RU2272286C1 - Способ определения антипирина в слюне - Google Patents
Способ определения антипирина в слюне Download PDFInfo
- Publication number
- RU2272286C1 RU2272286C1 RU2004127706/15A RU2004127706A RU2272286C1 RU 2272286 C1 RU2272286 C1 RU 2272286C1 RU 2004127706/15 A RU2004127706/15 A RU 2004127706/15A RU 2004127706 A RU2004127706 A RU 2004127706A RU 2272286 C1 RU2272286 C1 RU 2272286C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- saliva
- antipyrine
- supernatant
- rpm
- minutes
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования биологического материала, и может быть применено в лабораторной практике. Согласно способу определения антипирина в слюне центрифугирование супернатанта проводят при скорости 14000 об/мин в течение 5 минут, затем встряхивают смесь супернатанта с ZnSO4*7H2O и 0,75N NaOH в течение 1 минуты с последующим центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут, а затем 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 наносят в инжектор хроматографа, хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 С18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С, и определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата. Технический результат: упрощение, сокращение времени, повышение чувствительности и точности способа. При этом сокращаются количество рабочих растворов, число дозирующих процедур, время пробоподготовки, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ, исключается применение токсических веществ (хлороформа, серной кислоты). 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования биологического материала, и может быть применен в лабораторной практике.
Антипириновая проба - очень чувствительный и надежный тест, позволяющий судить о функциональном состоянии монооксигеназной системы печени. Антипирин достаточно медленно выводится из организма, малотоксичен, имеет высокую биодоступность (97-100%), низкое связывание с белками плазмы, равномерно распределяется во всех биологических жидкостях организма и, что самое важное, метаболизм антипирина почти полностью осуществляется при участии цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени (1), о чем свидетельствует линейность отношений между антипирингидроксилазной активностью и периодом полувыведения антипирина, а также тесная корреляция показателей активности цитохрома Р450 в биоптатах печени человека и кинетики элиминации этого препарата (2).
На основании вышеперечисленного антипириновый тест используется для оценки активности микросомальных монооксигеназ печени и служит в качестве количественного критерия функционального состояния печени (3). Иногда антипириновый тест является единственным маркером нарушения функционального состояния печени при нормальных значениях биохимических проб (4). Хорошая корреляция между концентрацией антипирина в плазме и слюне дает возможность при исследовании использовать слюну (5). Метод определения антипирина в слюне неинвазивен и доступен в научной и клинической практике.
Существуют хроматографические методы определения содержания антипирина в слюне:
1. Извлечение антипирина осуществляется в следующем порядке: к 0,5 мл слюны добавляют 4,5 мл хлороформа, содержимое пробирки тщательно встряхивают в течение 10 минут с целью максимального перехода антипирина, содержащегося в биопробе, в хлороформ.
После чего отбирают хлороформную фракцию в специальные конические колбы и упаривают на водяной бане при t - 60°С под током воздуха. Сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл ацетонитрила и 20 мкл аликвоты, вводят в инжектор хроматографической системы. Хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - "Econosil С-18" с размером зернистости 10 микрон (4,6*150 мм); подвижная фаза (элюент) - ацетонитрил: фосфатный буфер, рН - 6,0, в соотношении 35:65. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 254 нм, скорость потока элюента - 1 мл/мин при давлении на помпе 1500 psi, температура колонки - 25°С. Пороговая чувствительность метода составляет 0,2 мкг/мл (8).
2. Осаждение плотного осадка слюны проводят следующим образом: к 200 мкл супернатанта добавляют 200 мкл смеси 0,1N серной кислоты и этанола (30:70 об.%) и встряхивают в течение 1 минуты, после чего пробу центрифугируют (7000 об/мин в течение 20 мин) и 5 мкл надосадочной жидкости вводят в хроматограф. Состав подвижной фазы: ацетат натрия (рН 6,7) - ацетонитрил (70:30 об/об), скорость потока 100 мкл/мин. Спектр ультрафиолетового поглощения - 250 нм. Пороговая чувствительность методики - 1 мкг/мл (9).
Однако к недостаткам этих методов относится то, что при пробоподготовке слюны используют токсические вещества, такие как: хлороформ, серная кислота.
Наиболее близким к заявленному изобретению по пробоподготовке является метод Броди (6) и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче (7) для определения антипирина в слюне, заключающийся в том, что больные принимают натощак антипирин из расчета 18 мг/кг массы тела. Через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина собирают слюну в количестве 3 мл, центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Забирают 150 мкл супернатанта, к которому добавляют 150 мкл дистиллированной воды и 150 мкл ZnSO4*7H2О и затем по каплям при постоянном встряхивании - 150 мкл 0,75N NaOH. После 10-минутного стояния содержимое из колб переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 минут при 3500 об/мин. В мерные пробирки помещают по 3 мл супернатанта, раствора стандарта и дистиллированной воды. Далее после добавления ко всем пробам 0,05 мл 4N H2SO4 определяют оптическую плотность пробы со слюной относительно пробы с водой на спектрофотометре при длине волны 350 нм. После определения исходной плотности пробы ставят в водяную баню, температура которой 22°С. Через 5 минут во все пробирки добавляют 0,1 мл NaNO2, содержимое тщательно перемешивают и через 25 минут проводят повторное измерение оптической плотности проб относительно пробы с водой. Оптическая плотность стабильна в течение 20 минут, затем начинает постепенно снижаться. В качестве стандарта используют растворы антипирина концентрацией 8 мг/л и 12 мг/л.
Существенным недостатком данного метода являются: большие затраты времени, недостаточная чувствительность, необходимость химической модификации препарата.
Целью данного изобретения является его упрощение, сокращение времени, что позволяет быстро и с высокой точностью определять количество антипирина в слюне. Цель достигается путем осаждения балластных компонентов с последующим центрифугированием супернатанта при скорости 14000 об/мин в течение 5 минут, встряхиванием смеси супернатанта с ZnSO4*7H2О и 0,75N NaOH в течение 1 минуты с центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут, а затем хроматографированием 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 методом обращенной-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 C18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С.
Способ осуществляют следующим образом: пробу слюны (3 мл) собирают через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина и центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин, забирают 300 мкл супернатанта и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 14000 об/мин.
Отбирают 150 мкл супернатанта, добавляют 150 мкл ZnSO4*7H2О и 170 мкл 0,75N NaOH, встряхивают 1 минуту, центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, отбирают 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 и наносят в инжектор хроматографической системы. Хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 С18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, скорость потока элюента 100 мкл/мин, температура колонки 35°С.
Количественное определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата (см. таблицу 1).
Из таблицы 1 видно, что полученная концентрация антипирина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии соответствует концентрации стандарта градуировочных смесей на основе слюны.
В Новосибирском НИИ туберкулеза было исследовано 590 образцов слюны на спектрофотометре СФ-16, пороговая чувствительность метода составляла 1 мкг/мл. Параллельно было проведено исследование 430 проб предлагаемым нами хроматографическим методом, пороговая чувствительность составляла 0,2 мкг/мл.
Сравнительная характеристика данных высокоэффективной жидкостной хроматографии с результатами определения по способу Броди и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче доказывает возможность обнаружения низких концентраций антипирина (см. таблицу 2).
Таким образом, в отличие от других хроматографических методов, перечисленных выше, предлагаемый способ определения антипирина в слюне исключает применение токсических веществ (хлороформа, серной кислоты).
В сравнении с известным способом Броди и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче предлагаемый метод позволяет повысить точность, чувствительность определения антипирина в слюне, а также более прост в исполнении. В нем уменьшено количество рабочих растворов, сокращено число дозирующих процедур, сокращено время пробоподготовки, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ. В связи с этим возможно широкое внедрение метода в практическую деятельность медицинских учреждений, занимающихся лечением пациентов гепатотоксичными химиопрепаратами (онкологических, фтизиатрического профиля) либо страдающих заболеваниями печени (терапевтических и инфекционных стационаров).
Таблица 1 Результаты определения антипирина в модельных растворах слюны предлагаемым способом, р=0,95, n=5 |
|||
Концентрация стандарта, мкг/мл | По калибровочному графику, мкг/мл | ||
10 | 9,9±0,01 | ||
4,7 | 4,32±0,05 | ||
2,5 | 2,39±0,04 | ||
1,18 | 1,15±0,01 | ||
0,6 | 0,57±0,02 | ||
0,3 | 0,27±0,02 | ||
Таблица 2 Результаты определения антипирина в слюне методом спектрофотометрии (СФ) и предлагаемым способом с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) |
|||
Время, час | Концентрация антипирина, M±m, мкг/мл | ||
СФ, n=10 | ВЭЖХ, n=10 | ||
3 | 4,02±0,46 | 3,77±0,4 | |
5 | 3,07±0,41 | 2,73±0,3 | |
7 | 2,84±0,25 | 1,73±0,2 | |
9 | 2,3±0,32 | 1,21±0,15 | |
11 | 1,98±0,24 | 0,93±0,18 | |
13 | 1,18±0,2 | 0,35±0,1 |
Список литературы:
1. Викторов А.П., Рыбак А.Е. Использование антипиринового теста при изучении микросомального окисления лекарственных средств // Фармакология и токсикол. - 1990. - Т.53. - N1. - С.74-79.
2. Sotaniemi E.A., Pelkonen R.O., Ahokas J. et al. Drug metabolism in man: in vivo and in vitro correlations // Arch.Toxicol.Suppl. - 1978. - Vol.1. - P.36-39.
3. Логинов А.С., Бендиков Э.А., Кельня Ж.А., Петраков А.В. Активность монооксигеназ при заболеваниях печени по данным метаболизма антипирина // Тер.арх. - 1987. - N2. - С.84-88.
4. Криничный А.В., Бекетов Б.Н., Малюшина Л.Н. Антипириновая проба в диагностике заболеваний печени // Диагностика и лечение заболеваний печени, поджелудочной железы, селезенки и двенадцатиперстной кишки: Тез.докл.конф.хирургов. - Тюмень. - 1990. - Т.1. - С.54-55.
5. Неделькина С.В., Субботина Р.С. Определение активности микросомальных ферментов у человека // Изв. СО АН СССР. - 1977. - N5, c.139-140.
6. Brodie B.B., Axelrod J., Soberman R., Levy B.B. The estimation of antipyrine in biological materials // J.Biol.Chem. - 1949. - Vol.179. - N25. - P.25-39.
7. Davidsson D., Mac Intyre J. - Biochem. J., 1956, v.62. №3, p.37P-38P.
8. Гичев Ю.Ю. Влияние пищевых индолов на активность монооксигеназной системы печени у больных вирусными гепатитами: Автореф. дисс.... канд.мед. наук. - Новосибирск, 2003. - 25 с.
9. Андреева Т.В., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Горохов А.Г. Высокоэффективная жидкостная хроматография антипирина - метод экспресс-диагностики функциональной активности монооксигеназной системы печени человека // Хим.-фарм. жур. - 2000. - том 34. - №1. - с.10-11.
Claims (1)
- Способ определения антипирина в слюне, включающий сбор слюны через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина, центрифугирование 3 мл слюны 10 мин при 3000 об/мин, добавление к 150 мкл супернатанта 150 мкл дистиллированной воды, 150 мкл ZnSO4·7H2O и 150 мкл 0,75 N NaOH, последующее центрифугирование смеси, отличающийся тем, что полученный после центрифугирования слюны супернатант в количестве 300 мкл центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, к смеси супернатанта и ZnSO4·7Н2О добавляют 170 мкл 0,75 N NaOH, встряхивают смесь 1 минуту и центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, затем 100 мкл аликвоты рН=7,5-8 хроматографируют методом ОФ ВЭЖХ при следующих условиях: неподвижная фаза - пронтосил 120-5 С18 2·75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН=6,5, спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С, и определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004127706/15A RU2272286C1 (ru) | 2004-09-16 | 2004-09-16 | Способ определения антипирина в слюне |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004127706/15A RU2272286C1 (ru) | 2004-09-16 | 2004-09-16 | Способ определения антипирина в слюне |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004127706A RU2004127706A (ru) | 2006-02-20 |
RU2272286C1 true RU2272286C1 (ru) | 2006-03-20 |
Family
ID=36050801
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004127706/15A RU2272286C1 (ru) | 2004-09-16 | 2004-09-16 | Способ определения антипирина в слюне |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2272286C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2475733C1 (ru) * | 2011-08-22 | 2013-02-20 | Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" | Способ определения содержания троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате методом вэжх |
RU2476873C1 (ru) * | 2011-08-22 | 2013-02-27 | Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" | Способ определения содержания эстрогена и декспантенола в двухкомпонентном лекарственном препарате методом вэжх |
-
2004
- 2004-09-16 RU RU2004127706/15A patent/RU2272286C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRODIE В.В. et al. The estimation of antipyrine in biological material. J. Biol. Chem. 1949, vol.179, №25, p.25-39. АНДРЕЕВА и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография антипирина - метод экспресс-диагностики функциональной активности монооксигеназной системы печени человека. Хим.-фарм. журн. 2000, т.34, №1, с.10-11. SHIVELY С.А. et al. A sensitive gas-chromatographic assay using a nitrogen-phosphorus detector for determination of antipyrine and aminopyrine in biological fluids. Pharmacology. 1979, 19(5), р.228-236. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2475733C1 (ru) * | 2011-08-22 | 2013-02-20 | Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" | Способ определения содержания троксерутина, декспантенола, бензокаина и метилпарагидроксибензоата в лекарственном препарате методом вэжх |
RU2476873C1 (ru) * | 2011-08-22 | 2013-02-27 | Открытое акционерное общество "Нижегородский химико-фармацевтический завод" | Способ определения содержания эстрогена и декспантенола в двухкомпонентном лекарственном препарате методом вэжх |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2004127706A (ru) | 2006-02-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pichard et al. | Cyclosporin A drug interactions. Screening for inducers and inhibitors of cytochrome P-450 (cyclosporin A oxidase) in primary cultures of human hepatocytes and in liver microsomes. | |
Miron et al. | The mode of action of allicin: its ready permeability through phospholipid membranes may contribute to its biological activity | |
Vree et al. | Determination of trimethoprim and sulfamethoxazole (co-trimoxazole) in body fluids of man by means of high-performance liquid chromatography | |
Jiang et al. | Liver fibrosis and hepatocyte apoptosis are attenuated by GKT137831, a novel NOX4/NOX1 inhibitor in vivo | |
Rothmund et al. | Release and protein binding of components from resin based composites in native saliva and other extraction media | |
Jarrott et al. | High-performance liquid chromatographic analysis of captopril in plasma | |
KR100544377B1 (ko) | 맥아의 발효에 의해 얻어진 발효액으로부터 유도된건조물질을 함유하는 식이 보충물 | |
Woolf et al. | Determination of L-735 524, an human immunodeficiency virus protease inhibitor, in human plasma and urine via high-performance liquid chromatography with column switching | |
Linhares et al. | Capillary ultrafiltration: in vivo sampling probes for small molecules | |
Qing et al. | Identification of enzyme inhibitors using therapeutic target protein–magnetic nanoparticle conjugates | |
RU2272286C1 (ru) | Способ определения антипирина в слюне | |
KR101652737B1 (ko) | 대건중탕의 생물학적 검정 방법 및 이것을 사용하는 품질관리 방법 | |
US20050008710A1 (en) | Method for screening for endothelin-receptor antagonist activity and for treating conditions caused by endothelin | |
RU2302632C2 (ru) | Способ определения гистамина в плазме крови | |
CN101054401A (zh) | 南蛇藤素的碱金属盐化合物及其制备方法 | |
CN111991411A (zh) | 组合物在制备兽用驱虫药物中的应用、兽用驱虫的透皮溶液及其制备方法 | |
Kazanova et al. | Development and validation of a quantitative determination method for meropenem in blood plasma for therapeutic drug monitoring | |
Klimowicz et al. | A simple and rapid liquid chromatographic method for the determination of metronidazole and its hydroxymetabolite in plasma and cutaneous microdialysates | |
WO1999039718A1 (fr) | Medicament pour le traitement des dereglements de l'apoptose contenant des oligosaccharides | |
Dodion et al. | Metabolism and disposition of menogaril (NSC 269148) in the rabbit | |
Abou-Khalil et al. | Stability of chloramphenicol metabolites in human blood and liver as determined by high-performance liquid chromatography | |
RU2322674C1 (ru) | Способ определения 2,6-бис-[бис-(бета-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-n-пиперидино-пиримидо(5,4-d)пиримидина в биологическом материале | |
RU2374648C2 (ru) | Способ экстракции пенициллинов из плазмы крови | |
RU2722304C2 (ru) | Способ определения количества доксорубицина при его высвобождении из фунционализированных кальцийфосфатных конструктов | |
CN117720515B (zh) | 一种Gasdermins蛋白PROTAC降解剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070917 |