RU2201765C2 - Гибридные матричные имплантаты и эксплантаты - Google Patents
Гибридные матричные имплантаты и эксплантаты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2201765C2 RU2201765C2 RU98109891/14A RU98109891A RU2201765C2 RU 2201765 C2 RU2201765 C2 RU 2201765C2 RU 98109891/14 A RU98109891/14 A RU 98109891/14A RU 98109891 A RU98109891 A RU 98109891A RU 2201765 C2 RU2201765 C2 RU 2201765C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- collagen
- factor
- polypeptide
- microspheres
- Prior art date
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 97
- 239000007943 implant Substances 0.000 title description 5
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 117
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 116
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 116
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 68
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 8
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 claims abstract description 8
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 190
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 56
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 55
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 48
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 46
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 17
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 17
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 17
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 15
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 15
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 15
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 13
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 11
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 10
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 10
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 10
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 claims description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 8
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 8
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 claims description 8
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 claims description 8
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 claims description 8
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 claims description 7
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 7
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 7
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 6
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 6
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 claims description 6
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 6
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 6
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 6
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 6
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 claims description 6
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 claims description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 6
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 6
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 6
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 6
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 6
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 6
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 6
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 6
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 6
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 claims description 6
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 6
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 claims description 5
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 claims description 5
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 5
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 claims description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 4
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 4
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 4
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 claims description 4
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002729 catgut Substances 0.000 claims description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002592 gangliocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000762 glandular Effects 0.000 claims description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 4
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 4
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 4
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 claims description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002948 striated muscle cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 claims description 3
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 claims description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018146 globin Human genes 0.000 claims description 3
- 108060003196 globin Proteins 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 claims description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 claims description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 claims description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 claims description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 14
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 6
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 3
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 claims 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 claims 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 claims 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 2
- GWNVDXQDILPJIG-NXOLIXFESA-N leukotriene C4 Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C=C/C=C/[C@H]([C@@H](O)CCCC(O)=O)SC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O GWNVDXQDILPJIG-NXOLIXFESA-N 0.000 claims 2
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims 1
- GWNVDXQDILPJIG-SHSCPDMUSA-N Leukotriene C4 Natural products CCCCCC=C/CC=C/C=C/C=C/C(SCC(NC(=O)CCC(N)C(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)C(O)CCCC(=O)O GWNVDXQDILPJIG-SHSCPDMUSA-N 0.000 claims 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 claims 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 claims 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 15
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 12
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 12
- 244000309466 calf Species 0.000 description 12
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 3
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 3
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 3
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCSKNASZPVZHEG-UHFFFAOYSA-N 3,6-dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione;1,4-dioxane-2,5-dione Chemical group O=C1COC(=O)CO1.CC1OC(=O)C(C)OC1=O LCSKNASZPVZHEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000269586 Ambystoma 'unisexual hybrid' Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 229920000544 Gore-Tex Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 101100231743 Homo sapiens HPRT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001009007 Homo sapiens Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000501 collagen implant Substances 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000034184 interaction with host Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- RFKMCNOHBTXSMU-UHFFFAOYSA-N methoxyflurane Chemical compound COC(F)(F)C(Cl)Cl RFKMCNOHBTXSMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002455 methoxyflurane Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000002747 omentum Anatomy 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
- A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2310/00—Prostheses classified in A61F2/28 or A61F2/30 - A61F2/44 being constructed from or coated with a particular material
- A61F2310/00005—The prosthesis being constructed from a particular material
- A61F2310/00365—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
- A61L2300/414—Growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/426—Immunomodulating agents, i.e. cytokines, interleukins, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/428—Vitamins, e.g. tocopherol, riboflavin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
- A61L2300/64—Animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение может быть использовано в медицине для получения и доставки применяемых в медицине веществ. Имплантируемое устройство имеет корпус из матричного материала, образованный фибриллами нерастворимого коллагена и расположенными в нем: (а) множеством клеток млекопитающих и (б) множеством микросфер, каждая из которых состоит в основном из одного или более следующих веществ: коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона или стекла. Изобретение расширяет ассортимент средств, предназначенных для получения и доставки применяемых в медицине веществ. 6 с. и 78 з.п.ф-лы, 7 табл., 3 ил.
Description
Областью этого изобретения являются медицинские устройства, используемые in vivo или in vitro для получения и доставки применяемых в медицине веществ.
Предпосылки создания изобретения
Средства, используемые для доставки применяемых в медицине веществ, могут значительно влиять на их эффективность. Обычным путем введения для многих таких веществ является пероральный, внутривенный или подкожный. Каждый имеет присущие ему ограничения, которые могут влиять на терапевтический эффект веществ, которые должны быть введены. Например, многие лекарственные вещества на основе белков имеют короткий период полувыведения и низкую биодоступность - факторы, которые должны учитываться при выборе их лекарственной формы и способов доставки. Хотя были разработаны различные устройства для доставки (введения) используемых в медицине веществ, включая разборные портативные насосы и катетеры, все еще существует значительная потребность в усовершенствованных средствах введения (доставки).
Средства, используемые для доставки применяемых в медицине веществ, могут значительно влиять на их эффективность. Обычным путем введения для многих таких веществ является пероральный, внутривенный или подкожный. Каждый имеет присущие ему ограничения, которые могут влиять на терапевтический эффект веществ, которые должны быть введены. Например, многие лекарственные вещества на основе белков имеют короткий период полувыведения и низкую биодоступность - факторы, которые должны учитываться при выборе их лекарственной формы и способов доставки. Хотя были разработаны различные устройства для доставки (введения) используемых в медицине веществ, включая разборные портативные насосы и катетеры, все еще существует значительная потребность в усовершенствованных средствах введения (доставки).
Многие используемые в медицине вещества, включая белки, гликопротеины и некоторые пептидные и непептидные гормоны, более эффективно продуцируются культивируемыми клетками, чем получаются путем искусственного синтеза. Соответствующие клетки обычно культивируют в биореакторах и из этой культуры с помощью очистки получают желаемый продукт для введения больному обычным путем, например перорально или с помощью внутривенной или подкожной инъекции. Альтернативно клетки можно имплантировать непосредственно больному, где они будут продуцировать и выделять желаемый продукт. Хотя этот способ обладает рядом теоретических преимуществ по сравнению с введением продукта самого по себе, включая ту возможность, что нормальные клеточные механизмы обратной связи могут быть усилены для того, чтобы обеспечить выделение физиологически необходимого уровня продукта, он создает и дополнительные сложности. Одна из них касается соответствующей среды для клеток во время имплантации. Было бы желательно собрать клетки имплантата в форме, которая совместима с естественной средой in vivo для типа клеток, содержащихся в имплантате (фибробласты, например, в естественных условиях существуют в густой сети внеклеточного матрикса, образованного главным образом коллагеном). Существует также в некоторых случаях потребность обеспечения того, чтобы имплантированные клетки оставались локализованными в определенном месте в организме больного, так чтобы можно было проводить контроль за ними и, возможно, удалять, когда они больше не нужны.
При одной методике, которая была апробована с этой целью, использовано имплантационное устройство, состоящее из твердого единого кусочка коллагенового геля ("коллагеновой матрицы"), в который помещены клетки (например, Bell, US Patent 4485096). В коллагеновый имплантат могут быть включены другие вещества, такие как политетрафторэтиленовые (ПТФЭ) волокна (Moullier et al. , Nature Genetics, 4:154, 1993; WO 94/24298), которые придают прочность или другие желательные свойства коллагеновому гелю.
Краткое изложение изобретения
Было обнаружено, что функционирование коллагеновой матрицы может быть существенно улучшено путем добавления микросфер к коллагеновой матрице с образованием тем самым того, что называется здесь термином "гибридная матрица". Это может быть выполнено путем смешивания микросфер с клетками и растворимым коллагеном перед превращением коллагена в гель с образованием матрицы. Если желательно, микросферы и клетки можно культивировать вместе в течение срока, который дает возможность клеткам прикрепиться к микросферам перед добавлением не превращенного в гель раствора коллагена; альтернативно, три составные части можно смешивать по существу одновременно или в любом желаемом порядке с последующим образованием геля из растворимого коллагена в смеси с образованием гелеобразной смеси, состоящей из фибрилл нерастворимого коллагена, клеток и микросфер. Эта превращенная в гель смесь постепенно становится меньше в результате изгнания жидкости с образованием твердой, сравнительно эластичной имплантируемой частицей, которая содержит как микросферы, так и клетки, помещенные в сетку фибрилл нерастворимого коллагена. Если микросферы образованы тоже большей частью из коллагена, полученная матрица называется здесь термином "гибридная коллагеновая матрица".
Было обнаружено, что функционирование коллагеновой матрицы может быть существенно улучшено путем добавления микросфер к коллагеновой матрице с образованием тем самым того, что называется здесь термином "гибридная матрица". Это может быть выполнено путем смешивания микросфер с клетками и растворимым коллагеном перед превращением коллагена в гель с образованием матрицы. Если желательно, микросферы и клетки можно культивировать вместе в течение срока, который дает возможность клеткам прикрепиться к микросферам перед добавлением не превращенного в гель раствора коллагена; альтернативно, три составные части можно смешивать по существу одновременно или в любом желаемом порядке с последующим образованием геля из растворимого коллагена в смеси с образованием гелеобразной смеси, состоящей из фибрилл нерастворимого коллагена, клеток и микросфер. Эта превращенная в гель смесь постепенно становится меньше в результате изгнания жидкости с образованием твердой, сравнительно эластичной имплантируемой частицей, которая содержит как микросферы, так и клетки, помещенные в сетку фибрилл нерастворимого коллагена. Если микросферы образованы тоже большей частью из коллагена, полученная матрица называется здесь термином "гибридная коллагеновая матрица".
Это изобретение, таким образом, включает изделие или устройство, имеющее основу (корпус) из матричного материала, который включает нерастворимые коллагеновые фибриллы и распределенные в основе:
а) множество клеток позвоночных (в частности клеток млекопитающих, таких как клетки, полученные от человека, шимпанзе, мыши, крысы, хомяка, морской свинки, кролика, коровы, лошади, свиньи, козы, овцы, собаки или кошки) и
б) множество микросфер (или бусин), каждая из которых состоит в основном (т. е. более чем на 50% по ее сухому весу) из одного или более веществ, выбираемых из списка, включающего коллаген (предпочтительно коллаген I типа), полистирол, декстран, полиакриламид, целлюлозу, альгинат кальция, латекс, полисульфон и стекло (например, стекло, покрытое гелем, таким как коллаген, для того чтобы улучшить сцепление с клетками).
а) множество клеток позвоночных (в частности клеток млекопитающих, таких как клетки, полученные от человека, шимпанзе, мыши, крысы, хомяка, морской свинки, кролика, коровы, лошади, свиньи, козы, овцы, собаки или кошки) и
б) множество микросфер (или бусин), каждая из которых состоит в основном (т. е. более чем на 50% по ее сухому весу) из одного или более веществ, выбираемых из списка, включающего коллаген (предпочтительно коллаген I типа), полистирол, декстран, полиакриламид, целлюлозу, альгинат кальция, латекс, полисульфон и стекло (например, стекло, покрытое гелем, таким как коллаген, для того чтобы улучшить сцепление с клетками).
Обычно по меньшей мере 70% и предпочтительно по меньшей мере 80% (наиболее предпочтительно приблизительно между 90% и около 100%, например, по меньшей мере 95%) от сухого веса каждой микросферы составляет одно или более из перечисленных веществ. Коммерческими примерами микросфер, которые описаны как по существу состоящие из очищенного коллагена, включают бусины ICN CellagenТМ и макропористые микросферы Biosciences. Микросферы предпочтительно имеют пористую консистенцию, но могут быть гладкими и обычно имеют примерно сферическую форму с диаметром примерно 0,1-2 мм (например, в интервале между примерно 0,3 и 1 мм). Разумеется форма и размер микросфер из любой конкретной серии препарата будет отличаться в пределах допусков производства.
Изделию может быть придана такая форма, чтобы ее можно было имплантировать животному, например такому млекопитающему, как человек, или может быть предназначена для производства клеточных продуктов in vitro; например в экстракорпоральном аппарате-биореакторе, снабженном средствами для отвода крови от животного к изделию и затем обратно в кровеносный сосуд животного или в биореактор или другой сосуд, из которого среда, содержащая желаемый клеточный продукт, может быть возвращена для очистки и изготовления фармацевтического препарата. Клетки могут быть произведены из одной или более клеток, полученных от больного, и предпочтительно ими являются трансфицированные клетки, содержащие экзогенную ДНК, кодирующую один или более применяемых в медицине полипептидов, таких как ферменты, гормоны, цитокины, колониестимулирующий фактор, фактор, стимулирующий развитие сосудов, вакцинный антиген, антитела, фактор свертывания крови, регуляторные протеины, фактор транскрипции, рецепторы или структурные белки. Примеры таких полипептидов включают человеческий гормон роста (чГР), фактор VIII, фактор IX, эритропоэтин (ЭПО), альбумин, гемоглобин, альфа-1 антитрипсин, кальцитонин, глюкоцереброзидазу, рецепторы липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), рецепторы IL-2, иммуноглобулины, каталитические антитела, интерлейкины, инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), паратиреоидный гормон (ПТГ), лептин, интерфероны, фактор роста нервов (ФРН), основной фактор роста фибробластов (оФРФ), кислотный ФРФ (кФРФ), эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста клеток эндотелия, фактор роста, производимый тромбоцитами (ФРПТ), трансформирующий фактор роста, стимулирующий развитие сосудов, фактор эндотелиальных клеток (ФРСЭК), ангиогенин, тканевой активатор плазминогена (т-АП), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (Г-КСФ) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (га-КСФ). Альтернативно, экзогенная ДНК может быть регуляторной последовательностью, которая будет активировать экспрессию эндогенного гена (например, используя гомологичную рекомбинацию, как описано в WО94/12650-PCT/US93/11704, который включен здесь в виде ссылки).
Обычно в матрицах этого изобретения может использоваться любой тип клеток, который способен связываться с коллагеном и/или микросферами и который проявляет желаемые свойства, такие как экспрессия применяемых в медицине продуктов клеток или выполнение существенной структурной функции или функции в метаболизме. Примеры включают адипоциты, астроциты, клетки сердечной мышцы, хондроциты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, ганглиоциты, железистые клетки, глиальные клетки, кроветворные клетки, гепатоциты, кератиноциты, миобласты, нервные клетки, остеобласты, бета-клетки поджелудочной железы, почечные клетки, клетки гладких мышц и клетки поперечно-полосатых мышц, а также предшественники любых из вышеперечисленных. Если желательно, в данную матрицу может быть включен более чем один тип клеток. Эти клетки могут присутствовать в виде клоновых или гетерогенных популяций.
Коллаген в матричном материале предпочтительно представлен типом I, но может быть и коллагеном любого другого типа. Матричный материал может, необязательно, включать два или более типов коллагена (например, выбранных из типов I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X и XI), а также любые дополнительные компоненты, которые придают желательные свойства получаемой матрице: например, агарозу, альгинат, фибронектин, ламинин, гиалуроновую кислоту, гепарансульфат, дерматансульфат, хондроитинсульфат, сульфатированные протеогликаны, фибрин, эластин или тенасцин. Любой из вышеупомянутых коллагеновых и неколлагеновых компонентов может быть получен от людей или от других животных. Можно было бы включать коллагеновые и неколлагеновые волокна, располагаемые внутри устройства. Такие волокна могут, например, быть изготовлены из материала, который включает найлон, дакрон, политетрафторэтилен, полигликолевую кислоту, полимерные смеси полимолочной/полигликолевой кислоты, полистирол, поливинилхлоридный сополимер, кетгут, хлопок, лен, полиэфир или шелк.
В гибридных матрицах может содержаться большое число клеток. Например, могут быть получены гибридные матрицы, которые содержат по меньшей мере примерно в два раза (а предпочтительно примерно в три раза) больше клеток, чем матрицы, полученные с только одним растворимым коллагеном, принимая, что число введенных клеток и первоначальный объем продукции эквивалентны. Общее количество полипетида, экспрессируемое клетками, помещенными в данную гибридную матрицу за данный период времени обычно значительно выше (например, по меньшей мере на 50% выше, предпочтительно по меньшей мере на 100% выше и более предпочтительно, по меньшей мере на 200% выше), чем достигаемое со стандартной коллагеновой матрицей эквивалентного объема.
Гибридную матрицу этого изобретения обычно получают с помощью способа, который включает следующие стадии:
формирования смеси, которая включает (а) множество клеток позвоночника; (б) множество микросфер, каждая из которых состоит большей частью из одного или более веществ, выбираемых из списка, состоящего из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла и (в) раствор, содержащий растворимый коллаген;
побуждения растворимого коллагена в смеси к образованию геля из нерастворимых коллагеновых фибрилл, в который вкраплены клетки и микросферы, и
выдерживания геля в условиях культивирования, которые побуждают гель уменьшаться в размерах путем выделения жидкости с образованием тем самым основы изделия. Образование геля обычно вызывается путем повышения рН относительно кислого коллагенового раствора до показания свыше 5, например путем добавления концентрированной буферной культуральной среды, где коллаген образует нерастворимые фибриллы. Когда эта стадия проводится в форме, гель будет принимать форму внутреннего объема этой формы. В основном на сжатие геля влияют клетки в смеси, которые связываются с фибриллами и заставляют его сжиматься до меньшего варианта создаваемой формы (например, диска, как в случае, когда формой является чашка Петри, которая имеет цилиндрическую форму). Матрица может использоваться непосредственно после получения, ее можно подвергать культивированию для повышения числа клеток, присутствующих в матрице, или для улучшения их функционирования, или она может подвергаться неограниченной криоконсервации при температуре ниже 0oС.
формирования смеси, которая включает (а) множество клеток позвоночника; (б) множество микросфер, каждая из которых состоит большей частью из одного или более веществ, выбираемых из списка, состоящего из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла и (в) раствор, содержащий растворимый коллаген;
побуждения растворимого коллагена в смеси к образованию геля из нерастворимых коллагеновых фибрилл, в который вкраплены клетки и микросферы, и
выдерживания геля в условиях культивирования, которые побуждают гель уменьшаться в размерах путем выделения жидкости с образованием тем самым основы изделия. Образование геля обычно вызывается путем повышения рН относительно кислого коллагенового раствора до показания свыше 5, например путем добавления концентрированной буферной культуральной среды, где коллаген образует нерастворимые фибриллы. Когда эта стадия проводится в форме, гель будет принимать форму внутреннего объема этой формы. В основном на сжатие геля влияют клетки в смеси, которые связываются с фибриллами и заставляют его сжиматься до меньшего варианта создаваемой формы (например, диска, как в случае, когда формой является чашка Петри, которая имеет цилиндрическую форму). Матрица может использоваться непосредственно после получения, ее можно подвергать культивированию для повышения числа клеток, присутствующих в матрице, или для улучшения их функционирования, или она может подвергаться неограниченной криоконсервации при температуре ниже 0oС.
Используемый в медицине полипептид, такой как один из перечисленных выше, можно вводить больному при методе лечения, который включает получение гибридной матрицы, содержащей клетки, которые секретируют полипептид, представляющий интерес, и имплантирование изделия больному в выбранное местоположение, такое как подкожное, интраперитонеальное, субренально в капсулу, паховое, внутримышечное или интратекальное местоположение. Если полипептидом является полипептид, который вызывает заживление ран (например, ФРПТ или ИФР-1), матрицу можно имплантировать в местоположение существующей раны. Как обсуждалось выше, клетки могут быть получены из одной или более клеток, удаляемых у больного, и предпочтительно они трансфицированы in vitro экзогенной ДНК, кодирующей полипептид. Альтернативно они могут быть клетками, которые естественно секретируют полипептид или осуществляют желаемую функцию метаболизма (например, гепатоциты или бета-клетки поджелудочной железы).
При другом варианте воплощения изобретения применяемый в медицине полипептид можно вводить больному путем отвода части крови пациента с помощью аппарата, описанного выше, так что полипептид, секретируемый клетками в гибридной матрице, смешивается с кровью. В основном любой такой аппарат, известный специалистам в этой области, может быть приспособлен для размещения матрицы этого изобретения. Например, отведение крови в устройство, которое содержит проницаемо-селективную мембрану, окружающую матрицу данного изобретения, будет приводить в результате к доставке терапевтического продукта из матрицы в кровь. Для этой цели можно использовать устройство, подобное искусственной поджелудочной железе (Sullivan et al., Science 252: 718-721, 1991).
Еще одним вариантом использования гибридных матриц данного изобретения является использование в качестве средства получения полипептида in vitro. Этот способ включает стадии помещения гибридной матрицы в условия, при которых клетки в матрице экспрессируют и секретируют полипептид; контакт матрицы с жидкостью так, что клетки секретируют полипептид в жидкость, и получения полипептида из жидкости, например, путем стандартных методик, подходящих для данного полипептида. При одном осуществлении матрица закрепляется на поверхности и омывается жидкостью; альтернативно матрица свободно плавает в жидкости. Клетки, помещенные в гибридную матрицу, функционируют на высоком уровне в малом пространстве. Кроме того, первая стадия очистки экспрессируемого полипептида (удаление клеток из среды) значительно более эффективна с матрицами, чем при большинстве других стандартных способов культивирования клеток.
Другие признаки и преимущества этого изобретения будут ясны из формулы изобретения и из детального описания, представленного ниже и не имеющего ограничивающего значения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет карту плазмиды pXGH302 для экспрессии чГР.
Фиг.1 представляет карту плазмиды pXGH302 для экспрессии чГР.
Фиг.2 представляет схематический вид с частичным сечением (срезом) одного из воплощений этого изобретения.
Фиг. 3 является графиком, показывающим уровни чГР in vivo у безволосых мышей, которым имплантирована или коллагеновая матрица или гибридная коллагеновая матрица, содержащая клетки HFI65-24, человеческие фибробласты кожи, стабильно трансфицированные pXGH302 и экспрессирующие чГР.
Подробное описание
Примеры, представленные ниже, иллюстрируют несколько вариантов воплощения этого изобретения. Эти примеры представлены только с иллюстративными целями и не имеют значения ограничивающих.
Примеры, представленные ниже, иллюстрируют несколько вариантов воплощения этого изобретения. Эти примеры представлены только с иллюстративными целями и не имеют значения ограничивающих.
Пример I
В этом примере описаны методы, использованные для получения клонального клеточного штамма человеческих фибробластов, устойчиво трансфицированных плазмидой pXGH302, секретирующих рекомбинантный человеческий гормон роста (чГР), и для соединения их с пористыми коллагеновыми микросферами в гибридной матрице этого изобретения. Такие матрицы называются гибридными коллагеновыми матрицами (ГКМ).
В этом примере описаны методы, использованные для получения клонального клеточного штамма человеческих фибробластов, устойчиво трансфицированных плазмидой pXGH302, секретирующих рекомбинантный человеческий гормон роста (чГР), и для соединения их с пористыми коллагеновыми микросферами в гибридной матрице этого изобретения. Такие матрицы называются гибридными коллагеновыми матрицами (ГКМ).
А. Получение первичных человеческих фибробластов, экспрессирующих человеческий гормон роста
Фибробласты выделяли из свежеотсеченной крайней плоти человека с помощью методики ферментативной диссоциации. После слияния первичные культуры снимали с пластиковой поверхности с помощью мягкой трипсинизации, разводили и снова высевали для получения вторичной клеточной культуры для трансфицирования.
Фибробласты выделяли из свежеотсеченной крайней плоти человека с помощью методики ферментативной диссоциации. После слияния первичные культуры снимали с пластиковой поверхности с помощью мягкой трипсинизации, разводили и снова высевали для получения вторичной клеточной культуры для трансфицирования.
Плазмида pXGH302 была сконструирована, как описано в примере II, и трансфицирование проводили путем электропорации - процесса, при котором клетки суспендируют в растворе плазмидной ДНК, помещают между парой противоположно заряженных электродов и подвергают воздействию коротких электрических импульсов.
Обработанные клетки подвергали селекции в содержащей G-418 среде в течение 10-14 дней. Клетки, которые включили плазмиду в свои геномы, стабильно экспрессируют продукт nео гена и образовывают колонии устойчивого к действию неомицина аналога G418. Каждую колонию, состоящую из клоновой популяции клеток, отдельно удаляли с ее положения на чашке с культурой ткани с помощью трипсинизации. Эти клоны, положительно оцененные на экспрессию чГР, размножали для количественной оценки, и клон HFI65-24 был выбран для дальнейшего использования. Более детально процедуры для получения и трансфицирования клеток, подходящие для использования в матрицах этого изобретения, представлены в WО93/09222 (PCT/US92/09627), который приведен здесь в виде ссылки.
Б. Получение гибридных коллагеновых матриц
1. Получение микросфер
Коллагеновые микросферы (Cellex Biosciences cat. YBOO-0015UW) переносили из каждой первоначальной бутылочки, поставленной производителем (~10 мл на бутылочку) в 50 мл конические пробирки (1 пробирка на одну бутылочку) Микросферам в пробирке давали осесть и буферный раствор для хранения отсасывали. В градуированную пробирку добавляли среду для промывания микросфер (DMEM с 1% телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) до метки 50 мл, микросферам давали осесть и среду отсасывали. Эту серию стадий промывания повторяли до общего числа в 4 промывания. Микросферы переносили в 250 мл колбу Эрленмейера, используя 25 мл пластиковую пипетку, ограничивая объем микросфер до 100 мл на 250 мл колбу. Добавляли среду для промывания до отметки 250 мл и колбу закрывали и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37oС на 2-3 часа. Колбу вынимали из инкубатора и микросферам давали осесть, а среду для промывания отсасывали. Эту серию инкубаций и стадий промывания повторяли до общего числа в 3 промывания.
1. Получение микросфер
Коллагеновые микросферы (Cellex Biosciences cat. YBOO-0015UW) переносили из каждой первоначальной бутылочки, поставленной производителем (~10 мл на бутылочку) в 50 мл конические пробирки (1 пробирка на одну бутылочку) Микросферам в пробирке давали осесть и буферный раствор для хранения отсасывали. В градуированную пробирку добавляли среду для промывания микросфер (DMEM с 1% телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина) до метки 50 мл, микросферам давали осесть и среду отсасывали. Эту серию стадий промывания повторяли до общего числа в 4 промывания. Микросферы переносили в 250 мл колбу Эрленмейера, используя 25 мл пластиковую пипетку, ограничивая объем микросфер до 100 мл на 250 мл колбу. Добавляли среду для промывания до отметки 250 мл и колбу закрывали и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37oС на 2-3 часа. Колбу вынимали из инкубатора и микросферам давали осесть, а среду для промывания отсасывали. Эту серию инкубаций и стадий промывания повторяли до общего числа в 3 промывания.
2. Получение гибридной коллагеновой матрицы
Клетки и микросферы смешивали непосредственно перед добавлением раствора коллагена. Промытые микросферы добавляли в 15 мл градуированные конические пробирки до желаемого объема (объем = число матриц, умноженное 1 мл; см. таблица 1) Микросферам давали осесть в течение по меньшей мере 10 минут перед измерением объема. Избыток среды для промывания удаляли отсасыванием.
Клетки и микросферы смешивали непосредственно перед добавлением раствора коллагена. Промытые микросферы добавляли в 15 мл градуированные конические пробирки до желаемого объема (объем = число матриц, умноженное 1 мл; см. таблица 1) Микросферам давали осесть в течение по меньшей мере 10 минут перед измерением объема. Избыток среды для промывания удаляли отсасыванием.
Клетки, которые нужно разместить в матрице, собирали с помощью трипсинизации и число клеток подсчитывали. Необходимое число клеток (число клеток на матрицу, умноженное на общее число матриц, которое нужно получить) центрифугировали при 1500 об/мин (500•g) в течение 7 мин при комнатной температуре. В соответствующих по размеру полипропиленовых пробирках с коническим дном готовили смесь равных объемов модифицированной 2х DMEM (2x DMEM с 9 г/л глюкозы, 4 мМ L-глютамина и 22,5 мМ HEPES) и телячьей сыворотки в соответствии с таблицей 1. (Примечание: для объемов более 250 мл общий объем должен быть разделен на пробирки соответствующего размера.) Осадок клеток снова суспендировали в смеси 2x DMEM - телячьей сыворотки. Коллагеновые микросферы смешивали с клеточной суспензией путем добавления 1-2 мл суспензии клеток к уплотненным микросферам и затем переноса концентрированных микросфер с помощью 10 мл пипетки в оставшуюся суспензию клеток с последующим осторожным перемешиванием с помощью пипетки. Смесь помещали на лед и добавляли соответствующий объем раствора коллагена (коллаген крысиного хвоста типа I; UBI кошачий 08-115, разведенный до концентрации 4,0 мг/мл 0,02 М уксусной кислотой), как указано в таблице 1. Содержимое пробирки тщательно перемешивали (избегая появления пузырьков или вспенивания), используя 10 мл стеклянную пипетку, до тех пор, пока раствор матрицы не принимал вид гомогенного.
Чтобы получить матрицу, соответствующий объем смеси коллагена/клеток/микросфер/среда добавляли в стерильную чашку Петри с помощью пипетки (объемом 10 или 25 мл) в соответствии с общим объемом на чашку из перечисленных в приведенной в конце описания табл.1. (Эту смесь перемешивали с помощью пипетки при заполнении чашек, чтобы предотвратить оседание клеток или микросфер.) Заполненные чашки помещали в термостат для тканевых культур с температурой 37oС, 5% СO2, 98% относительной влажности и оставляли в покое примерно на 24 часа, в течение этого времени содержимое превращалось в гель и гель уменьшался в размерах по всем направлениям с образованием гибридных матриц этого изобретения, которые были диаметром примерно 50% и объемом примерно 10% от объема смеси, не превращенной в гель.
Одно из воплощений гибридной матрицы этого изобретения иллюстрируется на фиг. 2. Матрица 10 состоит из массы сжатого коллагенового геля 12, в который помещены клетки позвоночных 14 и микросферы 16. Для ясности на этой фигуре клетки показаны как точки, отдельные от микросфер. Фактически нужно ожидать, что большинство клеток связано с микросферами, и они должны быть значительно меньше, чем представленные на чертеже.
Пример II
pXGH302 была сконструирована путем субклонирования фрагмента HindIII в 6,9 т. п. о., располагающегося в положении 11960-18869 в последовательности человеческого HPRT (Edwards et al., Genomics, 6:593-608, 1990; Genbank entry HUMHPRTB) и включения экзонов 2 и 3 гена HPRT в сайт HindIII pTZ18R (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc.). Полученный клон расщепляли в особом сайте XhoI в экзоне 3 фрагмента гена HPRT и вставляли фрагмент SalI-XhoI в 1,1 т. п.о., содержащий ген nео из pMClNeo (Stratagene), разрывая кодирующую последовательность экзона 3. Была выбрана одна ориентация, с направлением транскрипции nео, противоположном направлению в HPRT, и обозначена рЕ3nео.
pXGH302 была сконструирована путем субклонирования фрагмента HindIII в 6,9 т. п. о., располагающегося в положении 11960-18869 в последовательности человеческого HPRT (Edwards et al., Genomics, 6:593-608, 1990; Genbank entry HUMHPRTB) и включения экзонов 2 и 3 гена HPRT в сайт HindIII pTZ18R (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc.). Полученный клон расщепляли в особом сайте XhoI в экзоне 3 фрагмента гена HPRT и вставляли фрагмент SalI-XhoI в 1,1 т. п.о., содержащий ген nео из pMClNeo (Stratagene), разрывая кодирующую последовательность экзона 3. Была выбрана одна ориентация, с направлением транскрипции nео, противоположном направлению в HPRT, и обозначена рЕ3nео.
Чтобы объединить ген чГР, последовательности HPRT и ген nео в одной и той же плазмиде, pXGH5 (Selden et al., Mol. Cell. Biol. 6:3173-3179, 1986) расщепляли с помощью EcoRI и выделяли фрагмент в 4,0 т.п.о., содержащий ген чГР и связанный мышиный промотор металлотионеин-1 (mMT-1). Выступы ExoRI заполняли с помощью фрагмента Кленова из ДНК-полимеразы E.coli. pE3Neo расщепляли с помощью XhoI, который разрезает в месте соединения фрагмента пео и экзона 3 HPRT (соединение 3' вставки в экзон 3). Свисающие концы XhoI линеаризированной плазмиды заполняли с помощью фрагмента Кленова из ДНК-полимеразы E. coli и полученный фрагмент лигировали в 4,0 т.п.о. фрагмент mMT/hGH с тупыми концами. Колонии бактерий, полученные из смеси лигирования, отсортировывали с помощью ферментативного рестрикционного анализа по единственной копии вставки фрагмента mMT-1/hGH. Один субклон, в котором ген чГР (hGH) транскрибируется в том же направлении, что и ген nео, был обозначен pXGH302. Карта плазмиды pXGH302 представлена на фиг.1. На этой фигуре отмечены положение и ориентация кодирующей чГР области и мышиного промотора металлотионеина-1 (тМТ-1), контролирующего экспрессию чГР. Показано положение основных элементов промотора (ТАТА), сайтов инициации транскрипции (CAP) и сайтов инициации трансляции (ATG). Как показано, транскрипция гена пео контролируется энхансером полиомы/промотором гена тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV). HPRT обозначает положения последовательностей из локуса человеческой гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы. В плазмиде pXGH302 используется в качестве основы pTZ18R (Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. ), производная плазмиды pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119, 1985), несущая промотор Т7 РНК-полимеразы и сайт инициации репликации fl.
Пример III
Этот пример иллюстрирует способ получения гибридной коллагенавой матрицы, при котором трансфицированные клетки, приготовленные, как описано выше, предварительно культивируют с микросферами перед образованием гибридной коллагеновой матрицы. Такие "предварительно культивируемые" коллагеновые матрицы называются ПКГКМ.
Этот пример иллюстрирует способ получения гибридной коллагенавой матрицы, при котором трансфицированные клетки, приготовленные, как описано выше, предварительно культивируют с микросферами перед образованием гибридной коллагеновой матрицы. Такие "предварительно культивируемые" коллагеновые матрицы называются ПКГКМ.
А. Предварительное культивирование клеток и микросфер
Трипсинизированные трансфицированные клетки высевают в промытые коллагеновые микросферы в соотношении 2•106 клеток на мл микросфер (например, 10•106 клеток на 5 мл микросфер) с помощью следующей методики:
1. В колбу Эрленмейера на 125 мл добавляют суспензию клеток в объем среды для роста, который в два раза больше объема микросфер. Предел составляет 10 мл микросфер на колбу.
Трипсинизированные трансфицированные клетки высевают в промытые коллагеновые микросферы в соотношении 2•106 клеток на мл микросфер (например, 10•106 клеток на 5 мл микросфер) с помощью следующей методики:
1. В колбу Эрленмейера на 125 мл добавляют суспензию клеток в объем среды для роста, который в два раза больше объема микросфер. Предел составляет 10 мл микросфер на колбу.
2. Удаляют 1-2 мл этой суспензии и добавляют к 5 мл (уплотненный объем) предварительно отмеренных микросфер в 15 мл пробирку.
3. Переносят суспензию клеток/микросферы обратно в 125 мл колбу Эрленмейера.
4. Помещают колбу в термостат для культур тканей и мягко перемешивают вращением в течение примерно 5 секунд через каждый час в течение 4-5 часов. Добавляют среду для роста до деления 50 мл на колбе и оставляют клетки и микросферы в инкубаторе на ночь.
Через 20-24 часа со времени посева определяют число клеток, связанных с коллагеновыми микросферами, с помощью следующей процедуры:
1. Определяют вес 5 мл полистироловой пробирки для испытаний с круглым дном.
1. Определяют вес 5 мл полистироловой пробирки для испытаний с круглым дном.
2. Отбирают небольшой образец микросфер (0,1-0,2 мл) из колбы Эрленмейера и добавляют в предварительно взвешенную пробирку для испытаний.
3. Отсасывают среду с образца микросфер и определяют вес пробирки плюс образца. Рассчитывают вес образца путем вычитания веса пробирки из веса пробирки вместе с образцом.
4. Добавляют 1 мл расщепляющего матрицу фермента [коллагеназа IA (Sigma cat С9891) при концентрации 1-2 мг/мл в ФБР (фосфатно-буферном физрастворе) с Са2+ и Mg2+] к образцу микросфер и осторожно перемешивают путем выливания жидкости на стенку пробирки.
5. Закрывают пробирку парафильмом и помещают в водяную баню с температурой 37oС на 1 час, вызывая дезинтеграцию микросфер путем пропускания жидкости через пипетку Пастера через 15 минутные интервалы.
6. После инкубации производят дополнительную диссоциацию клеток путем энергичного пропускания через 5 мл стеклянную пипетку. (Примечание: если все еще остаются комочки, в пробирку добавляют раствор 10х трипсина-ЭДТА в объеме 1/10 от объема добавленного раствора коллагеназы и инкубируют еще 10 мин).
7. Выполняют подсчет клеток, используя гемацитометр.
8. Определяют плотность клеток на мл микросфер, используя следующую формулу, в которой принимается, что 50% объема этих микросфер во влажном уплотненном состоянии является промежуточным пространством.
Общее число клеток/мл микросфер = 1000 мг/(вес образца в мг) х (число клеток в образце) х 0,5.
Смесь клеток/микросфер переносят из 125 мл колбы Эрленмейера в 250 мл вращаемую колбу (Bellco Microcarrier Spinner Flasks, 250 мл с роторными штоками (крыльчатками) модели 1965-60001), среду для роста добавляют до градуировочной метки 150 мл и вращаемую колбу помещают на диск магнитной мешалки (установить на 50 об/мин) в термостат для культур тканей. Культуру подпитывают свежей средой на следующий день и 3 раза в неделю после этого, давая возможность микросферам осесть на дно колбы, отсасывая "истощенную" среду до отметки 50 мл на колбе и добавляя свежую среду для роста до отметки 200 мл. Плотность клеток на мл микросфер можно определить в желательные моменты времени, как описано выше.
Б. Получение предварительно культивированных гибридных коллагеновых матриц. (ПКГКМ)
ПКГМК получали с помощью следующей методики:
1. Когда достигнута желаемая плотность клеток на мл микросфер (что определялось подсчетом клеток), микросферы, содержащие клетки, удаляют из вращаемой колбы.
ПКГМК получали с помощью следующей методики:
1. Когда достигнута желаемая плотность клеток на мл микросфер (что определялось подсчетом клеток), микросферы, содержащие клетки, удаляют из вращаемой колбы.
2. Получают матрицы по методике, описанной выше для получения ГКМ, со следующими изменениями:
I. Клетки не трисинизируют.
I. Клетки не трисинизируют.
II. Добавляют культивированные микросферы, содержащие клетки, в 15 мл грудуированные конические пробирки до желаемого уплотненного объема (объем = число матриц • 0,5 мл).
III. Добавляют пустые микросферы в 15 мл градуированные конические пробирки до желаемого уплотненного объема (объем = число матриц • 0,5 мл).
3. Готовят модифицированную смесь 2х DMEM и телячьей сыворотки, как описано в примере I, выше. К модифицированной смеси 2х DMEM/телячьей сыворотки (см. в конце описания табл.2) добавляют пустые микросферы (50% от всего объема микросфер) и микросферы, содержащие клетки (50% от общего объема микросфер). Смесь микросфер/DMEM/телячьей сыворотки помещают на лед и добавляют соответствующий объем раствора коллагена (коллагена типа I хвоста крысы; UBI кошачьего 08-115, разведенного до концентрации 4,0 мг/мл в 0,02 М уксусной кислоте), как точно указано в таблице 2. Содержимое пробирки тщательно перемешивают (избегая образования пузырьков или вспенивания), используя 10 мл стеклянную пипетку, до тех пор, пока раствор матрицы не примет вид гомогенного.
Пример IV
А. Гибридные матрицы (ГКМ или ПКГКМ) поддерживаются в культуре путем подпитывания матриц в первый день, а затем 2-3 раза в неделю с использованием следующей методики:
1. Осторожно отсасывают культуральную среду.
А. Гибридные матрицы (ГКМ или ПКГКМ) поддерживаются в культуре путем подпитывания матриц в первый день, а затем 2-3 раза в неделю с использованием следующей методики:
1. Осторожно отсасывают культуральную среду.
2. Добавляют необходимый объем соответствущей среды роста, принимая во внимание размер чашки, используемый для каждой матрицы (5-7 мл на 60 мм чашку, 10-15 мл на 100 мм чашку, 30-40 мл на 150 мм чашку). Среда может быть дополнена аскорбиновой кислоты 2-фосфатом и/или ТГФ-β (например, 10-50 мкг/мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата и/или 1-10 нг/ ТГФ-β.
Б. Диаметр гибридной коллагеновой матрицы может быть определен с использованием следующей процедуры:
1. Помещают чашку Петри, содержащую матрицу, которую нужно измерить, на верхнюю часть измерительной линейки, лежащей на темном основании.
1. Помещают чашку Петри, содержащую матрицу, которую нужно измерить, на верхнюю часть измерительной линейки, лежащей на темном основании.
2. Регистрируют диаметры (в сантиметрах), как желательно: например, ежедневно в течение первых 2 недель, через день после первых двух недель и в дни подсчета клеток в продолжение эксперимента.
В. Клетки могут быть выделены из гибридной коллагеновой матрицы и подсчитаны следующим образом:
1. Ферментативное расщепление гибридных коллагеновых матриц.
1. Ферментативное расщепление гибридных коллагеновых матриц.
а. Готовят раствор коллагеназы IA (1,0 мг/мл для ГКМ и ПКГКМ, 2,0 мг/мл для ГКМ или ПКГКМ, дополненным 2-фосфатом аскорбиновой кислоты и/или ТГФ-β в ФБР.
б. Распределяют раствор коллагеназы по 15 мл коническим центрифужным пробиркам объемом по 1 мл для матриц, засеянных (1-5)•106 клеток, и 5 мл для матриц, засеянных более чем 5•106 клеток на матрицу. Готовят столько пробирок с коллагеназой, сколько матриц нужно подсчитать.
в. Удаляют каждую матрицу из ее чашки, используя плоский пинцет, и осторожно промокают избыток жидкости
с матрицы, используя салфетку из абсорбентной бумаги (если клетки будут выброшены после подсчета) или стерильную абсорбентную подушечку.
с матрицы, используя салфетку из абсорбентной бумаги (если клетки будут выброшены после подсчета) или стерильную абсорбентную подушечку.
г. Помещают каждую матрицу в отдельную содержащую коллагеназу пробирку, плотно закрывают и укрепляют на орбитальном шейкере, установленном на 40 об/мин, в термостате для культур тканей.
д. Инкубируют матрицы в течение примерно 1 часа до тех пор, пока не завершится расщепление. Чтобы ускорить расщепление, разбивают матрицы с помощью пропускания через пипетку через 5-минутные интервалы.
2. Подсчет клеток
а. Измеряют общий объем каждой расщепленной суспензии клеток, используя градуировку на стенке центрифужной пробирки.
а. Измеряют общий объем каждой расщепленной суспензии клеток, используя градуировку на стенке центрифужной пробирки.
б. Для определения жизнеспособности клеток отбирают 0,1 мл суспензии клеток и добавляют 0,1 мл 0,08% трипанового синего в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Смешивают путем легкого постукивания по пробирке.
в. Подсчитывают живые и мертвые клетки, используя гемацитометр. Если необходимо, дополнительно разводят суспензию клеток ФБР перед добавлением трипанового синего. Подсчитывают общее число клеток, принимая во внимание общий объем, измеренный на стадии 2а.
Пример V
В этом примере описаны эксперименты, отличающиеся плотностью посева клонов человеческих фибробластов, стабильно трансфицированных плазмидой pXGH302 в гибридной коллагеновой матрице с целью определения плотности клеток, которая может поддерживаться в ГКМ. Также контролировалась продукция чГР каждой ГКМ.
В этом примере описаны эксперименты, отличающиеся плотностью посева клонов человеческих фибробластов, стабильно трансфицированных плазмидой pXGH302 в гибридной коллагеновой матрице с целью определения плотности клеток, которая может поддерживаться в ГКМ. Также контролировалась продукция чГР каждой ГКМ.
Получали гибридные коллагеновые матрицы с 3 плотностями посева (ПП) стабильно трансфицированного экспрессирующего чГР клона фибробластов крайней плоти новорожденных, обозначаемого HF165-24. Плотности составляли 5, 10 и 20•106 клеток на ГКМ. Для каждой ПП получали 9 ГКМ в 60 мм чашках. Среда для продукции гибридных матриц для каждой ПП состояла из 9 мл модифицированной 2х DMEM, 9 мл телячьей сыворотки, 9 мл коллагеновых микросфер и 9 мл растворимого коллагена хвоста крыс 4 мг/мл в 50 мл конических пробирках.
HF165-24, собранные с монослойных культур, объединяли для получения достаточного материала для каждой ПП для 9 ГКМ:
5•106 клеток на 9 ГКМ = всего 45•106 клеток;
10•106 клеток на 9 ГКМ = всего 90•106 клеток;
20•106 клеток на 9 ГКМ = всего 180•106 клеток.
5•106 клеток на 9 ГКМ = всего 45•106 клеток;
10•106 клеток на 9 ГКМ = всего 90•106 клеток;
20•106 клеток на 9 ГКМ = всего 180•106 клеток.
Объединенные клетки для каждой ПП центрифугировали при 1500 об/мин в течение 7 мин, супернатант отсасывали, осадок снова суспендировали в 9 мл модифицированной 2х DMEM и 9 мл телячьей сыворотки и переносили в 50 мл пробирки. К смеси клеток/2х DMEM/телячьей сыворотки добавляли девять мл коллагеновых микросфер, предварительно отмеренных в 15 мл градуированные пробирки, и смешивали путем мягкого пропускания через пипетку с помощью 10 мл пипетки. Эту смесь затем помещали на лед и добавляли 9 мл ледяного холодного раствора коллагена хвоста крыс типа I (4 мг/мл) и перемешивали с помощью 10 мл пипетки до получения гомогенного раствора. Четыре мл этой смеси добавляли в каждую из девяти 60 мм чашек Петри для каждой плотности. Чашки Петри ставили в инкубатор для культур тканей и оставляли в покое на 24 часа. После 24 часов инкубации (среду аккуратно отсасывали из каждой чашки, а ГКМ снова подпитывали ростовой средой (DMEM, 10% телячьей сыворотки 1% пен. /стрепт. ), используя 5 мл на чашку. Для обеспечения большего объема среды роста на матрицу ГКМ переносили на 3 дня с 60 мм чашек Петри на 100 мм, используя плоский пинцет, и добавляли по 10 мл среды роста на чашку. На 6 день среду от каждой ГКМ отсасывали, матрицы промывали 5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (ССРХ) и отсасывали, и в каждую чашку добавляли 10 мл среды для роста. Время добавления ростовой среды к ГКМ отмечали, чтобы взять образец среды через 24 часа на следующий день (день 7). Эту процедуру промывания и подпитывания повторяли на 13 и 20 день, чтобы получить образцы среды на 14 и 21 день. Образцы среды исследовали на чГР, как указано ниже. ГКМ также подпитывали на 10 и 17 дни без стадии промывания. Расщепление 3 ГКМ на ПП для подсчета клеток проводили на 7, 14 и 21 день после того, как были отобраны образцы, как описано в примере IV. Продукция чГР в ГКМ в указанные моменты времени определяли количественно с помощью радиоиммуноисследования (Институт Николса) в образцах среды, взятых через 24 часа, как описано в примере XII, ниже. В табл.3 (см. в конце описания) сведены данные по числу клеток для трех повторностей ГКМ на каждую ПП и продукции чГР в ГКМ при каждой ПП на 7 (n=9), 14 (n=6) и 21 (n=3) дни. Значения представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Как показано, равновесная плотность, определенная на 14 и 21 день для ГКМ, полученных, как описано выше, составляет примерно (7-10)•106 клеток на матрицу. Продукция чГР на клетку для полностью сформированных матриц на 21 день сходна для всех трех испытанных уровней ПП.
Пример VI
"Стандартные" коллагеновые матрицы (КМ) не включают коллагеновых микросфер. Чтобы сравнить КМ с ГКМ, получали КМ путем замещения объема, занятого микросферами в ГКМ дополнительным растворимым коллагеном с получением соотношения из 1 части 2х DMEM, 1 части телячьей сыворотки и 2 частей растворимого коллагена на КМ. Прямое сравнение КМ с ГКМ проводили следующим образом.
"Стандартные" коллагеновые матрицы (КМ) не включают коллагеновых микросфер. Чтобы сравнить КМ с ГКМ, получали КМ путем замещения объема, занятого микросферами в ГКМ дополнительным растворимым коллагеном с получением соотношения из 1 части 2х DMEM, 1 части телячьей сыворотки и 2 частей растворимого коллагена на КМ. Прямое сравнение КМ с ГКМ проводили следующим образом.
Использовали клон человеческих фибробластов, стабильно трансфицированных плазмидами pXGH302, обозначенный HF165-24. Получали девять матриц каждого типа с каждой из двух ПП (1•106 и 5•106 клеток на матрицу). Для обоих, КМ и ГКМ, 9•106 клеток (для ПП 1•106) и 45•106 клеток (для ПП 5•106) повторно суспендировали в 9 мл 2х DMEM + 9 мл телячьей сыворотки в 50 мл пробирках. Для КМ в ряд по каждой ПП добавляли в целом 18 мл раствора коллагена типа I хвоста крысы (4 мг/мл), и матрицы формировали, как описано выше в примере I. Для ГКМ в ряд для каждой ПП добавляли 9 мл коллагеновых микросфер и 9 мл раствора коллагена типа I хвоста крыс (4 мг/мл) и ГКМ формировали в соответствии с примером I. Матрицы содержали в первоначальных 60 мм чашках и подпитывали объемом в 5 мл среды роста. Число клеток на матрицу, а также продукцию чГР на матрицу определяли на 7, 14 и 30 день, как описано в примере V. Максимальные плотности клеток (измеренные на 14 день) и продукция чГР в 2-х типах матриц при 2 плотностях суммированы в табл.4 (см. в конце описания). Как показано в таблице, гибридный тип матрицы давал возможность более высокой плотности клеток и существенно большую продукцию чГР на матрицу по сравнению со стандартной коллагеновой матрицей без микросфер.
Пример VII
В этом примере описана продукция и анализ предварительно культивированных гибридных коллагеновых матриц (ПКГМ). Клетки клона человеческих фибробластов, стабильно трансфицированные плазмидами pXGH302 (HF165-24), высевали в коллагеновые микросферы в соотношении 2•106 клеток на мл микросфер следующим образом. Суспензию 48•106 клеток в 40 мл среды роста получали из собранных монослойных культур. 5 мл этой суспензии добавляли в каждую из четырех 15 мл градуированных пробирок, содержащих 6 мл уплотненных коллагеновых микросфер, и каждую смесь клеток/микросфер переносили в 125 мл колбу Эрленмейера. Добавляли дополнительно 5 мл суспензии клеток к смеси клеток/микросфер в 125 мл колбе Эрленмейера для получения конечной суспензии 12•10 клеток с 6 мл микросфер и 10 мл среды роста на колбу (всего 4 колбы). Колбы помещали в инкубатор для культур тканей и содержимое мягко перемешивали вращением в течение 5 секунд через каждый час в течение 4 часов. После четвертого часа в каждую колбу добавляли среду роста до 50 мл отметки и колбы оставляли в покое на 24 часа. Через 24 часа микросферы из каждой колбы Эрленмейера переносили в 250 мл колбу-волчок, добавляли среду роста до 150 мл отметки каждой колбы-волчка и колбы помещали на плату магнитной мешалки, установленной на 50 об/мин в инкубаторе для культур тканей. На следующий день добавляли среду роста до 200 мл отметки в каждую колбу с волчком и в колбах производили подпитку 3 раза в неделю путем отсасывания среды до 50 мл отметки и добавления свежей среды до 200 мл.
В этом примере описана продукция и анализ предварительно культивированных гибридных коллагеновых матриц (ПКГМ). Клетки клона человеческих фибробластов, стабильно трансфицированные плазмидами pXGH302 (HF165-24), высевали в коллагеновые микросферы в соотношении 2•106 клеток на мл микросфер следующим образом. Суспензию 48•106 клеток в 40 мл среды роста получали из собранных монослойных культур. 5 мл этой суспензии добавляли в каждую из четырех 15 мл градуированных пробирок, содержащих 6 мл уплотненных коллагеновых микросфер, и каждую смесь клеток/микросфер переносили в 125 мл колбу Эрленмейера. Добавляли дополнительно 5 мл суспензии клеток к смеси клеток/микросфер в 125 мл колбе Эрленмейера для получения конечной суспензии 12•10 клеток с 6 мл микросфер и 10 мл среды роста на колбу (всего 4 колбы). Колбы помещали в инкубатор для культур тканей и содержимое мягко перемешивали вращением в течение 5 секунд через каждый час в течение 4 часов. После четвертого часа в каждую колбу добавляли среду роста до 50 мл отметки и колбы оставляли в покое на 24 часа. Через 24 часа микросферы из каждой колбы Эрленмейера переносили в 250 мл колбу-волчок, добавляли среду роста до 150 мл отметки каждой колбы-волчка и колбы помещали на плату магнитной мешалки, установленной на 50 об/мин в инкубаторе для культур тканей. На следующий день добавляли среду роста до 200 мл отметки в каждую колбу с волчком и в колбах производили подпитку 3 раза в неделю путем отсасывания среды до 50 мл отметки и добавления свежей среды до 200 мл.
На 15 день культивирования в колбе с волчком определяли плотность клеток на мл микросфер. Из каждой колбы отбирали небольшой образец микросфер (~ 0,1-0,2 мл) и помещали в предварительно взвешенные 5 мл полистирольные пробирки. Избыток среды из каждой пробирки удаляли путем аспирации и пробирку, содержащую образец микросфер, взвешивали. В каждую пробирку добавляли один мл раствора коллагеназы типа IA, 2 мг/мл в ФБР и пробирки закрывали парафильмом и помещали в водяную баню с температурой 37oС. Каждые 15 минут по пробиркам, содержащим микросферы, слегка постукивали, чтобы диспергировать сгустки. Через 1 час проводили дополнительную диссоциацию клеток путем энергичного пропускания через пипетку с помощью 5 мл стеклянной пипетки. Чтобы дополнительно разбить комочки, добавляли раствор 10х трипсина: ЭДТА с получением конечной концентрации трипсина 1х в растворе коллагеназы и пробирки инкубировали в течение еще 10 минут. Суспензии диссоциированных клеток разводили 1:2 ФБР и вносили в камеры гемацитометра для подсчета клеток. Плотность клеток на мл микросфер рассчитывали, используя следующую формулу:
Общее количество клеток/мл микросфер = 1000 мг/(1 мг веса образца) х (количество клеток в образце) х 0,5.
Общее количество клеток/мл микросфер = 1000 мг/(1 мг веса образца) х (количество клеток в образце) х 0,5.
В этой формуле принимается, что: 1) влажный коллаген имеет удельный вес, равный 1,0, и поэтому грамм веса коллагена в образце микросфер равен объему коллагена в мл, и 2) половину объема микросфер во влажном уплотненном состоянии занимает промежуточное пространство. Среднее число клеток на мл микросфер (n= 4) в этом эксперименте составило 19,2•106. Микросферы удаляли из каждой колбы и объединяли в 15 мл градуированной пробирке. Весь объем из 6 мл микросфер, содержащий 19,2•106 клеток на мл микросфер, использовали для получения гибридных коллагеновых матриц.
В 100 мл стерильной бутылочке аккуратно смешивали 12 мл модифицированной 2х DMEM, 12 мл телячьей сыворотки, 6 мл пустых коллагеновых микросфер и 6 мл предварительно культивированных микросфер с использованием 10 мл стеклянной пипетки. Эту смесь помещали на лед и добавляли 12 мл охлажденного на льду коллагена типа I из хвоста крысы и аккуратно перемешивали, используя 10 мл стеклянную пипетку. В каждую из двенадцати 60 мм чашек Петри добавляли 4 мл этой смеси и чашки помещали в термостат с температурой 37oС и оставляли на 24 часа.
Конечное число клеток на матрицу составляло 9,6•106, так как каждая матрица состояла из 0,5 мл микросфер, содержащих 19,2•106 клеток на мл. Эти предварительно культивированные гибридные коллагеновые матрицы (ПКГКМ) подпитывали через 24 часа путем отсасывания среды и добавления 5 мл среды роста. ПКГКМ подпитывали на 4, 7, 11, 14, 18 и 20 день 6 мл среды для роста. На 7, 14 и 20 день ПКГКМ также промывали 4 мл ССРХ перед добавлением среды и время добавления среды отмечали. На 8, 15 и 21 день отбирали образец среды после 24 часов культивирования для исследования на продукцию чГР и ПКГКМ расщепляли для получения числа клеток следующим образом. В 15 мл пробирки добавляли раствор 2 мг/мл коллагеназы типа IA в ФБР в объеме 6 мл. ПКГКМ вынимали из чашек с помощью плоского пинцета и промокали на салфетке из абсорбентной бумаги перед переносом в раствор коллагеназы. Пробирки, содержащие ПКГКМ и раствор коллагеназы, закрепляли на орбитальном шейкере в инкубаторе для культур тканей, скорость устанавливали на 40 об/мин и ПКГКМ оставляли для расщепления на 2 часа. После 2 часов инкубации проводили диссоциацию ПКГКМ на единичные клетки с помощью энергичного пропускания смеси через 5 мл стеклянную пипетку. Дополнительная диссоциация считалась необходимой из-за наличия комочков, и добавляли раствор 10х трипсина: ЭДТА (0,5% трипсина, 5,3 мМ ЭДТА) для получения конечной концентрации трипсина в коллагеназе, равной 1х. Затем пробирки дополнительно инкубировали еще в течение 10 мин. Объем в каждой пробирке отмечали и суспензии клеток разводили в 2 раза ФБР и помещали в камеру гемацитометра для подсчета числа клеток. Продукция чГР в ПКГКМ в указанные моменты времени определяли с помощью радиоиммуноисследования образцов среды после 24 часов культивирования, как описано в примере VIII. В табл.5 (см. в конце описания) сведены данные по числу клеток в ПКГКМ в трех повторностях на каждый момент времени и продукции чГР в ПКГКМ на 8 (n=12), 15 (n=9) и 21 (n=6) день. Значения представлены средним арифметическим ± стандартное отклонение. Как показано в таблице 5, эти ПКГКМ поддерживают более высокую плотность клеток, чем ГКМ, описанные в примерах V и VI (таблицы 3 и 4). Степень продукции чГР на матрицу и на клетку была сходной в течение всего срока исследования.
Пример VIII
Экспрессию чГР контролировали путем количественного определения чГР с помощью радиоиммунометрического анализа по типу сэндвич (Allegro hGH Assay, Nichols Institute, Cat. 40-2205) с применением условий, рекомендуемых производителем.
Экспрессию чГР контролировали путем количественного определения чГР с помощью радиоиммунометрического анализа по типу сэндвич (Allegro hGH Assay, Nichols Institute, Cat. 40-2205) с применением условий, рекомендуемых производителем.
Чтобы определить степень продукции чГР, культуральную среду меняли за 24 часа перед сбором клеток для пассирования. Во время пассажа отбирали образец культуры для исследования на чГР, а затем клетки собирали, подсчитывали и снова высевали. После подсчета собранных клеток рассчитывали уровни чГР и выражали в виде мкг чГР/24 часа/106 клеток.
Пример IX
В этом примере описана имплантация in vivo гибридных коллагеновых матриц (ГКМ), полученных, как описано в примере III, а также стандартных коллагеновых матриц (КМ), полученных, как описано в примере VI.
В этом примере описана имплантация in vivo гибридных коллагеновых матриц (ГКМ), полученных, как описано в примере III, а также стандартных коллагеновых матриц (КМ), полученных, как описано в примере VI.
Для подкожной имплантации матриц мышам [М. musculus, линии N:NIH(S)-nu/nu (nude; Taconic Farms, Germantown, NY) производили внутрибрюшинную инъекцию авертина (раствор 2% вес/объем 2,2,2-трибромэтанола и 2% объем/объем 2-метил-2-бутанола) в дозе 0,0175 мл/г веса тела. Мышей, получивших анестезию, клали в боковое лежачее положение и подготавливали кожу, используя спирт и бетадин. На левом боку животного делали косой разрез. Подкожное пространство увеличивали путем быстрого препарирования до площади, немного большей, чем размер матрицы, которую нужно имплантировать. Матрицу помещали горизонтально в подкожное пространство и равномерно распределяли, используя хирургические щипцы Millipore. Разрез закрывали, используя хирургические скобки из нержавеющей стали.
Кровь собирали путем кровопускания из ретроорбитальной артерии после помещения мыши в большой лабораторный стакан, содержащий метоксифлуран (Pittman-Moore) до достижения легкой анестезии. Уровни чГР в сыворотке определяли, используя коммерчески доступный набор для радиоиммунометрического анализа по типу сэндвич, описанному выше. Анализ проводили, как описано и рекомендовано, за исключением того, что для получения корректных значений распадов/мин для построения стандартной кривой использовали контрольную сыворотку от не подвергавшихся воздействию мышей.
КМ и ГКМ для имплантации голым мышам получали, как описано в примерах I и VI, используя экспрессирующие чГР клетки HF165-24. В первом эксперименте (эксперимент 1, таблицы 6 и 7) было получено 13 матриц каждого типа. ГКМ были получены с плотностью посева (ПП) 5•106 клеток HF165-24 на матрицу, а стандартные коллагеновые матрицы (КМ) были получены с ПП 2•106 HF165-24 на матрицу. Меньшее количество клеток было использовано для посева в КМ потому, что эти матрицы не выдерживают такой высокой плотности клеток, как ГКМ (см. примеры V и VI). В последующих экспериментах (эксперименты 2 и 3, таблицы 6 и 7) испытывали только ГКМ матрицы (13 в каждом из экспериментов 2 и 3). Матрицы сохраняли в первичных 60 мм чашках и подпитывали 5 мл среды роста. Через 13 дней культивирования во все чашки вносили свежую питательную среду для роста; через 24 часа матрицы в трех повторностях каждого набора расщепляли для определения числа клеток и образцы среды от всех 13 матриц в каждом наборе анализировали на чГР.
Для эксперимента 1 во время имплантации среднее число клеток в КМ составляло 2,4•106 клеток/матрицу, тогда как среднее число клеток в ГКМ составляло 7,4•106 клеток/матрицу (таблица 6). Число клеток на матрицу было сходным с числом клеток для ГКМ, полученных в экспериментах 2 и 3 (8,9•106 и 9,2•106 клеток на матрицу ГКМ соответственно). В таблице 6 сведены число клеток (n= 3), продукция чГР на матрицу in vitro (n=13) и степень удельной продукции (мкг/106 клеток/24 часа; n=3) для каждой серии экспериментов in vitro. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Как показано в табл. 6 (см. в конце описания), ГКМ выдерживали высокую плотность клеток и продуцировали более высокий уровень чГР на день имплантации, чем КМ.
Восемь матриц каждого типа имплантировали голым мышам в эксперименте 1, в то время как пять ГКМ имплантировали голым мышам в каждом из экспериментов 2 и 3. Уровни чГР в сыворотке измеряли через установленные интервалы после имплантации. Результаты представлены в табл.7 (см. в конце описания) и на фиг. 3. В эксперименте 1 у животных с имплантированной ГКМ поддерживались существенно более высокие уровни чГР в сыворотке, чем у животных с имплантированными КМ в течение 186 дней после имплантации. У животных с имплантированными ГКМ в экспериментах 2 и 3 показаны близкие высокие уровни чГР в сыворотке.
Пример Х
Гибридные матрицы этого изобретения должны быть изготовлены для имплантации людям следующим образом:
Желаемые клетки, обычно стабильно трансфицированные аутологичные клетки, полученные от больного, собирают с чашек с культурами ткани и обрабатывают для получения ГКМ или ПКГКМ любыми способами, описанными в примерах I-IV. Дозировка для данного больного (т.е. физиологически эффективное количество терапевтического продукта, продуцируемого матрицей) может быть изменена путем использования большей или меньшей матрицы, имллантирования разного числа матриц больному и/или использованием клеток, которые экспрессируют разный уровень продукта на клетку при создании матрицы. Количество терапевтического продукта, продуцируемое у больного, может также меняться путем воздействия на клетки в матрице фармакологического или физиологического сигнала, который изменяет экспрессию терапевтического гена. Например, если терапевтический ген находится под контролем реагирующего на глюкокортикоид промотора, то действие in vivo на клетки лекарства, такого как дексаметазон (путем введения лекарства больному таким образом, который обеспечивает лекарству доступ к имплантату), будет изменять экспрессию терапевтического гена.
Гибридные матрицы этого изобретения должны быть изготовлены для имплантации людям следующим образом:
Желаемые клетки, обычно стабильно трансфицированные аутологичные клетки, полученные от больного, собирают с чашек с культурами ткани и обрабатывают для получения ГКМ или ПКГКМ любыми способами, описанными в примерах I-IV. Дозировка для данного больного (т.е. физиологически эффективное количество терапевтического продукта, продуцируемого матрицей) может быть изменена путем использования большей или меньшей матрицы, имллантирования разного числа матриц больному и/или использованием клеток, которые экспрессируют разный уровень продукта на клетку при создании матрицы. Количество терапевтического продукта, продуцируемое у больного, может также меняться путем воздействия на клетки в матрице фармакологического или физиологического сигнала, который изменяет экспрессию терапевтического гена. Например, если терапевтический ген находится под контролем реагирующего на глюкокортикоид промотора, то действие in vivo на клетки лекарства, такого как дексаметазон (путем введения лекарства больному таким образом, который обеспечивает лекарству доступ к имплантату), будет изменять экспрессию терапевтического гена.
Обычно нужно имплантировать много небольших матриц (примерно 1-2 см диаметром), полученных в 60 мы чашках Петри и содержащих порядка 10•106 клеток на матрицу. Таким образом, можно было бы имплантировать примерно 100 млн клеток, используя 10 небольших матриц. Использование матриц со значительно более высокой плотностью клеток (что получается путем включения, например, 2-фосфат-аскорбиновой кислоты) должно приводить к тому, что данному больному будет необходимо меньшее число матриц. Альтернативно, можно использовать большие чашки Петри (> 150 мм диаметром) в качестве формы для получения матриц большего размера, которые можно было бы или имплантировать непосредственно или разрезать на небольшие кусочки, которые и имплантируют.
До имплантации матрицы можно хранить или транспортировать в среде для роста или любом другом растворе, который позволяет сохранить клетки живыми. Альтернативно матрицы можно консервировать путем замораживания в соответствующей среде для замораживания, которую можно отмыть перед имплантацией.
Матрицы могут быть имплантированы в ряд мест, включая, но не ограничиваясь ими, внутрибрюшинное, в селезенке, в сальнике, в паху, интратекальное, интравентрикулярное и внутримышечное местоположение, а также в лимфатические узлы или в жировую ткань. Производится хирургический разрез в соответствующем месте, вводится матрица и разрез закрывается.
Пример XI
Существует ряд статических и перфузионных систем крупномасштабного культивирования in vitro, которые могут быть адаптированы для использования при производстве белка с использованием клеток, содержащихся в гибридных матрицах этого изобретения. В имеющемся ассортименте представлены различные уровни доступа на необходимых стадиях подачи и сбора среды перед очисткой целевых белков. Некоторые описаны ниже.
Существует ряд статических и перфузионных систем крупномасштабного культивирования in vitro, которые могут быть адаптированы для использования при производстве белка с использованием клеток, содержащихся в гибридных матрицах этого изобретения. В имеющемся ассортименте представлены различные уровни доступа на необходимых стадиях подачи и сбора среды перед очисткой целевых белков. Некоторые описаны ниже.
1. После формирования и созревания гибридных коллагеновых матриц (ГКМ) в обычных чашках Петри (например, после 10-25 дней инкубации) ряд этих ГКМ можно асептически перенести в стерильные Microcarrier Spinner Flask (объемом 250-100 мл). Эти ГКМ получают и сохраняют в условиях, которые обеспечивают максимальную плотность жизнеспособных клеток в каждой матрице. Обычно для этого необходимо 5-20 мл среды на каждый мл объема матрицы. Среду для продукции белка составляют так, чтобы она включала минимум неопределяемых компонентов (например, сыворотки) и могла включать дополнительные факторы, предназначенные для того, чтобы обеспечить максимум выхода продукции белка на клетку. Колбы для вращательного движения среды помещают в инкубатор с увлажнением с температурой 37±1oС, 5±1% CO2 на платформу магнитной мешалки, установленной на 30-70 об/мин. Через 1-3 дня колбу переносят в камеру с биологической защитой класса 100, и асептически отделяют производственную питательную среду, содержащую экспрессируемый белок, не взбалтывая осевшие матрицы. В колбу добавляют эквивалентный объем свежей среды для продукции белка и колбу возвращают на платформу для перемешивания в инкубатор.
2. Матрицы, описанные в (1) выше, можно асептически перенести в 1-5 л биореактор (например, Brunswick) с регулируемой осевой лопастной мешалкой. Уровень производственной питательной среды устанавливается регулирующей системой биореактора. Отбор среды и ее восполнение регулируется внутри стерильной закрытой системы в виде петли, для того чтобы свести к минимуму возможность загрязнения.
3. Для производства матриц больших объемов матрицы формируют из составляющих компонентов и дают образоваться гелю в бутылях для культур тканей с перемешиванием вращением. Бутыли инкубируют в статическом вертикальном положении до тех пор, пока контракция матриц не даст в результате свободно плавающие структуры (3-5 дней). Затем обновляют среду для выращивания и бутылки заполняют воздухом с 5% СО2 и помещают во вращающий аппарат в инкубаторе при 37oС. Среду для роста освежали каждые 2-3 дня до тех пор, пока не созреют ГКМ (10-25 дней инкубации в целом), после этого ГКМ помещали в среду для получения белка. Через 1-3 дня бутылки переносили в камеру с биологической защитой класса 100 и производственную питательную среду, содержащую экспрессируемый белок, асептически отбирали, не взмучивая матрицы. Эквивалентный объем свежей питательной среды для получения белка добавляют в бутылку, которую возвращают во вращаемый аппарат.
4. Составляющие ГКМ можно асептически вводить в стерильные газопроницаемые мешочки из тефлонатм через запаиваемое отверстие. Компонентам в мешочке дают образовать гель внутри мешочка и приобрести в нем форму и структуру. Мешочки инкубируют в увлажняемых термостатах при 37±1oС и 5±1% СО2. Когда ГКМ сжимаются и уменьшаются в объеме, для компенсации восполняют объем средой для роста. Отбор среды и ее обновление выполняется через стерильно соединяемые системы трубок, встроенных в мешочки. Использование снабженных отверстиями инкубаторов и протяженных трубопроводов должно дать возможность создания циклической насосной системы отбора/подачи, которая могла бы исключить необходимость удаления мешочков из инкубаторов во время производственного цикла.
5. Составляющие ГКМ можно асептически вводить в сделанные по заказу термическим формованием лотки с высокообъемной вместимостью. Самой простой формой был бы открытый, имеющий крышку прямоугольный поднос с возможностями для газообмена, сконструированный для использования в инкубаторе для культур тканей с повышенным содержанием СО2. Другая конструкция могла бы включать систему закрытой петли с отверстиями для доступа к резервуару со средой для регуляции подачи и отбора среды, похожую на камеру биореактора.
Другие варианты воплощения изобретения
Гибридные матрицы этого изобретения подходят для выделения (доставки в организм) широкого ряда продуктов клеток, включая не только чГР, но также фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина (ЭПО), альбумина, гемоглобина, альфа-1-антитрипсина, кальцитонина, глюкоцереброзидазы, рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), рецепторов ИЛ-2 (IL-2), глобина, иммуноглобулина, каталитических антител, интерлейкинов, инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), паратиреоидного гормона (ПТГ), лептина, интерферонов, факторов роста нервов, основного фактора роста фибробластов (оФРФ), кислого ФРФ (кФРФ), эпидермального фактора роста (ЭФР), фактора роста эндотелиальных клеток, фактора роста, получаемого из тромбоцитов (ФРПТ), факторов трансформации роста, фактора эндотелиальных клеток, стимулирующего ангиогенез (ЭФСА), ангиогенина, активатора тканевого плазминогена (т-АП), колониесхгимулирующего фактора гранулоцитов (Г-КСФ), колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ). Например, клетки, помещенные в матрицу, могут быть бета-клетками поджелудочной железы, которые природно секретируют инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови и которые поэтому могут восполнять неадекватное выделение инсулина у пациентов с диабетом и преддиабетическим состоянием. Альтернативно они могут быть клетками любого типа, генетически сконструированными для экспрессии и секреции высоких уровней необходимого полипептида, такого как фактор свертывания крови, в организме пациента. Такая конструкция может находиться под контролем структурно активируемого промотора или соответственно физиологически или фармакологически регулируемого промотора.
Гибридные матрицы этого изобретения подходят для выделения (доставки в организм) широкого ряда продуктов клеток, включая не только чГР, но также фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина (ЭПО), альбумина, гемоглобина, альфа-1-антитрипсина, кальцитонина, глюкоцереброзидазы, рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), рецепторов ИЛ-2 (IL-2), глобина, иммуноглобулина, каталитических антител, интерлейкинов, инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), паратиреоидного гормона (ПТГ), лептина, интерферонов, факторов роста нервов, основного фактора роста фибробластов (оФРФ), кислого ФРФ (кФРФ), эпидермального фактора роста (ЭФР), фактора роста эндотелиальных клеток, фактора роста, получаемого из тромбоцитов (ФРПТ), факторов трансформации роста, фактора эндотелиальных клеток, стимулирующего ангиогенез (ЭФСА), ангиогенина, активатора тканевого плазминогена (т-АП), колониесхгимулирующего фактора гранулоцитов (Г-КСФ), колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ). Например, клетки, помещенные в матрицу, могут быть бета-клетками поджелудочной железы, которые природно секретируют инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови и которые поэтому могут восполнять неадекватное выделение инсулина у пациентов с диабетом и преддиабетическим состоянием. Альтернативно они могут быть клетками любого типа, генетически сконструированными для экспрессии и секреции высоких уровней необходимого полипептида, такого как фактор свертывания крови, в организме пациента. Такая конструкция может находиться под контролем структурно активируемого промотора или соответственно физиологически или фармакологически регулируемого промотора.
Часть матрицы из коллагенового геля может целиком состоять из нерастворимых коллагеновых фибрилл или может содержать другие компоненты в дополнение к коллагену: например, агарозу, альгинат; гликозаминогликан, такой как гиалуроновая кислота, гепарансульфат, дерматансульфат или хондроитинсульфат; сульфатированный протеогликан; фибринонектин; ламинин; эластин; фибрин или тенасцин. Такие компоненты (особенно те, которые найдены в межклеточном матриксе тканей животных) способствуют структурной стабильности гибридных матриц этого изобретения и/или обеспечивают дополнительную способность связывания для клеток в матрицах и с тканями хозяина в месте имплантации. Они должны включаться в матрицы путем смешивания с раствором коллагена перед образованием геля.
Другие потенциальные добавки включают цитокины и/или факторы роста, которые применимы для оптимизации сохранения клеток или стимуляции благоприятного взаимодействия с тканями хозяина (например, васкуляризации), включая оФРФ (bFGF), КФРФ (aFGF), фактор роста эндотелиальных клеток (ФРЭК) (PDGF), фактор эндотелиальных клеток, стимулирующий ангиогенез (ЭСАФ) (ESAF), лейкотриен С4, простагландины (например, ПГЕ1 (PGE1), ПГЕ2 (PGE2) ), ИФР-1 (IGF-1), ГКСФ (GCSF), ангиогенин, ТГФ-α (TGF-α), ТГФ-β (TGF-β), аскорбиновая кислота, ЭФР (EGF) и онкостатин М. Эти добавки могут включаться в матрицу путем их смешивания с раствором коллагена перед образованием геля, путем их введения в промежуточное пространство микросфер или путем включения их в среду, которая омывает матрицы.
В качестве альтернативы могут быть генетически сконструированы для экспрессии желаемого продукта. Например, клетки матрицы могут быть сотрансфицированы ДНК, кодирующей фактор ангиогенеза, и ДНК, кодирующей второй терапевтический белок, или единственным вектором, кодирующим оба типа белков, связанным с подходящими регулирующими экспрессию последовательностями.
Коллаген, используемый в геле, может быть любого подходящего типа (например, типа I-XI) или смесью любых двух или более. В форму перед образованием геля из коллагена могут быть помещены волокна, так что они становятся интегральной частью матрикса и способствуют прочности матрицы и удобству обращения с ней. В обычном случае волокна могли бы быть изготовлены в основном из коллагена (например, кетгута) или неколлагенового материала, такого как найлон, дакрон, политетрафторэтилен (Gore-Texтм или Teflonтм), полигликолевая кислота, смесь полимолочной/полигликолевой кислот (Vicrylтм), полистирол, поливинилхлоридный сополимер, целлюлоза (например, хлопок или лен), полиэфир, гидратцеллюлоза или шелк. Волокна могут быть сплетены в сетку или ткань или использованы в виде нитей.
Вместо микросфер из коллагена типа I, описанных в вышеприведенных примерах, можно использовать микросферы, состоящие главным образом из коллагена другого типа, полистирола, декстрана (например, Cytodexтм, Pharmacia), полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона, стекла (покрытого веществом, таким как коллаген, которое способствует связыванию клеток) или комбинаций коллагена с любым из вышеперечисленных. Такие микросферы коммерчески доступны или могут быть изготовлены стандартными способами и затем простерилизованы для использования в гибридных матрицах этого изобретения.
Другие варианты воплощения данного изобретения находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.
Claims (84)
1. Изделие, включающее основу из матричного материала, содержащего нерастворимые коллагеновые фибриллы и расположенные в ней: (а) множество культивируемых клеток млекопитающих, сконструированных для экспрессии полипептида, и (б) множество микросфер.
2. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих выбираются из группы, состоящей из адипоцитов, астроцитов, клеток сердечной мышцы, хондроцитов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, фибробластов, ганглиоцитов, железистых клеток, глиальных клеток, гематопоэтических клеток, гепатоцитов, кератиноцитов, миобластов, нервных клеток, остеобластов, бета-клеток поджелудочной железы, клеток почек, клеток гладких мышц, клеток поперечно-полосатых мышц и предшественников любых из приведенных выше клеток.
3. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются человеческими клетками.
4. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными клетками, содержащими экзогенную ДНК, кодирующую указанный полипептид.
5. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными клетками, содержащими экзогенную ДНК, которая включает в себя регуляторную последовательность, которая активирует экспрессию гена, кодирующего указанный полипептид, причем указанный ген является эндогенным для указанных клеток позвоночных как до, так и после их трансфекции.
6. Изделие по п.4, отличающееся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из ферментов, гормонов, цитокинов, колониестимулирующих факторов, вакцинных антигенов, антител, факторов свертывания крови, регуляторных белков, факторов транскрипции, рецепторов и структурных белков.
7. Изделие по п.4, отличающееся тем, что полипептид является фактором ангиогенеза.
8. Изделие по п.4, отличающееся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из человеческого гормона роста, фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина и инсулина.
9. Изделие по п.5, отличающееся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из человеческого гормона роста, фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина и инсулина.
10. Изделие по п.4, отличающееся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из альфа-1-антитрипсина, кальцитонина, глюкоцереброзидазы, рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛНП), рецепторов ИЛ-2 (IL2), глобина, иммуноглобулина, каталитических антител, интерлейкинов, инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), паратиреоидного гормона (РТН), лептина интерферонов, факторов роста нервов, основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислотного фибробластного фактора роста (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста клеток эндотелия, фактора роста, производимого тромбоцитами (РDGF), трансформирующих факторов роста, стимулирующего развитие сосудов фактора эндотелиальных клеток (ESAF), антиогенина, тканевого активатора плазминогена (t-РА), колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF) и колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF).
11. Изделие по п.1, отличающееся тем, что микросферы являются гранулами коллагена типа 1.
12. Изделие по п.1, отличающееся тем, что большая часть микросфер имеет диаметр между примерно 0,1 и примерно 2 мм.
13. Изделие по п.1, отличающееся тем, что коллаген в матричном материале представлен коллагеном типа I.
14. Изделие по п.13, отличающееся тем, что матричный материал дополнительно включает вещество, выбираемое из группы, состоящей из коллагена второго типа, агарозы, альгината, фибронектина, ламинина, гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, дерматансульфата, сульфатированных протеогликанов, фибрина, эластина и тенасцина.
15. Изделие по п.1, отличающееся тем, что в корпусе матричного материала дополнительно дисперигированы неколлагеновые волокна.
16. Изделие по п.15, отличающееся тем, что неколлагеновые волокна состоят из материала, выбранного из группы, состоящей из найлона, дакрона, политетрафторэтилена, полигликолевой кислоты, смеси полимолочной/полигликолевой кислот, полистирола, поливинилхлоридного сополимера, кетгута, хлопка, льна, полиэфира и шелка.
17. Изделие по п.1, отличающееся тем, что изделие помещается в организм млекопитающего.
18. Изделие по п.1, отличающееся тем, что сконструировано для имплантации пациенту.
19. Изделие по п.18, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих получены из одной или более клеток, взятых у пациента.
20. Изделие по п.18, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих состоят из клоновой популяции.
21. Изделие по п.18, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными клетками, содержащими экзогенную ДНК, кодирующую полипептид.
22. Изделие по п.18, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными клетками, содержащими экзогенную ДНК, которая включает в себя регуляторную последовательность, которая активирует экспрессию эндогенного гена, кодирующего полипептид, причем указанный ген является эндогенным для указанных клеток позвоночных как до, так и после их трансфекции.
23. Изделие по п.11, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными человеческими клетками, а коллаген в матричном материале является коллагеном типа I.
24. Изделие по п.1, в котором каждая из микросфер состоит в основном из одного или нескольких веществ, выбранных из группы, состоящей из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла.
25. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются фибробластами.
26. Изделие по п. 1, отличающееся тем, что микросферы имеют приблизительно сферическую форму.
27. Изделие по п.1, отличающееся тем, что дополнительно включает, по меньшей мере, одну добавку, выбранную из группы, состоящей из фактора, усиливающего васкуляризацию, цитокина, фактора роста и аскорбиновой кислоты.
28. Изделие по п.27, отличающееся тем, что добавка выбрана из группы, состоящей из основного фибробластного фактора роста (bFGF), кислотного фибробластного фактора роста (aFGF), фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), эндотелиоцитарного стимулирующего ангиогенез фактора (ESAF), лейкотриена С4, простагландина, инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ангиогенина, трансформирующего рост фактора-α (TGF-α), трансформирующего рост фактора-β (ТGF-β), эпидермального фактора роста (EGF) и онкостатина М.
29. Изделие по п.27, отличающееся тем, что добавка представляет собой bFGF или PDGF.
30. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих генетически сконструированы для экспрессии, кроме полипептида, по меньшей мере, одного агента, выбранного из группы, состоящей из фактора, который усиливает васкуляризацию, цитокина и фактора роста.
31. Изделие по п.30, отличающееся тем, что агент выбран из группы, состоящей из bFGF, aFGF, фактора роста эндотелиальных клеток, PDGF, ESAF, IGF-1, G-CSF, ангиогенина, TCF-α, TGF-β, EGF и онкостатина М.
32. Изделие по п.30, отличающееся тем, что агент представляет собой bFGF или PDGF.
33. Изделие по п.1, отличающееся тем, что культивируемые клетки млекопитающих котрансфицированы ДНК, кодирующей полипептид, и ДНК, кодирующей указанный агент.
34. Способ изготовления изделия по п.1, включающий формирование смеси, состоящей из (а) множества культивируемых клеток млекопитающих, генетически сконструированных для экспрессии полипептида; (б) множества микросфер и (в) раствора, содержащего растворимый коллаген; воздействие на растворимый коллаген в смеси условиями, эффективными для образования геля, и выдерживание геля в условиях культивирования, которые заставляют гель сокращаться в объеме, с образованием корпуса изделия.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что клетки выбираются из группы, состоящей из адипоцитов, астроцитов, клеток сердечной мышцы, хондроцитов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, фибробластов, ганглиоцитов, железистых клеток, глиальных клеток, гематопоэтических клеток, гепатоцитов, кератиноцитов, миобластов, нервных клеток, остеобластов, бета-клеток поджелудочной железы, клеток почек, клеток гладких мышц, клеток поперечно-полосатых мышц и предшественников любых из приведенных выше клеток.
36. Способ по п.34, отличающийся тем, что микросферы являются пористыми коллагеновыми гранулами.
37. Способ по п.34, отличающийся тем, что раствор дополнительно включает вещество, выбранное из группы, состоящей из коллагена второго типа, агарозы, альгината, фибронектина, ламинина, гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, дерматансульфата, сульфатированных протеогликанов, фибрина, эластина и тенасцина.
38. Способ по п.34, отличающийся тем, что раствор является кислым водным раствором растворимого коллагена, а гелеобразование выполняют путем повышения рН раствора.
39. Способ по п.34, отличающийся тем, что стадия гелеобразования происходит в форме, так что перед стадией сокращения объема гель принимает ее форму.
40. Способ по п.34, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих и микросферы культивируют вместе перед смешиванием с раствором.
41. Способ по п.34, отличающийся тем, что каждая из множества микросфер состоит первично из одного или нескольких веществ, выбранных из группы, состоящей из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла.
42. Способ введения полипептида, указанного в п.1, пациенту, нуждающемуся в этом, включающий имплантацию изделия по п.1, в котором клетки секретируют полипептид.
43. Способ по п.42, отличающийся тем, что клетки получены из одной или более клеток, взятых у пациента, и трансфицированы in vitro экзогенной ДНК, кодирующей данный полипептид.
44. Способ по п.42, отличающийся тем, что имплантацию проводят под кожу пациента.
45. Способ по п.42, отличающийся тем, что имплантацию проводят во внутрибрюшинное, в субренально-капсулярное, паховое, внутримышечное, интравентрикулярное или интратекальное пространство пациента.
46. Способ по п.42, отличающийся тем, что полипептид является полипептидом, стимулирующим заживление ран, а имплантацию проводят в место образовавшейся у пациента раны.
47. Способ введения полипептида, указанного в п.1, пациенту, нуждающемуся в этом, включающий создание экстракорпорального устройства, включающего (а) изделие по п.1, в котором клетки секретируют полипептид, и (б) средство для отвода крови из кровеносного сосуда пациента к изделию и затем возврата в кровеносный сосуд пациента и отвода части крови пациента через указанное устройство и обратно в кровоток пациента, так что полипептид смешивается с кровью.
48. Способ получения полипептида, указанного в п.1, включающий использование изделия по п.1 в условиях, в которых культивируемые клетки млекопитающих экспрессируют и секретируют полипептид; контактирование изделия с жидкостью, так что культивируемые клетки млекопитающих секретируют полипептид в эту жидкость, и получение полипептида из жидкости.
49. Способ сохранения клеток, включающий криоконсервацию изделия по п.1 и хранение изделия при температуре ниже 0oС.
50. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанная смесь содержит суспендированные в водном растворе коллагена (а) множество культивируемых клеток млекопитающих, сконструированных для экспрессии полипептида, и (b) множество микросфер, причем в этой смеси находится достаточное количество коллагена для превращения смеси в гель при рН выше 5.
51. Способ п. 50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих выбраны из группы, состоящей из адипоцитов, астроцитов, клеток сердечной мышцы, хондроцитов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток, фибробластов, ганглиоцитов, железистых клеток, глиальных клеток, гемопоэтических клеток, гепатоцитов, кератиноцитов, миобластов, нервных клеток, остеобластов, бета-клеток поджелудочной железы, почечных клеток, клеток гладких мышц, клеток поперечно-полосатых мышц и предшественников любых из приведенных выше клеток.
52. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются человеческими клетками.
53. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки являются трансфицированными клетками, содержащими экзогенную ДНК, кодирующую указанный полипептид.
54. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными клетками, содержащими экзогенную ДНК, которая включает в себя регуляторную последовательность, которая активирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, причем указанный ген является эндогенным для указанных клеток позвоночных как до, так и после их трансфекции.
55. Способ по п.53, отличающийся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из ферментов, гормонов, цитокинов, колониестимулирующих факторов, вакцинных антигенов, антител, факторов свертывания, регуляторных белков, факторов транскрипции, рецепторов и структурных белков.
56. Способ по п.53, отличающийся тем, что полипептид является фактором ангиогенеза.
57. Способ по п.53, отличающийся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина и инсулина.
58. Способ по п.53, отличающийся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, фактора VIII, фактора IX, эритропоэтина и инсулина.
59. Способ по п.50, отличающийся тем, что полипептид выбран из группы, состоящей из альфа-1-антитрипсина, кальцитонина, глюкоцереброзидазы, рецептора липопротеина низкой плотности (ЛНП), рецептора IL-2, глобина, иммуноглобулина, каталитических антител, интерлейкинов, инсулиноподобного фактора роста1(IGF-1), паратиреоидного гормона (PTH), лептина, интерферонов, фактора роста нервов, основного фибробластного фактора роста (bFGF), кислотного фибробластного фактора роста (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), трансформирующих факторов роста, эндотелиоцитарного стимулирующего ангиогенез фактора (ESAF), ангиогенина, тканевого активатора плазминогена (t=PA), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).
60. Способ по п.50, отличающийся тем, что микросферы являются гранулами коллагена типа I.
61. Способ по п.50, отличающийся тем, что большинство микросфер имеют диаметр между приблизительно 0,1 и приблизительно 2 мм.
62. Способ по п.50, отличающийся тем, что коллаген является коллагеном типа I.
63. Способ по п.62, отличающийся тем, что смесь дополнительно содержит вещество, выбранное из группы, состоящей из коллагена типа II, агарозы, альгината, фибронектина, ламинина, гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, дерматансульфата, сульфатированных протеогликанов, фибрина, эластина и тенасцина.
64. Способ по п.50, отличающийся тем, что смесь дополнительно содержит неколлагеновые волокна.
65. Способ по п.64, отличающийся тем, что неколлагеновые волокна содержат материал, выбранный из группы, состоящей из найлона, дакрона, политетрафторэтилена, полигликолевой кислоты, смеси полимолочной/полигликолевой кислот, полистирола, сополимера поливинилхлорида, кетгута, хлопка, льна, полиэфира и шелка.
66. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих получены из одной или нескольких клеток, взятых из пациента.
67. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих состоят из клоковой популяции.
68. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих являются трансфицированными клетками человека, а растворимый коллаген является коллагеном типа I.
69. Способ п. 50, отличающийся тем, что каждая из множества микросфер состоит первично из одного или нескольких веществ, выбранных из группы, состоящей из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла.
70. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемыми клетками млекопитающих являются фибробласты.
71. Способ по п. 50, отличающийся тем, что микросферы имеют приблизительно сферическую форму.
72. Способ по п.50, отличающийся тем, что смесь дополнительно содержит, по меньшей мере, одну добавку, выбранную из группы, состоящей из фактора, который усиливает васкуляризацию, цитокина, фактора роста и аскорбиновой кислоты.
73. Способ по п.72, отличающийся тем, что добавка выбрана из группы, состоящей из основного фибробластного фактора роста (bFGF), кислотного фибробластного фактора роста (aFGF), фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), эндотелиоцитарного стимулирующего ангиогенез фактора (ESAF), лейкотриена С4, простагландина, инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ангиогенина, трансформирующего рост фактора-α (TGF-α), трансформирующего рост фактора-β (TGF-β), эпидермального фактора роста (EGF) и онкостатина М.
74. Способ по п. 72, отличающийся тем, что добавка представляет собой bFGF или PDGF.
75. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих генетически сконструированы для экспрессии, кроме полипептида, по меньшей мере, одного агента, выбранного из группы, состоящей из фактора, который усиливает васкуляризацию, цитокина и фактора роста.
76. Способ по п.75, отличающийся тем, что агент выбран из группы, состоящей из bFGF, aFGF, фактора роста эндотелиальных клеток, PDGF, ESAF, IGF-1, G-CSF, ангиогенина, TCF-α, TGF-β, EGF и онкостатина М.
77. Способ по п.75, отличающийся тем, что этот агент представляет собой bFGF или PDGF.
78. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих котрансфицированы ДНК, кодирующей полипептид, и ДНК, кодирующей агент, выбранный из группы, состоящей из фактора, который усиливает васкуляризацию, цитокина и фактора роста.
79. Способ по п.50, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих трансфицированы единой ДНК, кодирующей как полипептид, так и агент, выбранный из группы, состоящей из фактора, который усиливает васкуляризацию, цитокина и фактора роста.
80. Способ по п.34, отличающийся тем, что формование смеси, указанной в п.50, предусматривает объединение (а) множества культивируемых клеток позвоночных, генетически сконструированных для экспрессии полипептида; (b) множества микросфер и (с) раствора, содержащего растворимый коллаген, причем в этой смеси находится достаточное количество коллагена для превращения смеси в гель при рН выше 5.
81. Способ по п.80, отличающийся тем, что микросферы являются пористыми коллагеновыми гранулами.
82. Способ по п.80, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит вещество, выбранное из группы, состоящей из коллагена типа II, агарозы, альгината, фибронектина, ламинина, гиалуроновой кислоты, гепарансульфата, деоматансульфата, сульфатированных протеогликанов, фибрина, эластина и тенасцина.
83. Способ по п.80, отличающийся тем, что культивируемые клетки млекопитающих культивируют в присутствии микросфер перед смешиванием с раствором.
84. Способ по п.80, отличающийся тем, что каждая из множества микросфер состоит первично из одного или нескольких веществ, выбранных из группы, состоящей из коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона и стекла.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/548.002 | 1995-10-25 | ||
US08/548,002 US5965125A (en) | 1995-10-25 | 1995-10-25 | Hybrid matrix implants and explants |
US08/548,002 | 1995-10-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98109891A RU98109891A (ru) | 2000-03-27 |
RU2201765C2 true RU2201765C2 (ru) | 2003-04-10 |
Family
ID=24187023
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98109891/14A RU2201765C2 (ru) | 1995-10-25 | 1996-10-25 | Гибридные матричные имплантаты и эксплантаты |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5965125A (ru) |
EP (1) | EP0917428A4 (ru) |
JP (1) | JP2000501299A (ru) |
CN (1) | CN1199567C (ru) |
AU (1) | AU706563B2 (ru) |
BR (1) | BR9611248A (ru) |
NO (1) | NO326107B1 (ru) |
NZ (1) | NZ321417A (ru) |
RU (1) | RU2201765C2 (ru) |
WO (1) | WO1997015195A1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2449799C2 (ru) * | 2009-10-30 | 2012-05-10 | Федеральное Государственное Учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Средство для осуществления терапевтического ангиогенеза и способ его осуществления |
RU2545331C2 (ru) * | 2010-03-17 | 2015-03-27 | Амсилк Гмбх | Способ получения полимерсодержащих волокон |
RU2722744C1 (ru) * | 2019-03-26 | 2020-06-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ НМИЦ РК Минздрава России) | Органоспецифический биопластический материал на основе растворимой формы стабилизированного внеклеточного матрикса |
Families Citing this family (104)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9721585D0 (en) * | 1997-10-10 | 1997-12-10 | Geistlich Soehne Ag | Chemical product |
US20050186673A1 (en) * | 1995-02-22 | 2005-08-25 | Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemistrie Industrie | Collagen carrier of therapeutic genetic material, and method |
US6528483B2 (en) | 1995-06-07 | 2003-03-04 | André Beaulieu | Method of producing concentrated non-buffered solutions of fibronectin |
US6419920B1 (en) | 1995-10-25 | 2002-07-16 | Trans Karyotic Therapies, Inc. | Hybrid matrix implants and explants |
IL118376A0 (en) * | 1996-05-22 | 1996-09-12 | Univ Ben Gurion | Polysaccharide sponges for cell culture and transplantation |
US6150164A (en) * | 1996-09-30 | 2000-11-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions of a bioartificial kidney suitable for use in vivo or ex vivo |
US9155496B2 (en) | 1997-03-04 | 2015-10-13 | Dexcom, Inc. | Low oxygen in vivo analyte sensor |
US20050033132A1 (en) | 1997-03-04 | 2005-02-10 | Shults Mark C. | Analyte measuring device |
US7899511B2 (en) | 2004-07-13 | 2011-03-01 | Dexcom, Inc. | Low oxygen in vivo analyte sensor |
US20010007673A1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-07-12 | Merrill Seymour Goldenberg | Sustained-release delayed gels |
TW586934B (en) * | 1997-05-19 | 2004-05-11 | Sumitomo Pharma | Immunopotentiating composition |
GB9718415D0 (en) * | 1997-08-29 | 1997-11-05 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
US20050186283A1 (en) * | 1997-10-10 | 2005-08-25 | Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemistrie Industrie | Collagen carrier of therapeutic genetic material, and method |
US6886568B2 (en) * | 1998-04-08 | 2005-05-03 | The Johns Hopkins University | Method for fabricating cell-containing implants |
US6378527B1 (en) * | 1998-04-08 | 2002-04-30 | Chondros, Inc. | Cell-culture and polymer constructs |
US7427602B1 (en) * | 1998-05-13 | 2008-09-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Sustained DNA delivery from structural matrices |
WO2000017328A2 (en) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Isis Innovation Limited | Fibrils |
CA2370063C (en) * | 1999-03-19 | 2012-10-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Mineralization and cellular patterning on biomaterial surfaces |
US6767928B1 (en) | 1999-03-19 | 2004-07-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Mineralization and biological modification of biomaterial surfaces |
US6662805B2 (en) * | 1999-03-24 | 2003-12-16 | The Johns Hopkins University | Method for composite cell-based implants |
US6372494B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-04-16 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods of making conditioned cell culture medium compositions |
US6287340B1 (en) * | 1999-05-14 | 2001-09-11 | Trustees Of Tufts College | Bioengineered anterior cruciate ligament |
NZ518759A (en) * | 1999-10-05 | 2004-10-29 | Transkaryotic Therapies Inc | Hybrid matrices and hybrid matrix mixtures |
EP1099443A1 (en) | 1999-11-11 | 2001-05-16 | Sulzer Orthopedics Ltd. | Transplant/implant device and method for its production |
WO2001065936A1 (en) * | 2000-03-06 | 2001-09-13 | Shah Kumarpal A | Method for immune switching |
US7144729B2 (en) * | 2000-09-01 | 2006-12-05 | Dfb Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for tissue regeneration |
AR034262A1 (es) * | 2000-09-14 | 2004-02-18 | Transkaryotic Therapies Inc | Una composicion para proporcionar una mezcla fluida inyectable, un equipo, un metodo para preparacion de una mezcla de dicho equipo, un aparato para la introduccion de una mezcla en un paciente |
US6538010B1 (en) * | 2000-11-08 | 2003-03-25 | Research Triangle Institute | Compounds and methods for promoting smoking cessation |
US6444222B1 (en) * | 2001-05-08 | 2002-09-03 | Verigen Transplantation Services International Ag | Reinforced matrices |
CA2388723C (en) * | 2001-06-06 | 2012-10-23 | Becton, Dickinson & Company | Method of providing a substrate with a ready-to-use, uniformly distributed extracellular matrix |
US7160726B2 (en) * | 2001-06-07 | 2007-01-09 | Skin Medica, Inc. | Compositions comprising conditioned cell culture media and uses thereof |
WO2003007847A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-01-30 | Depuy Products, Inc. | Hybrid biologic-synthetic bioabsorable scaffolds |
EP1416886A4 (en) * | 2001-07-16 | 2007-04-18 | Depuy Products Inc | SCAFFOLD AND METHOD FOR CARTILAGE REPAIR AND REGENERATION |
EP1416866A4 (en) * | 2001-07-16 | 2007-04-18 | Depuy Products Inc | DEVICES FROM NATURALLY OBTAINING MEANS OF BIOLOGICAL ORIGIN |
EP1416874A4 (en) * | 2001-07-16 | 2007-04-18 | Depuy Products Inc | BIOLOGICAL / SYNTHETIC POROUS EXTRACELLULAR HYBRID MATRIX SCUFF |
US6867189B2 (en) * | 2001-07-26 | 2005-03-15 | Genset S.A. | Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders |
US7217570B2 (en) * | 2001-08-23 | 2007-05-15 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Organotypic intestinal culture and methods of use thereof |
US7332330B2 (en) * | 2001-09-11 | 2008-02-19 | Renamed Biologics, Inc. | Device for maintaining vascularization near an implant |
US20040031067A1 (en) * | 2001-10-11 | 2004-02-12 | Meenhard Herlyn | Regulation of human skin healing |
US20030166274A1 (en) * | 2001-11-15 | 2003-09-04 | Hewitt Charles W. | Three-dimensional matrix for producing living tissue equivalents |
US6902932B2 (en) * | 2001-11-16 | 2005-06-07 | Tissue Regeneration, Inc. | Helically organized silk fibroin fiber bundles for matrices in tissue engineering |
US10022078B2 (en) | 2004-07-13 | 2018-07-17 | Dexcom, Inc. | Analyte sensor |
WO2003075790A2 (en) * | 2002-03-08 | 2003-09-18 | The University Of Texas Health Science Center At San Antonio | Gas-plasma treatment of implants |
US7442546B2 (en) * | 2002-03-15 | 2008-10-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of modulating inflammatory response |
US7431922B2 (en) * | 2002-03-29 | 2008-10-07 | Tissuegene, Inc. | Bioadhesive directed somatic cell therapy |
WO2003089566A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Tufts University | Multi-dimensional strain bioreactor |
US7459152B2 (en) * | 2003-04-23 | 2008-12-02 | Rush University Medical Center | Erythropoietin administration to improve graft survival |
US7715893B2 (en) | 2003-12-05 | 2010-05-11 | Dexcom, Inc. | Calibration techniques for a continuous analyte sensor |
US7651596B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-01-26 | Dexcom, Inc. | Cellulosic-based interference domain for an analyte sensor |
US7591801B2 (en) | 2004-02-26 | 2009-09-22 | Dexcom, Inc. | Integrated delivery device for continuous glucose sensor |
US7920906B2 (en) | 2005-03-10 | 2011-04-05 | Dexcom, Inc. | System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration |
US7897384B2 (en) * | 2003-09-08 | 2011-03-01 | Ethicon, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
US7927599B2 (en) * | 2003-09-08 | 2011-04-19 | Ethicon, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
US8257963B2 (en) * | 2007-06-01 | 2012-09-04 | Depuy Mitek, Inc. | Chondrocyte container and method of use |
EP1670897A4 (en) * | 2003-09-24 | 2008-02-27 | Univ Leland Stanford Junior | IGF-1 MULTIPOTENTE ADULTS HAS NEW NEURAL CNS STEM CELLS INTO AN OLIGOD DROGLIA CELLINE |
US9247900B2 (en) | 2004-07-13 | 2016-02-02 | Dexcom, Inc. | Analyte sensor |
US8423114B2 (en) | 2006-10-04 | 2013-04-16 | Dexcom, Inc. | Dual electrode system for a continuous analyte sensor |
US11633133B2 (en) | 2003-12-05 | 2023-04-25 | Dexcom, Inc. | Dual electrode system for a continuous analyte sensor |
WO2009048462A1 (en) | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Dexcom, Inc. | Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor |
US8808228B2 (en) | 2004-02-26 | 2014-08-19 | Dexcom, Inc. | Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor |
US7654956B2 (en) | 2004-07-13 | 2010-02-02 | Dexcom, Inc. | Transcutaneous analyte sensor |
PT1781264E (pt) | 2004-08-04 | 2013-10-16 | Evonik Corp | Métodos para o fabrico de dispositivis de administração e dispositivos para a mesma |
WO2006073514A2 (en) * | 2004-08-25 | 2006-07-13 | Tufts University | Compositions, methods and kits for repressing virulence in gram positive bacteria |
US8744546B2 (en) | 2005-05-05 | 2014-06-03 | Dexcom, Inc. | Cellulosic-based resistance domain for an analyte sensor |
WO2006124770A2 (en) * | 2005-05-13 | 2006-11-23 | The Feinstein Institute For Medical Research | Treatment of sepsis and inflammation with alpha2a adrenergic antagonists |
JP2009508596A (ja) | 2005-09-19 | 2009-03-05 | ヒストジェニックス コーポレイション | 細胞支持基材及びその調製方法 |
US20070148144A1 (en) * | 2005-10-27 | 2007-06-28 | Mason James M | Gene-enhanced tissue engineering |
US9757061B2 (en) | 2006-01-17 | 2017-09-12 | Dexcom, Inc. | Low oxygen in vivo analyte sensor |
WO2008075206A2 (en) * | 2006-05-19 | 2008-06-26 | The University Of Hong Kong | Cell-matrix microspheres, methods for preparation and applications |
US20080138416A1 (en) * | 2006-06-13 | 2008-06-12 | Fmc Biopolymer As | Method and systems for using biopolymer-based beads and hydrogels |
KR100803576B1 (ko) * | 2006-06-14 | 2008-02-15 | 주식회사 인피트론 | 지방줄기세포 및 지방세포를 포함한 이식용 조성물 |
KR20070122316A (ko) * | 2006-06-26 | 2007-12-31 | (주) 에스바이오메딕스 | 주사용 인체 연조직 충전제 및 이의 제조 방법 |
KR20070122315A (ko) * | 2006-06-26 | 2007-12-31 | (주) 에스바이오메딕스 | 자가 진피 세포 및 히알루론산을 함유하는 주사용 인체연조직 충전제 조성물 |
US8735154B2 (en) * | 2006-10-30 | 2014-05-27 | The University Of Kansas | Templated islet cells and small islet cell clusters for diabetes treatment |
US8562558B2 (en) | 2007-06-08 | 2013-10-22 | Dexcom, Inc. | Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor |
CN101868298B (zh) * | 2007-07-06 | 2013-02-06 | 香港大学 | 基于胶原的微球及其制备方法和用途 |
KR100956267B1 (ko) * | 2007-12-12 | 2010-05-07 | 주식회사 에이프로테크놀로지 | 엘라스틴을 안정화제로서 함유하는 반유동성 이식용 조성물 |
WO2009078022A2 (en) * | 2007-12-17 | 2009-06-25 | Izun Pharmaceuticals Corporation | Synergistic combinations of growth factors with herbal compositions for the enhancement of tissue repair |
CA2709712C (en) | 2007-12-20 | 2016-05-10 | Surmodics Pharmaceuticals, Inc. | Process for preparing microparticles having a low residual solvent volume |
US9402724B2 (en) * | 2008-05-12 | 2016-08-02 | Mo-Sci Corporation | Dynamic bioactive nanofiber scaffolding |
CA2734922C (en) | 2008-09-15 | 2020-01-14 | Laetitia Malphettes | Compositions comprising polynucleotides comprising hybrid osmo-responsive transcriptional regulatory elements and methods for producing a protein under conditions of hyperosmolarity |
US9889230B2 (en) * | 2008-10-17 | 2018-02-13 | Covidien Lp | Hemostatic implant |
US9308070B2 (en) | 2008-12-15 | 2016-04-12 | Allergan, Inc. | Pliable silk medical device |
GB0912399D0 (en) * | 2009-07-16 | 2009-08-26 | Ucl Business Plc | Polymeric collagen biomaterials |
US8597948B2 (en) | 2011-03-10 | 2013-12-03 | First Principles, Inc. | Cloned biological material medical device and method thereof |
WO2012145594A2 (en) * | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Trustees Of Tufts College | Molded regenerated silk geometries using temperature control and mechanical processing |
KR101327630B1 (ko) * | 2012-03-05 | 2013-11-13 | 울산대학교 산학협력단 | 아텔로콜라겐을 이용한 췌도세포 이식용 담체의 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 인공췌장 |
KR102556951B1 (ko) * | 2013-05-08 | 2023-07-18 | 인리젠 | 단리된 신장 세포를 포함하는 오가노이드 및 이의 용도 |
CA2913074C (en) | 2013-05-30 | 2023-09-12 | Graham H. Creasey | Topical neurological stimulation |
US11229789B2 (en) | 2013-05-30 | 2022-01-25 | Neurostim Oab, Inc. | Neuro activator with controller |
US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
US9238090B1 (en) | 2014-12-24 | 2016-01-19 | Fettech, Llc | Tissue-based compositions |
US11077301B2 (en) | 2015-02-21 | 2021-08-03 | NeurostimOAB, Inc. | Topical nerve stimulator and sensor for bladder control |
US10973956B2 (en) | 2017-01-05 | 2021-04-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Microporous hydrogel scaffolds for cell transplantation |
EP3928687B1 (en) | 2017-10-24 | 2024-06-26 | Dexcom, Inc. | Wearable device with pre-connected analyte sensor |
US11331022B2 (en) | 2017-10-24 | 2022-05-17 | Dexcom, Inc. | Pre-connected analyte sensors |
JP2021510608A (ja) | 2017-11-07 | 2021-04-30 | ニューロスティム オーエービー インコーポレイテッド | 適応回路を有する非侵襲性神経アクティベーター |
CN111787907A (zh) * | 2018-02-22 | 2020-10-16 | 维多利亚大学工业合作股份有限公司 | 释放形态发生化合物的微球及其在生物墨水中的应用 |
CN108690205A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-10-23 | 深圳市第二人民医院 | 一种ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶及其制备和应用 |
KR20220025834A (ko) | 2019-06-26 | 2022-03-03 | 뉴로스팀 테크놀로지스 엘엘씨 | 적응적 회로를 갖는 비침습적 신경 활성화기 |
CN114728161A (zh) | 2019-12-16 | 2022-07-08 | 神经科学技术有限责任公司 | 具有升压电荷输送的非侵入性神经激活器 |
CN111203115B (zh) * | 2020-01-07 | 2022-02-11 | 天津市第三中心医院 | 一种氧化多糖抗凝涂层血液透析膜材料及其制备方法 |
WO2021210026A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-21 | Vasanthi Palanivel | A cell-free growth factor concentrate, method of preparing the same and a kit thereof |
CN115785256A (zh) * | 2022-11-09 | 2023-03-14 | 武汉轻工大学 | 一种调控胶原与细胞受体结合能力的方法 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2967509D1 (en) * | 1978-12-26 | 1985-10-10 | Massachusetts Inst Technology | Skin-equivalent |
US4485096A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue-equivalent and method for preparation thereof |
US4686098A (en) * | 1984-05-14 | 1987-08-11 | Merck & Co., Inc. | Encapsulated mouse cells transformed with avian retrovirus-bovine growth hormone DNA, and a method of administering BGH in vivo |
US4604346A (en) * | 1984-10-09 | 1986-08-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy |
US4861714A (en) * | 1985-04-04 | 1989-08-29 | Verax Corporation | Weighted collagen microsponge for immobilizing bioactive material |
US4863856A (en) * | 1985-04-04 | 1989-09-05 | Verax Corporation | Weighted collagen microsponge for immobilizing bioactive materials |
US4997753A (en) * | 1985-04-04 | 1991-03-05 | Verax Corporation | Weighted collagen microsponge for immobilizing bioactive material |
US5100783A (en) * | 1985-05-10 | 1992-03-31 | Verax Corporation | Weighted microsponge for immobilizing bioactive material |
US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US4963489A (en) * | 1987-04-14 | 1990-10-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
US5266480A (en) * | 1986-04-18 | 1993-11-30 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional skin culture system |
EP0338716A3 (en) * | 1988-04-21 | 1990-04-11 | Berlex Laboratories, Inc. | Method and system for the production of non-degraded proteins from mammalian cells |
US4837379A (en) * | 1988-06-02 | 1989-06-06 | Organogenesis Inc. | Fibrin-collagen tissue equivalents and methods for preparation thereof |
IL90690A0 (en) * | 1988-09-30 | 1990-01-18 | Organogenesis Inc | Tissue equivalents and their preparation |
US5106949A (en) * | 1989-09-15 | 1992-04-21 | Organogenesis, Inc. | Collagen compositions and methods for preparation thereof |
IL95429A (en) * | 1989-09-15 | 1997-09-30 | Organogenesis | Living tissue equivalents comprising hydrated collagen lattice and a collagen gel and their production |
US5032550A (en) | 1989-10-13 | 1991-07-16 | Aluminum Company Of America | High impact resistant ceramic composite |
US5256418A (en) * | 1990-04-06 | 1993-10-26 | Organogenesis, Inc. | Collagen constructs |
US5270192A (en) * | 1991-02-07 | 1993-12-14 | Monsanto Company | Biological artificial liver |
NZ245015A (en) * | 1991-11-05 | 1995-12-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production |
SK62495A3 (en) * | 1992-11-16 | 1995-11-08 | Univ Brown Res Found | Microporous macrocapsules |
TW402639B (en) * | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
FR2708202B1 (fr) * | 1993-07-26 | 1996-03-29 | Pasteur Institut | Implant biocompatible pour l'expression chez l'homme ou chez l'animal de substances déterminées. |
US5906817A (en) * | 1993-04-21 | 1999-05-25 | Institut Pasteur | Biocompatible implant for the expression and in vivo secretion of a therapeutic substance |
FR2704236B1 (fr) * | 1993-04-21 | 1995-06-23 | Pasteur Institut | Vecteur rétroviral pour la préparation de cellules recombinantes susceptibles d'être implantées in vivo dans un but thérapeutique. |
KR100474803B1 (ko) * | 1994-01-13 | 2005-03-10 | 더 로고신 인스티튜트 | 거대캡슐화 분비세포 |
JPH10501706A (ja) * | 1994-04-04 | 1998-02-17 | コラーゲン コーポレイション | 細胞−ゲル |
-
1995
- 1995-10-25 US US08/548,002 patent/US5965125A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-10-25 WO PCT/US1996/017114 patent/WO1997015195A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-10-25 AU AU74744/96A patent/AU706563B2/en not_active Ceased
- 1996-10-25 NZ NZ321417A patent/NZ321417A/xx unknown
- 1996-10-25 JP JP9516803A patent/JP2000501299A/ja active Pending
- 1996-10-25 CN CNB961993243A patent/CN1199567C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-25 RU RU98109891/14A patent/RU2201765C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-10-25 EP EP96936960A patent/EP0917428A4/en not_active Withdrawn
- 1996-10-25 BR BR9611248-4A patent/BR9611248A/pt not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-04-24 NO NO19981859A patent/NO326107B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-05-14 US US09/312,246 patent/US6472181B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-02 US US10/188,628 patent/US6582391B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2449799C2 (ru) * | 2009-10-30 | 2012-05-10 | Федеральное Государственное Учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Средство для осуществления терапевтического ангиогенеза и способ его осуществления |
RU2545331C2 (ru) * | 2010-03-17 | 2015-03-27 | Амсилк Гмбх | Способ получения полимерсодержащих волокон |
RU2722744C1 (ru) * | 2019-03-26 | 2020-06-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ НМИЦ РК Минздрава России) | Органоспецифический биопластический материал на основе растворимой формы стабилизированного внеклеточного матрикса |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR9611248A (pt) | 1999-12-28 |
NO981859L (no) | 1998-06-24 |
US6472181B1 (en) | 2002-10-29 |
AU706563B2 (en) | 1999-06-17 |
NO326107B1 (no) | 2008-09-22 |
US5965125A (en) | 1999-10-12 |
JP2000501299A (ja) | 2000-02-08 |
CN1205613A (zh) | 1999-01-20 |
US20030077260A1 (en) | 2003-04-24 |
EP0917428A1 (en) | 1999-05-26 |
NO981859D0 (no) | 1998-04-24 |
WO1997015195A1 (en) | 1997-05-01 |
NZ321417A (en) | 2000-03-27 |
US6582391B2 (en) | 2003-06-24 |
EP0917428A4 (en) | 2002-09-18 |
AU7474496A (en) | 1997-05-15 |
CN1199567C (zh) | 2005-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2201765C2 (ru) | Гибридные матричные имплантаты и эксплантаты | |
US6419920B1 (en) | Hybrid matrix implants and explants | |
EP1221937B1 (en) | Hybrid matrices and hybrid matrix mixtures | |
AU712763B2 (en) | Delivery of bioactive compounds to an organism | |
JP2002511284A (ja) | 三次元組織の創造 | |
RU98109891A (ru) | Гибридные матричные имплантаты и эксплантаты | |
KR100864648B1 (ko) | 단백질 대사 기능을 갖는 인공 신장 및 그 제작 방법 | |
EP0186084A2 (en) | Brain-derived growth factor | |
WO1999025396A2 (en) | Hybrid tissues for tissue engineering | |
WO1989007944A1 (en) | Device for site directed neovascularization and method for same | |
AU736255B2 (en) | Hybrid matrix implants and explants | |
CA2235811C (en) | Hybrid matrix implants and explants | |
IL148962A (en) | Hybrid matrices and hybrid matrix mixtures | |
Wang et al. | In vitro circadian ANP secretion by gene transferring cells encapsulated in polycaprolactone tubes: gene chronotherapy | |
US20030180264A1 (en) | Devices and methods for delivery of a bioactive compound to an organism |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20091026 |