RU2258081C1 - Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2258081C1 RU2258081C1 RU2003136863/13A RU2003136863A RU2258081C1 RU 2258081 C1 RU2258081 C1 RU 2258081C1 RU 2003136863/13 A RU2003136863/13 A RU 2003136863/13A RU 2003136863 A RU2003136863 A RU 2003136863A RU 2258081 C1 RU2258081 C1 RU 2258081C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid
- recombinant
- pes4
- gene
- base pairs
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 18
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 101000714491 Escherichia phage T7 Major capsid protein Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 18
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 101150103227 IFN gene Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- -1 β-cyanethyl-diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения рекомбинантного интерферона α-2b человека. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pES4-4, которая имеет молекулярную массу 3,64 МДа (5917 п.о.) и состоит из Ndel/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного интерферона α-2b человека, гена β-лактамазы и Ndel/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7. Плазмида pES4-4 содержит в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных этой плазмидой клеток Е. coli к ампициллину, и уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта Ndel: XbaI -38 п.о., HpaI-1332 п.о., PstI-4065 п.о., PvuI-4190 п.о., XhoI-5363 п.о. Полученной плазмидой трансформируют клетки Escherichia coli и получают штамм E. coli BDEES4 - суперпродуцент рекомбинантного интерферона α-2b человека. Изобретение позволяет получать рекомбинантный интерферон α-2b человека с высоким выходом и по упрощенной технологии. 2 н.п. ф-лы, 2 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генной и белковой инженерии, и может быть использовано для получения рекомбинантного интерферона α-2b человека.
Интерферон α-2b человека (ИФН α-2b) относится к белковому семейству интерферонов α (синонимы: интерферон В-клеток, лейкоцитарный интерферон, лимфобластный интерферон), состоящему из более чем 23 форм с общим консервативным участком. ИФН α-2b секретируется активированными моноцитами, макрофагами, лимфобластами и фибробластами. ИФН α-2b человека представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 20-25 кДа. Пептидная часть ИФН α-2b представлена 165 аминокислотными остатками и содержит 4 цистеиновых аминокислотных остатка и два внутримолекулярных дисульфидных мостика. ИФН α-2b обладает иммуномодулирующей, антипролиферативной, антивирусной и антимикробной активностью.
[Streuli M., Nagata S., Weissmann С. // At least three human type alpha interferons: structure of alpha 2. Science, 1980, v. 209(4463), p 1343-1347].
ИФН α-2b осуществляет свое действие через связывание со специфическим рецептором [Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Sirverman R.H., Schreiber R.D. // How cells respond to interferons. Annual Review of Biochemistry, 1998, v.67, p.227-264].
Лекарственные формы ИФН α-2b (синонимы - Интрон (Шеринг-Плау), Виферон (Ферон) и Реальдирон (Биофа)) широко используются в медицине для терапии вирусных гепатитов В, С и D и различных онкологических заболеваний.
Известен способ получения рекомбинантного ИФН α-2b в дрожжевых клетках Pichia Pastoris [заявка PCT/IB 00/00339, МКИ C 12 N 15/00, 2000]. Недостатком этого способа является низкий выход - 100-150 мг с 1 л культуры клеток.
Известен способ получения ИФН α-2b, основанный на химическом синтезе фрагментов белковой молекулы ИФН α-2b с последующей их сборкой в целую молекулу [заявка РСТ/ЕР 03/01745, МКИ С 07 К 14/555, 2003]. Недостатками этого способа являются его высокая себестоимость и трудоемкость.
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения ИФН α-2b, заключающийся в биосинтезе клетками бактерий Escherichia coli рекомбинантного ИФН α-2b [пат. РФ №2165455, МКИ C 12 N 15/21, 2001]. Получение ИФН α-2b в этом изобретении достигается посредством конструирования плазмиды pSS5 и продуцента SS5, полученного трансформацией штамма Escherichia coli BL21(DE3) этой плазмидой. Плазмида pSS5 несет сразу три последовательных промотора различной природы: лактозный промотор, промотор фага Т7 и триптофановый промотор; полусинтетический ген ИФН α-2b и терминатор транскрипции rrsBT1T2. Недостатками плазмиды pSS5 и продуцента на ее основе являются полусинтетический ген ИФН α-2b и триптофановый промотор. При получении полусинтетических генов сложно устранить все проблемы, связанные с переносом эукариотического гена в прокариотический организм, так как их получают путем мутагенеза природного гена. К таким проблемам относятся наличие редких кодонов и образующих "шпильки" последовательностей. Расположение триптофанового промотора в конце триады промоторов в плазмиде pSS5 ограничивает использование питательных сред для ферментации только средами, не содержащими триптофан. Это приводит к снижению выхода и значительному увеличению времени ферментации до 15-25 часов.
Изобретение решает задачу конструирования плазмиды, детерминирующей синтез рекомбинантного ИФН α-2b, и создания на ее основе высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный ИФН α-2b с высоким выходом (от 1 г с 1 л культуры) и по упрощенной технологии за счет уменьшения общего времени ферментации до 6 часов.
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pES4-4, кодирующей полипептид с последовательностью ИФН α-2b человека, имеющей молекулярную массу 3,64 МДа (5917 п.о.), состоящей из NdeI/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы и усилитель трансляции гена 10 фага Т7, и NdeI/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного интерферона α-2b человека; содержащей в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pES4-4 клеток Е.coli к ампициллину; содержащей уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта Ndel: XbaI - 38 п.о., HpaI - 1332 п.о., PstI - 4065 п.о., PvuI - 4190 п.о., XhoI - 5363 п.о., а также за счет штамма Escherichia coli BDEES4, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК pES4-4, - продуцента рекомбинантного ИФН α-2b человека.
Предлагаемый штамм обеспечивает синтез рекомбинантного ИФН α-2b в количестве 20-30% от суммарного содержания белка клеток.
Преимущества предлагаемого изобретения заключаются, во-первых, в использовании полностью синтентетического, в отличие от плазмиды pSS5, гена ИФН α-2b с максимально широким набором кодонов, являющихся оптимальными для продукции белка в Escherichia coli; расположение которых устраняет возможность образования на синтезируемой мРНК протяженных "шпилек", потенциально ингибирующих трансляцию. На фиг.1 приведена аминокислотная последовательность ИФН α-2b и соответствующая ей нуклеотидная последовательность гена: верхняя строка - природная кДНК ИФН α-2b, нижняя строка - синтезированный искусственный ген. Во-вторых, применение для биосинтеза рекомбинантного белка оптимальных регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию: Т7-lac промотора для предотвращения базальной экспрессии гена до момента начала индукции и высокого уровня транскрипции, соответствующей мРНК при индукции, высокоэффективного терминатора транскрипции Т7, и блока стоп-кодонов, исключающих биосинтез удлиненных вариантов рекомбинантного ИФН α-2b. Преимущества предлагаемого штамма Е. coli BL21(DE3) заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного ИФН α-2b и загрязнения выделяемого белка наиболее активными протеазами Е.coli. Также BL21(DE3) несет ген Т7-РНК полимеразы, что при использовании Т7-lac промотора и Т7 терминатора в плазмиде pES4-4 приводит к быстрой и эффективной продукции белка клетками Е.coli и, в отличие от плазмиды pSS5, существенно расширяет выбор питательных сред для ферментации.
Конструирование нового гена, кодирующего ИФН α-2b человека, осуществляют на основе плазмиды рЕТ22b(+). Искусственный ген, кодирующий ИФН α-2b, фланкированный сайтами рестриктаз NdeI и BamaHI, получают химико-ферментативным синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей их сборкой и амплификацией при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Перед лигированием для генерации липких концов амплификат и векторную плазмиду обрабатывают рестриктазами NdeI и BamHI. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.coli DH5α. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров, с последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК рестриктазами NdeI и BamHI. Структуру гена, кодирующего рекомбинантный ИФН α-2b, определяют секвенированием по методу Сенгера. Она должна полностью соответствовать нуклеотидной последовательности исходного искусственного гена ИФН α-2b (фиг.1).
Рекомбинантная плазмидная ДНК pES4-4, кодирующая полипептид ИФН α-2b, характеризуется следующими признаками:
- имеет молекулярную массу 3,64 МДа;
- кодирует полипептид ИФН α-2b;
- состоит из: Ndel/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ22b(+), содержащей промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фагаТ7, ген β-лактамазы, и Ndel/BamHI - фрагмента ДНК, включающего искусственный ген ИФН α-2b;
- имеет уникальную совокупность признаков: промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7, усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7; искусственный ген, кодирующий ИФН α-2b; ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pES4-4 клеток Е. coli к ампициллину; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., HpaI - 1332 п.о., PstI - 4065 п.о., PvuI - 4190 п.о., XhoI - 5363 п.о.
Для получения штамма-продуцента рекомбинантного ИФН α-2b плазмидную ДНК pES4-4 используют для трансформации компетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) и проводят отбор клонов, сохраняющих уровень биосинтеза рекомбинантного полипептида не ниже 20-30% от суммарного клеточного белка в течение по крайней мере шести последовательных пассирований. Для этого клоны трансформированных плазмидой pES4-4 клеток Е.coli BL21(DE3) выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл и раствора глюкозы до 1% в течение 12-14 часов, инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растят культуру до достижения оптической плотности 1 O.Е., индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом, и растят еще 3-6 часов. Получение из клеток продуцента рекомбинантного ИФН α-2b включает следующие стадии: отделение бактерий от культуральной среды, их разрушение одним из обычно применяемых способов; отмывку буферными растворами телец включения от водорастворимых компонентов клетки; солюбилизацию и восстановление целевого белка, его рефолдинг и окончательную очистку.
Полученный штамм-продуцент Escherichia coli BDEES4 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).
Преимущества предлагаемого штамма-продуцента заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного ИФН α-2b и загрязнения выделяемого белка наиболее активными протеазами Е.coli, а также в использовании богатых сред, что позволяет проводить ферментацию за 6 часов.
Клетки Е.coli BDEES4 являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез рекомбинантного ИФН α-2b, который накапливается в клетках в количестве более 20% суммарного белка бактерий.
На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность Ndel/BamHI-фрагмента плазмиды pES4-4; на фиг.2 - физическая карта плазмиды pES4-4.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pES4-4.
Нуклеотидную последовательность, соответствующую гену ИФН α-2b, получают химико-ферментативным синтезом. Для этого теоретически расчитанную последовательность ДНК разбивают на перекрывающиеся фрагменты размером 45-55 п.о. Химический синтез олигонуклеотидов, соответствующих этим фрагментам, выполняют твердофазным фосфоамидитным методом при помощи, например, ДНК-синтезатора ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов -5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Полученные олигонуклеотиды подвергают 5'-концевому фосфорилированию с использованием Т4 полинуклеотидкиназы (Fermentas, Литва). Для этого олигонуклеотиды в количестве 20 пмоль смешивают с ферментом в количестве 10 ед. в буферном растворе, содержащем 50 мМ Tris-HCl (pH 7.6 при 25°С), 10 мМ MgCl2, 5 мМ дитиотреита, 1 мМ спермидина, 0,1 мМ АТФ и 0,1 мМ ЭДТА. Реакцию ведут 30 минут, полинуклеотидкиназу инактивируют нагреванием до 65°С в течение 10 мин.
Фосфорилированные олигонуклеотиды смешивают в эквимолярном соотношении в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреита, прогревают до 65°С, медленно охлаждают до 37°С в течение часа и добавляют 10 ед. ак. Т4-ДНК-лигазы. Реакцию лигирования ДНК проводят 4 ч при 37°С, 0,1 мкл полученного раствора используют в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы Pfu и специфических праймеров:
5' CTTCCTTCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTTGGTAGCCGTCGT3' и
5' AGAAGAGGATCCAGAAGCTTATTATTCCTTGGAACGTAAAGATTCTTGCAAGT 3'.
Проводят 25 циклов амплификации (95°С, 20 с; 62°С, 40 с; 72°С, 60 с) для синтеза полноразмерного фрагмента ДНК, содержащего последовательность гена ИФН α-2b, фланкированного сайтами узнавания рестриктаз NdeI и BamHI. Продукт амплификации гидролизуют рестриктазами NdeI и BamHI, очищают электрофорезом в 5%-ном акриламидном геле, полосу ДНК величиной около 500 п.о. выделяют из геля методом электроэлюции и осаждают ДНК из раствора этанолом.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ-22b(+) (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой Ndel (10 ед. акт.), осаждают ДНК этанолом, растворяют в 40 мкл буфура для рестриктазы BamHI (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 5 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,02% Triton X-100, 0,1 мг/мл BSA) и обрабатывают рестриктазой BamHl (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Полученный фрагмент ДНК величиной 5,4 т.п.о. после электрофоретического разделения в 1%-ном агарозном геле выделяют из геля методом электроэлюции и осаждают ДНК из раствора этанолом.
1 мкг полученного векторного фрагмента лигируют с 2 пмоль Ndel/BamHI - фрагмента размером 500 п.о., содержащего синтетический ген рекомбинантного ИФН α-2b, в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреита) с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
1 мкл полученной лигазной смеси используют для электротрансформации компетентных клеток Е.coli BL21(DE3), которую проводят, например, при помощи аппарата для электротрансформации ВТХ 600 (ВТХ, США) при зазоре между пластинами электропорационной кюветы 1 мм и напряжении разряда 1.4 кВ. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой SOC, растят 1 ч на +37°С и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.
Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, проводят методом "ПЦР с клонов" с использованием специфических праймеров:
5' CTTCCTTCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTTGGTAGCCGTCGT 3' и
5' AGAAGAGGATCCAGAAGCTTATTATTCCTTGGAACGTAAAGATTCTTGCAAGT 3'.
Проводят 25 циклов амплификации (95°С, 20с; 62°С, 40с; 72°С, 60с), с последующим электрофоретическим анализом ПЦР продуктов в 1%-ном агарозном геле на наличие ПЦР-продукта длиной около 500 п.о. Отобранные клоны используют для подроста в жидкой среде и выделения плазмидной ДНК плазмиды, которую анализируют на наличие вставки с помощью эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI с последующим разделением продуктов гидролиза в 5%-ном полиакриламидном геле. Окончательное строение плазмид, содержащих Ndel/BamHI-фрагмет около 500 п.о., подтверждают определением нуклеотидной последовательности методом секвенирования по Сенгеру. По данным секвенирования отбирают ту плазмиду, нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательности Ndel/BamHI - фрагмента которой полностью идентичны первоначально запланированной (фиг.1). Проводят трансформацию клеток Е.coli BL21(DE3) выбранной плазмидой, как описано выше, петлей переносят 5-10 колоний в 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, отбирают аликвоту культуры для последующего анализа, прибавляют индуктор - изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают рост еще 2 ч. Равные аликвоты суспензии клеток, отобранных до внесения индуктора и после завершения роста центрифугируют, отделяют супернатант и анализируют осадок клеток электрофорезом в ПААГ, как описано ниже в примере 2. Появление отчетливо видимой полосы белка в районе 20 кДа в образце пробы, отобранной после индукции, свидетельствует о способности штамма синтезировать рекомбинантный ИФН α-2b при индукции IPTG и полностью подтверждает корректность сборки плазмиды.
Пример 2.
Получение штамма-продуцента Е.coli BDEES4 с рекомбинантным ИФН α-2b и определение его продуктивности.
Штамм-продуцент BDEES4 получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21(DE3) плазмидой pES4-4, как описано в примере 1.
Штамм продуцента Е.coli BDEES4 выращивают при 37°С в 100 мл YT бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А 550 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 4 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А 550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А 550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 с ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка. По данным сканирования содержание рекомбинантного ИФН α-2b составляет 20-30% от всех клеточных белков.
Claims (2)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pES4-4, кодирующая полипептид с последовательностью интерферона α-2b человека, имеющая молекулярную массу 3,64 МДа (5917 п.о.), состоящая из
NdeI/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды pET22b(+), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы и усилитель трансляции гена 10 фага Т7;
NdeI/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего последовательность искусственного гена рекомбинантного интерферона α-2b, приведенную на фиг.1, и содержащая
ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pES4-4 клеток E. coli к ампициллину, в качестве генетического маркера,
уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: XbaI - 38 п.о., HpaI - 1332 п.о., PstI - 4065 п.о., PvuI - 4190 п.о., XhoI - 5363 п.о.
2. Штамм Escherichia coli BDEES4, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pES4-4 - продуцент рекомбинантного интерферона α-2b человека.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003136863/13A RU2258081C1 (ru) | 2003-12-23 | 2003-12-23 | Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003136863/13A RU2258081C1 (ru) | 2003-12-23 | 2003-12-23 | Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003136863A RU2003136863A (ru) | 2005-06-27 |
| RU2258081C1 true RU2258081C1 (ru) | 2005-08-10 |
Family
ID=35836296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003136863/13A RU2258081C1 (ru) | 2003-12-23 | 2003-12-23 | Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2258081C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2326168C1 (ru) * | 2006-10-20 | 2008-06-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pIF TREN, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2118366C1 (ru) * | 1996-05-06 | 1998-08-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2 |
| RU2165455C1 (ru) * | 1999-11-23 | 2001-04-20 | Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSS5, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI SS5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b |
-
2003
- 2003-12-23 RU RU2003136863/13A patent/RU2258081C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2118366C1 (ru) * | 1996-05-06 | 1998-08-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2 |
| RU2165455C1 (ru) * | 1999-11-23 | 2001-04-20 | Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSS5, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI SS5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CESAR SANCHEZ J. et al., Elimination of an HuIFN alpha 2b readthrough species, produced in Escherichia coli, by replacing its natural translational stop signal, J. Biotechnol., 1998, v.63, n.3, p.179-186. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2326168C1 (ru) * | 2006-10-20 | 2008-06-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pIF TREN, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003136863A (ru) | 2005-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0272703A1 (en) | Novel polypeptide | |
| JPH0141312B2 (ru) | ||
| US6773899B2 (en) | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides | |
| AU2001284914A1 (en) | Phage-dependent Superproduction of Biologically Active Protein and Peptides | |
| EP0326046A2 (en) | Production of human epidermal growth factor | |
| JP3236284B2 (ja) | プラスミド、その製造方法及びこれをプラスミノ―ゲンアクチベーターの収得に使用する方法 | |
| KR100358948B1 (ko) | 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자를 분비하는 대장균 | |
| RU2258081C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека | |
| US6617130B1 (en) | DNA construct for regulating the expression of a polypeptide coding sequence in a transformed bacterial host cell | |
| JPH05320200A (ja) | 新規ヒトインターフェロン−γポリペプチド | |
| RU2260049C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pes3-7, кодирующая полипептид с последовательностью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, и штамм escherichia coli bl21(de3)/pes3-7 - продуцент рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека | |
| RU2233879C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина | |
| RU2261913C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pES6-1, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ИНТЕРФЕРОН БЕТА-1b ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli BDEES6 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА БЕТА-1b ЧЕЛОВЕКА | |
| KR100890184B1 (ko) | ＳｌｙＤ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| RU2054041C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PIF16, КОДИРУЮЩАЯ ЗРЕЛЫЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН α2 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЗРЕЛОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА α2 ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2097428C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рттg кm2, кодирующая синтез рекомбинантного иммунного интерферона человека, штамм escherichia coli t3g - продуцент рекомбинантного иммунного интерферона человека и способ получения рекомбинантного иммунного интерферона человека | |
| RU2610173C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pFM-IFN-17, обеспечивающая экспрессию интерферона альфа-2b человека, рекомбинантная плазмида pFM-АР, обеспечивающая экспрессию фермента метионинаминопептидазы E. coli, биплазмидный штамм Escherichia coli FM-IFN-АР (pFM-IFN-17, pFM-АР) - продуцент (Met-) рекомбинантного интерферона альфа-2b человека | |
| CN116478969A (zh) | 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用 | |
| RU2113483C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pggf 8, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека | |
| KR100890187B1 (ko) | Ｔｓｆ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| RU2426787C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET32M/mTrx-rhIL-11, КОДИРУЮЩАЯ ИНТЕРЛЕЙКИН -11 ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET32M/mTrx-rhIL-11 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-11 | |
| KR100890183B1 (ko) | 말산탈수소효소를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의제조방법 | |
| RU2435858C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Hir, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА, ШТАММ Escherichia coli ER2566/pER-Hir-ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА | |
| SU1703693A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека | |
| JP3696322B2 (ja) | 新規ｈｓ遺伝子及び該遺伝子を異種遺伝子産物をコードする構造遺伝子の下流に連結した発現プラスミド並びに該発現プラスミドを保有する形質転換体を用いた異種遺伝子産物の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151224 |