RU2251570C2 - Питательная среда для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза путем выделения Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis из клинического и другого материала. Питательная среда (И-агар) содержит, г/л: пептон - 19,0-21,0, дрожжевой экстракт - 1,9-2,1, маннит - 19,0-21,0, натрия пируват - 1,9-2,1, натрия хлорид - 0,95-1,05, магния сульфат - 0,009-0,011, натрия дезоксихолат - 0,48-0,53, нейтральный красный - 0,028-0,032, кристаллический фиолетовый - 0,009-0,0011, агар-агар - 11,9-13,1, иргасан - 0,0039-0,0041, дистиллированная вода - остальное. При более простом составе по сравнению с ближайшим аналогом И-агар имеет улучшенные селективные характеристики в отношении Y. pseudotuberculosis без существенного изменения других свойств среды. 3 табл.

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза путем выделения Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis из клинического материала и объектов внешней среды.

Известно использование для выделения из клинического и неклинического материала возбудителей кишечного иерсиниоза (патогенных бактерий вида Yersinia enterocolitica) среды Yersinia Selective Medium - CIN-агара [1]. Недостатками указанной среды являются подавление на этой среде роста близкородственных бактерий, вызывающих псевдотуберкулез - Yersinia pseudotuberculosis, а также сложность приготовления и недоступность для многих практических лабораторий некоторых ингредиентов среды [2].

Целью настоящего изобретения является упрощение состава питательной среды и улучшение ее селективных свойств в отношении Yersinia pseudotuberculosis

Поставленная цель достигается, что для приготовления питательной среды (И-агара) используют пептон, дрожжевой экстракт, маннит, пируват натрия, хлорид натрия, сульфат магния, дезоксихолат натрия, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый, агар-агар, иргасан (триклозан) и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:

Пептон 19,0-21,0

Дрожжевой экстракт 1,9-2,1

Маннит 19,0-21,0

Натрия пируват 1,9-2,1

Натрия хлорид 0,95-1,05

Магния сульфат 0,009-0,011

Натрия дезоксихолат 0,48-0,53

Нейтральный красный 0,028-0,032

Кристаллический фиолетовый 0,009-0,0011

Агар-агар 11,9-13,1

Иргасан 0,0039-0,0041

Дистиллированная вода остальное

Все компоненты среды, за исключением иргасана, растворяют в дистиллированной воде и доводят значение рН до 7,4±0,2. Среду стерилизуют в автоклаве при температуре 120-122°С в течение 14-16 минут. Иргасан растворяют в асептических условиях при помешивании в 1,5-2,5 мл стерильной дистиллированной воды при температуре 45-50°С. После стерилизации в остывшую до 45-50°С основу вносят раствор иргасана и тщательно перемешивают. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают.

Посев материала на поверхность среды производят общепринятыми методами. Учет производят после 24-48 часов инкубации при температуре 32°С. Культуры патогенных иерсиний вырастают в виде типичных выпуклых мелких прозрачных колоний розового цвета с четко очерченным малиновым “глазком” в центре (“бычий глаз”). Колонии имеют гладкую блестящую поверхность, ровные края и маслянистую консистенцию.

Для сравнения с CIN-агаром в серии экспериментов у И-агара определяли чувствительность, время появления роста бактерий, селективные свойства, а также морфолого-физиологические признаки выделенных на этой среде иерсиний.

Для определения чувствительности сред производили смыв ночных культур иерсиний со скошенного питательного агара и стандартизировали полученную суспензию до 10 единиц по ОСО 42-28-59-85 и готовили ее десятикратные разведения. По 0,1 мл взвеси каждого штамма в различных разведениях вносили в чашки Петри с испытуемыми средами. Чувствительность среды определяли по наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний или визуально видимый рост на всех засеянных чашках. По отношению к Y.enterocolitica чувствительность И-агара и CIN агара составила 10^-8, по отношению к Y.pseudotuberculosis чувствительность И-агара составила 10^-7, а рост Y.pseudotuberculosis на CIN агаре был подавлен во всех разведениях.

Время появления (скорость) роста в часах определяли по минимальному периоду инкубации посевов, необходимому для формирования типичных колоний на среде в чашках. Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1
Время появления роста типичных колоний, ч
Тест-штиммы	Питательные среды
	Ближайший аналог	Предложенная среда
Y.enterocolitica серовара O3	23,1	22,7
Y.enterocolitica серовара O9	23,4	22,9
Y.pseudotuberculosis	Рост отсутствует	24,5

Селективные свойства сред оценивали путем посева 0,1 мл микробной взвеси ночных агаровых культур, содержащей 300 колониеобразующих единиц иерсиний в чистой культуре и в смесях с культурами бактерий-ассоциантов при соотношении 1:1, на чашки с испытуемыми и контрольной средами. В качестве ассоциантов использовали культуры Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, K.pneumoniae, K.oxytoca, P.stuartii и P.rettgeri, а в качестве контрольной среды - триптон-соевый агар в общепринятой прописи. Показатель ингибиции (ПИ) рассчитывали по формуле:

Результаты приведены в табл.2. В отличие от CIN-агара на предложенной среде помимо типичных колоний Y.enterocolitica вырастают типичные колонии Y.pseudotuberculosis без каких-либо признаков подавления роста. Вместе с тем ингибирующее действие И-агара по отношению к серрациям и псевдомонадам слабее, чем у CIN-агара. Однако этот недостаток полностью компенсируется четкими различиями в морфологии колоний указанных микроорганизмов и иерсиний. Дифференцирующие свойства И-агара позволили уверенно отличить колонии иерсиний от колоний ассоциантов в 90% случаев посева смешанных культур.

Таблица 2

Показатели ингибиции сред через 48 ч инкубирования при 32°С
Тест-штаммы	Питательные среды
	Ближайший аналог	Предложенная среда
Y.enterocolitica серовара O3	0,98	1,00
Y.enterocolitica серовара O9	0,94	0,97
Y.pseudotuberculosis	0	0,94
S.marcescens	0,06	0,85
S.liquefaciens	0,29	0,89
P.aeruginosa	0	0,95
S.typhimurium	0	0
P.mirabilis	0	0
P.vulgaris	0	0
E.cloacae	0	0
E.faecalis	0	0
E.coli	0	0
K.pneumoniae	0	0
K.oxytoca	0	0
P.stuartii	0	0
P.rettgeri	0	0
S.aureus	0	0

В табл.3 представлены размеры колоний иерсиний, выращенных на испытуемых средах при 32°С. При расчете не было обнаружено статистически достоверных различий между диаметром колоний иерсиний на предложенной среде и CIN-агаре (при уровне вероятности 95%).

Таблица 3

Средний диаметр колоний иерсиний (мм)
Тест-штаммы	Время инкубации	Питательные среды
		Ближайший аналог	Предложенная среда
Y.enterocolitica серовара O3	24 ч	0,82±0,05	0,82±0,05
	48 ч	1,17±0,07	1,2±0,08
Y.enterocolitica серовара O9	24 ч	0,8±0,07	0,77±0,06
	48 ч	1,1±0,11	1,18±0,1
Y.pseudotuberculosis	24 ч	Рост отсутствует	0,58±0,05
	48 ч	Рост отсутствует	0,99±0,06

Морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические и антигенные свойства иерсиний, выросших на И-агаре, соответствовали таковым после культивирования на среде сравнения - CIN-агаре.

Пример 1.

В материал с миндалин здоровых свиней, помещенный в забуференную пептонную воду (рН 7,6), вносили следующие культуры: Y.enterocolitica серовара О3 (100 КОЕ/мл); S.typhimurium, S.marcescens, P.vulgaris, P.aeruginosa, E.cloacae, E.faecalis, E.coli и S.aureus (no 1000 КОЕ/мл). Посевы инкубировали при 4-6°С в течение 7 сут. Высевы на предлагаемую среду и CIN-агар производили сразу после внесения культур, а также на 3-е, 5-е и 7-е сутки. Засеянные селективные среды для иерсиний инкубировали при 32°С в течение 48 часов с последующей реидентификацией выделенных культур по физиолого-биохимическим и антигенным свойствам. В 10 высевах из 12 (83,3%) иерсиний выделены как на CIN-агаре, так и на предложенной среде.

Таким образом, при более простом составе по сравнению с ближайшим аналогом И-агар имеет улучшенные селективные характеристики в отношении Y. pseudotuberculosis без существенного изменения других свойств среды.

Источники информации

1. Schiemann D.A. Synthesis of a selective agar medium for Yersinia enterocolitica. Can. J. Microbiol, 1979, Vol.25, P.1298-1304 (прототип).

2. Schiemann D.A. Yersinia enterocolitica: observations on some grown characteristics and response to selective agents. Can. J. Microbiol, 1980, Vol.26, P.1232-1240.

3. Л.В.Саяпина. Диагностическая ценность новой питательной среды для выделения и культивирования возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2000, №6, с.15-18.

4. P.R. Murray, E. Jo Baron, M.A. Pfaller et al. Manual of clinical microbiology, Washington, D.C, 1999, p.483-496.

Claims (1)

1. Питательная среда для выделения Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, маннит, натрия пируват, натрия хлорид, магния сульфат, натрия дезоксихолат, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый, агар-агар, иргасан и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:

   Пептон 19,0-21,0

   Дрожжевой экстракт 1,9-2,1

   Маннит 19,0-21,0

   Натрия пируват 1,9-2,1

   Натрия хлорид 0,96-1,05

   Магния сульфат 0,009-0,011

   Натрия дезоксихолат 0,48-0,53

   Нейтральный красный 0,028-0,032

   Кристаллический фиолетовый 0,009-0,0011

   Агар-агар 11,9-13,1

   Иргасан 0,0039-0,0041

   Дистиллированная вода Остальное