RU2272286C1 - Способ определения антипирина в слюне - Google Patents

Способ определения антипирина в слюне Download PDF

Info

Publication number
RU2272286C1
RU2272286C1 RU2004127706/15A RU2004127706A RU2272286C1 RU 2272286 C1 RU2272286 C1 RU 2272286C1 RU 2004127706/15 A RU2004127706/15 A RU 2004127706/15A RU 2004127706 A RU2004127706 A RU 2004127706A RU 2272286 C1 RU2272286 C1 RU 2272286C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
saliva
antipyrine
supernatant
rpm
minutes
Prior art date
Application number
RU2004127706/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2004127706A (ru
Inventor
Тать на Игоревна Петренко (RU)
Татьяна Игоревна Петренко
Наталь Сергеевна Кизилова (RU)
Наталья Сергеевна Кизилова
Юли Михайловна Харламова (RU)
Юлия Михайловна Харламова
Людмила Ивановна Еремеева (RU)
Людмила Ивановна Еремеева
Людмила Алексеевна Кожанова (RU)
Людмила Алексеевна Кожанова
Original Assignee
ГУ Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза (ННИИТ) МЗ РФ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ГУ Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза (ННИИТ) МЗ РФ filed Critical ГУ Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза (ННИИТ) МЗ РФ
Priority to RU2004127706/15A priority Critical patent/RU2272286C1/ru
Publication of RU2004127706A publication Critical patent/RU2004127706A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2272286C1 publication Critical patent/RU2272286C1/ru

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования биологического материала, и может быть применено в лабораторной практике. Согласно способу определения антипирина в слюне центрифугирование супернатанта проводят при скорости 14000 об/мин в течение 5 минут, затем встряхивают смесь супернатанта с ZnSO4*7H2O и 0,75N NaOH в течение 1 минуты с последующим центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут, а затем 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 наносят в инжектор хроматографа, хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 С18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С, и определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата. Технический результат: упрощение, сокращение времени, повышение чувствительности и точности способа. При этом сокращаются количество рабочих растворов, число дозирующих процедур, время пробоподготовки, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ, исключается применение токсических веществ (хлороформа, серной кислоты). 2 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования биологического материала, и может быть применен в лабораторной практике.
Антипириновая проба - очень чувствительный и надежный тест, позволяющий судить о функциональном состоянии монооксигеназной системы печени. Антипирин достаточно медленно выводится из организма, малотоксичен, имеет высокую биодоступность (97-100%), низкое связывание с белками плазмы, равномерно распределяется во всех биологических жидкостях организма и, что самое важное, метаболизм антипирина почти полностью осуществляется при участии цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени (1), о чем свидетельствует линейность отношений между антипирингидроксилазной активностью и периодом полувыведения антипирина, а также тесная корреляция показателей активности цитохрома Р450 в биоптатах печени человека и кинетики элиминации этого препарата (2).
На основании вышеперечисленного антипириновый тест используется для оценки активности микросомальных монооксигеназ печени и служит в качестве количественного критерия функционального состояния печени (3). Иногда антипириновый тест является единственным маркером нарушения функционального состояния печени при нормальных значениях биохимических проб (4). Хорошая корреляция между концентрацией антипирина в плазме и слюне дает возможность при исследовании использовать слюну (5). Метод определения антипирина в слюне неинвазивен и доступен в научной и клинической практике.
Существуют хроматографические методы определения содержания антипирина в слюне:
1. Извлечение антипирина осуществляется в следующем порядке: к 0,5 мл слюны добавляют 4,5 мл хлороформа, содержимое пробирки тщательно встряхивают в течение 10 минут с целью максимального перехода антипирина, содержащегося в биопробе, в хлороформ.
После чего отбирают хлороформную фракцию в специальные конические колбы и упаривают на водяной бане при t - 60°С под током воздуха. Сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл ацетонитрила и 20 мкл аликвоты, вводят в инжектор хроматографической системы. Хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - "Econosil С-18" с размером зернистости 10 микрон (4,6*150 мм); подвижная фаза (элюент) - ацетонитрил: фосфатный буфер, рН - 6,0, в соотношении 35:65. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 254 нм, скорость потока элюента - 1 мл/мин при давлении на помпе 1500 psi, температура колонки - 25°С. Пороговая чувствительность метода составляет 0,2 мкг/мл (8).
2. Осаждение плотного осадка слюны проводят следующим образом: к 200 мкл супернатанта добавляют 200 мкл смеси 0,1N серной кислоты и этанола (30:70 об.%) и встряхивают в течение 1 минуты, после чего пробу центрифугируют (7000 об/мин в течение 20 мин) и 5 мкл надосадочной жидкости вводят в хроматограф. Состав подвижной фазы: ацетат натрия (рН 6,7) - ацетонитрил (70:30 об/об), скорость потока 100 мкл/мин. Спектр ультрафиолетового поглощения - 250 нм. Пороговая чувствительность методики - 1 мкг/мл (9).
Однако к недостаткам этих методов относится то, что при пробоподготовке слюны используют токсические вещества, такие как: хлороформ, серная кислота.
Наиболее близким к заявленному изобретению по пробоподготовке является метод Броди (6) и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче (7) для определения антипирина в слюне, заключающийся в том, что больные принимают натощак антипирин из расчета 18 мг/кг массы тела. Через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина собирают слюну в количестве 3 мл, центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Забирают 150 мкл супернатанта, к которому добавляют 150 мкл дистиллированной воды и 150 мкл ZnSO4*7H2О и затем по каплям при постоянном встряхивании - 150 мкл 0,75N NaOH. После 10-минутного стояния содержимое из колб переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 минут при 3500 об/мин. В мерные пробирки помещают по 3 мл супернатанта, раствора стандарта и дистиллированной воды. Далее после добавления ко всем пробам 0,05 мл 4N H2SO4 определяют оптическую плотность пробы со слюной относительно пробы с водой на спектрофотометре при длине волны 350 нм. После определения исходной плотности пробы ставят в водяную баню, температура которой 22°С. Через 5 минут во все пробирки добавляют 0,1 мл NaNO2, содержимое тщательно перемешивают и через 25 минут проводят повторное измерение оптической плотности проб относительно пробы с водой. Оптическая плотность стабильна в течение 20 минут, затем начинает постепенно снижаться. В качестве стандарта используют растворы антипирина концентрацией 8 мг/л и 12 мг/л.
Существенным недостатком данного метода являются: большие затраты времени, недостаточная чувствительность, необходимость химической модификации препарата.
Целью данного изобретения является его упрощение, сокращение времени, что позволяет быстро и с высокой точностью определять количество антипирина в слюне. Цель достигается путем осаждения балластных компонентов с последующим центрифугированием супернатанта при скорости 14000 об/мин в течение 5 минут, встряхиванием смеси супернатанта с ZnSO4*7H2О и 0,75N NaOH в течение 1 минуты с центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут, а затем хроматографированием 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 методом обращенной-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 C18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С.
Способ осуществляют следующим образом: пробу слюны (3 мл) собирают через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина и центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин, забирают 300 мкл супернатанта и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 14000 об/мин.
Отбирают 150 мкл супернатанта, добавляют 150 мкл ZnSO4*7H2О и 170 мкл 0,75N NaOH, встряхивают 1 минуту, центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, отбирают 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 и наносят в инжектор хроматографической системы. Хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 С18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, скорость потока элюента 100 мкл/мин, температура колонки 35°С.
Количественное определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата (см. таблицу 1).
Из таблицы 1 видно, что полученная концентрация антипирина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии соответствует концентрации стандарта градуировочных смесей на основе слюны.
В Новосибирском НИИ туберкулеза было исследовано 590 образцов слюны на спектрофотометре СФ-16, пороговая чувствительность метода составляла 1 мкг/мл. Параллельно было проведено исследование 430 проб предлагаемым нами хроматографическим методом, пороговая чувствительность составляла 0,2 мкг/мл.
Сравнительная характеристика данных высокоэффективной жидкостной хроматографии с результатами определения по способу Броди и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче доказывает возможность обнаружения низких концентраций антипирина (см. таблицу 2).
Таким образом, в отличие от других хроматографических методов, перечисленных выше, предлагаемый способ определения антипирина в слюне исключает применение токсических веществ (хлороформа, серной кислоты).
В сравнении с известным способом Броди и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче предлагаемый метод позволяет повысить точность, чувствительность определения антипирина в слюне, а также более прост в исполнении. В нем уменьшено количество рабочих растворов, сокращено число дозирующих процедур, сокращено время пробоподготовки, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ. В связи с этим возможно широкое внедрение метода в практическую деятельность медицинских учреждений, занимающихся лечением пациентов гепатотоксичными химиопрепаратами (онкологических, фтизиатрического профиля) либо страдающих заболеваниями печени (терапевтических и инфекционных стационаров).
Таблица 1
Результаты определения антипирина в модельных растворах слюны предлагаемым способом, р=0,95, n=5
Концентрация стандарта, мкг/мл По калибровочному графику, мкг/мл
10 9,9±0,01
4,7 4,32±0,05
2,5 2,39±0,04
1,18 1,15±0,01
0,6 0,57±0,02
0,3 0,27±0,02
Таблица 2
Результаты определения антипирина в слюне методом спектрофотометрии (СФ) и предлагаемым способом с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Время, час Концентрация антипирина, M±m, мкг/мл
СФ, n=10 ВЭЖХ, n=10
3 4,02±0,46 3,77±0,4
5 3,07±0,41 2,73±0,3
7 2,84±0,25 1,73±0,2
9 2,3±0,32 1,21±0,15
11 1,98±0,24 0,93±0,18
13 1,18±0,2 0,35±0,1
Список литературы:
1. Викторов А.П., Рыбак А.Е. Использование антипиринового теста при изучении микросомального окисления лекарственных средств // Фармакология и токсикол. - 1990. - Т.53. - N1. - С.74-79.
2. Sotaniemi E.A., Pelkonen R.O., Ahokas J. et al. Drug metabolism in man: in vivo and in vitro correlations // Arch.Toxicol.Suppl. - 1978. - Vol.1. - P.36-39.
3. Логинов А.С., Бендиков Э.А., Кельня Ж.А., Петраков А.В. Активность монооксигеназ при заболеваниях печени по данным метаболизма антипирина // Тер.арх. - 1987. - N2. - С.84-88.
4. Криничный А.В., Бекетов Б.Н., Малюшина Л.Н. Антипириновая проба в диагностике заболеваний печени // Диагностика и лечение заболеваний печени, поджелудочной железы, селезенки и двенадцатиперстной кишки: Тез.докл.конф.хирургов. - Тюмень. - 1990. - Т.1. - С.54-55.
5. Неделькина С.В., Субботина Р.С. Определение активности микросомальных ферментов у человека // Изв. СО АН СССР. - 1977. - N5, c.139-140.
6. Brodie B.B., Axelrod J., Soberman R., Levy B.B. The estimation of antipyrine in biological materials // J.Biol.Chem. - 1949. - Vol.179. - N25. - P.25-39.
7. Davidsson D., Mac Intyre J. - Biochem. J., 1956, v.62. №3, p.37P-38P.
8. Гичев Ю.Ю. Влияние пищевых индолов на активность монооксигеназной системы печени у больных вирусными гепатитами: Автореф. дисс.... канд.мед. наук. - Новосибирск, 2003. - 25 с.
9. Андреева Т.В., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Горохов А.Г. Высокоэффективная жидкостная хроматография антипирина - метод экспресс-диагностики функциональной активности монооксигеназной системы печени человека // Хим.-фарм. жур. - 2000. - том 34. - №1. - с.10-11.

Claims (1)

  1. Способ определения антипирина в слюне, включающий сбор слюны через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина, центрифугирование 3 мл слюны 10 мин при 3000 об/мин, добавление к 150 мкл супернатанта 150 мкл дистиллированной воды, 150 мкл ZnSO4·7H2O и 150 мкл 0,75 N NaOH, последующее центрифугирование смеси, отличающийся тем, что полученный после центрифугирования слюны супернатант в количестве 300 мкл центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, к смеси супернатанта и ZnSO4·7Н2О добавляют 170 мкл 0,75 N NaOH, встряхивают смесь 1 минуту и центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, затем 100 мкл аликвоты рН=7,5-8 хроматографируют методом ОФ ВЭЖХ при следующих условиях: неподвижная фаза - пронтосил 120-5 С18 2·75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН=6,5, спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С, и определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата.
RU2004127706/15A 2004-09-16 2004-09-16 Способ определения антипирина в слюне RU2272286C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004127706/15A RU2272286C1 (ru) 2004-09-16 2004-09-16 Способ определения антипирина в слюне

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004127706/15A RU2272286C1 (ru) 2004-09-16 2004-09-16 Способ определения антипирина в слюне

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2004127706A RU2004127706A (ru) 2006-02-20
RU2272286C1 true RU2272286C1 (ru) 2006-03-20

Family

ID=36050801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004127706/15A RU2272286C1 (ru) 2004-09-16 2004-09-16 Способ определения антипирина в слюне

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2272286C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2475733C1 (ru) * 2011-08-22 2013-02-20 Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" Способ определения содержания троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате методом вэжх
RU2476873C1 (ru) * 2011-08-22 2013-02-27 Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" Способ определения содержания эстрогена и декспантенола в двухкомпонентном лекарственном препарате методом вэжх

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRODIE В.В. et al. The estimation of antipyrine in biological material. J. Biol. Chem. 1949, vol.179, №25, p.25-39. АНДРЕЕВА и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография антипирина - метод экспресс-диагностики функциональной активности монооксигеназной системы печени человека. Хим.-фарм. журн. 2000, т.34, №1, с.10-11. SHIVELY С.А. et al. A sensitive gas-chromatographic assay using a nitrogen-phosphorus detector for determination of antipyrine and aminopyrine in biological fluids. Pharmacology. 1979, 19(5), р.228-236. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2475733C1 (ru) * 2011-08-22 2013-02-20 Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" Способ определения содержания троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате методом вэжх
RU2476873C1 (ru) * 2011-08-22 2013-02-27 Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" Способ определения содержания эстрогена и декспантенола в двухкомпонентном лекарственном препарате методом вэжх

Also Published As

Publication number Publication date
RU2004127706A (ru) 2006-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pichard et al. Cyclosporin A drug interactions. Screening for inducers and inhibitors of cytochrome P-450 (cyclosporin A oxidase) in primary cultures of human hepatocytes and in liver microsomes.
Miron et al. The mode of action of allicin: its ready permeability through phospholipid membranes may contribute to its biological activity
Vree et al. Determination of trimethoprim and sulfamethoxazole (co-trimoxazole) in body fluids of man by means of high-performance liquid chromatography
Jiang et al. Liver fibrosis and hepatocyte apoptosis are attenuated by GKT137831, a novel NOX4/NOX1 inhibitor in vivo
Jarrott et al. High-performance liquid chromatographic analysis of captopril in plasma
KR100544377B1 (ko) 맥아의 발효에 의해 얻어진 발효액으로부터 유도된건조물질을 함유하는 식이 보충물
Woolf et al. Determination of L-735 524, an human immunodeficiency virus protease inhibitor, in human plasma and urine via high-performance liquid chromatography with column switching
Linhares et al. Capillary ultrafiltration: in vivo sampling probes for small molecules
Qing et al. Identification of enzyme inhibitors using therapeutic target protein–magnetic nanoparticle conjugates
RU2272286C1 (ru) Способ определения антипирина в слюне
Lee et al. Effects of diabetes mellitus induced by alloxan on the pharmacokinetics of metformin in rats: restoration of pharmacokinetic parameters to the control state by insulin treatment
Cheng et al. Preclinical pharmacokinetics study of R-and S-enantiomers of the histone deacetylase inhibitor, AR-42 (NSC 731438), in rodents
Weber et al. Acute oral toxicity of TCDD-metabolites in male guinea pigs
KR101652737B1 (ko) 대건중탕의 생물학적 검정 방법 및 이것을 사용하는 품질관리 방법
US20050008710A1 (en) Method for screening for endothelin-receptor antagonist activity and for treating conditions caused by endothelin
RU2302632C2 (ru) Способ определения гистамина в плазме крови
CN101054401A (zh) 南蛇藤素的碱金属盐化合物及其制备方法
CN111991411A (zh) 组合物在制备兽用驱虫药物中的应用、兽用驱虫的透皮溶液及其制备方法
Kazanova et al. Development and validation of a quantitative determination method for meropenem in blood plasma for therapeutic drug monitoring
Klimowicz et al. A simple and rapid liquid chromatographic method for the determination of metronidazole and its hydroxymetabolite in plasma and cutaneous microdialysates
WO1999039718A1 (fr) Medicament pour le traitement des dereglements de l'apoptose contenant des oligosaccharides
Dodion et al. Metabolism and disposition of menogaril (NSC 269148) in the rabbit
Abou-Khalil et al. Stability of chloramphenicol metabolites in human blood and liver as determined by high-performance liquid chromatography
RU2322674C1 (ru) Способ определения 2,6-бис-[бис-(бета-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-n-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологическом материале
RU2374648C2 (ru) Способ экстракции пенициллинов из плазмы крови

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20070917