RU2202799C2 - Способ обнаружения антигенов бруцелл - Google Patents
Способ обнаружения антигенов бруцелл Download PDFInfo
- Publication number
- RU2202799C2 RU2202799C2 RU2000117885A RU2000117885A RU2202799C2 RU 2202799 C2 RU2202799 C2 RU 2202799C2 RU 2000117885 A RU2000117885 A RU 2000117885A RU 2000117885 A RU2000117885 A RU 2000117885A RU 2202799 C2 RU2202799 C2 RU 2202799C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substrate
- solution
- minutes
- washing
- antigens
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ осуществляется путем адсорбции на твердую подложку исследуемого образца. Свободные сайты связывания на подложке инактивируют и далее подложку обрабатывают противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром. Далее подложку обрабатывают реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду. Способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность полученных результатов. Способ характеризуется демонстративностью, экспрессностью, доступностью и простотой исполнения.
Description
Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования различного материала на наличие возбудителя бруцеллеза и его антигенов.
Несмотря на то, что в практике здравоохранения используется ряд методов обнаружения антигенов бруцелл, все они не лишены тех или иных недостатков, поэтому усовершенствование существующих и разработка новых современных методов диагностики бруцеллеза остается актуальной задачей.
В последнее время в практических лабораториях довольно часто используется иммуноферментный метод как для обнаружения различных инфекционных агентов, так и для выявления специфических антител, предполагающий использование в качестве твердой фазы полистироловых микротитровальных планшетов (Меринов С.П., Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Захлебная О.Д., Лаукнер И. В. , Грачева Н.Ж., Широков В.А., Коха А.М. Методические рекомендации по обнаружению возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом. - Иркутск, 1984, - 7 с.). Этот метод обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, однако имеет ряд существенных недостатков. К их числу относятся использование канцерогенных субстратов, нестабильность фермента, фоновое окрашивание в лунках при исследовании биологических субстратов, содержащих эндогенную пероксидазу, что обусловливает необходимость использования приборов - ридеров для учета результатов реакции.
Наиболее близким к предлагаемому является способ обнаружения антигенов бруцелл с помощью противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным золотом (Загоскина Т. Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Журн. микробиол. - 1998. - 6. - С. 64-68). Однако данный способ имеет следующие недостатки: предполагает использование дорогостоящих (импортных) реактивов и оборудования (ультрацентрифуги).
Цель изобретения - удешевление и повышение доступности способа обнаружения антигенов бруцелл.
Поставленная цель достигается тем, что для проведения анализа используют твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, на которую адсорбируют исследуемый образец, не связавшийся материал дважды отмывают 0,02 М фосфатным буфером (ФБ) рН 7,2 с 0,15 М NaCl и 0,05% твина 20 (отмывающий р-р), свободные сайты связывания на подложке инактивируют в течение часа 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБ, далее подложку обрабатывают в течение 50-60 мин противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром, твердую фазу дважды (до и после обработки меченными антителами) промывают отмывающим р-ром и один раз - дистиллированной водой. Конечную обработку подложки осуществляют в течение 10 минут реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду при следующем соотношении компонентов, г: метол - 0,2; лимонная кислота - 0,5; азотнокислое серебро - 0,2; дистиллированная вода - 100. Затем ее промывают и высушивают на воздухе.
Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что используют твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, удаление не связавшегося с ней материала проводят отмывающим р-ром, свободные участки связывания на подложке инактивируют 2%-ным раствором БСА на ФБ в течение часа. Далее подложку обрабатывают в течение 50-60 мин противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром, промывание подложки до и после обработки меченными антителами проводят дважды отмывающим р-ром и один раз - дистиллированной водой, а конечную обработку осуществляют в течение 10 минут реактивом, содержащим метол, лимонную кислоту, азотнокислое серебро и воду при следующем соотношении компонентов, г: метол - 0,2; лимонная кислота - 0,5; азотнокислое серебро - 0,2; дистиллированная вода - 100. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна".
Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ обнаружения антигенов бруцелл, который осуществлялся бы на твердых пористых подложках с применением в качестве диагностикума противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром. Предлагаемые режимы проведения анализа позволяют достичь поставленной цели - удешевить и повысить доступность способа обнаружения антигенов бруцелл. При этом он экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность получаемых результатов. Данный способ обнаружения антигенов бруцелл может быть использован в клинических, ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся диагностикой бруцеллеза.
Таким образом, предлагаемый способ обнаружения антигенов бруцелл соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".
Предлагаемый способ обнаружения антигенов бруцелл выполняется следующим образом: исследуемый материал, предположительно содержащий антигены бруцелл, наносят в виде капель на полоску твердой пористой подложки с размером пор 0,17-0,45 мкм (нитроцеллюлозные мембраны, фильтры "Synpor", Чехия). После полного впитывания материала (высыхание при комнатной температуре в течение 20 мин) подложку помещают в чашку Петри и дважды промывают отмывающим р-ром для удаления несвязавшегося материала. Свободные участки иммунологически активной твердой фазы "забивают" в течение 1 часа инертным белком - 2%-ным раствором БСА на ФБ, после чего дважды промывают отмывающим р-ром. Иммунное проявление адсорбированного на подложке антигена осуществляют обработкой раствором противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром, в течение 50-60 мин при легком встряхивании. После двукратного отмывания отмывающим р-ром и однократного - дистиллированной водой подложку погружают на 10 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимых или корпускулярных антигенов бруцелл) и в случае содержания в исследуемых образцах антигенов возбудителей бруцеллеза формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость, суспензии здоровых животных, не инфицированные объекты окружающей среды и т. п. ) и при отсутствии антигенов бруцелл в образцах формирования окрашенных пятен не наблюдается, подложка остается чистой. После выдерживания твердофазного носителя в реактиве с метолом, лимонной кислотой и азотнокислым серебром допускается появление небольшого фонового окрашивания его поверхности в бледно-серый цвет, которое при последующем высушивании полностью исчезает.
Пример 1. Смыв с шерсти животного, содержащий корпускулярные антигены бруцелл, наносят в виде капель на полоску нитроцеллюлозной мембраны с размером пор 0,45 мкм. После полного впитывания материала (высыхание образца при комнатной температуре в течение 20 мин) мембрану помещают в чашку Петри и дважды промывают отмывающим р-ром. Свободные активные участки мембраны "забивают" в течение 1 часа 2%-ным раствором БСА на ФБ, после чего дважды промывают отмывающим р-ром. Иммунное проявление адсорбированного на мембране антигена осуществляют обработкой раствором противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром, в течение 50 мин при легком встряхивании. После тщательного двукратного промывания отмывающим р-ром и однократного дистиллированной водой мембрану погружают на 10 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем ее промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В исследуемом образце (смыве с шерсти животного) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация корпускулярных антигенов бруцелл) формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательных контролях (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдается, мембрана остается чистой. После выдерживания мембраны в проявляющем реактиве допускается появление небольшого фонового окрашивания ее поверхности в бледно-серый цвет, которое при последующем высушивании мембраны полностью исчезает. Чувствительность анализа составляет ≥6,1•104м.к./мл корпускулярных антигенов бруцелл.
Пример 2. Исследуемый раствор, содержащий липополисахарид бруцелл, наносят в виде капли на полоску фильтра фирмы "Synpor" (Чехия) с размером пор 0,17 мкм. После полного впитывания материала (высыхание образца при комнатной температуре в течение 20 мин) фильтр помещают в чашку Петри и дважды промывают отмывающим р-ром. Свободные активные участки фильтра "забивают" в течение 1 часа 2%-ным раствором БСА на ФБ, после чего дважды промывают отмывающим р-ром. Иммунное проявление адсорбированного на фильтре антигена осуществляют обработкой раствором противобруцеллезных IgG, меченных коллоидным серебром в течение 60 мин при легком встряхивании. После тщательного двукратного промывания отмывающим р-ром и однократного - дистиллированной водой фильтр погружают на 10 мин в реактив, состоящий из 0,2% метола, 0,5% лимонной кислоты и 0,2% азотнокислого серебра, растворенных в дистиллированной воде. Затем его промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводят визуально. В исследуемом растворе, содержащем липополисахарид бруцелл, и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо известная концентрация растворимого антигена бруцелл) формируются четкие стойко окрашенные в темно-серый цвет пятна. В отрицательном контроле (разводящая жидкость) формирования окрашенных пятен не наблюдается, фильтр остается чистым. После выдерживания в проявляющем реактиве допускается появление небольшого фонового окрашивания поверхности фильтра в бледно-серый цвет, которое при последующем его высушивании полностью исчезает. Чувствительность анализа составляет ≥9 нг/мл растворимых антигенов бруцелл.
Указанный способ обнаружения антигенов бруцелл использован при анализе 250 проб (штаммы бруцелл всех известных видов, имеющихся в лаборатории, искусственно контаминированные объекты внешней среды, растворимые антигенные фракции, изолированные из бруцелл, материал от больных людей и экспериментальных животных).
Исследование материала, содержащего антигены бруцелл, параллельно проводили в дот-иммуноанализе с IgG, меченными коллоидным золотом. Отмечено совпадение результатов по чувствительности и специфичности. Однако предлагаемый способ обнаружения антигенов бруцелл дешевле, доступнее, не требует использования дорогостоящих реактивов.
Claims (1)
- Способ обнаружения антигенов бруцелл, включающий фиксацию исследуемого материала на твердой пористой подложке в течение 20 мин, двукратное ее промывание 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20, инактивацию свободных участков связывания на подложке раствором бычьего сывороточного альбумина, двукратное ее промывание 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20, обработку подложки специфическим IgG, меченным коллоидным металлом, конечную обработку подложки раствором, содержащим соль серебра, и последующее промывание подложки в воде, отличающийся тем, что используют подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, свободные участки связывания на ней инактивируют 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 60 мин, обработку подложки осуществляют противобруцеллезными IgG, меченными коллоидным серебром, затем подложку дважды промывают 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,2) с 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20 и дополнительно дистиллированной водой, а в качестве реактива для конечной ее обработки используют раствор, содержащий метол, лимонную кислоту и азотнокислое серебро при следующем соотношении компонентов, г:
Метол - 0,2
Лимонная кислота - 0,5
Азотнокислое серебро - 0,2
Дистиллированная вода - 100
при этом подложку инкубируют в растворе в течение 10 мин, после чего ее промывают проточной водой и высушивают.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000117885A RU2202799C2 (ru) | 2000-07-05 | 2000-07-05 | Способ обнаружения антигенов бруцелл |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000117885A RU2202799C2 (ru) | 2000-07-05 | 2000-07-05 | Способ обнаружения антигенов бруцелл |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2000117885A RU2000117885A (ru) | 2002-09-10 |
RU2202799C2 true RU2202799C2 (ru) | 2003-04-20 |
Family
ID=20237427
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000117885A RU2202799C2 (ru) | 2000-07-05 | 2000-07-05 | Способ обнаружения антигенов бруцелл |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2202799C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2517120C1 (ru) * | 2012-09-05 | 2014-05-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ детекции ботулинических токсинов |
-
2000
- 2000-07-05 RU RU2000117885A patent/RU2202799C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЗАГОСКИНА Т.Ю., МАРКОВ Е.Ю., КАЛИНОВСКИЙ А.И., ГОЛУБИНСКИЙ Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа. Микробиология. - 1998, № 6, с. 64-68. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2517120C1 (ru) * | 2012-09-05 | 2014-05-27 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ детекции ботулинических токсинов |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1767941B1 (en) | Chromatographic detection apparatus | |
US5200312A (en) | Membrane based dot immunoassay and method of use | |
JP4056875B2 (ja) | 迅速に行えるマイクロウエーブ媒介固相酵素免疫検定方法 | |
AU2001218830A1 (en) | A rapid method for microwave mediated enzyme-linked immunosorbent assay | |
TW494238B (en) | Chromatographic test pieces and chromatographic assay | |
KR20170140252A (ko) | 미생물 항원의 회수법 | |
JPH02156157A (ja) | 正荷電イオン性バインディング支持体を使用するクラミジア抗原または淋菌抗原の測定 | |
RU2202799C2 (ru) | Способ обнаружения антигенов бруцелл | |
EP0868665A1 (en) | Fecal test method and device | |
JPH0326965A (ja) | 表面水酸基を有する膜を用いるクラミジア抗原の測定のための診断用試験キット及び方法 | |
EP0217845A1 (fr) | Procede de determination immunologique d'une substance biologique dans un echantillon. | |
RU2203496C2 (ru) | Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба | |
JP3827409B2 (ja) | 免疫学的測定方法 | |
IE901081L (en) | Enzymatic assay kit and method applicable to whole cells | |
RU2408021C2 (ru) | Способ обнаружения антигенов чумного микроба | |
Matsuzawa et al. | A rapid dot-blot method for species identification of bloodstains | |
RU2783710C1 (ru) | Способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза | |
WO2009040364A1 (en) | Multiparameter assay | |
RU2290444C2 (ru) | Способ определения вирусов гриппа | |
WO1995023969A1 (en) | Rapid immunological test | |
KR100193267B1 (ko) | 면역 멤브레인 스트립 및 그의 제조방법 | |
RU2202800C2 (ru) | Способ приготовления диагностикума для обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа | |
JP3874520B2 (ja) | 免疫測定用担体及びそれを用いた免疫測定用固相の調製方法 | |
Polson et al. | Coated glass beads in enzyme linked immunosorbent assays | |
RU2198407C2 (ru) | Способ постановки реакции латексной агглютинации |