RU2239657C2 - Способ очистки пектолитического ферментного препарата - Google Patents
Способ очистки пектолитического ферментного препарата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2239657C2 RU2239657C2 RU2002128157/13A RU2002128157A RU2239657C2 RU 2239657 C2 RU2239657 C2 RU 2239657C2 RU 2002128157/13 A RU2002128157/13 A RU 2002128157/13A RU 2002128157 A RU2002128157 A RU 2002128157A RU 2239657 C2 RU2239657 C2 RU 2239657C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme preparation
- enzymes
- solution
- carried out
- exchange resin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, гидролизной промышленности и виноделия и предназначено для получения очищенного пектолитического ферментного препарата. Способ включает концентрирование культуральной жидкости или неочищенного ферментного препарата из Aspergillus foetidus, стабилизацию, проводимую добавлением многоатомного спирта, комплексообразователя и любого неактивного белка с молекулярной массой выше 15 кДа. Ультрафильтрацию проводят при 35-40°С и при постоянном добавлении ацетатного буферного раствора, содержащего многоатомный спирт и комплексообразователь. Ферменты выделяют сильнокислотной катионообменной смолой с последующей их десорбцией, обессоливанием диафильтрацией и лиофильно сушат. Способ позволяет получить пектолитический ферментный препарат с более высокой степенью очистки и с высоким выходом по активности, а также увеличить удельную активность ферментов более чем в 20 раз. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, гидролизной промышленности и виноделия и предназначено для получения с высоким выходом пектолитического ферментного препарата из Aspergillus foetidus, пригодного для исследования структуры растительных пектинов методом ферментативного гидролиза, для переработки и утилизации растительного сырья с целью получения олиго- и моносахаридов, для удаления винного камня и осветления лучших сортов вин.
Известен способ очистки полигалактуроназы (прототип), включающий осветление культуральной жидкости центрифугированием, ее концентрирование в 5 раз при 5°С с помощью ультрафильтрации на половолоконном модуле с пределом пропускания 13 кДа с последующей очисткой и выделением методами ионообменной и гель-проникающей хроматографии с получением препарата в 20%-ном растворе глицерина [Kobayashi Т. et al. Purification and properties of a galacturonic asid-releasing exopoligalacturonase from a strain of Bacillus.//Biosci., Biotechnol., Biochem., 65 (4), 842-847 (2001)].
Недостатками способа являются низкие степень очистки (1,2 раза) и выход ферментов по активности (52%), а также низкая удельная полигалактуроназная активность ферментного препарата (0,25 ед/мг белка) после стадии ультрафильтрации.
Это связано с тем, что ферменты присутствуют в культуральной жидкости в основном в виде малоактивных гликопротеиновых комплексов с углеводами и пектиновыми веществами, которые в условиях способа-прототипа не разрушаются в процессе ультрафильтрации.
Технический результат изобретения заключается в получении пектолитического ферментного препарата, содержащего смесь эндо- и экзополигалактуроназ при более высокой степени очистки и выходе ферментов по активности, а также в увеличении удельной полигалактуроназной активности ферментов.
Технический результат достигается тем, что культуральную жидкость или раствор неочищенного ферментного препарата из Aspergillus foetidus предварительно осветляют, например, с помощью коагуляции хлоридом кальция в среде фосфатного буфера при рН 6,0-7,0 и удаляют взвешенные частицы микрофильтрацией, активируют ферменты, извлекая ионы металлов путем катионообменной очистки, и после концентрирования раствора в 5-10 раз в концентрат добавляют стабилизаторы и проводят ультрафильтрацию при температуре 35-40°С при непрерывном добавлении в концентрат ацетатного буферного раствора с рН 4,0 со стабилизаторами. Ферменты выделяют из очищенного раствора путем сорбции сильнокислотной катионообменной смолой с последующей десорбцией фосфатным буфером, обессоливанием и лиофильной сушкой концентрата.
Способ осуществляют следующим образом.
Культуральную жидкость или раствор технического пектолитического ферментного препарата из Aspergillus foetidus осветляют, например, с помощью коагуляции хлоридом кальция в среде фосфатного буфера при рН 6,0-7,0 и удаляют взвешенные частицы микрофильтрацией, активируют ферменты, извлекая ионы металлов сильнокислотной катионообменной смолой, например КУ-2 или Амберлит CG-120, при рН 6,0-7,0 и дозировке 100 г/дм3 и концентрируют в 5-10 раз, например, с помощью ультрафильтрации. Концентрат стабилизируют добавлением 200 г/дм3 многоатомного спирта, в частности глицерина или низкомолекулярного гликоля, добавкой 10 ммоль/дм3 комплексообразователя, например Трилона Б или диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА), а также 10 г/дм3 любого неактивного белка с молекулярной массой выше 15 кДа, например бычьего сывороточного альбумина, после чего устанавливают температуру раствора 35-40°С и проводят его ультрафильтрацию при постоянном добавлении в концентрат ацетатного буферного раствора с рН 4,0 и температурой 35-40°С, содержащего 100 г/дм3 многоатомного спирта и 1 ммоль/дм3 комплексообразователя. Ферменты выделяют из раствора сильнокислотной катионообменной смолой, например КУ-2 или Амберлит CG-120, с размерами зерен 100-250 мкм при комнатной температуре, рН 4,0-5,0 и дозировке 400 г/дм3. Десорбцию ферментов осуществляют путем промывки смолы фосфатным буфером с рН 6,0-7,0. Очищенный ферментный раствор обессоливают путем диафильтрации и лиофильно высушивают.
Разрушение гликопротеиновых комплексов полигалактуроназ с углеводами в процессе ультрафильтрации при нагревании и при выделении ферментов сильнокислотной катионообменной смолой приводит к увеличению подвижности молекул ферментов и, следовательно, их удельной активности. Это позволяет получить выход ферментов по активности более 100% от исходного значения.
Пример 1. Культуральную жидкость от продуцента Aspergillus foetidus или раствор технического пектолитического ферментного препарата Пектофоетидин Г3х объемом 4 дм3 с концентрацией 10 г/дм3 подвергают концентрированию при температуре 4-6°С с помощью ультрафильтрации на половолоконном модуле с пределом пропускания 15 кДа до объема 0,4 дм3. Концентрат стабилизируют добавлением 200 г/дм3 глицерина, 10 ммоль/дм3 Трилона Б и 10 г/дм3 бычьего сывороточного альбумина, после чего устанавливают рН 4,0 и температуру раствора 35-40°С и проводят его ультрафильтрацию в течение 90 минут при постоянном добавлении 0,01-0,10 М ацетатного буферного раствора с рН 4,0 и температурой 35-40°С, содержащего 100 г/дм3 глицерина и 1 ммоль/дм3 Трилона Б. Ферменты выделяют из раствора сильнокислотной катионообменной смолой КУ-2 с размерами зерен 100-250 мкм при комнатной температуре, рН 4,0-5,0 и дозировке смолы 400 г/дм3. Десорбцию ферментов осуществляют путем промывки смолы 1 дм3 0,25 М фосфатного буфера с рН 6,0-7,0. Ферментный раствор обессоливают путем диафильтрации и лиофильно высушивают. Результаты приведены в таблице.
Пример 2. Обработку проводят аналогично п.1, но в качестве источника неактивного белка используют белковую фракцию из раствора после выделения ферментов катионообменной смолой, содержащую неадсорбировавшиеся белки. Результаты приведены в таблице.
Пример 3. Обработку проводят аналогично п.1, но ферментный раствор перед концентрированием осветляют путем коагуляции, добавляя 20-40 см3 1 М раствора хлорида кальция и 20-40 см3 1 М фосфатного буфера с рН 6,0-7,0, после чего раствор отстаивают 30 минут, декантируют с осадка и удаляют взвешенные частицы микрофильтрацией. Результаты приведены в таблице.
Пример 4. Обработку проводят аналогично п.3, но после осветления ферментный раствор активируют обработкой сильнокислотной катионообменной смолой КУ-2 (100-250 мкм) при комнатной температуре, рН 6,0-7,0 и дозировке 100 г/дм3. Результаты приведены в таблице.
Пример 5 (по прототипу). Культуральную жидкость от продуцента Aspergillus foetidus или раствор технического пектолитического ферментного препарата Пектофоетидин Г3х объемом 4 дм3 с концентрацией 10 г/дм3 осветляют с помощью центрифугирования и концентрируют его при температуре 4-6°С с помощью ультрафильтрации на половолоконном модуле с пределом пропускания 15 кДа до объема 0,4 дм3. Ферменты выделяют из раствора сильнокислотной катионообменной смолой КУ-2 с размерами зерен 100-250 мкм при комнатной температуре, рН 4,0-5,0 и дозировке смолы 400 г/дм3. Десорбцию ферментов осуществляют промывкой смолы 1 дм3 0,25 М фосфатного буфера с рН 6,0-7,0. Раствор после десорбции обессоливают путем диафильтрации и лиофильно высушивают. Результаты приведены в таблице.
Таким образом, разрушение гликопротеиновых комплексов ферментов с углеводами в процессе ультрафильтрации при нагревании и при выделении ферментов сильнокислотной катионообменной смолой позволяет получить пектолитический ферментный препарат с более высокой степенью очистки и с выходом по активности выше 100%, а также увеличить удельную активность ферментов более чем в 20 раз.
Claims (5)
1. Способ очистки пектолитического ферментного препарата, включающий концентрирование ультрафильтрацией при 4-6°С культуральной жидкости или неочищенного ферментного препарата, стабилизацию, выделение ферментов, отличающийся тем, что концентрированию подвергают культуральную жидкость или неочищенный ферментный препарат из Aspergillus foetidus, стабилизацию ведут добавлением 200 г/дм3 многоатомного спирта, 10 ммоль/дм3 комплексообразователя и 10 г/дм3 любого неактивного белка с молекулярной массой выше 15 кДа с последующей ультрафильтрацией при 35-40°С и при постоянном добавлении ацетатного буферного раствора с рН 4,0, содержащего 100 г/дм3 многоатомного спирта и 1 ммоль/дм3 комплексообразователя, ферменты выделяют сильнокислотной катионообменной смолой при рН 4,0-5,0 и концентрации смолы 400 г/дм3 с последующей их десорбцией фосфатным буфером с рН 6,0-7,0, обессоливают диафильтрацией и лиофильно сушат.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед концентрированием дополнительно проводят осветление с помощью коагуляции путем добавления раствора хлорида кальция и фосфатного буфера с рН 6,0-7,0, а взвешенные частицы удаляют микрофильтрацией.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что после осветления раствор активируют обработкой сильнокислотной катионообменной смолой при комнатной температуре, рН 6,0-7,0 и концентрации смолы 100 г/дм3.
4. Способ п.1 или 3, отличающийся тем, что используют сильнокислотную катионообменную смолу КУ-2 с размерами зерен 100-250 мкм.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что в качестве неактивного белка используют белковую фракцию из раствора после выделения ферментов.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002128157/13A RU2239657C2 (ru) | 2002-10-21 | 2002-10-21 | Способ очистки пектолитического ферментного препарата |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002128157/13A RU2239657C2 (ru) | 2002-10-21 | 2002-10-21 | Способ очистки пектолитического ферментного препарата |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002128157A RU2002128157A (ru) | 2004-07-27 |
RU2239657C2 true RU2239657C2 (ru) | 2004-11-10 |
Family
ID=34310019
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002128157/13A RU2239657C2 (ru) | 2002-10-21 | 2002-10-21 | Способ очистки пектолитического ферментного препарата |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2239657C2 (ru) |
-
2002
- 2002-10-21 RU RU2002128157/13A patent/RU2239657C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KOBAYASHI Т. et al. Purification and properties of a galacturonic asid-releasing expolygalacturonase from a strain of Bacillus. Biosci., Biotechnol., Biochem., 65(4), p.842-847, 2001. * |
КАЛУНЯНЦ К.А. и др. Микробные ферментные препараты. Технология и оборудование. - М.: Пищевая промышленность, 1979, с.10-12. ГРАЧЕВА И.М. и др. Технология ферментных препаратов. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Элевар, 2000, с.236. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0695350B1 (en) | Process for purifying collagenase | |
JPS63105693A (ja) | 細胞から親油性タン白の抽出方法 | |
RU2239657C2 (ru) | Способ очистки пектолитического ферментного препарата | |
CN1336434A (zh) | 胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法 | |
US5061627A (en) | Method for preparing enzymes from crustaceans | |
EP0242301B1 (fr) | Procédé de purification d'antigènes protéiques de bactéries appartenant au genre Bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire | |
CN109134622B (zh) | 口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法 | |
JP2006515568A (ja) | 複合媒体から組み換えタンパク質を精製する方法およびそれにより得られる精製タンパク質 | |
US7002007B2 (en) | Production of high molecular weight hyaluronates | |
US4136168A (en) | Process for the preparation of neuraminidase from viral sources and methods of utilizing same | |
RU2027759C1 (ru) | Способ получения гиалуронидазы | |
JP3331870B2 (ja) | 水溶性多糖類の製造法 | |
RU2584601C1 (ru) | Способ выделения протеолитического фермента террилитина | |
RU2510398C2 (ru) | Способ выделения низкомолекулярных пептидов | |
JPS6160050B2 (ru) | ||
JP2010053259A (ja) | ヒアルロン酸及び/又はその塩の精製法 | |
EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
JP2005245394A (ja) | 魚類白子からの二本鎖dnaの抽出・精製方法 | |
RU2745443C1 (ru) | Способ получения средства, обладающего антигипоксической, регенеративной активностью | |
RU2225441C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
JPH05310799A (ja) | ムチンの精製方法 | |
JPS63132898A (ja) | 蛋白質の分離精製方法 | |
US2937120A (en) | Process for obtaining intrinsic factor | |
JP2009039656A (ja) | 水酸化アルミニウム吸着体の吸着性及び/又は溶出性の改変方法 | |
RU2066995C1 (ru) | Способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081022 |