RU2198407C2 - Способ постановки реакции латексной агглютинации - Google Patents

Способ постановки реакции латексной агглютинации Download PDF

Info

Publication number
RU2198407C2
RU2198407C2 RU2001104761A RU2001104761A RU2198407C2 RU 2198407 C2 RU2198407 C2 RU 2198407C2 RU 2001104761 A RU2001104761 A RU 2001104761A RU 2001104761 A RU2001104761 A RU 2001104761A RU 2198407 C2 RU2198407 C2 RU 2198407C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dilution
reaction
diluting liquid
latex agglutination
tween
Prior art date
Application number
RU2001104761A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2001104761A (ru
Inventor
А.А. Зайцев
В.В. Бинатова
Original Assignee
Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт filed Critical Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Priority to RU2001104761A priority Critical patent/RU2198407C2/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2198407C2 publication Critical patent/RU2198407C2/ru
Publication of RU2001104761A publication Critical patent/RU2001104761A/ru

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике особо опасных инфекций. Способ включает последовательное введение в полистироловые планшеты разводящей жидкости, неионного детергента твин-80, белкового стабилизатора, исследуемого материала, антительного полиакролеинового диагностикума и формирование агглютината. В качестве белкового стабилизатора используют водную эмульсию белка куриного яйца. Предложенный способ более чувствителен и более демонстративен. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике особо опасных инфекций.
В настоящее время реакция латексной агглютинации (РЛА) находит широкое применение в экспрессной диагностике инфекционных заболеваний.
Преимущества РЛА перед реакцией пассивной гемагглютинации (РПГА) обоснованы в сравнительных исследованиях этих методов с использованием вакцинного штамма чумного микроба EV ВНИИЭГ и набора гетерогенных штаммов. В качестве антительного диагностикума использовали полиакролеиновые латексные частицы диаметром 1,2-1,8 мкм, сенсибилизированные иммуноглобулиновой фракцией G, выделенной из кроличьей гипериммунной чумной сыворотки.
Постановка РЛА осуществлялась в полистироловых микропланшетах, образование агглютинатов происходило в фосфатно-буферном растворе (ФБР) рН 7,2 [Рудник М.П., Гриднева Л.Г. Экспресс-диагностика возбудителя чумы с использованием реакции агглютинации латекса // Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез. докл. региональной науч. -практ. конф. (16-17 сент. 1993 г.) - Чита, 1993. - С.134-135].
Однако, если при использовании очищенных антигенов уже через 1,5-2,0 ч четко просматривалось наличие в исследуемом и отсутствие в гетерогенных штаммах агглютинатов, то при исследовании объектов внешней среды на наличие антигена зачастую наблюдалась неспецифическая агглютинация.
Наиболее близким к заявленному является способ постановки РЛА при исследовании проб полевого материала [Пат. РФ 2012888, C 01 N 33/531, оп. 15.05.94. БИ 9].
Способ осуществляется последовательным внесением в полистироловые микропланшеты разводящей жидкости, исследуемого материала, антительного латексного диагностикума и формированием агглютината.
В качестве разводящей жидкости использовали 0,15 М раствор хлорида натрия в фосфатно-солевом буфере рН 7,2. В качестве исследуемого материала - образцы полевого материала, подозреваемого на зараженность возбудителями бактериальных особо опасных инфекций. Применяли полигрупповые диагностикумы на основе полиакролеиновых частиц, сенсибилизированных иммуноглобулинами полигрупповой сыворотки.
Недостатками прототипа является то, что при исследовании материала из объектов внешней среды на наличие антигена содержащиеся в нем посторонние агенты могут вызвать частичное повреждение поверхностной структуры диагностикумов. Чаще всего это обуславливает потерю инертности микросфер диагностикума, которые начинают отталкиваться друг от друга, образуя ложноположительные "зонтики". Частичная неспецифическая агглютинация латекса имеет место при постановке РЛА с отдельными сериями диагностикумов, что выражается в нечетком формировании "пуговок" и "колечек" в контролях.
Техническим результатом заявляемого способа является расширение диапазона объектов исследования в РЛА при высокой чувствительности и демонстративности результатов реакций, а также повышение демонстративности реакции с отдельными сериями диагностикумов.
Указанный технический результат достигается тем, что способ постановки РЛА включает последовательное введение в полистироловые микропланшеты разводящей жидкости, в качестве которой используют раствор белкового стабилизатора (БС) в разведении 1:50-1:100 на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,0-7,4 с добавлением неионного детергента твин-80 в разведении 1:50000-1: 100000, исследуемого материала, антительного полиакролеинового диагностикума и формирование агглютината. При этом в качестве белкового стабилизатора используют водную эмульсию белка куриного яйца.
По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.
Использование в качестве разводящей жидкости ФСБ рН 7,0-7,4 обеспечивает оптимальные условия для связывания антигена с антителами, фиксированными на латексных микрочастицах.
Добавление к разводящей жидкости белкового стабилизатора снижает неспецифическую активность реакции агглютинации, обеспечивая иммунологическую инертность диагностикума.
Введение в разводящую жидкость неионного детергента твин-80 способствует образованию стабильной гетерогенной коллоидной системы.
Совокупность отличительных признаков обеспечивает прохождение РЛА только за счет специфического связывания антигена и антител при расширении диапазона исследуемых объектов и повышении демонстративности результатов реакции.
Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения.
Пример 1. В круглодонные лунки микропланшеты для иммунологических реакций раскапывают по 50 мкл 0,05 М ФСБ рН 7,0-7,4. В первую лунку вносят 50 мкл суспензии внутренних органов загнившего трупа животного, павшего от чумы, и титруют с шагом 1:2. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл 0,1-0,2% суспензии диагностикума полиакролеинового чумного иммуноглобулинового. Параллельно ставят реакцию торможения латексной агглютинации (РТЛА) с чумной агглютинирующей сывороткой. В РЛА наблюдается формирование зонтиков в 10 лунках, а в РТЛА - в 9 лунках. Это вызывает сомнение в наличии чумного антигена в исследуемой пробе.
Пример 2. РЛА и РТЛА ставят аналогично примеру 1, но в разводящую жидкость дополнительно добавляют белковый стабилизатор в разведении 1:100 и твин-80 в концентрации 1:80000. БС готовят следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляют 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия углекислого кислого, перемешивают в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревают при температуре 56oС 40-60 мин, фильтруют через 8 слоев марли и лиофилизируют.
В РЛА наблюдается формирование зонтиков в 10 лунках, а в РТЛА - в 6 лунках при четких контролях. Система реакций указывает на наличие в исследуемой пробе чумного антигена (Ф I).
Пример 3. В круглодонные полистироловые микропланшеты для иммунологических реакций вносят по 50 мкл 0,05 М ФСБ рН 7,0-7,4. В первую лунку вносят взвеси клеток чумного микроба, выращенные при 37oС. Во все лунки добавляют по 25 мкл 0,1-0,2% суспензии диагностикума чумного иммуноглобулинового. При концентрации 3,12•105-1,56•105 м.кл./мл формируются "зонтики", занимающие не менее 2/3 дна лунок. Контроли с некоторыми сериями диагностикума (2 из 7) нечеткие, так как отдельные латексные микрочастицы спонтанно отталкиваются друг от друга и не оседают на дно лунок.
Пример 4. РЛА ставят, как в примере 2. При концентрации взвесей микробных клеток 3,12•105-1,56•105 м.кл./мл формируются "зонтики", занимающие не менее 2/3 дна лунок. Контроли с аналогичными сериями, как в примере 3, четкие. Демонстративность реакции улучшена.
Демонстративность реакции латексной агглютинации схематически представлена на фиг.1 и фиг.2.
Степень агглютинации обозначается: (++++) - хорошо выраженный агглютинат, покрывает все дно лунки тонким равномерным слоем в виде "зонтика"; (+++) - агглютинат несколько меньшего диаметра, чем при (++++); (++) - агглютинат в два раза меньше диаметра лунки; (+) - частицы латекса оседают в самом центре лунки и вокруг имеются отдельные зерна агглютининов; (-) - латексные микросферы оседают в самом центре лунки в виде "пуговки" или маленького колечка с ровно очерченными краями. Положительной считается реакция со степенью агглютинации (+++) - (++++).
По горизонтали обозначены лунок с материалом, раститрованным с шагом 1:2 (лунки 12 - контрольная) - по вертикали - лунок с различными вариантами разводящей жидкости.
Варианты разводящей жидкости:
А, В - ФСБ рН 7,0-7,4;
С, D - ФСБ рН 7,0-7,4 + твин-80 в разведении 1:80000;
Е, F - ФСБ рН 7,0-7,4 + БС в разведении 1:100;
G, H - ФСБ рН 7,0-7,4 + БС в разведении 1:100 + твин-80 в разведении 1: 80000.
На фиг.1 представлены результаты учета РЛА через 2 ч в двух повторностях опыта. При использовании в качестве разводящей жидкости ФСБ рН 7,0-7,4 формирование агглютинатов, оцениваемых в (+++), наблюдается в 9-ых лунках при отсутствии четких контролей (+, ++). Добавление к разводящей жидкости твин-80 в разведении 1:80000 приводит к аналогичному результату. Внесение в разводящую жидкость БС в разведении 1:100 позволяет несколько улучшить демонстративность РЛА. При этом в 8-ых лунках образовались "зонтики", оцениваемые в (+++, ++++) при удовлетворительных контролях (-, +). Применение сочетания твин-80 в разведении 1:80000 с БС в разведении 1:100 значительно повышает демонстративность реакции. Отмечается четкая картина агглютинации в 7-ых лунках (++++) при отличных контролях (-).
На фиг. 2 отображены результаты учета РЛА через 18-22 ч. Положительные результаты наблюдались в 8-ых лунках при применении всех вышеуказанных вариантов разводящей жидкости. Однако использование ФСБ и ФСБ с твин-80 давало менее четкие "зонтики" (+++, ++++) при удовлетворительных контролях (-, +). БС и БС в сочетании с твин-80 позволяли дать абсолютно четкую картину агглютинации после полного прохождения реакции (опыт - (++++), контроль - (-)).
Как показали экспериментальные исследования, схематические представленные на фиг.3 и фиг.4, заявленные пределы значений концентраций белкового стабилизатора и твина-80 являются оптимальными.
По горизонтали обозначены лунок с материалом, раститрованным с шагом 1:2 (лунки 12 - контрольная) - по вертикали - лунок с различными вариантами разводящей жидкости.
Варианты разводящей жидкости:
А - твин-80 в разведении 1:20000;
В - твин-80 в разведении 1:40000;
С - твин-80 в разведении 1:80000;
D - твин-80 в разведении 1:160000;
Е - БС в разведении 1:25;
F - БС в разведении 1:50;
G - БС в разведении 1:100;
Н - БС в разведении 1:200.
Использование заявляемого способа позволит значительно расширить возможности применения РЛА как экспресс-метода в полевых условиях и при чрезвычайных ситуациях.

Claims (2)

1. Способ постановки реакции латексной агглютинации, включающий последовательное внесение в полистироловые микропланшеты разводящей жидкости, исследуемого материала, антительного полиакролеинового диагностикума и формирование агглютината, отличающийся тем, что в качестве разводящей жидкости используют 0,05 М фосфатно-солевой буфер рН 7,0-7,4, в который дополнительно вносят белковый стабилизатор в разведении 1:50-1:100 и неионный детергент твин-80 в разведении 1:50000-1:100000.
2. Способ постановки реакции латексной агглютинации по п.1, отличающийся тем, что в качестве белкового стабилизатора используют водную эмульсию белка куриного яйца.
RU2001104761A 2001-02-20 2001-02-20 Способ постановки реакции латексной агглютинации RU2198407C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001104761A RU2198407C2 (ru) 2001-02-20 2001-02-20 Способ постановки реакции латексной агглютинации

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001104761A RU2198407C2 (ru) 2001-02-20 2001-02-20 Способ постановки реакции латексной агглютинации

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2198407C2 true RU2198407C2 (ru) 2003-02-10
RU2001104761A RU2001104761A (ru) 2003-02-20

Family

ID=20246264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001104761A RU2198407C2 (ru) 2001-02-20 2001-02-20 Способ постановки реакции латексной агглютинации

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2198407C2 (ru)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1149277A (en) Process for determining immuno-complexes
US4322495A (en) Immunoassay
US5200312A (en) Membrane based dot immunoassay and method of use
JPH07508102A (ja) アッセイ
JPH02503228A (ja) イムノグロブリンのアッセイ方法
PL98604B1 (pl) Preparat diagnostyczny do wykrywania powierzchniowego antygenu hepatitis b we krwi ludzkiej
JPH02502942A (ja) 凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬
JP2824794B2 (ja) 固相法により赤血球抗体を探索し、同定する方法
RU2198407C2 (ru) Способ постановки реакции латексной агглютинации
US4547466A (en) Detecting rheumatoid factor with synthetic particles having immune complexes thereon
EP0079145B1 (en) Reagent for use in diagnosis of syphilis and preparation thereof
JPS60177265A (ja) 抗体の免疫グロブリンのクラス別検出法
Sathar, MA,* Simjee, AE,* Delarey Nel, J.,* Bredenkamp, BLF,* Gathiram, V.** & Jackson Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay in the serodiagnosis of amoebic liver abscess
JP3889045B2 (ja) Hivを検出するためのペプチド
Gao et al. Single‐bead‐based immunofluorescence assay for snake venom detection
DE4202923A1 (de) Verfahren zur bestimmung von antigenen oder antikoerpern in gegenwart eines immunkomplexes
RU2783710C1 (ru) Способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза
Bürgin-Wolff et al. A rapid fluorescent solid-phase method for detecting antibodies against milk proteins and gliadin in different immunoglobulin classes
RU2044320C1 (ru) Способ иммунологического анализа
RU2761003C1 (ru) Способ получения конъюгатов коллоидного золота с иммуноглобулинами при изготовлении иммунохроматографических тест-систем
JP2684425B2 (ja) ラテックス試薬
RU2582941C1 (ru) Композитный чумной антигенный f1-диагностикум для индикации специфических антител
NZ516587A (en) Assay
Lim et al. A two-particle turbidometric latex immunoassay for the detection of specific IgM antibodies
RU2695525C1 (ru) Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида