₃-(СН₂)₁₃-Se-СН₂-СООН (тетрадецилселеноуксусная кислота (TSA)), можно очищать посредством кристаллизации из диэтилового эфира и гексана.

Другие соединения по настоящему изобретению можно синтезировать, как показано заявителем в его патентной заявке WO 99/58122.

Синтез аналогов не подвергающихся β-окислению жирных кислот с углерод-углеродной двойной связью.

Синтез таких соединений обычно проводят согласно синтезу тиагептадец-9-еновой кислоты:

(Z) НО(O)С-СН₂-S-(СН₂)₅-СН=СН-С₇Н₁₅, где

(Z) означает цис-конфигурацию.

1) Получение 1-бром-5-гидроксипентана

Пентан-1,5-диол, НО-(СН₂)₅-ОН обрабатывали HBr в бензоле и нагревали с обратным холодильником в течение 24 часов. Смесь продуктов хроматографировали сначала смесью гексан-диэтиловый эфир в соотношении 85:15 для удаления дибромида, а затем смесью в соотношении 70:30. Выход 1-бром-5-гидроксипентана составил 80%.

¹H ЯМР: 1,81 (-СН₂-СН₂OH); 1,44 (-СН₂-); 3,35 (-CH₂-Br); 3,55 (-СН₂-ОН); 3,32 (-ОН); 1,51 (-СН₂-СН₂Br).

¹³С ЯМР: 31,43-32,30 (С₂, С₄); 24,24 (С₃); 33,64 (С₅); 62,11 (C₁).

2) Получение 5-(тетрагидропиранилокси)-1-бромпентана

Этому соединению давали провзаимодействовать с 3,4-дигидро-2Н-пираном в CH₂Cl₂ при 0°С. 2 капли концентрированной HCI использовали в качестве катализатора. После удаления растворителя продукт реакции хроматографировали в системе гексан-диэтиловый эфир в соотношении 95:5. Выход 5-(тетрагидропиранилокси)-1-бромпентана составил 77%.

¹H ЯМР: 1,45-1,63 (-СН₂-); 1,83 (-СН₂-СН₂O-); 3,38 (-СН₂-Br); 3,27-3,79 (-СН₂-O-); 4,52 (-O-СН-O).

¹³С ЯМР: 24,9-32,92 (C₂-C₄); 33,61 (C₅); 62,26 (С₆); 98,83 (С₁ в ТНР).

3) Получение 7-(тетрагидропиранилокси)-1-гептина

Продукт стадии 2 обрабатывали EDA-комплексом Li-ацетиленида в сухом диметилсульфоксиде при 0°С в атмосфере аргона. После 4 часов при комнатной температуре реакционную смесь гидролизовали водой, и органические продукты экстрагировали диэтиловым эфиром. Остаток после удаления эфира хроматографировали в системе гексан-диэтиловый эфир в соотношении 97:3, получая 7-(тетрагидропиранилокси)-1-гептин с выходом 62%.

¹H ЯМР: 1,45-1,66 (-СН₂-); 3,45-3,82 (-CH₂-O); 2,16 (-CH₂-C≡); 1,90 (НС≡С-); 4,53 (-O-СН-O-).

¹³С ЯМР: 18,27-30,66 (С₃-С₆); 62,21 (С₇); 68,14 (С₁); 84,40 (C₂).

4) Получение 1-(тетрагидропиранилокси)-тетрадец-6-ина

К 1,6 М раствору BuLi в гексане, растворенному в THF (тетрагидрофуране) при 0°С в атмосфере аргона, и продукту стадии 3 добавляли смесь 1-бромгептана и N,N-диметилпропиленмочевины. После гидролиза, экстракции и хроматографии выделяли 1-(тетрагидропиранилокси)-тетрадец-6-ин с выходом 69%.

¹H ЯМР: 0,85 (СН₃-); 1,22-1,57 (-СН₂-); 2,10 (-СН₂-С≡); 3,30-3,84 (-СН₂O-); 4,55 (-O-СН-O-).

¹³С ЯМР: 14,02 (C₁₄); 22,60-31,73 (C₂-C₁₃); 18,69-18,71 (C₅ и C₈); 62,23 (C₁); 79,91-80,32 (C₆ и С₇).

5) Получение 1-(тетрагидропиранилокси)-тетрадец-6-ена

Замещенный тетрадец-6-ин стадии 4 восстанавливали водородом в присутствии катализатора Линдлара (Lindlar) в этаноле. Восстановление длилось в течение 4 часов. Полученный 1-(тетрагидропиранилокси)-тетрадец-6-ен был достаточно чистым для стадии 6 без дальнейшей очистки, но мог быть выделен с выходом 89% и после хроматографии.

¹H ЯМР: 0,90 (СН₃-); 1,27-1,61 (-СН₂-); 3,39-3,89 (-СН₂-O); 2,04 (-СН₂-С=); 4,59 (-O-СН-O-); 5,37 (-НС=СН-).

¹³С ЯМР: 14,07 (С₁₄); 22,65-31,85 (C₂-C₁₃); 62,27 (C₁); 27,13, 27,19 (С₅ и C₈); 129,60-130,04 (С₆ и С₇).

6) Получение 1-бромтетрадец-6-ена

Продукт стадии 5 бромировали CBr₄ при 0°С в дихлорметане в присутствии Ph₃Р. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Выход 1-бромтетрадец-6-ена был количественным.

¹H ЯМР: 0,87 (СН₃-); 1,27-1,52 (-CH₂-); 2,01 (-СН₂-С=); 3,39 (-CH₂-Br); 1,45 (-СН₂-СН₂-Br); 1,85 (-СН₂-СН₂С=); 5,34 (-НС=СН-).

¹³С ЯМР: 14,00 (C₁₄); 22,60-32,68 (C₂-C₁₃); 26,97, 27,24 (C₅ и С₈); 33,75 (C₁); 129,15-130,32 (С₆ и С₇).

7) Получение (Z) тиа-гептадец-9-еновой кислоты

Бромдецен стадии 6 в метаноле добавляли к 3 эквивалентам КОН и 1,5 эквивалентам HS-CH₂-C(O)OH в метаноле в атмосфере аргона в течение 30 минут. После перемешивания при комнатной температуре в течение 4 часов, кипячения с обратным холодильником в течение еще 12 часов, с последующим гидролизом и экстракцией диэтиловым эфиром, а затем подкислением до рН 1-2, выделяли продукт, соединение, приведенное в заголовке, в виде вязкого масла с выходом 60%.

Были проведены следующие анализы: ИК (инфракрасная спектроскопия), 600 МГц ¹H и ¹³С ЯМР (ядерный магнитный резонанс), МС (масс-спектрометрия), ГХ (газовая хроматография), ГХ-МС (масс-спектрометрия - газовая хроматография) метилового эфира. Результаты ЯМР приведены ниже. Все данные приведены в миллионных долях (млн^-1). Никаких следов Е-соединений не было обнаружено.

¹H ЯМР: 0,86 (СН₃-); 1,16-1,60 (-СН₂-); 1,99 (-СН₂-С=); 2,64 (-CH₂-S-); 3,22 (-S-CH₂-C(O)OH); 5,33 (НС=СН).

¹³С ЯМР: 176,63 (C₁); 33,34 (С₂); 32,69 (С₄); 22,63-31,83 (C₅-C₇, C₁₂-C₁₆); 129,32 и 130,24 (С₉, С₁₀); 26,98 и 27,19 (С₈, С₁₁); 14,08 (C₁₇).

Синтез аналогов не подвергающихся β-окислению жирных кислот, содержащих углерод-углеродную тройную связь.

Синтез таких соединений проводят согласно синтезу 3-тиа-15-гептадецина.

1) Получение 11-бром-1(тетрагидро-2-пиранилокси)ундекана

Пиридин-толуол-4-сульфонат (1,0 г; 4,0 ммоль) и 11-бром-1-ундеканол (10,0 г; 400 ммоль) растворяли в сухом СН₂СН₂ (200 мл) при температуре окружающей среды и добавляли 3,4-дигидро-2Н-пиран (5,0 г; 60 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле, который элюировали СН₂Cl₂. Выход 11-бром-1(тетрагидро-2-пиранилокси)ундекана составил 10,7 г (80%).

2) Получение 14-(тетрагидро-2-пираноил)-2-тетрадецина

Газ пропин пропускали через раствор MeLi в диэтиловом эфире (0,8 М; 60 мл; 51,2 ммоль) со скоростью, подобранной так, чтобы обеспечить дефлегмацию эфира. Когда тепло больше не выделялось, реакцию считали законченной (белая суспензия). 11-бром-1(тетрагидро-2-пиранилокси)ундекан (продукт 2) (13,0 г; 38,8 ммоль) добавляли по капле к этому раствору на протяжении периода 20 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и осторожно по капле добавляли воду (50 мл). Смесь разбавляли диэтиловым эфиром и промывали водой (5х), сушили (MgSO₄) и выпаривали растворитель. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии с CH₂Cl₂ в качестве элюента. Выход 14-(тетрагидро-2-пираноил)-2-тетрадецина составил 8,5 г (74%).

3) Получение 12-тетрадецин-1-ола

Пиридин-толуол-4-сульфонат (0,3 г; 1,2 ммоль) и алкин (продукт 3) растворяли в этаноле (25 мл) и нагревали до 50°С в течение ночи. Растворитель выпаривали и распределяли между водой и CH₂Cl₂. Водную фазу промывали водой, сушили (MgSO₄) и выпаривали растворитель. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии с CH₂Cl₂ в качестве элюента. Выход 12-тетрадецин-1-ола составил 1,5 г (78%).

4) Получение 14-бром-2-тетрадецина

12-Тетрадецин-1-ол (5,0 г; 23,8 ммоль) растворяли в гексане (50 мл) и добавляли 10 капель пиридина. Добавляли к этой смеси PBr₃. Смесь нагревали до 60°С в течение трех часов, охлаждали и добавляли воду по капле. Смесь промывали водой, сушили (MgSO₄) и выпаривали растворитель. Неочищенный продукт очищали посредством флэш-хроматографии с гексаном в качестве элюента до содержания 2,5% EtOAc в гексане. Выход 14-бром-2-тетрадецина составил 2,2 г (34%).

5) Получение 3-тиа-15-гептадецина

КОН (2,76 г; 49,0 ммоль) растворяли в метаноле (30 мл) и добавляли по капле тиогликолевую кислоту (2,04 г; 22,1 ммоль) в метаноле (25 мл). Через 10 минут осторожно по капле добавили 14-бром-2-тетрадецин (5,5 г; 20,1 ммоль) и смесь нагревали до 50°С в течение ночи. Смесь охлаждали до 0°С и добавляли 30 мл HCl (рН=1). Осадок отфильтровывали и промывали водой (2х). Твердое вещество растворяли в хлороформе (100 мл) и промывали водой (1х), сушили (MgSO₄) и выпаривали растворитель. Выход соединения 14-бром-2-тетрадецина составил 4,4 г (77%).

¹H ЯМР (300 МГц; CDCl₃) δ: 1,26 (10Н, острый m); 1,3-1,4 (4Н, m); 1,46 (2Н, квинтет, J=7,0 Гц, ≡CCH₂CH₂-); 1,60 (2Н, квинтет, J=7,0 Гц, -CH₂CH₂S-); 1,77 (3Н, t, J=2,6 Гц, СН₃С≡); 2,10 (2Н, tq, J=2,6; 7,0 Гц, ≡ССН₂-); 2,65 (2Н, t, J=7,3 Гц, -CH₂S-); 3,25 (2Н, s, -SCH₂COOH); 10,40 (1H, уширенный s, -COOH).

¹³С ЯМР (75 МГц; CDCl₃) δ: 3,35 (СН₃С≡); 18,61 (≡CCH₂-); 28,60; 28,78; 28,78; 28,97; 29,04; 29,04; 29,34; 29,38; 29,40; 32,70 (-CH₂CH₂S-); 33,32 (-SCH₂CO); 75,20 (МеС≡С-); 79,31 (МеС≡С-); 176,42 (СО).

Синтез аналогов не подвергающихся β-окислению жирных кислот, замещенных в одном или нескольких положениях

Одна или несколько водородных групп цепи жирной кислоты могут быть замещены одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₂-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил. Заместители можно, например, вводить в соединение формулы (I) при помощи выбора других субстратов на стадиях 1-4, указанных выше. Наконец, полученные ненасыщенные соединения можно превращать в насыщенные соединения обычными реакциями гидрогенизации, таким образом, обеспечивая R₁ группу, которая полностью насыщена (то есть алкил), но замещена в одном или более чем одном положении.

Пример 2

Влияние ТТА на дифференциацию и пролиферацию кератиноцитов

Материалы и методы

Культура клеток и дифференциация

Нормальные эпидермальные кератиноциты взрослого человека выделяли из кожи человека, полученной после пластической хирургической операции. Кератиноциты первого пассажа выращивали на среде KGM без сыворотки (GIBCO BRL/Life Technologies, Inc.) и пересевали в 75 см² колбу для выращивания культуры или на 96-луночные титрационные микропланшеты с плотностью 3500 клеток на лунку, предварительно нагретые при 37°С. Клетки инкубировали в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37°С. При достижении клетками 40% конфлюэнтности их обрабатывали средой для выращивания, содержащей селективные лиганды PPAR (либо по отдельности, либо в сочетаниях, как указано), тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА) или 1,2 мМ Са²⁺. Wy14643 получали от Calbiochem, BRL49653 был любезно предоставлен J.FIeckner (Novo Nordisk), L165041 был любезно предоставлен D.E.Moller (Merck Research Laboratories, Rahway, Нью-Джерси). ТТА получали в соответствии с примером 1. Среду заменяли каждый день. Для дифференциации кератиноциты при 40% конфлюэнтности (день 0) обрабатывали 1,2 мМ CaCl₂. Среду заменяли через день. Клетки НаСаТ получали от L. Aarenstrup (Danish Cancer Society, Дания). Клетки НаСаТ культивировали на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина, 1 мг/мл сульфата стрептомицина) в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37°С. Среду заменяли через день.

Разделение кератиноцитов на базальные и супрабазальные клетки

Образцы кожи нормального взрослого человека, полученные после пластической хирургической операции, очищали от жира и отсекали эпидермальную сторону, используя шпатель. Ткань инкубировали в течение ночи на льду в растворе 25 Ед/мл диспазы II (Roche), приготовленном в забуференном солевом растворе Хэнкса. Эпидермис отслаивали, используя пинцет, и эпидермальные слои инкубировали в 0,05 мг/мл трипсине (1:250, GIBCO BRL/Life Technologies, Inc) при 37°С до высвобождения отдельных клеток. Активность трипсина подавляли путем добавления среды, содержащей сыворотку. Клетки центрифугировали при 800 rcf (максимальное относительное центрифужное ускорение) и ресуспендировали в предварительно нагретой среде Кератиноцит-SFM (GIBCO BRL/Life Technologies, Inc). Суспензию клеток добавляли в колбы для выращивания тканей, покрытые коллагеном из хвостов крыс. Через 1 час несвязанные клетки собирали как супрабазальную фракцию, а связавшиеся базальные клетки собирали, используя палочку с резинкой на конце. Осадок клеток замораживали при -70°С до использования.

Определение жизнеспособности и пролиферации

Жизнеспособность/пролиферацию измеряли путем модификации МТТ-теста (МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид), внедренного Mosmann Т (J Immunol Methods 65: 55-63, 1983). Двадцать пять мкл 5 мг/мл МТТ в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) без ионов Са²⁺ и Mg²⁺ (NaCl 8 г/л, KCl 0,2 г/л, Na₂HPO₄·2H₂O 1,44 г/л, КН₂PO₄ 0,2 г/л, рН 7,4) добавляли в каждую лунку и планшеты помещали в термостат до проникновения растущих кристаллов в клеточные стенки, типично через промежуток времени от трех до четырех часов. Планшеты встряхивали для удаления среды и дважды замораживали и размораживали перед тем, как кристаллы формазана растворяли в системе этанол:ацетон (60:40 мас./мас.) путем осторожного перемешивания в течение 30 минут при 4°С. Количество формазана измеряли на считывающем устройстве ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) при 540 нм. Значения исходных данных при 650 нм вычитали.

Определение экспрессии Tg-1 с помощью метода ELISA

Клетки подвергали двум циклам замораживание-оттаивание, и трансглютаминазу 1 типа (Tg-1) определяли с помощью метода ELISA. Каждую лунку блокировали 200 мкл 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в PBS в течение одного часа при 37°С и затем инкубировали в течение 1 часа при 37°С со 100 мкл Tg-1-специфического моноклонального антитела В. С1 (Biomedical Technologies Inc), разведенных 1:1000 в PBS-1% BSA. Лунки промывали трижды в течение 5 минут в PBS-0,05% Tween 20 и инкубировали в течение 1 часа со 100 мкл вторичной пероксидазы хрена, конъюгированной с козьим антимышиным антителом, разведенными 1:2500 в PBS-1% BSA. Лунки промывали трижды в PBS-0,05% Tween 20 и один раз в PBS. Добавляли 100 мкл о-фенилендиаминного (OPD) субстрата и через 30 минут после выдержки в темноте реакции останавливали с помощью 100 мкл 2 н серной кислоты. Количество трансглютаминазы измеряли путем квантификации реакции OPD с помощью считывающего устройства ELISA при 490 нм и вычитания исходных данных при 650 нм. Для того чтобы ввести поправку на изменения в количестве клеток, все значения стандартизировали по числу клеток.

Результаты

Влияние на CD36

Для того чтобы оценить, как ТТА и различные активаторы PPAR влияют на экспрессию известного PPAR-зависимого гена и дифференциацию кератиноцитов, авторы изобретения сначала измеряли уровни мРНК CD36/FAT и двух маркеров дифференциации Inv и Tg-1 в клетках NHK, обработанных селективными активаторами PPAR и ТТА на протяжении трехдневного периода (Фиг.1а). Проксимальный промотор гена CD36/FAT, как было показано, содержит в себе PPAR-зависимый элемент. Введение BRL49653 (лиганда PPARγ) или Wy14643 (лиганда PPARα) вызывало экспрессию CD36/FAT, а селективный лиганд PPARδ L165041 вызывал значительную дозо-зависимую экспрессию CD36, свидетельствуя о том, что CD36/FAT также является PPARδ-зависимым геном.

Наконец, добавление соединения по настоящему изобретению, то есть ТТА, вызывало экспрессию мРНК CD36/FAT до уровня немного большего, чем уровни, наблюдаемые с Wy14643 или BRL49653.

Обработка CaCl₂, хорошо зарекомендовавшим себя и сильным индуктором дифференциации кератиноцитов, не вызвала экспрессии CD36/FAT.

Экспрессия мРНК Inv

Как показано на Фиг.1а, обработка Wy14643 приводила к ограниченной индукции экспрессии мРНК Inv. Интересно, что добавление L165041 приводило к дозо-зависимой индукции экспрессии мРНК Inv, тогда как BRL49653 сам по себе не оказывал влияния на экспрессию мРНК Inv. Совместное добавление L165041 и Wy14643 значительно не повысило уровень экспрессии мРНК Inv. Аналогично, совместная обработка Wy14643 и BRL49653 не вызывала экспрессии мРНК Inv выше, чем наблюдали при обработке одним Wy14643. Примечательно, что совместное добавление L165041 и BRL49653 сильно вызывало экспрессию мРНК Inv, свидетельствуя о синергизме между PPARδ и PPARγ. Вестерн-блоттинг, по существу, обобщил результаты, полученные посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), показывающей дозо-зависимую индукцию белка Inv с помощью L165041 и сильный синергизм между L165041 и BRL49653 (Фиг.1б). Каждый селективный лиганд PPAR вызывал экспрессию мРНК Tg-1, а сочетания селективных лигандов PPAR вызывали экспрессию аддитивным образом.

Добавление соединения по настоящему изобретению, то есть ТТА, вызывало экспрессию мРНК Inv и Tg-1 до уровней, которые значительно превосходили уровни, полученные путем обработки селективными лигандами PPAR. Эффективность ТТА как индуктора экспрессии Inv и Tg-1 была даже более заметной, когда экспрессию анализировали на уровне белка посредством вестерн-блоттинга (Фиг.1б). Следует заметить, что ТТА вызывала экспрессию мРНК Inv и Tg-1 и белка до уровней, равных или больших, чем уровни, наблюдаемые при обработке CaCl₂. Взятые вместе, эти результаты говорят о том, что ТТА возможно помимо индукции экспрессии Inv и Tg-1 посредством PPAR-зависимых путей оказывала определенное влияние на экспрессию Inv и Tg-1 посредством механизмов, не связанных с функцией ТТА как лиганда PPAR и активатора.

Поскольку ТТА активировала экспрессию маркеров дифференциации кератиноцитов, авторы изобретения исследовали, влияет ли обработка ТТА или различными активаторами подтипа селективных PPAR, либо по отдельности, либо в сочетании, на морфологию NHK во время раннего периода процесса дифференциации (Фиг.2). Кроме того, экспрессию Inv и Tg-1 исследовали посредством непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии (Фиг.3). Как было определено при помощи фазово-контрастной микроскопии, морфология NHK, обрабатываемых в течение трех дней лигандами или 1,2 мМ CaCl₂, заметно не отличалась. Однако плотность клеток на чашках, обработанных ТТА, была гораздо ниже, чем клеток, обработанных носителем, или клеток, обработанных селективными лигандами PPAR, свидетельствуя о том, что ТТА помимо индукции специфических маркеров кератиноцитов также приводила к замедлению роста или уменьшению скорости пролиферации.

Подтверждая результаты, полученные посредством вестерн-блоттинга, непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия показала сопоставимые уровни экспрессии Inv и Tg-1 в клетках, обработанных CaCl₂ и ТТА. Кроме того, этот анализ также показал, что селективный лиганд PPARδ L165041 вызывал дозо-зависимую экспрессию Inv.

Дифференциацию кератиноцитов сопоставляли с увеличением размера клеток. Интересно, что тщательное сравнение морфологии клеток, обработанных CaCl₂ и ТТА, показало, что ядерно-плазматическое отношение у клеток, обработанных ТТА, имело тенденцию быть меньше, чем у клеток, обработанных CaCl₂. Таким образом, несмотря на то что обработка CaCl₂ и ТТА вызывала перекрывание групп генов-маркеров кератиноцитов, это наблюдение говорит о том, что ТТА и CaCl₂ оказывают различное влияние на дифференциацию кератиноцитов. Для того чтобы исследовать влияние селективных лигандов PPAR и ТТА на пролиферацию кератиноцитов более количественным способом, клетки NHK обрабатывали лигандами PPAR, ТТА и CaCl₂, как показано на Фиг.3, и пролиферацию определяли, используя модификацию МТТ-теста, как описано в разделе «Материалы и методы». Параллельно экспрессию Tg-1 контролировали, используя тест на основе метода ELISA (Фиг.3б).

Примечательно, что ТТА вызывала сильное и дозо-зависимое подавление пролиферации клеток NHK, которое намного превосходило те, что наблюдали для селективных лигандов PPAR. Антипролиферативное действие CaCl₂ в этих экспериментах было незначительным. Обобщая результаты, полученные посредством ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, установили, что только ТТА и CaCl₂ вызывали значительную экспрессию Tg-1. Таким образом, результаты, полученные при использовании МТТ-теста, четко дифференцировали ТТА от селективных лигандов PPAR и подтвердили представление о том, что ТТА сильно подавляет пролиферацию клеток NHK и вызывает сильную экспрессию генов-маркеров дифференциации кератиноцитов.

Эффективность лечения организма-хозяина с пролиферативным кожным заболеванием с использованием соединения по настоящему изобретению можно оценить посредством объективных критериев, таких как улучшение при десквамации и эритеме, уменьшение размера поражений, а также субъективных критериев, таких как прекращение зуда. Объективные методы, которые используют для определения эффективности лечения пациентов с псориазом, включают в себя анализ бляшек посредством визуального контроля и фотографии.

Пример 3

Влияние положения атома Х относительно карбоксильного конца аналогов жирных кислот по изобретению на митохондриальное β-окисление в печени

Были проведены эксперименты для оценки эффекта перемещения атома Х в разные положения относительно карбоксильного конца аналогов жирных кислот по изобретению. В этих экспериментах измеряли активность (в нмоль/мин/мг/белка) митохондриального β-окисления в печени аналогов жирных кислот по изобретению, содержащих атом серы в 3, 5 и 7 положениях относительно карбоксильного конца. Активности составили 0,81±0,16 для серы в 3-м положении, 0,61±0,06 для серы в 5-м положении, 0,58±0,09 для серы в 7-м положении. При этом активность пальмитиновой кислоты, использовавшейся в качестве контроля, не блокирующего β-окисление, была меньше и составила 0,47±0,06.

Пример 4

Влияние жирных кислот с тройными связями на ω-конце на митохондриальное окисление жирных кислот в печени и пероксисомальное окисление жирных кислот в печени крыс

В эксперименте использовали крыс линии Zucker, которым давали две различные дозировки тестируемой жирной кислоты: 50 или 150 мг на кг массы тела в сутки (мг/кг/сутки). Исследовали следующие параметры: митохондриальное окисление жирных кислот в печени и пероксисомальное окисление жирных кислот в печени.

Результаты:

Митохондриальное окисление жирных кислот увеличилось почти в 4 раза в присутствии самой высокой дозы аналога жирной кислоты с тройной связью. Это увеличение более чем в 6 раз превосходило величину увеличения митохондриального окисления жирных кислот, которую наблюдали при использовании ТТА.

Активность митохондриального фермента CPT-II, который регулирует скорость митохондриального окисления жирных кислот, увеличилась на 160% в присутствии аналога жирной кислоты с тройной связью по сравнению с 40%-ным увеличением активности фермента в присутствии эквивалентной дозы ТТА.

Пероксисомальное окисление жирных кислот увеличилось в 10 раз для аналога жирной кислоты с тройной связью по сравнению с удвоением активности в присутствии эквивалентной дозы ТТА.

Эти данные подтверждают, что введение ω-блока не только не отменяет эффект жирных кислот, наблюдаемый для насыщенных аналогов жирных кислот типа ТТА, но и усиливает его благодаря увеличению периода времени, за которое данное соединение распадается in vivo (периода полувыведения соединения in vivo).

Claims (16)

1. Применение аналогов жирных кислот общей формулы (I)

где R₁ представляет собой С₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, и/или С₁-С₂₄алкин, и/или С₁-С₂₄алкил, либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₁-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил;

R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂;

X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂;

при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является CH₂, и при условии, что если R₁ представляет собой алкин или алкен, то углерод-углеродная тройная связь или двойная связь расположена между (ω-1)-углеродом и (ω-2)-углеродом, или между (ω-2)-углеродом и (ω-3)-углеродом, или между (ω-3)-углеродом и (ω-4) углеродом,

либо их соли для приготовления фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения пролиферативных кожных расстройств.

2. Применение по п.1, где пролиферативное кожное заболевание выбрано из группы, включающей в себя псориаз, атопический дерматит, неспецифический дерматит, простой контактный артефициальный дерматит, аллергический контактный дерматит, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предраковый кератоз, вызванный действием солнечных лучей и себорею.

3. Применение по п.2, где пролиферативное кожное заболевание представляет собой псориаз.

4. Применение по п.1, где R₁ представляет собой алкил.

5. Применение по п.1. где R₁ представляет собой алкен.

6. Применение по п.1, где соединение представляет собой тетрадецилтиоуксусную кислоту.

7. Применение по п.1, где соединение представляет собой тетрадецилселеноуксусную кислоту.

8. Применение аналогов жирных кислот общей формулы (I)

где R₁ представляет собой С₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, и/или С₁-С₂₄алкин, и/или С₁-С₂₄алкил либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₂-С₄ацилокси или С₁-С₄алкил;

R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂;

X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂;

при условии, что по меньшей мере один из Х_i не является СН₂, и

при условии, что если R₁ представляет собой алкин или алкен, то углерод-углеродная тройная связь или двойная связь расположена между (ω-1)-углеродом и (ω-2)-углеродом, или между (ω-2)-углеродом и (ω-3)-углеродом, или между (ω-3)-углеродом и (ω-4)-углеродом,

либо их соли для приготовления фармацевтической композиции для подавления пролиферации и/или индукции дифференциации кератиноцитов.

9. Применение по п.8, где соединение представляет собой тетрадецилтиоуксусную кислоту.

10. Применение по п.8, где соединение представляет собой тетрадецилселеноуксусную кислоту.

11. Способ лечения и/или предупреждения пролиферативных кожных расстройств, при котором осуществляют стадию введения нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества аналогов жирных кислот общей формулы (I)

где R₁ представляет собой

С₁-С₂₄алкен с одной или более чем одной двойной связью и/или одной или более чем одной тройной связью, и/или

С₁-С₂₄алкин, и/или

С₁-С₂₄алкил, либо С₁-С₂₄алкил, замещенный по одному или нескольким положениям одним или более чем одним соединением, выбранным из группы, включающей в себя фторид, хлорид, гидрокси, С₁-С₄алкокси, С₁-С₄алкилтио, С₂-С₅ацилокси или С₁-С₄алкил;

R₂ представляет собой водород или С₁-С₄алкил;

n представляет собой целое число от 1 до 12;

i представляет собой нечетное число и указывает положение относительно COOR₂;

X_i независимо друг от друга выбраны из группы, включающей в себя О, S, SO, SO₂, Se и СН₂;

при условии, что по меньшей мере один из X_i не является СН₂, и

при условии, что если R₁ представляет собой алкин или алкен, то углерод-углеродная тройная связь или двойная связь расположена между (ω-1)-углеродом и (ω-2)-углеродом, или между (ω-2)-углеродом и (ω-3)-углеродом, или между (ω-3)-углеродом и (ω-4)-углеродом,

либо их соли.

12. Способ по п.11, где R₁ представляет собой алкил.

13. Способ по п.11, где R₁ представляет собой алкен.

14. Способ по п.11, где соединение представляет собой тетрадецилтиоуксусную кислоту.

15. Способ по п.11, где соединение представляет собой тетрадецилселеноуксусную кислоту.

16. Способ по п.11, при котором аналоги жирных кислот вводят местно.

Images