RU2268301C2 - Инкапсулирование полипептидов в матрицу крахмала - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. Конструируют молекулу нуклеиновой кислоты, включающую функциональный в крахмалсодержащих тканях растения промотор, фрагмент, кодирующий транзитный пептид для транслокации полезного пептида в амилопласт, фрагмент, кодирующий полезный пептид, область, инкапсулирующуюся в крахмал и терминатор. При встраивании в геном растения молекула ДНК экспрессирует гибридный полипептид, включающий инкапсулированный в матрицу крахмала желаемый белок. Полученный растительный материал может быть использован, например, для производства кормов для млекопитающих, рыб и птиц. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 19 ил., 9 табл.

Description

Настоящее изобретение заявляет приоритет по первой заявке США №60/026855 с датой подачи 30 сентября 1996 г. Указанная первая заявка на изобретение включена в настоящую заявку в объеме, не противоречащем данной заявке.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полисахаридные ферменты

И прокариотные, и эукариотные клетки используют полисахаридные ферменты для резервного хранения. В прокариотной клетке первичным резервным полисахаридом является гликоген. Хотя гликоген родственен крахмалу, обнаруживаемому в большинстве сосудистых растений, он обладает другой длиной цепи и степенью полимеризации. Во многих растениях крахмал используется в качестве первичного резервного полисахарида. Крахмал хранится в различных тканях растения, вырабатывающего крахмал. В большинстве случаев крахмал состоит из двух компонентов; одним является амилоза, а другим - амилопектин. Амилоза образуется в виде линейных глюканов, а амилопектин - в виде разветвленных цепей глюканов. Типичный крахмал состоит на 25% из амилозы и на 75% из амилопектина. Изменение в растении соотношения между амилозой и амилопектином может повлиять на свойства крахмала. Кроме того, крахмалы из различных растений часто обладают различными свойствами. Кукурузный крахмал и картофельный крахмал, по-видимому, различаются по наличию или отсутствию фосфатных групп. Свойства крахмала некоторых растений различаются вследствие мутаций, введенных в геном растения. Мутантные крахмалы хорошо известны для кукурузы, риса и гороха и др.

Изменения в степени разветвленности крахмала или в соотношениях компонентов крахмала приводят к различающимся характеристикам крахмала. Одной из характеристик крахмала является формирование гранул крахмала, которые образуются, в частности, в листьях, корнях, клубнях и семенах. Эти гранулы образуются в процессе синтеза крахмала. Некоторые синтетазы крахмала, в особенности синтетаза, иммобилизованная на грануле крахмала, синтетазы растворимого крахмала и ветвящие ферменты, представляют собой белки, которые "инкапсулируются" в гранулу крахмала при ее формировании.

Использование кДНК клонов гликогенсинтетаз животных и бактерий описано в Международной патентной заявке № GB 92/01881. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности описаны в литературе. В частности, нуклеотидную последовательность для гена, кодирующего гликогенсинтетазу Е.coli, можно получить в базе данных GenBank/EMBL (SWISSPROT), инвентарный номер J02616 (Kumar et al., 1986, J. Biol. Chem., 261: 16256-16259). Структуральные гены фермента биосинтеза гликогена Е.coli также клонировали Okita et al. (1981, J. Biol. Chem., 256 (13): 6944-6952). Структуральные гены гликогенсинтетазы glgA клонировали из Salmonella typhimurium LT2 Leung et al. (1987, J. Bacteriol., 169 (9): 4349-4354). Также известны последовательности гликогенсинтетазы скелетной мышцы кролика (Zhang et al., 1989, FASEB J., 3: 2352-2356) и мышцы человека (Browner et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1443-1447).

Описано применение клонов кДНК синтетаз растворимого крахмала растений. Аминокислотные последовательности изоформ I и II синтетазы растворимого крахмала гороха опубликовали Dry et al. (1991, Plant Journal, 2: 193-202). Аминокислотные последовательности синтетазы растворимого крахмала риса описали Baba et al. (Plant Physiology). В этой последней последовательности (SSTS риса) приведена неправильная N-концевая последовательность и, следовательно, она является ошибочной. По-видимому, это вызвано какой-то ошибкой экстракции, включающей деструкцию протеазы или другой характерной нестабильностью экстрагированного фермента. Правильная N-концевая последовательность (начинающаяся с AELSR) приведена в той области, которую они называют транзитной пептидной последовательностью SSTS риса.

Последовательность для ветвящего фермента I кукурузы исследовали Baba et al., 1991, BBRC, 18: 8794. Ветвящий фермент II эндосперма кукурузы исследовали Fisher and Shrable (1993, Plant Physiol., 102: 1045-1046). Описано применение клонов кДНК ветвящих ферментов растений, бактерий и животных. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности ветвящих ферментов (BE) бактерий описана в литературе. В частности, Kiel et al. клонировали ген glgB ветвящего фермента Cyanobacterium synechococcussp PCC7942 (1989, Gene (Amst), 78 (I): 918) и Bacillus stearothermophilus (Kiel et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 230 (12): 136-144). Гены glc3 и ghal S. cerevisiae являются аллельными и кодируют ветвящий фермент гликогена (Rowen et al., 1992, Mol. Cell Biol, 12 (I): 22-29). Matsumomoto et al. исследовали ветвящий фермент гликогена Neuruspora crassa (1990, J. Biochem., 107: 118-122). База данных GenBank/EMBL также содержит последовательности для гена glgB, кодирующего ветвящий фермент Е.coli.

Синтетаза крахмала (ЕС 2.4.1.11) удлиняет молекулы крахмала и предполагается, что она действует и на амилозу, и на амилопектин. Можно показать, что активность синтетазы крахмала (STS) связана и с гранулой, и с пластидой стромы. Способность крахмала ассоциироваться с иммобилизованным ферментом синтетазой крахмала хорошо известна. В настоящее время из работы Mu-Foster et al. (Plant Phys., 111: 821-829) известно, что различные ферменты, участвующие в биосинтезе крахмала, обладают различной склонностью к связыванию. Активность иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала (GBSTS) сильно коррелирует с выработкой восковидного гена (Shure et al., 1983, Cell, 35: 225-233). Показано, что синтез амилозы в различных видах растений, таких как кукуруза, рис и картофель, зависит от экспрессии этого гена (Tsai, 1974, Biochem. Gen., 11: 83-96; Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor. Appl. Gen., 75: 217-221). Visser et al. описали молекулярное клонирование и частично охарактеризовали этот ген для иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала картофеля (1989, Plant Sci. 64 (2): 185-192). Visser et al. также описали ингибирование экспрессии этого гена для иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала картофеля с помощью обращенной конструкции (1991, Mol. Gen. Genet., 225 (2): 289-296).

После пионерской работы Frydman and Cardini (Frydman and Cardini, 1964, Biochem. Biophys. Res. Communications, 17: 407-411) стали известны другие STS ферменты, представляющие собой синтетазы растворимого крахмала. В свете обнаружения того, что эти ферменты и ассоциированы с гранулой, и присутствуют в растворенной фазе (Denyer et al., 1993, Plant J. 4: 191-198; Denyer et al., 1995, Planta, 97: 57-62; MuFoster et al., Plant Physiol. III: 821-829), недавно была поставлена под сомнение применимость термина "растворимый". Обычно полагают, что биосинтез амилопектина происходит с участием синтетаз растворимого крахмала и ферментов, ветвящих крахмал. Различные изоформы синтетазы растворимого крахмала были идентифицированы и клонированы для гороха (Denyer and Smith, 1992, Planta, 186: 609-617; Dry et al., 1992, Plant Journal, 2: 193-202), картофеля (Edwards et al., 1995, Plant Physiol. 112: 89-97; Marshall et al., Plant Cell, 8: 1121-1135) и риса (Baba et al., 1993, Plant Physiol. 103: 565-573), тогда как ячмень, видимо, содержит множество изоформ, часть из которых ассоциирована с ферментом, ветвящим крахмал (Tyynela and Schulman, 1994, Physiol. Plantarum, 89: 835-841). Общей характеристикой STS клонов является наличие согласованной последовательности KXGGLGDV, которая предположительно является сайтом фермента, связывающим АДФ-Glc (Furukawa et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 2086-2090; Furukawa et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 23837-23842).

Для кукурузы идентифицированы две растворимые формы STS, известные под названием изоформ I и II (Macdonald and Preiss, 1983, Plant Physiol. 73: 175-178; Boyer and Preiss, 1978, Carb. Res. 61: 321-334; Pollock and Preiss, 1980, Arch. Biochem. Biophys. 204: 578-588; Macdonald and Preiss, 1985, Plant Physiol. 78: 849-852; Dang and Boyer, 1988, Phytochemistry, 27: 1255-1259; Mu et al., 1994, Plant J. 6: 151-159), однако ни одна из них не была клонирована. STSI активность эндосперма кукурузы недавно была скоррелирована с полипептидом с молекулярной массой 76 кДа, обнаруженном и в растворимой, и в ассоциированной с гранулами фракциях (Mu et al., 1994, Plant J. 6: 151-159). Полипептидная идентичность STSII остается неизвестной. STSI и II обладают различными ферментативньми характеристиками. STSI обладает активностью, не зависящей от праймера, тогда как STSII для катализа переноса гликозильного фрагмента требует присутствия гликогенового праймера. Показано, что синтетазы растворимого крахмала обладают большим коэффициентом контроля потока для осаждения крахмала (Jenner et al., 1993, Aust. J. Plant Physiol. 22: 703-709; Keeling et al., 1993, Planta, 191: 342-348) и необычными кинетическими характеристиками при повышенных температурах (Keeling et al., 1995, Aust. J. Plant Physiol. 21: 807-827). У кукурузы соответствующие изоформы обладают значительными различиями и по оптимумам температуры, и по стабильности.

Последовательности синтетазы крахмала растений (и синтетазы Е.coli) включают последовательность KTGGL, для которой известно, что она представляет собой домен, связывающий ADPG. Гены любой такой синтетазы крахмала можно использовать в конструкциях, соответствующих настоящему изобретению.

Ветвящий фермент [α1,4Dглюкан: α1,4Dглюкан 6D(α1,4Dглюкано)трансфераза (Е.С.2.4.1.18)], иногда называемый Q-ферментом, превращает амилозу в амилопектин.

Сегмент α1,4Dглюкановой цепи переносится к первичной гидроксильной группе аналогичной глюкановой цепи.

Описаны последовательности генов ветвящих ферментов бактерий и растений (эндосперма риса: Nakamura et al., Physiologia Plantarum, 84: 329-335 и Nakamura and Yamanouchi, 1992, Plant Physiol., 99: 1265-1266; горох: Smith, 1988, Planta, 175: 270-279 Bhattacharyya et al., 1989, J. Cell Biochem., Suppl. 13D: 331; Sing and Preiss, 1985, Plant Physiology, 79: 34-40; VosScherperkeuter et al., 1989, Plant Physiology, 90: 75-84; картофель: Kossmann et al., 1991, Mol. Gen. Genet., 230 (12): 39-44; маниока: Salehuzzaman and Visser, 1992, Plant Mol. Biol., 20: 809-819).

В области полисахаридных ферментов имеются сообщения о векторах для проводимой с помощью генной инженерии модификации метаболизма крахмала растений путем использования целого ряда генов синтеза крахмала для различных видов растений. Хорошо известно, что некоторые из этих полисахаридных ферментов связываются с целлюлозой, крахмалом или гликогеном. В одном конкретном запатентованном примере применения полисахаридного фермента продемонстрировано использование ферментов биосинтеза гликогена для модификации растительного крахмала. В патенте США №5349123, выданном Shewmaker, исследован вектор, содержащий ДНК и вырабатывающий ферменты биосинтеза гликогена в клетках растений. Более конкретно, в этом патенте описаны изменения картофельного крахмала, вызванные интродукцией этих ферментов. Также описаны другие гены синтеза крахмала и их применение.

Гибридные (полученные путем слияния) пептиды

Гибридные белки (также называемые белками, полученными путем слияния) представляют собой полипептидные цепи, которые состоят из двух или большего количества белков, слитых друг с другом в единый полипептид. Часто один из белков представляет собой лиганд, который присоединяется к специфической рецепторной клетке. Векторы, кодирующие гибридные пептиды, в первую очередь используются для выработки чужих белков путем ферментации микроорганизмов. Полученные гибридные белки можно очистить с помощью афинной хроматографии. Связывающая область одного из полипептидов используется для присоединения гибридного полипептида к афинной матрице. Например, можно получить гибридные белки с бета-галактозой, которую можно иммобилизировать на хроматографической колонке. Этот способ использовали для получения вирусных антигенов.

Другим случаем применения является извлечение одного из полипептидов из гибридного полипептида. Для расщепления гибридных полипептидов имеются химические и биологические методы. Если между пептидами имеется разрушающаяся при действии кислоты аспартил-пролиновая связь и кислота не действует на пептиды, то для расщепления пептидов можно использовать низкое значение рН. Гормоны расщепляли с помощью бромциана. Также описано расщепление с помощью сайт-специфичного протеолиза. Другие методы очистки белков, такие как ионная хроматография, были сделаны более эффективными путем использования полиаргининовых концевых сегментов, которые увеличивают общую основность белка, тем самым усиливая связывание с ионообменными колонками.

В целом ряде патентов описаны улучшения способов получения гибридных пептидов или специфических гибридных пептидов, предназначенных для конкретных целей. В патенте США №5635599, выданном Pastan et al., описано улучшение гибридных белков. В этом патенте описан подвергнутый кольцевой перестановке лиганд, являющийся частью гибридного пептида. Этот лиганд обладает специфичностью и хорошей связывающей способностью. Другое улучшение для гибридных белков описано в патенте США №5648244, выданном Kulopulos. В этом патенте описан способ получения гибридного пептида с помощью пептида-переносчика. Эта область нуклеиновой кислоты, распознанная рестриктазой, порождает непалиндромный свободный конец длиной в 3 основания. Это создает возможность расщепления вектора.

Пример созданного для особой цели гибридного белка приведен в патенте США №5643756. В этом патенте описан вектор для экспрессии гликозилированных белков в клетки. Этот гибридный белок адаптирован для использования при иммунных реакциях gp120 ВИЧ. Этот вектор улучшает выделение доменов gp120, которые являются сильно гликозилированными.

В патентах США №№5202247 и 5137819 обсуждены гибридные белки, обладающие полисахаридными связывающими доменами, и способы и композиции для получения гибридных белков, которые способны к связыванию с полисахаридной матрицей. В патенте США №5202247 особо рассмотрен гибридный белок, присоединяющий связывающий участок целлюлазы к нужному пептиду. В этом патенте показано, что гибридный белок после экспрессии в бактериального хозяина можно очистить с помощью афинной хроматографии на целлюлозе.

Разработка методов генной инженерии сделала возможным перенос генов из различных организмов и растений в другие организмы и растения. Хотя при трансформации крахмал подвергается изменениям, а в дальнейшем и мутагенезу, все же сохраняется потребность в дополнительной модификации крахмала. Для этой цели необходимы векторы, которые обеспечивают инкалсулирование нужных аминокислот или пептидов в крахмал, а конкретно, в гранулу крахмала. Модифицируется образовавшийся крахмал и модифицируется ткань растения, содержащего этот вектор.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен гибридный полипептид, содержащий инкапсулирующуюся в крахмал область (SER) из связывающего крахмал фермента, который присоединен к полезному полипептиду, который не является эндогенным по отношению к указанной инкапсулирующейся в крахмал области, т.е. не встречается в природе присоединенным к инкапсулирующейся в крахмал области. Этот гибридный полипептид применим для получения модифицированных крахмалов, содержащих указанный полезный полипептид. Такие модифицированные крахмалы можно применять для получения зерновых кормов, обогащенных некоторыми аминокислотами. Такие модифицированные крахмалы также пригодны для получения полипептидов, таких как гормоны и другие лекарственные препараты, например, инсулин, в инкапсулированной в крахмал форме, что замедляет их разрушение кислотами, находящимися в желудке. Эти гибридные полипептиды также применимы для получения указанных полезных полипептидов в форме, легко поддающейся очистке. В частности, такие гибридные полипептиды, полученные бактериальным брожением, или в зернах, или в животных, с помощью известных специалистам способов можно выделить и очистить от модифицированных крахмалов, с которыми они ассоциированы.

В настоящем патенте термин "полипептид" означает множество одинаковых или различных аминокислот, он также охватывает белки.

Термин "гибридный полипептид" означает полипептид, образованный пептидами или полипептидами, взятыми не менее чем из двух источников, например, инкапсулирующаяся в крахмал область связывающего крахмал фермента, соединенная с другим полипептидом, таким как гормон, отличающаяся тем, что не менее двух компонентов гибридного полипептида не встречаются в природе в соединенном друг с другом виде.

Термин "полезный полипептид" означает полипептид, не эндогенный по отношению к инкапсулирующемуся в крахмал участку, экспрессия которого в ассоциации с этой областью направлена на экспрессию модифицированного крахмала, содержащего полезный полипептид.

Если полезный полипептид необходимо использовать для увеличения содержания конкретных аминокислот в модифицированном крахмале, он предпочтительно содержит более трех различных типов аминокислот, выбранных из группы, включающей: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.

Если полезный полипептид необходимо использовать для подачи биологически активного полипептида в организм-хозяин или в другой организм, этот полезный полипептид может представлять собой биологически активный полипептид, такой как гормон, например, инсулин, фактор роста, например, соматотропин, антитело, фермент, иммуноглобулин или краситель, или может представлять собой их биологически активный фрагмент, как это известно специалистам. Если этот полипептид обладает биологической активностью, он не должен представлять собой природный полипептид, а должен быть подвергнут мутации, усечению или модифицирован каким-либо другим образом. Такие биологически активные полипептиды могут представлять собой модифицированные полипептиды, содержащие только биологически активные области биологически активных полипептидов. Они также могут представлять собой аминокислотные последовательности, гомологичные природным биологически активным аминокислотным последовательностям (предпочтительно гомологичными не менее чем примерно на 75%), которые сохраняют биологическую активность.

Инкапсулирующаяся в крахмал область гибридного полипептида может представлять собой инкапсулирующуюся в крахмал область любого известного специалистам связывающегося с крахмалом фермента, например, фермента, выбранного из группы, включающей синтетазу растворимого крахмала I, синтетазу растворимого крахмала II, синтетазу растворимого крахмала III, синтетазу, иммобилизованную на грануле крахмала, ветвящий фермент I, ветвящий фермент IIa, ветвящий фермент IIBb и глюкоамилазные полипептиды.

Если гибридный полипептид необходимо использовать для получения полезного полипептида в чистом или частично очищенном виде, предпочтительно, чтобы гибридный полипептид включал расщепляющийся центр, расположенный между областью, инкапсулирующейся в крахмал, и полезным полипептидом. Тогда способ выделения полезного полипептида включает стадию взаимодействия гибридного полипептида с расщепляющим агентом, специфичным для данного расщепляющегося центра.

В настоящем изобретении также предложены молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот (РНК или ДНК), кодирующие гибридные полипептиды. Предпочтительно, чтобы такие молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот включали регулярные последовательности, адаптированные для экспрессии гибридного полипептида в выбранного хозяина. Термин "регулярные последовательности" включает промоторы, интроны, предпочтительно кодонные последовательности для конкретного организма-хозяина, и другие последовательности, которые, как известно специалистам, влияют на экспрессию ДНК или РНК в конкретных хозяев. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие инкапсулирующуюся в крахмал область и полезный полипептид, могут представлять собой природную последовательность нуклеиновых кислот или их биологически активные фрагменты, или могут представлять собой биологически активные последовательности, гомологичные таким последовательностям, предпочтительно гомологичные таким последовательностям не менее чем примерно на 75%.

К организмам-хозяевам относятся бактерии, растения и животные. Предпочтительными хозяевами являются растения. Для экспрессии гибридных полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, пригодны и однодольные растения и двудольные растения.

В настоящем изобретении также предложены экспрессирующие векторы, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие гибридные белки, соответствующие настоящему изобретению. Эти экспрессирующие векторы используются для трансформации нуклеиновых кислот в организмы-хозяева и также могут включать последовательности, способствующие экспрессии нуклеиновых кислот в организм-хозяин. Эти экспрессирующие векторы могут представлять собой плазмиды, модифицированные вирусы или молекулы ДНК или РНК, или другие векторы, которые, как это известно специалистам, пригодны для трансформирующих систем.

С помощью способов, соответствующих настоящему изобретению, образуются трансформированные клетки, содержащие молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот, способные к экспрессии гибридных полипептидов, соответствующих настоящему изобретению. Они могут представлять собой прокариотные или эукариотные клетки одноклеточных организмов, растений или животных. Они могут представлять собой клетки бактерий, из которых можно выделить гибридный полипептид. Также они могут представлять собой растительные клетки, которые можно внедрить обратно в растения, из которых можно выделить гибридный полипептид, или же такие растительные клетки можно внедрить обратно в плодоносящие растения, семена которых содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие гибридный полипептид. В предпочтительном способе реализации настоящего изобретения такие семена содержат модифицированный крахмал, включающий этот полезный полипептид.

Термин "модифицированный крахмал" означает природный крахмал, который был модифицирован путем включения полезного полипептида.

Также предложен способ селективного ферментативного гидролиза полезного полипептида на особой фазе процесса ферментативного гидролиза, в частности, предотвращающий разрушение полезного полипептида в желудке животных, включающий кормление животных модифицированным крахмалом, соответствующим настоящему изобретению и содержащим полезный полипептид, вследствие чего этот полипептид защищен крахмалом от разрушения в желудке животного. Альтернативно, этим крахмалом может быть крахмал, для которого известно, что он гидролизуется в желудке животного с выделением в нем полезного полипептида.

Предпочтительные молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот, соответствующие настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующие инкапсулирующие крахмал области, выбранные из синтезирующих крахмал последовательностей генов, приведенных в соответствующих таблицах.

Предпочтительные плазмиды, соответствующие настоящему изобретению, адаптированы для применения с конкретными хозяевами. В настоящем изобретении предложены плазмиды, включающие промотор, последовательность, кодирующую синтез пластиды, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую инкапсулирующуюся в крахмал область, и терминаторную последовательность. Такие плазмиды пригодны для включения нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующих полезные полипептиды и инкапсулирующиеся в крахмал области для экспрессии в выбранных хозяев.

Плазмиды, соответствующие настоящему изобретению, факультативно могут включать разделительное или связующее звено, расположенное вблизи центра слияния нуклеиновых кислот, кодирующих SER, и нуклеиновых кислот, кодирующих полезный полипептид. Настоящее изобретение включает плазмиды, содержащие промоторы, адаптированные для прокариотных или эукариотных хозяев. Такие промоторы также могут быть специфично адаптированы для экспрессии в однодольные или двудольные растения.

Способ получения модифицированного пептидом крахмала, соответствующего настоящему изобретению, включает стадии: предоставления плазмиды, обладающей промотором, ассоциированным с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инкапсулирующуюся в крахмал область, причем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инкапсулирующуюся в крахмал область, соединена с областью нуклеиновой кислоты, кодирующей полезный полипептид, и трансформации хозяина с помощью плазмиды, причем хозяин подвергает экспрессии модифицированный пептидом крахмал.

Настоящее изобретение дополнительно включает содержащие крахмал зерна, состоящие из: зародыша и питательных тканей; и модифицированные гранулы крахмала, содержащие инкапсулированный в них белок, который не является эндогенным по отношению к немодифицированным гранулам крахмала указанных зерен. Такие зерна, содержащие крахмал, могут представлять собой зерна, в которых зародышем является зародыш кукурузы, зародыш риса или зародыш пшеницы.

Все публикации, цитированные в настоящем патенте, включены только для ссылки в степени, не противоречащей настоящему патенту.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ.1а приведена плазмида pEXS114, которая содержит синтетический GFP (зеленый флуоресцирующий белок), субклонированный в pBSK Stratagen.

На ФИГ.1b приведена плазмида pEXS115.

На ФИГ.2а приведен восковидный ген с сайтом рестрикции, субклонированным в продажную плазмиду.

На ФИГ.2b приведена плазмида р ЕТ-21А производства фирмы Novagen, содержащая субклонированный фрагмент GFP из pEXS115.

На ФИГ.3а приведена pEXS114, субклонированная в pEXSWX, и карта GFP-FLWX.

На ФИГ.3b приведена плазмида GFP-Bam HIWX.

На ФИГ.4 приведен фрагмент SGFP из pEXS115, субклонированный в pEXSWX, и карта GFP-NcoWX.

На ФИГ.5 приведено линейное представление плазмиды, которая адаптирована для использования в однодольных растениях.

На ФИГ.6 приведена плазмида pEXS52.

На ФИГ.7a-7f приведены шесть интродукционных плазмид, использованных для получения pEXS51 и рЕХ560:

На ФИГ.7а приведена pEXS adh1.

На ФИГ.7b приведена pEXS adhl-nos3'.

На ФИГ.7с приведена pEXS33.

На ФИГ.7d приведена pEXS10zp.

На ФИГ.7е приведена pEXS10zp-adh1.

На ФИГ.7f приведена pEXS10zp-adh1-nos3.

На ФИГ.8а и 8b приведены плазмиды pEXS50 и pEXS51 соответственно, содержащие ген MS-SIII, который представляет собой ген синтетазы растворимого крахмала.

На ФИГ.9а приведена плазмида pEXS60, которая не включает интрон, приведенный для pEXS50, а на ФИГ.9b приведена плазмида pEXS61, которая не включает интрон, приведенный для pEXS60.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В широком смысле, в настоящем изобретении предложен гибридный полипептид, способ получения гибридного полипептида и нуклеиновые кислоты, кодирующие этот гибридный полипептид. Гибридный полипептид состоит из двух или большего количества фрагментов, соединенных в одну пептидную цепь. Этими фрагментами могут быть аминокислоты, пептиды или полипептиды. Один из фрагментов представляет собой область, инкапсулирующуюся в крахмал. Таким образом, гибридные полипептиды можно направить в гранулы крахмала, выработанные организмами, экспрессирующими гибридные полипептиды.

Способ получения гибридных полипептидов в клетках включает получение конструкции ДНК, содержащей хотя бы фрагмент ДНК, кодирующий последовательность, действие которой заключается в связывании продукта экспрессии присоединенной ДНК с гранулой крахмала, к которому присоединена нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая нужный полипептид (полезный полипептид). Эта конструкция экспрессируется с эукариотной или прокариотной клеткой. Гибридный полипептид можно использовать для получения очищенного белка или для иммобилизации нужного белка на грануле крахмала или для получения зерна, которое содержит чужие аминокислоты или пептиды.

Гибридные полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, содержат три области.

Полезный полипептид (X)	Центральный сайт (CS*)	Сайт, инкапсулирующий в крахмал (SER)
Где Х - любая нужная аминокислота или пептид, * - факультативный компонент.

Ген для Х можно расположить в положении 5' или 3' конструкции ДНК, описанной ниже.

CS - это центральный сайт, который может представлять собой уходящий сайт, сайт расщепления или разделительный сайт, как это известно специалистам. Сайт расщепления распознается расщепляющим ферментом. Расщепляющий фермент представляет собой фермент, который расщепляет пептиды на конкретном сайте. Примеры химикатов и ферментов, который можно использовать для расщепления полипептидов, включают тромбин, трипсин, бромциан, муравьиную кислоту, гидроксиламин, коллагеназу и аласубтилизин. Разделитель представляет собой пептид, который соединяет пептиды, образующие гибридный полипептид. Обычно он не обладает никакой специфической активностью кроме способности соединять пептиды или сохранять некоторое минимальное расстояние, или влиять на укладку, заряд или присоединение воды к белку. Разделителями могут являться любые пептидные последовательности, биологическая активность которых не препятствует активности гибридного полипептида.

Область, инкапсулирующаяся в крахмал (SER), представляет собой область рассматриваемого полипептида, которая обладает способностью связываться с крахмалом. Обычно SER выбирают из группы, включающей пептиды, содержащие связывающиеся с крахмалом области синтетаз крахмала и ветвящие ферменты растений, но эта группа может включать и связывающиеся с крахмалом домены других систем, таких как глюкоамилаза и аналогичные. В предпочтительной реализации настоящего изобретения SER включает пептидные генные продукты, которые входят в природный цикл синтеза крахмала. Эта подгруппа предпочтительных SER называется образующими крахмал инкапсулирующими областями (SFER). Другой подгруппой SER, предпочтительной в соответствии с настоящим изобретением, являются специфические инкапсулирующие в крахмал области (SSER) из специфических ферментов синтетазы крахмала (STS), иммобилизованная на грануле синтетаза крахмала (GBSTS) и ветвящие ферменты (BE) растений, содержащих крахмал. Наиболее предпочтительным генным продуктом из этой подгруппы является GBSTS. Кроме того, применимыми генными продуктами являются синтетаза крахмала I и ветвящий фермент II. Предпочтительно, чтобы SER (и все рассмотренные выше подгруппы) представляли собой усеченные варианты полного гена фермента, синтезирующего крахмал, такие чтобы усеченный фрагмент включал инкапсулирующую в крахмал область.

Конструкция ДНК для экспрессии гибридного полипептида в хозяина в широком смысле имеет следующий вид:

Промотор	Интрон*	Область кодирования транзитного пептида	Х	SER	Терминатор
* Факультативный компонент. Можно также использовать другие факультативные компоненты.

Как известно специалистам, промотор представляет собой область ДНК, контролирующую транскрипцию. Для различных хозяев выбираются различные типы промоторов. Промоторы Lac и Т7 хорошо подходят для прокариотов, промотор 35S CaMV хорошо подходит для двудольных растений, а полиубикитиновый промотор хорошо подходит для различных однодольных растений. Специалистам известно много различных промоторов и все они могут быть использованы в соответствии с областью применения настоящего изобретения.

Как также известно специалистам, интрон представляет собой нуклеотидную последовательность гена, которая не кодирует генный продукт. Одним примером интрона, который часто увеличивает экспрессию в случае однодольных растений, является интрон Adh1. Этот компонент конструкции является факультативным.

Область кодирования транзитного пептида представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует транслокацию белка в органеллы, такие как пластиды. Предпочтительно выбирать такой транзитный пептид, который распознает хозяина и совместим с хозяином, в котором используется транзитный пептид. В соответствии с настоящем изобретением наилучшей пластидой является амилопласт.

Предпочтительно, чтобы гибридный полипептид располагался в амилопласте в клетках, таких как растительные клетки, которые синтезируют и хранят крахмал в амилопластах. Если хозяин представляет собой бактериальную или иную клетку, которая не содержит амилопласта, там не должно быть области кодирования транзитного пептида.

Терминатор представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК, которая заканчивает транскрипцию.

Х представляет собой область, кодирующую полезный полипептид, которым может являться любой представляющий интерес полипептид или цепи аминокислот. Он может включать полную последовательность известного полипептида или нужные его фрагменты. Полезный полипептид может представлять собой полипептид, его фрагмент или биологически активный белок, который представляет собой гормон, фактор роста, иммуноглобулин, краситель и т. п. Примеры некоторых полезных полипептидов, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают следующие (но не ограничиваются ими): пролактин (PRL), сывороточный альбумин, факторы роста и гормоны роста, т.е. соматотропин. Сывороточные альбумины включают сывороточные альбумины крупного рогатого скота, овцы, лошади, птицы и человека. Факторы роста включают эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), инсулиноподобный фактор роста II (IGF-II), фибробластовый фактор роста (FGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-alpha), трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta), нервный фактор роста (NGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), и рекомбинантные инсулиноподобные факторы роста человека I (rHuIGF-I) и II (rHuIGF-II). Соматотропины, которые можно использовать в практике настоящего изобретения, включают следующие (но не ограничиваются ими): соматотропины крупного рогатого скота, свиньи, овцы, лошади, птицы и человека. Соматотропин свиньи включает рекомбинантный соматотропин свиньи дельта-7, который описан и патентная формула которого заявлена в Европейском патенте №104920 (Biogen). Предпочтительными полезными полипептидами являются соматотропин, инсулиновые цепи А и В, кальцитонин, бета-эндорфин, урогастрон, бета-глобин, миоглобин, гормон роста человека, ангиотензин, пролин, протеазы, бета-галактозидаза и целлюлазы.

Гибридный полипептид, область SER и полезный полипептид после трансляции также могут подвергаться модификациям, известным специалистам, таким как гликозилирование, ацилирование, и другим модификациям, не препятствующим проявлению требуемой активности полипептида.

Формирование гибридного полипептида

Область SER имеется в генах, участвующих в синтезе крахмала. Методы выделения таких генов включают поиск в библиотеках геномных ДНК и кДНК. Гены можно вырезать и изменить с помощью сшивания, мутирующих агентов, ферментативного гидролиза, рестрикции и других аналогичных процедур, например, таких, которые описаны в руководстве Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, N. Y. Примеры превосходных исходных материалов для получения области SER включают следующие (но не ограничиваются ими): синтетазы крахмала I, II, III, IV, ветвящие ферменты I, IIA и В и иммобилизованную на грануле синтетазу крахмала (GBSTS). Эти гены имеются в растениях, содержащих крахмал, таких как рис, кукуруза, горох, картофель, пшеница и др. Использование пробы SER, приготовленной из геномной ДНК, или кДНК, или мРНК или антител, вырабатываемых в ответ на SER, позволяет выделить и идентифицировать гены, пригодные для клонирования. Последовательности, кодирующие фермент крахмала, можно модифицировать, если эта модификация не мешает способности области SER инкапсулировать связанные с ней полипептиды.

Если гены, кодирующие белки, которые инкапсулируются в гранулу крахмала, найдены, то, как известно специалистам, для выделения SER можно использовать различные подходы. Одним способом является вырезание генов из различных сайтов с помощью рестриктаз, удаление участков с N-конца и выполнение экспрессии полученного белка. Экспрессированный усеченный белок затем наносится на гель крахмала для оценки констант ассоциации и диссоциации оставшегося белка. К усеченному белку могут быть присоединены маркерные гены, известные специалистам, например, ген зеленого флуоресцентного белка, и использованы для установления наличия маркерного гена в грануле крахмала.

После выделения области генной последовательности SER ее можно использовать для получения генной последовательности фрагмента, которая будет экспрессировать полезный полипептид, инкапсулированный в крахмал. Генная последовательность SER и генная последовательность, кодирующая полезный полипептид, могут быть сшиты друг с другом. Полученная сшитая ДНК затем может быть помещена в ряд векторных конструкций для экспрессии в ряд хозяев. Предпочтительные хозяева формируют гранулы крахмала в пластидах, но тестирование SER без затруднений можно провести и на бактериальных хозяевах, таких как Е.coli.

Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полезный полипептид, можно выделить из ДНК, РНК, геномной ДНК, кДНК, мРНК или можно полностью или частично синтезировать. Последовательностью полезного полипептида можно манипулировать, вводя мутации, так чтобы полученный белок являлся новым, мутантным белком, при условии что сохраняются его биологические функции.

Когда последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая полезный полипептид, пришивается к последовательности, кодирующей SER, генную последовательность для полезного полипептида предпочтительно присоединять к концу последовательности SER, кодирующему N-конец. Хотя N-конец предпочтителен, для настоящего изобретения не является критическим, пришивается ли полезный полипептид к N-концу или к С-концу SER. Ясно, что для настоящего изобретения не является критическим то, каков способ формирования молекул рекомбинантных нуклеиновых кислот, синтетический, посредством клонирования или сшивания.

Центральная область гибридного полипептида является факультативной. Для некоторых случаев применения настоящего изобретения может оказаться очень полезным ввести кодирование ДНК для удобного сайта протеазного расщепления в этой области в молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, используемой для экспрессии гибридного полипептида. Альтернативно, для формирования центральной области может быть полезно ввести кодирование ДНК для аминокислотной последовательности, которая чувствительна к рН. Если применение настоящего изобретения осуществляется с целью получения чистого белка, который можно экстрагировать и выделять из гранулы крахмала с помощью протеазы или чего-нибудь аналогичного, то полезен сайт протеазного расщепления. Кроме того, если белок должен быть гидролизован в организме животного, то сайт протеазного расщепления может быть полезен для содействия выделения белка из крахмала ферментами пищеварительного тракта животного. Для других случаев применения и многих случаев ферментативного гидролиза сайт расщепления будет излишним.

Сайт центральной области может включать разделитель. Разделителем называется пептид, который соединяет белки, образующие гибридный полипептид. Обычно он не обладает какой-либо специфической активностью, кроме способности соединять белки, сохранять между ними минимальное расстояние, влиять на укладку, заряд и гидрофобную или гидрофильную природу гибридного полипептида.

Формирование конструкции

После образования сшитой ДНК, которая кодирует полипептид, готовят клонирующие векторы или плазмиды, которые способны переносить ДНК к хозяину для экспрессии гибридных полипептидов. Рекомбинантная последовательность нуклеиновых кислот, соответствующая настоящему изобретению, встраивается в удобный клонирующий вектор или плазмиду. Для целей настоящего изобретения предпочтительным хозяином является хозяин, вырабатывающий гранулу крахмала. Однако также можно использовать бактерию-хозяина. Особенно полезны бактерии-хозяева, которые трансформированы так, что содержат некоторые или все синтезирующие крахмал гены растения. Специалисту с общей подготовкой понятно, что плазмида пришивается к хозяину. Например, в бактериях-хозяевах регулирующие транскрипцию промоторы включают lac, TAC, trp и аналогичные. Кроме того, ДНК, кодирующая транзитный пептид, вероятнее всего, не будет использоваться и для перевода полипептида в среду можно использовать секреторный лидер, расположенный в обратном направлении от структурального гена. Альтернативно, продукт остается в хозяине и хозяин подвергается лизису и продукт выделяется и очищается с помощью методов экстракции крахмала или путем связывания материала с матрицей крахмала (или с крахмалоподобной матрицей, такой как амилоза или амилопектин, гликоген и аналогичные вещества) для экстракции продукта.

Предпочтительным хозяином является растение и, поэтому, предпочтительная плазмида адаптирована для использования в растениях. Плазмида должна содержать промотор, предпочтительно промотор, адаптированный для направления экспрессии белка в содержащую крахмал ткань растения. Промотор может быть специфическим для различных тканей, таких как семена, корни, клубни и аналогичные; или он может представлять собой конститутивный промотор для экспрессии гена во все ткани растения. К хорошо известным промоторам относятся промотор зеин 10 кДа (кукурузы), промотор CAB, патастин, промоторы вирусов мозаики цветной капусты 35S и 19S (очень хорошо подходят для двудольных растений), полиубикутиновый промотор (подходит для однодольных растений) и их усиленные и модифицированные формы, известные специалистам.

Клонирующий вектор может содержать последовательности для транзитного пептида, чтобы направлять плазмиду в правильное положение. Примеры последовательностей, кодирующих транзитный пептид, приведены в таблицах последовательностей. Можно использовать транзитные последовательности для других транзитных пептидов. Предпочтительно использовать природные транзитные пептиды данного хозяина. Предпочтительные кодирующие области транзитного пептида для кукурузы представлены в таблицах и на чертежах, приведенных в настоящем патенте. Задачей транзитного пептида является направление вектора на правильный внутриклеточный участок.

Кодирующая последовательность, присоединенная к транзитному пептиду, представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую N-конец полезного полипептида. Направление последовательности, кодирующей полезный полипептид, меняется в зависимости от того, прямое или обратное направление считывания необходимо. Конструкции ДНК, соответствующие настоящему изобретению и описанные здесь, обладают последовательностью, кодирующей полезный полипептид, расположенной на N-конце, однако область, кодирующая SER, также может находиться на N-конце и за ней располагается последовательность полезного полипептида. На конце конструкции ДНК расположена терминаторная последовательность. Такие последовательности хорошо известны специалистам.

Клонирующий вектор трансформируется в хозяине. Введение в хозяина клонирующего вектора, предпочтительно плазмиды, можно осуществить различными методами трансформации, известными специалистам. Эти методы могут меняться в зависимости от хозяина, но они включают облучение микрочастицами, микроинъекции, трансформации Agrobacterium, "нитевидную" технологию (патенты США №№5302523 и 5464765), электрошоковое открытие клеточных пор и аналогичные методы. Если хозяином является растение, клетки можно регенерировать с формированием растения. Методы регенерации растений известны специалистам. После того как хозяин трансформирован и в него экспрессированы белки, можно подтвердить наличие в хозяине ДНК, кодирующей полезный полипептид. Наличие экспрессированных белков можно подтвердить методиками Western Blot, или ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ), или по результатам изменений, произошедших в растении или клетке.

Применение инкапсулированного белка

Имеется целый ряд способов применения настоящего изобретения. Гибридный полипептид можно отщепить в чистом виде от крахмала (можно включить сайты расщепления) и можно выделить очищенный белок. Альтернативно, находящийся в крахмале инкапсулированный полезный полипептид можно использовать в неочищенном виде для выделения белка в различных отделах пищеварительного тракта потребляющего его животного (под термином "животное" следует понимать млекопитающих, птиц и рыб). Например, если крахмал, в который инкапсулирован материал, устойчив к перевариванию, то белок будет медленно выделяться в кишечнике животного; тем самым предотвращается разрушение ценного белка в желудке. Аминокислоты, такие как метионин и лизин, можно инкапсулировать так, чтобы они включились непосредственно в зерно, которое потребляет животное, так что исключается необходимость пополнения рациона другими формами этих аминокислот.

Настоящее изобретение позволяет направлять гормоны, ферменты, белки, белковые пищевые продукты и белковые лекарственные препараты в заданные переваривающие отделы желудочно-кишечного тракта животных. Белки, которые обычно перевариваются в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, будучи инкапсулированными в крахмал, способны проходить через желудок, не подвергаясь перевариванию, и поглощаться кишечником в неизмененном виде или частично. Полезные полипептиды, способные проходить через стенки кишечника, можно использовать для медикаментозного лечения животных или введения им гормонов, таких как факторы роста, например, соматотропина, для вакцинации животных или для увеличения питательной ценности даваемого им фуража.

Если используемый крахмал неустойчив по отношению к перевариванию в желудочно-кишечном тракте (например, сахаристый крахмал 2 переваривается очень легко), то можно сделать так, что добавленный белок будет всасываться в верхних отделах желудочно-кишечного тракта животного. Для этого потребуется, чтобы хозяин, используемый для выработки модифицированного крахмала, был подвергнут мутации или трансформации, чтобы он вырабатывал сахаристый крахмал 2. Настоящее изобретение охватывает применение мутантных организмов, которые вырабатывают модифицированный крахмал как хозяева. Некоторые примеры этих мутантных хозяев включают рис и кукурузу и аналогичные растения, в которых произошли мутации сахаристая 1, сахаристая 2, ломкости, усыхания, восковидная, амилозного удлинителя, потускнения, непрозрачности и мучнистая и аналогичные. Эти мутантные крахмалы и крахмалы, полученные из различных растительных источников, обладают разной степенью переваримости. Таким образом, путем подбора хозяина для экспрессии ДНК и животного, которому будет скармливаться модифицированный крахмал, можно сделать так, чтобы гибридные полипептиды переваривались в нужном месте. Различные белки наиболее эффективно поглощаются в различных частях тела. Путем инкапсулирования белка в крахмал, обладающий специфической перевариваемостью, белок можно направить в любой отдел желудочно-кишечного тракта и на определенных стадиях пищеварительного процесса.

Другим преимуществом настоящего изобретения является способность ингибировать или экспрессировать различные уровни гликозилирования используемого полипептида. Процедура инкапсулирования может разрешить экспрессирование белка в гранулу в другом состоянии гликозилирования, чем при экспрессии другими молекулами ДНК. Гликозилирование будет зависеть от инкапсулируемого количества, используемого хозяина и полипептидной последовательности.

Улучшенные сельскохозяйственные культуры, обладающие вышеуказанными характеристиками, можно получить путем генетической модификации растений, обладающих другими благоприятными характеристиками. Путем управления нуклеотидной последовательностью гена фермента, синтезирующего крахмал, можно изменить количество ключевых аминокислот, белков или пептидов, вырабатываемых в растении. Одну или большее количество полученных с помощью генной инженерии генных конструкций, которые могут обладать растительным, грибным, бактериальным или животным происхождением, можно включить в геном растения путем полового скрещивания или путем трансформации. Полученные путем генной инженерии гены могут включать дополнительные копии диких генов или могут кодировать модифицированные или аллельные, или альтернативные ферменты, обладающие новыми свойствами. Включение таких генных конструкций может оказать различное влияние в зависимости от количества и типа введенных генов (в прямой или обратной ориентации). Это может усилить способность растения вырабатывать определенный белок, пептид или обеспечивать улучшенный аминокислотный баланс.

Клонирование ферментов, участвующих в биосинтезе крахмала

Для получения конструкций ДНК, соответствующих настоящему изобретению, можно использовать известные методы клонирования. Источником специальных форм SSTS, GBSTS, BE, гликогенсинтетазы (GS), амилопектина и других генов может являться любой организм, который может вырабатывать крахмал или гликоген. Проведен скрининг и идентификация потенциальных донорных организмов. После этого можно использовать два подхода: (а) использование очистки ферментов и генерации антитела/последовательности по описанным в настоящем изобретении протоколам; (b) использование SSTS, GBSTS, BE, GS, амилопектина или других кДНК в качестве гетерологичных зондов для идентификации геномных ДНК для SSTS, GBSTS, BE, GS, амилопектина или других инкапсулирующих в крахмал ферментов в библиотеках для рассматриваемого организма. Трансформация генов, регенерация растений и протоколы тестирования известны специалистам. В этом случае необходимо изготовить генные конструкции для трансформации, которые включают регуляторные последовательности, обеспечивающие экспрессию во время образования крахмала. Эти регуляторные последовательности имеются во многих небольших зернах и в клубнях и корнях. В частности, эти регуляторные последовательности легко получить из эндосперма кукурузы в ДНК, кодирующей иммобилизованную на грануле синтетазу крахмала (GBSTS), растворимые синтетазы крахмала (SSTS) или ветвящие ферменты (BE) или другие ферменты цикла синтеза крахмала эндосперма кукурузы. Эти регуляторные последовательности из эндосперма обеспечивают экспрессию белка с правильным временем проявления (например, ADPG пирофосфорилазу).

В этом способе мы измеряем константы связывания крахмала для связывающих крахмал белков с помощью электрофореза нативного белка в присутствии подходящих концентраций углеводов, таких как гликоген или амилопектин. Инкапсулирующие крахмал области можно изучить с помощью сайт-специфического мутагенеза и других методов генной инженерии, известных специалистам. Определить новые, полученные с помощью генной инженерии белки, содержащие новые пептиды или комбинации аминокислот, можно с помощью методик, описанных в настоящем патенте.

ПРИМЕРЫ

Пример первый: Методика идентификации инкапсулирующихся в крахмал белков

Выделение белка из гранулы крахмала:

Гомогенизируйте 12,5 г зерен в 25 мл экстракционного буферного раствора (50 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометанацетат, рН 7,5; 1 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты, 1 ммоль/л трео-1,4-димеркаптобутан-2,3-диол в гомогенизаторе Уоринга 3 раза по 20 секунд с 1-минутными интервалами). Держите образцы на льду. Профильтруйте через ткань mira и центрифугируйте при 6000 оборотов/мин в течение 30 мин. Отбросьте надосадочную жидкость и соскребите обесцвеченные твердые вещества, покрывающие белую таблетку крахмала. Ресуспендируйте таблетку в 25 мл буферного раствора и повторно процентрифугируйте. Повторите промывку еще 2 раза. Ресуспендируйте промытую таблетку в ацетоне при -20°С, дайте таблетке отстояться при -20°С. Повторите. Высушите крахмал в токе воздуха. Храните при -20°С.

Экстракция белка:

Перемешайте 50 мг крахмала с 1 мл 2% раствора додецилсульфата натрия в колбе Эппендорфа. Встряхните, центрифугируйте при 18000 оборотов/мин и температуре 4°С в течение 5 мин. Слейте надосадочную жидкость. Повторите дважды. Прибавьте 1 мл буферного раствора для образца (4 мл дистиллированной воды, 1 мл 0,5 моль/л солянокислого трис(гидроксиметил)аминометана, рН 6,8; 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора додецилсульфата натрия, 0,4 мл В-меркаптоэтанола, 0,2 мл 0,5% раствора бромфенолового синего). Кипятите в колбе Эппендорфа в течение 10 мин, закрыв отверстие крышкой. Охладите, процентрифугируйте при 10000 оборотов/мин в течение 10 мин. Декантируйте надосадочную жидкость в другую колбу Эппендорфа. Кипятите в течение 4 минут со внутренними стандартами. Охладите.

Гели додецилсульфата натрия для электрофореза в полиамидном геле: (неденатурирующие)

	10% разделяющий	4% концентрирующий
Акриламид/1,3-бисфосфоглицерат, 40% исходный раствор	2,5 мл	1,0 мл
1,5 моль/л трис(гидроксиметил)аминометан, рН 8,8	2,5 мл	-
0,5 моль/л трис(гидроксиметил)аминометан, рН 8,8	-	2,5 мл
10% раствор додецилсульфата натрия	100 мкл	100 мкл
Вода	4,845 мл	6,34 мл
Дегазируйте 15 минут и прибавьте свежеприготовленные
10% раствор персульфата аммония	50 мкл	50 мкл
TEMED	5 мкл	10 мкл

Кювета Mini-Protean II Dual Slab; 3,5 мл разделяющего буферного раствора для каждого геля. Сверху налить 4% концентрирующий буферный раствор. На гель подать рабочее напряжение 200 В постоянного тока. 10 × рабочий буферный раствор (250 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометан, 1,92 моль/л глицин, 1% додецилсульфат натрия, рН 8,3).

Методика исследования инкапсулирующих в крахмал областей:

Растворы:

Экстракционный буферный раствор:	50 ммоль/л ацетат трис(гидроксиметил)аминометана рН 7,5; 10 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты; 10% раствор сахарозы; 2,5 ммоль/л свежеприготовленный трео-1,4-димеркаптобутан-2,3-диол.
Концентрирующий буферный раствор:	0,5 моль/л солянокислый трис(гидроксиметил)аминометан, рН 6,8
Разделяющий буферный раствор:	1,5 моль/л солянокислый трис(гидроксиметил)аминометан, рН 8,8
10 × буферный раствор для нижнего электрода:	30,3 г трис(гидроксиметил)аминометана + 144 г глицина, разбавить до объема в 1 л (рН приблизительно 8,3, не регулировать). Разбавить перед употреблением.
Буферный раствор для верхнего электрода:	Такой же, как и для нижнего электрода.
Раствор сахарозы:	18,66 г сахарозы + 100 мл dH2О.
Исходный раствор 30% Акриламид/1,3-бисфосфоглицерат (2,67% С):	146 г акриламида + 4 г 1,3-бисфосфоглицерата + 350 мл dH2O. Разбавить до 500 мл. Профильтровать и хранить в темноте при 4°С не более месяца.
Исходный раствор 15% акриламид/1,3-бисфосфоглицерат (20% С):	6 г акриламида + 1,5 г 1,3-бисфосфоглицерата + 25 мл dH2O. Разбавить до 500 мл. Профильтровать и хранить в темноте при 4°С не более месяца.

Раствор рибофлавина:	1,4 г рибофлавина + 25 мл dH2O. Хранить в темноте не более месяца.
Смесь для SS анализа:	25 ммоль/л цитрат натрия, 25 ммоль/л N,N-бис(2-гидроксиэтилглицин)-NaOH (рН 8,0), 2 ммоль/л этилендиаминтетрауксусная кислота, 1 ммоль/л свежеприготовленный трео-1,4-димеркаптобутан-2,3-диол, 1 ммоль/л свежеприготовленный аденозин-5'-дифосфоглюкоза, 10 мг/мл свежеприготовленный гликоген типа III печени кролика.
Раствор йода:	2 г йода + 20 г KI, разбавить до 1 л 0,1 н. раствором HCl.

Экстракт:

- 4 мл экстракционного буферного раствора + 12 г эндосперма. Гомогенизировать.

- профильтровать через ткань mira или 4 слоя суровой марли, процентрифугировать при 20000 g (14500 оборотов/мин, ротор SM-24), 2 мин, 4°С.

- с помощью стеклянной пипетки удалить надосадочную жидкость.

- 0,85 мл экстракта +0,1 мл глицерина + 0,05 мл 0,5% раствора бромфенолового синего.

- встряхнуть и центрифугировать на микроцентрифуге при максимальной скорости. Использовать сразу же или заморозить в жидком азоте и хранить при температуре 80°С не более 2 недель.

Отлитые гели:

С помощью двусторонней липкой ленты к внутренней стороне внешней стеклянной пластинки прикрепить пленку Gel Bond PAG (производства фирмы FMC Industries, Rockland, ME) гидрофильной стороной вверх. Пленка и лента должны быть расположены как можно ровнее и ближе к нижней стороне пластинки. Пленка должна быть немного меньше пластинки. Чтобы закрепить пленку, шприцем внесите воду между пленкой и пластинкой. С помощью салфетки выдавите избыток воды. Установите пластинки как обычно, затем с помощью липкой ленты загерметизируйте нижние части пластинок. Если из стойки для отлитых гелей удалить серый каучуковый вкладыш, то кассета вставится в стойку. Гель полимеризуется с пленкой и во время всех последующих операций остается скрепленным с ней.

Отливка 4,5% Т разделяющего мини-геля (0,75 мм):

2,25 мл dH₂O

+ 3,75 мл раствора сахарозы

+ 2,5 мл разделяющего буферного раствора

+ 1,5 мл 30% исходного раствора акриламид/1,3-бисфосфоглицерата

+ для каждого геля различные количества гликогена (т.е. 0-1,0%)

ДЕГАЗИРОВАТЬ 15 МИН

+ 50 мкл 10% раствора аденозин-5'-фосфосульфата

+ 5 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина

ПОЛИМЕРИЗОВАТЬ В ТЕЧЕНИЕ 30 МИНУТ ИЛИ В ТЕЧЕНИЕ НОЧИ.

Отливка 3,125% Т концентрирующего геля:

1,59 мл dH₂O

+ 3,75 мл раствора сахарозы

+ 2,5 мл разделяющего буферного раствора

+ 2,083 мл 15% исходного раствора акриламид/1,3-бисфосфоглицерата

НЕ ДЕГАЗИРОВАТЬ.

15 мкл 10% раствора аденозин-5'-фосфосульфата

+ 35 мкл раствора рибофлавина

+ 30 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина

ПОЛИМЕРИЗОВАТЬ В ТЕЧЕНИЕ 2,5 ЧАСОВ ВБЛИЗИ ЛАМПЫ

Перед извлечением гребенок охладить до 4°С. Также можно не использовать гребенки, а просто отлить сантиметровый шаблон.

Предшествующая процедура:

- Можно выполнять при различных температурах; предварительно инкубировать гели и растворы.

- Провести предварительный эксперимент при 200 В в течение 15 мин.

- Залить гель: по 7 мкл на лунку или 115 мкл, если гребенка не используется.

- Проводить эксперимент при 140 В, пока фронт красителя не окажется вблизи дна. Если поместить весь образец геля в водяную баню, то можно проводить эксперимент при различных температурах. Периодически можно останавливать эксперимент для помещения в гель температурного датчика.

- Анализ фермента: Обрежьте гели на фронте красителя. Инкубируйте в SS. Путем осторожного встряхивания перемешивайте анализируемую смесь в течение ночи. Промойте гели водой. Залейте раствором I₂/RI.

- Поместите образцы геля с изображениями на просмотровый стол с подсветкой и измерьте изображения. Rm = (расстояние в миллиметрах от верхнего края геля до активной зоны)/(расстояние в миллиметрах от верхнего края геля до нижнего края геля, где он был обрезан (где находился фронт красителя)). Постройте график зависимости содержания гликогена в % от 1/Rm. Точка пересечения графика с осью х (где у=0) соответствует - К.

Протокол тестирования и оценки длины области SER:

Осуществление вышеописанной процедуры для выбора области SER требует выполнения четырех основных шагов. Сначала необходимо выбрать ДНК, кодирующую белок, содержащий инкапсулирующуюся в крахмал область. Ее можно выбрать из числа известных генов, синтезирующих крахмал, или генов, связывающих крахмал, таких как, например, гены для амилазы. Белок необходимо проэкстрагировать. Специалистам известно много методик экстракции белков. Белок можно обработать протеазами, получив фрагменты белка различной длины. Предпочтительные фрагменты обладают делециями преимущественно со стороны N-концевой области белка. Область SER расположена ближе к С-концу, чем к N-концу. Белок перемещается по описанному выше гелю и оценивается сродство гелевой матрицы. Более высокое сродство указывает на более значительную предпочтительность этой области белка по отношению к матрице. Эта методика позволяет сопоставить различные белки и идентифицировать инкапсулирующиеся в крахмал области в природных и синтетических белках.

Пример второй:

Вектор слияния SER:

Следующие векторы слияния адаптированы для использования с E.coli. Ген слияния, который был присоединен к вероятной SER в этих векторах, декодирует зеленый флуоресцирующий белок (GFP). К этим векторам может быть пришито любое количество различных генов, кодирующих белки и полипептиды. Вектор слияния был построен с SER восковидного гена кукурузы, слитым со вторым геном или фрагментом гена, в данном случае GFP.

PEXS114 (см. ФИГ.1а): Синтетический GFP (SGFP) был PCR-амплифицирован из плазмиды HBT-SGFP (получена от Jen Sheen; Dept. of Molecular Biology; Wellman 11, MGH; Boston, MA 02114, USA) с использованием праймеров EXS73 (5'GACTAGTCATATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3') [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 1] и EXS74 (5'CTAGATCTTCATATG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3') [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 2]. Концы продукта PCR были выравнены с помощью Т ДНК полимеразы, чтобы получить тупые концы; затем продукт PCR гидролизовали с помощью Spe I. Этот SGFP фрагмент субклонировали в сайты EcoRV-Spe I pBSK (Stratagene at 11011 North Torrey Pines Rd. La Jolla, Ca.) с получением pEXSl 14.

pEXS115 (см. ФИГ.1b): Синтетический GFP (SGFP) был PCR-амплифицирован из плазмиды HBT-SGFP (получена от Jen Sheen) с использованием праймеров EXS73 (см. выше) и EXS75 (5'-CTAGATCTTGGCCATGGC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3') [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 3]. Концы продукта PCR были выравнены с помощью Т ДНК полимеразы, чтобы получить тупые концы; затем продукт PCR гидролизовали с помощью Spe I. Этот SGFP фрагмент субклонировали в сайты EcoR'V-Spe I pBSK (Stratagene) с получением pEXS115.

pEXSWX (см. ФИГ.2а): WX кукурузы субклонировал Ndel-Not I в рЕТ-21а (см. ФИГ.2b). Последовательность геномной ДНК и ассоциированные аминокислоты, из которых можно генерировать последовательность мРНК, приведены в Таблицах 1а и 1b ниже и альтернативно можно использовать ДНК, приведенную в следующих таблицах.

Конструкции GFP:

1. GFP только в рЕТ-21а:

pEXS115 гидролизуется с Nde I и Xho I и фрагмент из 740 пар оснований, содержащий кодирующую последовательность SGFP, субклонируется в сайты Nde I и Xho I pET-21a (Novagen 601, Science Dr. Madison WI). (См. ФИГ.2b, карту GFP-21a).

2. GFP субклонируется, так чтобы не вызвать сдвиг рамки считывания, на 5'-конец зрелой WX полной длины:

Фрагмент Nde I из 740 пар оснований, содержащий SGFP из pEXS114, субклонируется в сайт Nde I pEXSWX. (См. ФИГ.3а, карту GFP-FLWX).

3. GFP субклонируется, так чтобы не вызвать сдвиг рамки считывания, на 5'-конец усеченного на N-конце WX:

WX обрезается на 700 пар оснований на N-конце.

Фрагмент ВатН I из 1000 пар оснований, кодирующий С-конец WX из pEXSWX субклонируется на сайт Bgl II pEXS115. Затем весь SGFP-усеченный фрагмент WX субклонируется на рЕТ-21а в виде фрагмента Nde I-HindIII. (См. ФИГ. 3b, карту GFP-Bam HIWX).

4. GFP субклонируется, так чтобы не вызвать сдвиг рамки считывания, на 5'-конец усеченного WX: WX обрезается на 100 пар оснований на N-конце.

Состоящий из 740 пар оснований фрагмент Nde 1-Nco I, содержащий SGFP из pEXS115 субклонируется на pEXSWX в сайтах Nde I и Nco I (См. ФИГ. 4, карту GFP-NcoWX).

Пример третий:

Трансформация плазмид в бактериях:

Приготовление компетентных клеток Escherichia coli:

1. Инокулировать 2,5 мл среды LB одной колонией нужного штамма Е.coli: выбран штамм XLIBLUE DL2IDE3 (Stratagen), добавив соответствующие антибиотики. Выращивать при 37°С и 250 оборотов/мин в течение ночи.

2. Инокулировать 100 мл среды LB в разбавлении 1: 50 выдержанной в течение ночи культурой, добавив соответствующие антибиотики. Выращивать при 37°С и 250 оборотов/мин до достижения OD₆₀₀=0,3-0,5.

3. Перенести культуру в стерильный сосуд для центрифугирования и охлаждать на льду в течение 15 минут.

4. Центрифугировать в течение 5 минут при 3000 × g (4°C).

5. Ресуспендировать таблетку в 8 мл охлажденного на льду трансформационного буферного раствора. Инкубировать на льду в течение 15 минут.

6. Центрифугировать в течение 5 минут при 3000 × g (4°С).

7. Ресуспендировать таблетку в 8 мл охлажденного на льду трансформационного буферного раствора 2. Отобрать аликвоту, мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при -70°С.

Трансформационный буферный раствор 1		Трансформационный буферный раствор 2
RbCl	1,2 г	4-морфолинпропансульфоновая кислота (10 ммоль/л)	0,209 г
MnCl2.4H2O	0,99 г	RbCl	0,12 г
Ацетат калия	0,294 г	CaCl2.2H2O	1,1 г
CaCl2.2H2O	0,15 г	Глицерин	15 г
Глицерин	15 г	dH2O	100 мл
dH2O	100 мл	Довести рН до 6,8 с помощью NaOH
Довести рН до 5,8 с помощью 0,2 моль/л уксусной кислоты		Простерилизовать на фильтре
Простерилизовать на фильтре

Метод трансформации Escherichia coli хлоридом рубидия путем теплового шока: Hanahan, D. (1985) in DNA cloning: a practical approach (Glover, D.M. ed.), pp.109-135, IRL Press.

1. Инкубировать 1-5 мкл ДНК на льду с помощью 150 мкл компетентных клеток Е. coli в течение 30 минут.

2. Подвергнуть тепловому шоку при 42°С в течение 45 секунд.

3. Немедленно поместить на лед на 2 минуты.

4. Прибавить 600 мкл среды LB и инкубировать при 37°С в течение 1 часа.

5. Поместить на агар LB, добавив соответствующие антибиотики.

Эта плазмида будет экспрессировать в бактерии гибридный полипептид, содержащий зеленый флуоресцирующий полипептид.

Пример четвертый:

Экспрессия конструкции в Е.coli:

1. Инокулировать 3 мл среды LB с помощью Е.coli, содержащей нужную плазмиду. Добавить соответствующий антибиотик. 37°С, 250 оборотов/мин, в течение ночи.

2. Инокулировать 100 мл среды LB с помощью 2 мл среды, выдержанной в течение ночи. Добавить соответствующий антибиотик. Выращивать при 37°С, 250 оборотов/мин.

3. При достижении OD₆₀₀ около 0,4-0,5 поместить при комнатной температуре, 200 оборотов/мин.

4. При достижении OD₆₀₀ около 0,6-0,8 индуцировать с помощью 100 мкл 1 моль/л 1PTG. Конечная концентрация 1PTG составляет 1 ммоль/л.

5. Выращивать при комнатной температуре, 200 оборотов/мин, 4-5 часов.

6. Собрать клетки путем центрифугирования.

7. Мгновенно заморозить в жидком азоте и до использования хранить при -70°С.

Клетки можно ресуспендировать в dH₂О и под ультрафиолетовым излучением (λ_maч=395 нм) исследовать собственную флуоресценцию. Альтернативно, клетки можно обработать ультразвуком и аликвоту клеточного экстракта можно разделить с помощью электрофореза в полиамидном геле с додецилсульфатом натрия и исследовать под ультрафиолетовым излучением для обнаружения флуоресценции GFP. Если использованный белок представляет собой зеленый флуоресцирующий белок, то наличие белка в гидролизованном веществе можно установить на основании характерного зеленого свечения под ультрафиолетовым излучением при длине волны 395 нм на просмотровом столе с подсветкой.

Пример пятый:

Экстракция плазмиды из бактерий:

Ниже описан лишь один из многих обычных протоколов очистки плазмиды путем щелочного лизиса, применяющихся при реализации настоящего изобретения:

1. Инокулировать 100-200 мл среды LB одной колонией Е.coli, трансформированной с помощью одной из плазмид, описанных выше. Добавить соответствующий антибиотик. Выращивать при 37°С, 250 оборотов/мин, в течение ночи.

2. Центрифугировать в течение 10 минут при 5000 × g (4°C).

3. Ресуспендировать клетки в 10 мл воды, перенести в пробирку для центрифуги на 15 мл и повторить центрифугирование.

4. Ресуспендировать таблетку в 5 мл 0,1 моль/л NaOH, 0,5% додецилсульфата натрия. Инкубировать на льду в течение 10 минут.

5. Прибавить 2,5 мл 3 моль/л ацетата натрия (рН 5,2), осторожно перевернуть и инкубировать на льду в течение 10 минут.

6. Центрифугировать в течение 5 минут при 15000-20000 × g (4°C).

7. Экстрагировать надосадочную жидкость равным объемом смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1).

8. Центрифугировать в течение 10 минут при 6000-10000 × g (4°С).

9. Перенести водную фазу в чистую пробирку и осадить 1 объемом изопропанола.

10. Центрифугировать в течение 15 минут при 12000 × g (4°C).

11. Растворить таблетку в 0,5 мл ТЕ, прибавить 10 мкл раствора рибонуклеазы концентрации 10 мг/мл и инкубировать в течение часа при 37°С.

12. Дважды проэкстрагировать смесью фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1).

13. Один раз проэкстрагировать хлороформом.

14. Осадить водную фазу 1 объемом изопропанола и 0,1 объема раствора ацетата натрия концентрации 3 моль/л.

15. Один раз промыть таблетку 70% этанолом.

16. Высушить таблетку в аппарате для быстрой вакуумной сушки SpeedVac и ресуспендировать таблетку в РЕ. Эту плазмиду затем можно внедрить в других хозяев.

Пример шестой:

В этом эксперименте использована плазмида, содержащая промотор кукурузы, транзитный пептид кукурузы, инкапсулирующую в крахмал область гена синтетазы крахмала I и пришитый генный фрагмент. Плазмида, показанная на ФИГ.6, содержит нуклеотидную последовательность ДНК, приведенную в таблице 8.

Плазмиду pEXS53 конструировали по следующему протоколу:

При конструировании трансгенных плазмид использовали следующие материалы:

Плазмиду pBluescript SK-

Плазмиду pMF6 (содержит терминатор nos3')

Плазмиду рНКН1 (содержит интрон кукурузы adh1)

Плазмиду MstsI(6-4) (содержит транзитный пептид кукурузы stsI, используется в качестве шаблона для удаления транзитного пептида РСТ stsI)

Плазмиду MstsIII в pBluescript SK-

Праймеры EXS29 (GTGGATCCATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG)

[ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 22]

EXS35 (CTGAATTCCATATGGGGCCCCTCCCTGCTCAGCTC)

[ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 23]

оба используются для транзитного пептида РСТ stsl

Праймеры EXS31 (CTCTGAGCTCAAGCTTGCTACTTTCTTTCCTTAATG)

[ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 24]

EXS32 (GTCTCCGCGGTGGTGTCCTTGCTTCCTAG)

[ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 25]

оба используются для зеинового промотора PCR кукурузы 10 кДа (Journal: Gene 71: 359-370 [1988])

Геномная ДНК А632 кукурузы (используется в качестве шаблона для зеинового промотора PCR кукурузы 10 кДа)

Стадия 1: Клонировать зеиновый промотор PCR кукурузы 10 кДа в pBluescript SK-(обозначение pEXS10zp).

1. Зеиновый промотор 10 кДа PCR кукурузы 1100 нуклеотидных оснований

праймеры: EXS31, EXS32

шаблон: геномная ДНК А632 кукурузы

2. Клонировать зеиновый промотор 10 кДа PCR кукурузы 1100 нуклеотидных оснований в плазмиду pBluescript SK-на сайты Sad и SacII (См. ФИГ.7).

Стадия 2: Удалить сайт NdeI из pEXS10zp (обозначение pEXS10zp-NdeI).

NdeI удаляется лигированием по заполненньм и тупым концам из зеинового промотора 10 кДа PCR кукурузы в pBluescript SK.

Стадия 3: Клонировать интрон кукурузы adhl в pBluescript SK-(обозначение pEXSadh1).

Интрон adh1 кукурузы высвобождается из плазмиды рНКН1 на сайтах XbaI и BamHI. Интрон adh1 кукурузы (фрагмент XbaI/BamHI) клонируется в pBluescript SK- на сайты XbaI и BamHI (См. ФИГ.7).

Стадия 4: Клонировать зеиновый промотор 10 кДа кукурузы и интрон кукурузы adh1 в pBluescript SK- (обозначение pEXS10zp-adhl).

Зеиновый промотор 10 кДа кукурузы высвобождается из плазмиды pEXS 10zp-NdeI на сайтах SacI и SacII. Зеиновый промотор 10 кДа кукурузы (фрагмент SacI/SacII) клонируется в плазмиду pEXSadhl (содержит интрон кукурузы adhl) на сайты SacI и SacII (см. ФИГ.7).

Стадия 5: Клонировать терминатор кукурузы nos3' в плазмиду pEXSadh1 (обозначение pEXSadhl-nos3').

Терминатор кукурузы nos3' высвобождается из плазмиды pMF6 на сайтах EcoRI и HindIII. Терминатор кукурузы nos3' (фрагмент EcoRI/HindIII) клонируется в плазмиду pEXSadhl на сайты EcoRI и HindIII (см. ФИГ.7).

Стадия 6: Клонировать терминатор кукурузы nos3' в плазмиду pEXS10zp-adhl (обозначение pEXSadh I-adh1-nos3').

Терминатор кукурузы nos3' высвобождается из плазмиды pEXSadhl-nos3' на сайтах EcoRI и ApaI. Терминатор кукурузы nos3' (фрагмент EcoRI/ApaI) клонируется в плазмиду pEXS10zp-adh1 на сайты EcoRI и ApaI (см. ФИГ.7).

Стадия 7: Клонировать транзитный пептид кукурузы STSI в плазмиду pEXSadh 1-adh1-nos3' (обозначение pEXS33).

1. Транзитный пептид кукурузы STSI 150 пар оснований PCR

праймеры: EXS29, EXS35 шаблон: плазмида MSTSI(6-4)

2. Клонировать транзитный пептид кукурузы STSI 150 пар оснований PCR в плазмиду pEXSadh1-adh1-nos3' на сайты EcoRI и BamHI (См. ФИГ.7).

Стадия 8: Сайт-ориентированный мутагенез транзитного пептида кукурузы STSI в pEXS33 (обозначение pEXS33(m)).

Происходит мутация (терминирующий трансляцию кодон) на транзитном пептиде кукурузы в плазмиде pEXS33. Сайт-ориентированный мутагенез проводится для превращения терминирующего кодона в нетерминирующий кодон. Новая плазмида (содержащая зеиновый промотор 10 кДа кукурузы, транзитный пептид кукурузы STSI, интрон кукурузы adh1, терминатор кукурузы nos3') обозначена как pEXS33(m).

Стадия 9: В pEXS33(m) обнаружен сайт NotI (обозначение pEXS50).

Сайт NotI удален из pEXS33 лигированием по заполненным и тупым концам с образованием pEXS50 (см. ФИГ.8).

Стадия 10: Из pEXS33(m) удален интрон кукурузы adhl (обозначение pEXS60).

Интрон кукурузы adhl удален путем гидролиза с помощью NotI/BamHI, закрытого фрагментом Klenow, лигированием по тупому концу с получением pEXS60 (см. ФИГ.9).

Стадия 11: Клонировать STSIII кукурузы в pEXS50, pEXS60.

STSIII кукурузы высвобождается из плазмиды кукурузы STSIII в pBluescript SK- на сайтах NdeI и EcoRI. STSIII кукурузы (фрагмент NdeI-EcoRI) клонируется в pEXS50, pEXS60 по отдельности, обозначения pEXS51, pEXS61 (см. ФИГ.8 и 9 соответственно).

Стадия 12: Клонировать гены, приведенные в Таблице 8, в pEXS51 на сайте NdeI/NotI с получением pEXS52. Аналогичные другие плазмиды можно получить путем клонирования других генов (STSII, II, WX, glgA, glgB, glgC, BEI, BEII и др.) на сайты pEXS51, pEXS61 и NdeI/NotI.

Плазмида EXS52 трансформирована в рисе. Регенерированные растения риса, трансформированные с помощью pEXS52, промаркированы и помещены в красную камеру.

Из красной камеры выбрано по два сиблинга каждой линии и перенесены в горшки размером 2,5 дюйма, заполненные почвенной смесью (верхний слой почвы, перемешанный с торфо-вермикулитной смесью 50/50). Горшки поместили в аквариум (сосуд для рыб), в котором находилось полдюйма воды. Для поддержания высокой влажности аквариум накрыли сверху (проделано несколько отверстий для отвода тепла). За температурой следили с помощью термометра. Аквариум облучали ультрафиолетовым излучением. В течение первой недели растения не удобряли. Световой период составлял от 6 часов до полудня до 8 часов после полудня, минимальная длительность освещения составляла 14 часов. Под аквариумом размещалась нагревательная панель, которая при необходимости способствовала росту корней. Растения находились в указанных условиях в течение недели. (Примечание: вследствие низкой интенсивности освещения проростки начинали сильно удлиняться).

После первой недели с аквариума снимали крышку и трансформированные растения риса на три недели переносили в камеры для выращивания, в которых поддерживалась высокая влажность и большая интенсивность освещения.

Альтернативно, для поддержания высокой влажности в теплице можно использовать водяную смесь. Растения выращивали в течение трех недель. Затем растения переносили в горшки размером 6 дюймов (минимальный размер горшков должен составлять 5 дюймов) с почвенной смесью (верхний слой почвы и влажный торф, 50/50). Горшки помещали в траншею, в которой находилось полдюйма воды. Раз в неделю или в соответствии с потребностью растений исходя из их внешнего вида растения подкармливали смесью удобрений 15-16-17 (N-K-P) (250 млн^-1). Растения выращивали в условиях 14-часового светового дня (минимально) от 6 часов до полудня до 8 часов после полудня при высокой интенсивности освещения и при температуре 85°-90°F (29,4-32,2°С) днем и 70°F (21,1°С) ночью.

Растения формировали зерна риса, и эти зерна собирали. Эти собранные зерна могут содержать экстрагируемый крахмал и их можно проанализировать на наличие в крахмале лигированных аминокислот С, V, А, Е, L, S, R, Е [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 27].

Пример седьмой:

SER вектор для растений

Плазмида, приведенная на Фиг.6, адаптирована для использования с однодольньми растениями, т.е. кукурузой. Плазмида pEXS52 (ФИГ.6) содержит промотор, транзитный пептид (кукурузы) и лигированный генный фрагмент (TGC GTC GCG GAG CTG AGC AGG GAG) [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 26], который кодирует аминокислотную последовательность CVAELSRE [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 27].

Эти генные фрагменты в природе поблизости от N-конца содержат ген синтетазы растворимого крахмала кукурузы (MSTSI). Как показано в таблице 8, SER начинается примерно от аминокислоты 292 синтетазы крахмала. В кукурузе-хозяине предпочтительно трансформируется этот вектор. Ясно, что при необходимости транзитный пептид и промотор можно изменить, чтобы они подходили для нужного растения-хозяина. После трансформации с помощью "нитевидной" технологии (патенты США №№5302523 и 5464765) трансформированные клетки хозяина регенерируют с помощью методик, известных специалистам, трансформированный продукт опыляют и полученные ядра можно собрать и проанализировать на наличие пептида в крахмале и грануле крахмала.

Для улучшения семян кукурузы можно использовать следующие предпочтительные гены: ген фитазы, ген соматотропина, следующие цепные аминокислоты: AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG AUG [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 28]; и/или AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 29]; и/или ААА ААА ААА ААА ААА ААА [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 30]; или комбинацию кодонов, кодирующих аминокислоту лизин в цепях, или комбинацию кодонов, кодирующих одновременно лизин и метионин, или любую комбинацию из двух или трех указанных аминокислот. Длина цепей не должна быть чрезмерно большой, но длина цепи не должна быть критической. Таким образом, эти аминокислоты будут инкапсулированы в гранулу крахмала или иммобилизованы на крахмале, образовавшемся в содержащем крахмал участке растения-хозяина.

Эту плазмиду можно трансформировать в другие злаки, такие как рис, пшеница, ячмень, овес, сорго или просо при небольшой модификации плазмиды или без такой модификации. Промотором может являться промотор восковидного гена, последовательность для которого опубликована в литературе, или другие зеиновые промоторы, известные специалистам.

Кроме того, эти плазмиды, без проведения слишком большого объема исследований, можно трансформировать в двудольные растения, такие как картофель, батат, таро, ямс, маниок, арахис, соя, бобы и нут. Промотор можно выбрать так, чтобы он воздействовал на участки конкретных двудольных растений, в которых хранится крахмал, или на клубни, например, для клубней картофеля можно использовать промотор пататин.

В промышленности известны различные способы трансформирования однодольных и двудольных растений и способ трансформирования генов не является критическим для настоящего изобретения. Плазмиду можно ввести в Agrobacterium tumefaciens методом замораживания-размораживания, предложенным An et al. (1989) Binary Vectors, in Plant Molecular Biology Manual A3, S.B. Gelvin and R.A. Schilperoot, eds. (Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers), pp. 1-19. Приготовление инокулируемого материала Agrobacterium, содержащего конструкцию, и инокуляция растительного материала, регенерация побегов и проращивание побегов описаны в работе Edwards et al., "Biochemical and molecular characterization of a novel starch synthase from potatoes". Plant J., 8, 283 - 294 (1995).

Целый ряд инкапсулирующих областей присутствует во многих генах. Хотя предпочтительно, чтобы белок инкапсулировался в гранулу крахмала (инкапсулирование в гранулу), термин "инкапсулирование" в соответствии с настоящим изобретением включает и инкапсулирование в крахмал, не находящийся в грануле. Для этой цели пригодны следующие типы генов.

Использование инкапсулирующих в крахмал областей гликогенсинтетазы:

Гликогенсинтетаза Е.coli представляет собой небольшой белок: структуральный ген содержит 1431 пару оснований, специфицируя белок из 477 аминокислот с оцененной молекулярной массой 49000. Известно, что в случае бактериальных генов, внедряемых в геномы растений, возникают затруднения с использованием кодонов, однако в случае генов Е.coli это не столь существенно, как в случае генов других бактерий, таких как принадлежащих к семейству Bacillus. Гликогенсинтетаза Е.coli обладает профилем применимости кодона, очень сходным с профилем для генов кукурузы, однако предпочтительно, чтобы с помощью известных методик была изменена последовательность в месте начала трансляции, чтобы она лучше совмещалась с типичной последовательностью для растений:

gIg AGATAATGCA

[ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 31]

cons AACAATGGCT

[ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 32]

Использование инкапсулирующих в крахмал областей синтетазы растворимого крахмала:

Клоны кДНК синтетаз растворимого крахмала растений описаны в предыдущих разделах и могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Гены любого такого SSTS белка могут использоваться в конструкциях, соответствующих настоящему изобретению.

Использование инкапсулирующих в крахмал областей ветвящего фермента:

Клоны кДНК ветвящих ферментов растений, бактерий и животных описаны в предыдущих разделах и могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Ветвящий фермент [α1,4Dглюкан: α1,4Dглюкан 6D(α1,4Dглюкано) трансфераза (Е.С.2.4.1.18)] конвертирует амилозу в амилопектин (фрагмент α1,4Dглюкановой цепи переносится к первичной гидроксильной группе аналогичной глюкановой цепи), его иногда называют Q-ферментом.

Последовательность ветвящего фермента I кукурузы исследовали Baba et al. (1991), BBRC, 181: 87-94. Ветвящий фермент II крахмала из эндосперма кукурузы исследовали Fisher et al. (1993), Plant Physiol, 102: 1045-1046. Конструкция BE гена может потребовать присутствия транзитного пептида амилопласта для обеспечения ее корректной локализации в амилопласте. Гены любого такого ветвящего фермента белка GBSTS можно использовать в конструкциях, соответствующих настоящему изобретению.

Использование связывающих крахмал областей синтетазы крахмала, иммобилизованной на грануле:

Использование кДНК клонов иммобилизованных на грануле синтетаз крахмала растений описано в работах Shure et al. (1983), Cell 35: 225-233 и Visser et al. (1989), Plant Sci. 64(2): 185-192. Visser et al. также описали ингибирование экспрессии гена иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала для картофеля с помощью конструкций с обратным считыванием (1991) Mol. Gen. Genetic 225(2): 289-296; (1994) The Plant Cell, 6: 43-52. Shimada et al. показали наличие обратного считывания для риса (1989) Theor. Appl. Genet. 86: 665-672. Van der Leij et al. показали наличие восстановления синтеза амилозы в картофеле с небольшим содержанием амилозы после трансформации диким восковидным геном картофеля (1991) Theor. Appl. Genet. 82: 289-295.

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности синтетаз гранул крахмала, например, кукурузы, риса, пшеницы, картофеля, маниоки, гороха и ячменя, хорошо известны. Гены любого такого белка GBSTS можно использовать в конструкциях, соответствующих настоящему изобретению.

Конструирование трансформационных векторов растений:

Трансформационные векторы растений для применения в способе, соответствующем настоящему изобретению, можно сконструировать с помощью стандартных методик.

Использование последовательностей транзитного пептида:

Некоторые генные конструкции требуют присутствия амилопластового транзитного пептида для обеспечения корректной локализации в амилопласте. Предполагается, что хлоропластовые транзитные пептиды обладают аналогичными последовательностями (Heijne et al. описали базу данных для хлоропластовых транзитных пептидов в работе (1991) Plant Mol. Biol. Reporter, 9 (2): 104-126). Другими транзитными пептидами, пригодными в соответствии с настоящим изобретением, являются транзитные пептиды ADPG пирофосфорилазы (1991) Plant Mol. Biol. Reporter, 9(2): 104-126), небольшая субъединица RUBISCO, ацетолактатсинтетаза, глицеральдегид3Рдегидрогеназа и нитритредуктаза.

Типичная последовательность транзитного пептида небольшой субъединицы RUBISCO из различных генотипов обладает последовательностью:

MASSMLSSAAVATRTNPAQASM VAPFTGLKSAAFPVSRKQNLDI TSIASNGGRVQC [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 33].

Небольшая субъединица RUBISCO кукурузы обладает последовательностью:

MAPTVMMASSATATRTNPAQAS AVAPFQGLKSTASLPVARRSSR SLGNVASNGGRIRC [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 34].

Транзитный пептид глицеральдегид3Рдегидрогеназа листьев кукурузы обладает последовательностью:

MAQILAPSTQWQMRITKTSPCA TPITSKMWSSLVMKQTKKVAHS [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 35].

Последовательность транзитного пептида синтетазы крахмала, иммобилизованного на эндосперме кукурузы, обладает последовательностью:

MAALATSQLVATRAGHGVPDASTFRRGAAQGLRGARASAAADTLSMRTSARAAPRHQQQA RRGGRFPFPSLVVC [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 36].

Последовательность транзитного пептида синтетазы растворимого крахмала, эндоспермы кукурузы, обладает последовательностью:

MATPSAVGAACLLLARXAWPAAVGDRARPRRLQRVLRRR [ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ НОМЕР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 37].

Включение новых аминокислот или пептидов в инкапсулирующие в крахмал белки с помощью генной инженерии:

Связывающиеся с крахмалом белки, используемые в настоящем изобретении, можно модифицировать способами, известными специалистам, для включения новых комбинаций аминокислот. В частности, последовательности связывающихся с крахмалом белков можно модифицировать для экспрессии более высоких, чем обычные, содержаний лизина, метионина или триптофана. Такие содержания выгодно увеличивать по сравнению с содержаниями в природных системах и такие белки повышают питательную ценность культур, таких как зерновые культуры.

В дополнение к изменению аминокислотного баланса с помощью генной инженерии можно так изменить связывающиеся с крахмалом белки, чтобы ценные пептиды включились в белок, связывающийся с крахмалом. Присоединение полезного полипептида к связывающемуся с крахмалом белку на N-конце белка создает известные средства добавления пептидных фрагментов при сохранении способности связываться с крахмалом. Дополнительные улучшения можно внести путем включения специфичных протеазных расщепляющих сайтов в сайт присоединения полезного полипептида в инкапсулирующую в крахмал область. Специалистам хорошо известно, что протеазы обладают предпочтительной специфичностью по отношению к различным аминокислотным связям. Такие специфичности можно использовать для создания средств подачи ценных полипептидов в различные отделы желудочно-кишечного тракта животных и человека.

В еще одной реализации настоящего изобретения полезный полипептид можно выделить после очистки и обработки таких гранул крахмала. Известно, что с помощью процедур амилоза и/или желатинирования белки, связанные с гранулой крахмала, можно высвободить или сделать доступными для протеолиза. Становится возможным такое выделение промышленных количеств белков и пептидов из матрицы гранулы крахмала.

В еще одной реализации настоящего изобретения можно различными способами обработать гранулы крахмала, что дает возможность изменить гидролизуемость крахмала. С помощью этой методологии можно изменить биодоступность белков, пептидов и аминокислот, включенных в гранулы крахмала.

Хотя выше настоящее изобретение подробно описано в иллюстративных целях и приведены примеры для пояснения и обеспечения понимания, специалисту после изучения настоящего изобретения становится ясно, что в настоящее изобретение можно внести некоторые изменения и модификации без отклонения от сущности и целей прилагаемой формулы изобретения.

Claims (15)

1. Конструкция молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты для обеспечения регулируемой экспрессии гибридного полипептида в крахмал, включающая последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие

a) промотор, адаптированный для направления экспрессии полезного полипептида в крахмалсодержащие ткани растения при образовании крахмала,

b) транзитный пептид, область кодирования которого способна к транслокации полезного полипептида в амилопласт,

c) полезный пептид,

d) область, инкапсулирующуюся в крахмал,

e) терминатор.

2. Конструкция по п.1, отличающаяся тем, что промотор и терминатор адаптированы для экспрессии гибридного полипептида в крахмал однодольного растения.

3. Конструкция по п.1, отличающаяся тем, что промотор и терминатор адаптированы для экспрессии гибридного полипептида в крахмал двудольного растения.

4. Экспрессирующий вектор, включающий конструкцию по п.1.

5. Способ производства чистого полезного полипептида, включающий

а) трансформацию клеток растения с помощью конструкции по п.1,

b) создание гибридному полипептиду, содержащему полезный полипептид, возможности экспрессирования в указанную клетку,

c) выделение гибридного полипептида из клетки,

d) извлечение полезного полипептида из гибридного полипептида.

6. Гибридный полипептид, включающий полезный полипептид и область, инкапсулирующуюся в крахмал, отличающийся тем, что кодирующая его ДНК представляет собой конструкцию по п.1.

7. Гибридный полипептид по п.6, отличающийся тем, что он содержит расщепляющий сайт, расположенный между полезным полипептидом и областью, инкапсулирующейся в крахмал.

8. Гибридный полипептид по п.6, отличающийся тем, что указанный полезный полипептид является биологически активным полипептидом.

9. Гибридный полипептид по п.8, отличающийся тем, что биологически активный полипептид выбран из группы, включающей гормоны, факторы роста, антитела, пептиды, полипептиды, ферменты, иммуноглобулины, красители и их биологически активные фрагменты.

10. Гибридный полипептид по п.9, отличающийся тем, что биологически активный полипептид выбран из группы, включающей соматотропин, инсулин А, инсулин В, кальцитонин, бета-эндорфин, урогастрон, бета-глобин, миоглобин, гормон роста человека, ангиотензин, проластин, протеазу, бета-галактозидазу и целлюлазу.

11. Гибридный полипептид по п.6, отличающийся тем, что область, инкапсулирующаяся в крахмал, образуется из связывающего крахмал фермента.

12. Гибридный полипептид по п.11, отличающийся тем, что область, инкапсулирующаяся в крахмал, является карбокситерминальным сегментом связывающего крахмал фермента.

13. Гибридный полипептид по п.11, отличающийся тем, что связывающий крахмал фермент выбран из группы, содержащей синтетазу крахмала, ветвящий фермент крахмала, синтетазу гликогена и глюкоамилазу.

14. Гибридный полипептид по п.13, отличающийся тем, что связывающий крахмал фермент выбран из группы, содержащей синтетазу растворимого крахмала I, синтетазу растворимого крахмала II, синтетазу растворимого крахмала III, синтетазу, иммобилизованную на грануле крахмала, ветвящий фермент I, ветвящий фермент IIa и ветвящий фермент IIb.

15. Модифицированный крахмал, включающий гибридный полипептид по п.6.

Images