RU2154822C1 - Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material - Google Patents
Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material Download PDFInfo
- Publication number
- RU2154822C1 RU2154822C1 RU99109319A RU99109319A RU2154822C1 RU 2154822 C1 RU2154822 C1 RU 2154822C1 RU 99109319 A RU99109319 A RU 99109319A RU 99109319 A RU99109319 A RU 99109319A RU 2154822 C1 RU2154822 C1 RU 2154822C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- genus lactobacillus
- bacteria
- liquid
- agar
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для селективного выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого). The invention relates to medical microbiology and can be used for the selective isolation of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material (feces, vaginal discharge).
Бактерии рода Lactobacillus широко распространены в природе. Они являются типичными представителями нормальной микрофлоры организма человека и животных, содержатся во многих пищевых продуктах (молочных, мясных, растительных). Bacteria of the genus Lactobacillus are widespread in nature. They are typical representatives of the normal microflora of the human and animal body, found in many foods (dairy, meat, vegetable).
Известно, что бактерии рода Lactobacillus являются доминирующей флорой влагалища человека. Существует тесная взаимосвязь между состоянием микрофлоры родовых путей беременных и формированием эубиотической микрофлоры кишечника ребенка в неонатальном периоде. При возникновении ряда акушерско-гинекологических заболеваний как инфекционной, так и не инфекционной природы, формируются выраженные нарушения резидентной вагинальной микрофлоры. Бактериальный вагиноз, сопровождающийся резкими изменениями лактофлоры, в настоящее время рассматривается как дисбактериоз влагалища. В диагностике дисбактериоза кишечника и влагалища одним из критериев дисбактериоза служит содержание бактерий рода Lactobacillus. При проведении бактериотерапии дисбактериозов содержание бактерий рода Lactobacillus служит показателем нормализации микрофлоры. Bacteria of the genus Lactobacillus are known to be the dominant flora of the human vagina. There is a close relationship between the state of the microflora of the birth canal of pregnant women and the formation of eubiotic microflora of the intestines of the child in the neonatal period. In the event of a number of obstetric and gynecological diseases of both infectious and non-infectious nature, pronounced disorders of resident vaginal microflora are formed. Bacterial vaginosis, accompanied by abrupt changes in lactoflora, is currently regarded as vaginal dysbiosis. In the diagnosis of intestinal and vaginal dysbiosis, one of the criteria for dysbiosis is the content of bacteria of the genus Lactobacillus. When conducting bacteriotherapy of dysbiosis, the content of bacteria of the genus Lactobacillus serves as an indicator of the normalization of microflora.
В связи с тем, что перед проведением антибиотикотерапии лечащий врач должен знать, влияет ли выбранный для лечения препарат на состояние индигенной лактофлоры пациента, необходимо определение чувствительности к антибиотикам индигенных бактерий рода Lactobacillus, а для этого нужен способ выделения их из клинического материала. Due to the fact that before conducting antibiotic therapy, the attending physician must know whether the drug chosen for treatment affects the patient’s indigenous lactoflora, it is necessary to determine the sensitivity of the indigenous bacteria of the genus Lactobacillus to antibiotics, and this requires a way to isolate them from the clinical material.
Кроме того, в тех случаях, когда содержание индигенных бактерий рода Lactobacillus у пациента ниже нормы (Дисбактериоз кишечника и методы его лабораторной диагностики. - Метод. рекомендации. - Хабаровск. - 1987), ему проводят заместительную бактериотерапию эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus. Однако применение эубиотических штаммов не всегда бывает эффективным. Известно, что экзогенные бактерии рода Lactobacillus не всегда приживаются в организме хозяина. Это связано с тем, что среди бактерий рода Lactobacillus широко распространен межвидовой и даже внутривидовой антагонизм, они могут оказывать повреждающее действие на индигенную микрофлору, или наоборот, аутофлора может подавлять развитие эубиотика, что снижает его лечебный эффект (Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. //Вестн. Рос. АМН. - 1996. - N 2. - С. 60 - 65). В связи с этим, необходимо каждому пациенту до начала бактериотерапии определять биосовместимость эубиотических бактерий рода Lactobacillus с аутолактофлорой, а для этого необходим простой и доступный для осуществления в бактериологических лабораториях способ выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала. In addition, in cases where the content of indigenous bacteria of the genus Lactobacillus in a patient is below normal (Dysbacteriosis of the intestine and methods of its laboratory diagnosis. - Method. Recommendations. - Khabarovsk. - 1987), he is given bacterial replacement therapy with eubiotic strains of bacteria of the genus Lactobacillus. However, the use of eubiotic strains is not always effective. It is known that exogenous bacteria of the genus Lactobacillus do not always take root in the host organism. This is due to the fact that interspecific and even intraspecific antagonism is widespread among bacteria of the genus Lactobacillus, they can have a damaging effect on indigenous microflora, or vice versa, autoflora can inhibit the development of eubiotics, which reduces its therapeutic effect (V. Korshunov, V. Smeyanov V. .V., Efimov B.A. Rational approaches to the problem of correction of intestinal microflora. // Vestnik Ros. AMN. - 1996. -
Выделение чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) необходимо и для получения аутоштамма, на основе которого затем изготавливают бактерийный препарат для восстановления индигенной лактофлоры конкретного пациента. Считают, что применение аутоштаммов является наиболее оптимальным способом восстановления индигенной микрофлоры после антибиотикотерапии. Isolation of a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material (feces, vaginal discharge) is also necessary to obtain an auto-strain, on the basis of which a bacterial preparation is then made to restore the indigenous lactoflora of a particular patient. It is believed that the use of auto-strains is the most optimal way to restore indigenous microflora after antibiotic therapy.
Известен способ выделения бактерий рода Lactobacillus, который предусматривает посев клинического материала на поверхность плотной среды Рогоза следующего состава (в граммах на 1 литр): 25,0 дрожжевого аутолизата обыкновенного; 20,0 агар-агара; 10,0 пептона; 20,0 глюкозы; 1,0 Твин-80; 6,0 KH2PO4; 25,0 ацетата натрия; 2,0 цитрата аммония; 0,575 MgSO4; 0,12 MnSO4•2H2O; 0,034 FeSO4•7H2O; 1,32 уксусной кислоты ледяной; воды дистиллированной до 1 л; pH среды 5,4±0,1; с последующей инкубацией посевов при температуре 37oC в заполненном углекислым газом анаэростате в течение 4 суток (Ленцнер А. А., Тоом М.А., Воронина М.Н., Микельсаар М.Э. К методике выделения отдельных видов лактобацилл микрофлоры человека. //Лабораторное дело. - 1967. - N 5. - С. - 301 - 302).A known method of isolating bacteria of the genus Lactobacillus, which provides for the sowing of clinical material on the surface of a dense Rogoz medium of the following composition (in grams per 1 liter): 25.0 ordinary yeast autolysate; 20.0 agar-agar; 10.0 peptone; 20.0 glucose; 1.0 Tween-80; 6.0 KH 2 PO 4 ; 25.0 sodium acetate; 2.0 ammonium citrate; 0.575 MgSO 4 ; 0.12 MnSO 4 · 2H 2 O; 0.034 FeSO 4 • 7H 2 O; 1.32 glacial acetic acid; distilled water up to 1 l; pH of the medium 5.4 ± 0.1; followed by incubation of crops at a temperature of 37 o C in an anaerostat filled with carbon dioxide for 4 days (Lenzner A.A., Toom M.A., Voronina M.N., Mikelsaar M.E. On the method of isolating individual species of lactobacilli of human microflora // Laboratory work. - 1967. -
Недостатком этого способа является многокомпонентность состава питательной среды, что делает процесс ее изготовления трудоемким и длительным, а также то, что для создания селективности в отношении бактерий рода Lactobacillus и подавления нежелательной микрофлоры, используется ацетат натрия в высокой концентрацией (25 г/л). Вместе с тем, известно, что введение химических селективных факторов, наряду с торможением развития посторонней микрофлоры, может ингибировать рост лактобацилл. Так, при посеве фекалий, желудочного сока и вагинального отделяемого на среду Рогоза было обнаружено, что разные виды лактобацилл обладали различной всхожестью. Это объясняется различной чувствительностью отдельных штаммов лактобацилл к концентрации ацетата натрия (25 г/л) в среде Рогоза. Кроме того, культивирование посевов по этому способу осуществляют в заполненных углекислым газом анаэростатах в отсутствие кислорода, в течение 4 - 5 суток, затем колонии лактобацилл отсевают на полужидкую среду МРС-2, инкубируют при 37oC в течение 2 - 4 суток, затем делают высев на плотную среду Рогоза, инкубируют в заполненном углекислым газом анаэростате при 37oC в течение 4 - 5 суток. Для получения чистых культур выделенные штаммы лактобацилл рассевают на плотную среду Рогоза по меньшей мере 6 раз. К недостатку указанного способа относится еще и длительность процесса выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала.The disadvantage of this method is the multicomponent composition of the nutrient medium, which makes the manufacturing process time-consuming and time-consuming, as well as the use of high concentration of sodium acetate (25 g / l) to create selectivity for bacteria of the genus Lactobacillus and suppress undesirable microflora. However, it is known that the introduction of chemical selective factors, along with inhibition of the development of extraneous microflora, can inhibit the growth of lactobacilli. So, when sowing feces, gastric juice and vaginal discharge on the medium of Rogoz, it was found that different types of lactobacilli had different germination rates. This is due to the different sensitivity of individual strains of lactobacilli to the concentration of sodium acetate (25 g / l) in the medium of Rogoz. In addition, the cultivation of crops by this method is carried out in carbon dioxide-filled anaerostats in the absence of oxygen, for 4 to 5 days, then colonies of lactobacilli are screened on a semi-liquid medium MPC-2, incubated at 37 o C for 2 to 4 days, then do Sowing on a dense Rogoz medium, incubate in a carbon dioxide-filled anaerostat at 37 o C for 4 - 5 days. To obtain pure cultures, the isolated strains of lactobacilli are seeded at least 6 times on a dense Rogosa medium. The disadvantage of this method also relates to the length of the process of isolating a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material.
Известен способ выделения микроорганизмов рода Lactobacillus из клинического материала с использованием плотной среды МРС-4, содержащей (в граммах на 1 литр):
50,0 (или 5,0 сухого) дрожжевого аутолизата обыкновенного; 500,0 гидролизата обезжиренного молока жидкого; 20,0 агар-агара; 10,0 пептона; 20,0 глюкозы; 1,0 Твина-80; 2,0 K2HPO4; 5,0 ацетата натрия; 2,0 цитрата аммония; 0,2 MgSO4•7H2O; 0,05 MnSO4•4H2O; 0,2 цистеина; 100,0 печеночного экстракта; 0,04 сорбиновой кислоты; воды дистиллированной до 1 литра; 10% раствора лимонной кислоты до pH среды 5,0 - 5,1. Культивирование посевов по этому способу осуществляют в заполненных углекислым газом анаэростатах в отсутствие кислорода, в течение 4 - 5 суток, затем колонии лактобацилл отсевают на полужидкую среду МРС-2, инкубируют при 37oC в течение 2 - 4 суток, затем делают высев на плотную среду MРC-4, инкубируют в заполненном углекислым газом анаэростате при 37oC в течение 4 - 5 суток. Для получения чистых культур выделенные штаммы лактобацилл рассевают на плотную среду МРС-4 по меньшей мере 6 раз (Ленцнер А.А., Тоом М.А., Воронина М.Н., Микельсаар М.Э. К методике выделения отдельных видов лактобацилл микрофлоры человека. //Лабораторное дело. - 1967. - N 5. - С. - 301 - 302).A known method of isolating microorganisms of the genus Lactobacillus from clinical material using a dense medium MPC-4 containing (in grams per 1 liter):
50.0 (or 5.0 dry) yeast autolysate ordinary; 500.0 hydrolyzate of skim milk liquid; 20.0 agar-agar; 10.0 peptone; 20.0 glucose; 1.0 Tween-80; 2.0 K 2 HPO 4 ; 5.0 sodium acetate; 2.0 ammonium citrate; 0.2 MgSO 4 • 7H 2 O; 0.05 MnSO 4 • 4H 2 O; 0.2 cysteine; 100.0 hepatic extract; 0.04 sorbic acid; distilled water up to 1 liter; 10% citric acid solution to a pH of 5.0 - 5.1. Cultivation of crops according to this method is carried out in carbon dioxide-filled anaerostats in the absence of oxygen, for 4 to 5 days, then colonies of lactobacilli are screened on semi-liquid medium MPC-2, incubated at 37 o C for 2 to 4 days, then seeding is done on a dense MPC-4 medium, incubated in a carbon dioxide-filled anaerostat at 37 o C for 4 to 5 days. To obtain pure cultures, the isolated strains of lactobacilli are scattered on a dense medium MPC-4 at least 6 times (Lenzner A.A., Toom M.A., Voronina M.N., Mikelsaar M.E. On the method of isolating certain types of lactobacilli microflora person. // Laboratory. - 1967. -
Недостатком этого способа является многокомпонентность состава питательной среды, что делает процесс ее изготовления трудоемким и длительным, а также то, что для создания селективности в отношении бактерий рода Lactobacillus используется сорбиновая кислота, которая способна ингибировать рост некоторых штаммов лактобацилл. Исключение сорбиновой кислоты снижает селективные свойства среды, что затрудняет выделение чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала. Между тем отмечено, что в среде МРС без сорбиновой кислоты хорошо растут все виды лактобацилл. К недостатку указанного способа относится также длительность процесса выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus из клинического материала. The disadvantage of this method is the multicomponent composition of the nutrient medium, which makes the manufacturing process time-consuming and time-consuming, as well as the use of sorbic acid to inhibit the growth of bacteria of the genus Lactobacillus, which can inhibit the growth of some strains of lactobacilli. The exclusion of sorbic acid reduces the selective properties of the medium, which makes it difficult to isolate a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material. Meanwhile, it was noted that in the MPC medium without sorbic acid, all types of lactobacilli grow well. The disadvantage of this method also relates to the length of the process of isolating a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material.
Наиболее близким к заявляемому является способ накопления биомассы бактерий рода Lactobacillus на молочно-дрожжевой среде, состоящей из 500,0 г гидролизата обезжиренного молока жидкого (содержание аминного азота 200 - 250 мг%), 50,0 г дрожжевого аутолизата обыкновенного (содержание аминного азота 140 - 150 мг%), 2,0 г глюкозы, воды дистиллированной до 1 литра, pH среды 6,2, температура инкубации посевов 37 - 38oC. Молочно-дрожжевая среда применяется только для накопления биомассы бактерий рода Lactobacillus при изготовлении закваски из чистых культур (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях N 11 - 14/6-33. - Утв. 27.03.87. МЗ СССР. - М., 1987. - С. 6).Closest to the claimed is a method of accumulating biomass of bacteria of the genus Lactobacillus on a milky-yeast medium consisting of 500.0 g of hydrolyzed skim milk liquid (amine nitrogen content 200 - 250 mg%), 50.0 g ordinary yeast autolysate (amine nitrogen content 140 - 150 mg%), 2.0 g of glucose, distilled water to 1 liter, pH 6.2, incubation temperature of crops 37 - 38 o C. Milk-yeast medium is used only for the accumulation of biomass of bacteria of the genus Lactobacillus in the manufacture of starter culture cultures (Instructions on copulating Bifilakt fermented milk in dairy kitchens 11 N - 14 / 6-33 -. Approved 27/03/87 USSR Ministry of Health -... Moscow, 1987. - p 6).
Недостатком этого способа является то, что используемая питательная среда совершенно не обладает способностью подавлять рост сопутствующей бактериальной флоры. При посеве в эту среду клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) и культивировании посевов при 37oC происходит обильное размножение сопутствующей аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры, что приводит к угнетению роста бактерий рода Lactobacillus, делает невозможным накопление их в питательной среде, а при высеве со среды накопления на плотную селективную питательную среду колонии бактерий рода Lactobacillus не вырастают.The disadvantage of this method is that the nutrient medium used does not have the ability to inhibit the growth of concomitant bacterial flora. When clinical material (feces, vaginal discharge) is sown in this medium and crops are cultured at 37 ° C, copious aerobic and facultative anaerobic microflora proliferate, which leads to inhibition of the growth of bacteria of the genus Lactobacillus, making it impossible to accumulate them in a nutrient medium, and when Sowing from the accumulation medium onto a dense selective nutrient medium, colonies of bacteria of the genus Lactobacillus do not grow.
Задача изобретения - создание более простого и эффективного способа выделения бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого). The objective of the invention is the creation of a simpler and more effective way of isolating bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material (feces, vaginal discharge).
Поставленная задача достигается тем, что осуществляют накопление бактерий рода Lactobacillus из клинического материала при 39oC на жидкой селективной питательной среде обогащения состава, г/л, представленного в табл. 1, а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде состава, г/л, представленного в табл. 2, а культивирование посевов осуществляют при температуре 39oC.The problem is achieved by the fact that they carry out the accumulation of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material at 39 o C on a liquid selective nutrient enrichment medium composition, g / l, are presented in table. 1, and then carry out the isolation of lactobacilli in a dense selective nutrient medium composition, g / l, are presented in table. 2, and the cultivation of crops is carried out at a temperature of 39 o C.
Новизна заявляемого способа состоит в том, что выделение бактерий рода Lactobacillus производят в два этапа при сочетании нескольких факторов: низкого значения pH среды (5,3 - 5,5), оптимального соотношения компонентов питательной среды, повышенной температуре инкубации (39oC), культивировании посевов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода, обеспечивающих ускоренный рост бактерий рода Lactobacillus, обитающих в организме человека, и одновременно ингибирующих развитие сопутствующей микрофлоры, адаптированной к нейтральному значению pH (7,0), температуре 37oC и аэробным условиям. Развитие сопутствующей облигатной анаэробной микрофлоры в таких условиях невозможно (см. табл. 2, 3, 4).The novelty of the proposed method lies in the fact that the isolation of bacteria of the genus Lactobacillus is carried out in two stages with the combination of several factors: low pH of the medium (5.3 - 5.5), the optimal ratio of the components of the nutrient medium, increased incubation temperature (39 o C), cultivating crops in an atmosphere containing 5% carbon dioxide, 16% oxygen, providing accelerated growth of bacteria of the genus Lactobacillus that live in the human body and at the same time inhibiting the development of concomitant microflora adapted to a neutral pH value (7.0) , a temperature of 37 o C and aerobic conditions. The development of concomitant obligate anaerobic microflora in such conditions is impossible (see tab. 2, 3, 4).
Сущность способа заключается в следующем. The essence of the method is as follows.
Выделение бактерий рода Lactobacillus из клинического материала (фекалий, вагинального отделяемого) осуществляют в два этапа. Первый этап заключается в приготовлении серии 10-ти кратных разведений исследуемого материала в жидкой селективной питательной среде обогащения для накопления лактобацилл состава, приведенного в табл. 3. Isolation of bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material (feces, vaginal discharge) is carried out in two stages. The first step is to prepare a series of 10-fold dilutions of the test material in a liquid selective nutrient enrichment medium for the accumulation of lactobacilli of the composition shown in table. 3.
Разведения делают в пробирках, содержащих по 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения при помощи автоматического дозатора со съемными наконечниками, путем перенесения из пробирки в пробирку по 0,5 мл. Титрование по 0,5 мл производят до 10-8 - 10-10. После титрования посевы инкубируют в течение 24 часов при повышенном содержании углекислого газа (5%) и пониженной концентрации кислорода (16%) в атмосфере культивирования при температуре 39oC. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр лактобацилл (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г клинического материала) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. Отмечают пробирки с разведениями клинического материала, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus.Dilutions are made in tubes containing 4.5 ml of liquid selective nutrient enrichment medium using an automatic dispenser with removable tips, by transferring 0.5 ml from the tube to the tube. Titration of 0.5 ml is carried out up to 10 -8 - 10 -10 . After titration, the crops are incubated for 24 hours at a high carbon dioxide content (5%) and a low oxygen concentration (16%) in the cultivation atmosphere at a temperature of 39 o C. The result is taken into account visually, by the presence of a general turbidity of the medium or the growth of isolated colonies. Then, smears are prepared from tubes with growth, stained according to Gram. The last breeding is noted, where the growth of gram-positive rods characteristic of morphology was detected. The titer of lactobacilli (the number of bacteria of the genus Lactobacillus in 1 g of clinical material) is determined by the maximum dilution in which typical gram-positive bacilli are found. Tubes with dilutions of clinical material were noted in which abundant growth of bacteria of the genus Lactobacillus was detected.
Затем проводят второй этап - выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде. Для этого из пробирок с разведениями клинического материала, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus, осуществляют посев бактериологической петлей на поверхность плотной селективной питательной среды для получения изолированных колоний. Плотная селективная питательная среда имеет состав, г/л, представленный в табл. 4. Then, the second stage is carried out - the isolation of lactobacilli in a dense selective nutrient medium. To do this, from tubes with dilutions of clinical material in which abundant growth of bacteria of the genus Lactobacillus was detected, a bacteriological loop is sown on the surface of a dense selective nutrient medium to obtain isolated colonies. Dense selective nutrient medium has a composition, g / l, are presented in table. 4.
Культивирование посевов осуществляют при 39oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода, в течение 24 - 48 часов.Cultivation of crops is carried out at 39 o C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide, 16% oxygen, for 24 to 48 hours.
В условиях первого этапа культивирования на жидкой селективной среде происходит накопление бактерий рода Lactobacillus за счет их ускоренного роста и ингибирования роста сопутствующей микрофлоры при культивировании в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода в течение 24 часов при температуре 39oC. Лактобациллы, обитающие в организме человека в составе индигенной микрофлоры, являются термофильными и хорошо растут при 39oC. Бактерии рода Lactobacillus являются факультативными анаэробами, поэтому растут в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода. Для получения атмосферы культивирования, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, посевы помещают в герметически закрывающуюся емкость (анаэростат, эксикатор), зажигают свечу и плотно закрывают.In the conditions of the first stage of cultivation on a selective liquid medium, bacteria of the genus Lactobacillus accumulate due to their accelerated growth and inhibition of the growth of concomitant microflora when cultivated in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen for 24 hours at a temperature of 39 o C. Lactobacilli, living in the human body as part of indigenous microflora, are thermophilic and grow well at 39 o C. Bacteria of the genus Lactobacillus are facultative anaerobes, therefore they grow in an atmosphere containing 5% carbon dioxide gas, 16% oxygen. To obtain a cultivation atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen, the crops are placed in a hermetically sealed container (anaerostat, desiccator), a candle is lit and tightly closed.
Гидролизат молока жидкий (содержание аминного азота 200 - 250 мг%) в количестве 200,0 - 250,0 г/л обеспечивает подавление сопутствующей микрофлоры за счет присутствия уксусной кислоты. При замене жидкого гидролизата молока на сухой (содержание аминного азота 1485 мг%), установили, что 27,0 - 33,0 г сухого гидролизата молока и 3,3 - 3,5 г ледяной уксусной кислоты равноценны вышеуказанному количеству жидкого. Liquid milk hydrolyzate (amine nitrogen content 200 - 250 mg%) in an amount of 200.0 - 250.0 g / l provides suppression of concomitant microflora due to the presence of acetic acid. When replacing a liquid milk hydrolyzate with a dry one (amine nitrogen content 1485 mg%), it was found that 27.0 - 33.0 g of dry milk hydrolyzate and 3.3 - 3.5 g of glacial acetic acid are equivalent to the above amount of liquid.
Дрожжевой аутолизат концентрированный (содержание аминного азота 580 - 600 мг%) в количестве 100,0 - 120,0 г на 1 литр среды служит стимулятором роста и источником пластических веществ, способствующих регенерации лактобацилл, поврежденных действием селективных факторов (pH 5,4±0,1, уксусная кислота). Concentrated yeast autolysate (amine nitrogen content 580 - 600 mg%) in an amount of 100.0 - 120.0 g per 1 liter of medium serves as a growth stimulant and a source of plastic substances that promote the regeneration of lactobacilli damaged by selective factors (pH 5.4 ± 0 , 1, acetic acid).
Указанные количества гидролизата молока и дрожжевого аутолизата позволяют получить концентрацию аминного азота в питательной среде от 100 до 130 мг%, что обеспечивает чувствительность (всхожесть) среды. The indicated amounts of milk hydrolyzate and yeast autolysate make it possible to obtain a concentration of amine nitrogen in the nutrient medium from 100 to 130 mg%, which ensures the sensitivity (germination) of the medium.
Использование в заявляемом способе 0,8 г/л агара повышает вязкость среды, что позволяет получить рост изолированных колоний бактерий рода Lactobacillus в столбике среды, а также уменьшает растворимость кислорода в толще среды. В тоже время, 0,8 г/л агара в питательной среде не затрудняет приготовление разведений. Using in the inventive method 0.8 g / l agar increases the viscosity of the medium, which allows to obtain the growth of isolated colonies of bacteria of the genus Lactobacillus in the column of the medium, and also reduces the solubility of oxygen in the thickness of the medium. At the same time, 0.8 g / l of agar in the medium does not complicate the preparation of dilutions.
Установление значения pH среды в пределах 5,3 - 5,5 в сочетании с заявляемым составом обеспечивает подавление сопутствующей микрофлоры, не угнетая при этом роста засеянных лактобацилл. Культивирование посевов при 39oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, 16% кислорода обеспечивает ускорение роста колоний лактобацилл, одновременно задерживая рост сопутствующей микрофлоры при исследовании клинического материала. Атмосфера такого газового состава может быть получена при помощи анаэростата и свечи. Сопутствующая индигенная анаэробная микрофлора в таких условиях не растет, из представителей аэробной микрофлоры, в указанных условиях возможен рост энтерококков и грибов рода Candida.Setting the pH of the medium in the range of 5.3 - 5.5 in combination with the claimed composition provides suppression of concomitant microflora, without inhibiting the growth of seeded lactobacilli. Cultivation of crops at 39 o C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide, 16% oxygen provides accelerated growth of colonies of lactobacilli, while delaying the growth of concomitant microflora in the study of clinical material. The atmosphere of such a gas composition can be obtained using an anaerostat and a candle. The concomitant indigenous anaerobic microflora does not grow under such conditions; among representatives of the aerobic microflora, under the indicated conditions, the growth of enterococci and Candida fungi is possible.
Введение в состав среды 20,0 - 25,0 г агара на 1 литр позволяет получить плотную селективную питательную среду для выделения изолированных колоний лактобацилл, что дает возможность выделения чистой культуры бактерий рода Lactobacillus для дальнейшего изучения. The introduction of 20.0 - 25.0 g of agar per liter into the medium makes it possible to obtain a dense selective nutrient medium for isolation of isolated colonies of lactobacilli, which makes it possible to isolate a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus for further study.
Пример 1
Выделение бактерий рода Lactobacillus из фекалий с предварительным накоплением на жидкой селективной питательной среде обогащения.Example 1
Isolation of bacteria of the genus Lactobacillus from feces with preliminary accumulation on a liquid selective nutrient enrichment medium.
В колбу вместимостью 1 литр помещают 200,0 г гидролизата обезжиренного молока жидкого (содержание аминного азота 215 мг%), 100,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 0,8 г агара, 2 мл 20%-ного раствора едкого натра, воды дистиллированной до 1 литра, нагревают до расплавления агара, контролируют pH при помощи pH-метра (в данном примере pH 5,3), стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15 - 20oC, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. После стерилизации среду можно хранить в холодильнике до 2-х месяцев.200.0 g of skim milk liquid hydrolyzate (amine nitrogen content 215 mg%), 100.0 g concentrated yeast autolysate concentrated (amine nitrogen content 583 mg%), 0.8 g agar, 2 ml 20% are placed in a 1 liter flask; sodium hydroxide solution, water distilled to 1 liter, heated until the agar melts, the pH is controlled using a pH meter (pH 5.3 in this example), and sterilized in an autoclave at 0.5 atm for 20 minutes. The medium is quickly cooled by placing the flask in a water bath with a temperature of 15 - 20 o C, periodically stirred to accelerate cooling and uniform distribution of agar in the medium. After sterilization, the medium can be stored in the refrigerator for up to 2 months.
Жидкую селективную питательную среду обогащения в асептических условиях разливают в пробирки по 4,5 мл. Пробирки можно хранить в холодильнике до 4 недель, поместив в герметичный пластиковый пакет для предотвращения высыхания. Перед использованием пробирки необходимо подогреть в термостате или на водяной бане до 37 - 39oC.Aseptic liquid selective nutrient enrichment medium is poured into 4.5 ml tubes. Test tubes can be stored in the refrigerator for up to 4 weeks by being placed in a sealed plastic bag to prevent drying out. Before use, the tubes must be heated in a thermostat or in a water bath to 37 - 39 o C.
Из основного разведения фекалий 10-1 (в стерильном физиологическом растворе) при помощи дозатора готовят ряд 10-ти кратных последовательных разведений в 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения (титрование по 0,5 мл, до 10-10). Посевы инкубируют при 39oC в течение 24 часов в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г фекалий) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. В посевах фекалий, кроме лактобацилл, в указанных условиях могут расти энтерококки, которые легко отличимы по морфологии в мазках по Граму. Отмечают пробирки с разведениями фекалий, в которых обнаружен обильный рост бактерий рода Lactobacillus без энтерококков, или с минимальным присутствием энтерококков, а затем из этих пробирок бактериологической петлей делают высев на поверхность плотной селективной питательной среды для получения изолированных колоний.From the main dilution of feces 10 -1 (in sterile physiological saline) using a dispenser, a series of 10-fold serial dilutions in 4.5 ml of a liquid selective nutrient enrichment medium is prepared (titration of 0.5 ml, up to 10 -10 ). Crops are incubated at 39 o C for 24 hours in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen. The result is taken into account visually, by the presence of a general turbidity of the medium or the growth of isolated colonies. Then, smears are prepared from tubes with growth, stained according to Gram. The last breeding is noted, where the growth of gram-positive rods characteristic of morphology was detected. The titer (the number of bacteria of the genus Lactobacillus in 1 g of feces) is determined by the maximum dilution in which typical gram-positive bacilli are found. In feces, in addition to lactobacilli, enterococci can grow under these conditions, which are easily distinguishable by morphology in Gram smears. Test tubes with faecal dilutions are noted in which abundant growth of bacteria of the genus Lactobacillus without enterococci is detected, or with a minimal presence of enterococci, and then from these test tubes a bacteriological loop is used to seed a dense selective nutrient medium to obtain isolated colonies.
Плотную селективную питательную среду готовят следующим образом. A dense selective nutrient medium is prepared as follows.
В колбу вместимостью 1 литр помещают 225,0 г гидролизата обезжиренного молока жидкого (содержание аминного азота 215 мг%), 110,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 25,0 г агара, 2,1 мл 20%-ного раствора едкого натра, воды дистиллированной до 1 литра, нагревают до расплавления агара, контролируют pH при помощи pH-метра (в данном примере pH 5,4), стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)oC в течение 15 минут. Среду охлаждают до температуры 45 - 50oC, разливают в асептических условиях по 20 мл в стерильные чашки Петри, перед посевом чашки подсушивают в термостате при 37 - 39oC до исчезновения капель конденсата на поверхности среды.225.0 g of skim milk liquid hydrolyzate (amine nitrogen content 215 mg%), 110.0 g concentrated yeast autolysate concentrated (amine nitrogen content 583 mg%), 25.0 g agar, 2.1 ml 20 are placed in a 1 liter flask. % sodium hydroxide solution, water distilled to 1 liter, heated until the agar melts, control the pH using a pH meter (in this example, pH 5.4), sterilize in an autoclave at a temperature of (121 ± 1) o C for 15 minutes. The medium is cooled to a temperature of 45 - 50 o C, poured under aseptic conditions of 20 ml into sterile Petri dishes, before sowing the dishes are dried in an thermostat at 37 - 39 o C until droplets of condensate disappear on the surface of the medium.
Инкубацию посевов на плотной селективной питательной среде проводят в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, крышкой вниз, при 39oC в течение 24 - 48 часов.The incubation of crops in a dense selective nutrient medium is carried out in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen, with the lid down, at 39 o C for 24 to 48 hours.
Колонии бактерий рода Lactobacillus вырастают разной величины, от точечных (росинки), до 2 - 3 мм в диаметре, чаще плоские, шероховатые, слегка опалесцирующие, прозрачные, иногда с возвышением в центре и валиком по краю, редко белого цвета. В мазке по Граму - грамположительные мелкие или крупные, без капсулы, неспорообразующие палочки, расположенные отдельно или цепочками. При посеве фекалий, наряду с колониями бактерий рода Lactobacillus, обнаруживают колонии энтерококков. Колонии энтерококков белые, круглые, выпуклые, блестящие, гладкие, редко шероховатые. От бактерий рода Lactobacillus их дифференцируют в мазках по Граму. Colonies of bacteria of the genus Lactobacillus grow in various sizes, from punctate (dewdrops) to 2–3 mm in diameter, often flat, rough, slightly opalescent, transparent, sometimes with an elevation in the center and a roller along the edge, rarely white. In a Gram smear, gram-positive small or large, capsule-free, non-spore-forming sticks located separately or in chains. When sowing feces, along with colonies of bacteria of the genus Lactobacillus, enterococcus colonies are found. Enterococcal colonies are white, round, convex, shiny, smooth, rarely rough. From bacteria of the genus Lactobacillus, they are differentiated in Gram smears.
Для накопления чистой культуры бактерий рода Lactobacillus, после микроскопии производят посев остатков колонии в 5 мл молочно-дрожжевой жидкой среды накопления. Инкубацию посевов на среде накопления проводят при 39oC в течение 16 - 20 часов, проверяют чистоту культуры и используют для дальнейшего изучения (определения биосовместимости с эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus, приготовления лактобактерина на основе аутоштамма бактерий рода Lactobacillus, определения чувствительности аутоштамма бактерий рода Laclobacillus к антибиотикам).To accumulate a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus, after microscopy, the remains of the colony are seeded in 5 ml of milky-yeast liquid accumulation medium. The incubation of crops on the accumulation medium is carried out at 39 o C for 16 to 20 hours, the purity of the culture is checked and used for further study (determination of biocompatibility with eubiotic strains of bacteria of the genus Lactobacillus, preparation of lactobacterin based on the auto-strain of bacteria of the genus Lactobacillus, determination of the sensitivity of the auto-strain of bacteria of the genus Laclobac to antibiotics).
Для обоснования принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus используют следующие признаки. Сам факт развития культуры на селективной питательной среде в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, позволяет предположить развитие культуры лактобацилл. Дополнительно проводят морфологические исследования: палочковидная форма и положительная окраска по Граму, а также выявление метахроматических включений при окраске метиленовым синим, отсутствие способности к споро - и капсулообразованию. Подтверждением принадлежности культуры к роду лактобацилл служит отсутствие подвижности (особенно из жидкой среды) при фазово-контрастной микроскопии, неспособность к редукции нитратов и метиленовой сини, отрицательная оксидазная и каталазная пробы, отсутствие пигментообразования. На принадлежность культуры к группе анаэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов указывает неспособность к росту на неселективной плотной среде для культивирования лактобацилл при 39oC в аэробных условиях, отсутствие роста при 39oC на простом arape в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода.To justify the belonging of the selected bacteria to the genus Lactobacillus, the following characteristics are used. The very fact of the development of culture on a selective nutrient medium in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen suggests the development of a culture of lactobacilli. In addition, morphological studies are carried out: a rod-shaped form and a positive Gram stain, as well as the identification of metachromatic inclusions when stained with methylene blue, the lack of ability to spore and capsule formation. Confirmation of the belonging of the culture to the genus of lactobacilli is the lack of mobility (especially from a liquid medium) under phase contrast microscopy, the inability to reduce nitrates and methylene blue, negative oxidase and catalase samples, and the absence of pigmentation. The fact that the culture belongs to the group of anaerobic and facultative anaerobic microorganisms is indicated by the inability to grow on a non-selective solid medium for culturing lactobacilli at 39 o C under aerobic conditions, the lack of growth at 39 o C on a simple arape in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen.
Пример 2
Выделение бактерий рода Lactobacillus из вагинального отделяемого с предварительным накоплением на жидкой селективной питательной среде обогащения.Example 2
Isolation of bacteria of the genus Lactobacillus from the vaginal discharge with preliminary accumulation of enrichment on a liquid selective nutrient medium.
В колбу вместимостью 1 литр помещают 120,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 33,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 0,8 г агара, 3,5 г ледяной уксусной кислоты, воды дистиллированной до 1 литра, 2,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до pH 5,5, нагревают до расплавления агара, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)oC в течение 15 минут. Среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15 - 20oC, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. После стерилизации среду можно хранить в холодильнике до 2-х месяцев.In a flask with a capacity of 1 liter, 120.0 g of concentrated yeast autolysate (amine nitrogen content 583 mg%), 33.0 g skim milk hydrolyzate, enzymatic skim milk powder (amine nitrogen content 1485 mg%), 0.8 g agar, 3.5 g glacial acetic acid, distilled water to 1 liter, 2.5 ml of a 20% sodium hydroxide solution to pH 5.5, heated until the agar melts, sterilized in an autoclave at a temperature of (121 ± 1) o C for 15 minutes. The medium is quickly cooled by placing the flask in a water bath with a temperature of 15 - 20 o C, periodically stirred to accelerate cooling and uniform distribution of agar in the medium. After sterilization, the medium can be stored in the refrigerator for up to 2 months.
Жидкую селективную питательную среду обогащения в асептических условиях разливают в пробирки по 4,5 мл. Пробирки можно хранить в холодильнике до 4 недель, поместив в герметичный пластиковый пакет для предотвращения высыхания. Перед использованием пробирки необходимо подогреть в термостате или на водяной бане до 37 - 39oC.Aseptic liquid selective nutrient enrichment medium is poured into 4.5 ml tubes. Test tubes can be stored in the refrigerator for up to 4 weeks by being placed in a sealed plastic bag to prevent drying out. Before use, the tubes must be heated in a thermostat or in a water bath to 37 - 39 o C.
Из исследуемого материала готовят серию 10-ти кратных разведений в пробирках, содержащих по 4,5 мл жидкой селективной питательной среды обогащения, начиная от 10-2 до разведения 10-10. Посевы инкубируют при 39oC в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, в течение 24 - 48 часов. Результат учитывают визуально, по наличию общего помутнения среды или росту изолированных колоний. Затем из пробирок с наличием роста готовят мазки, окрашивают по Граму. Отмечают последнее разведение, где был обнаружен рост характерных по морфологии грамположительных палочек. Титр лактобацилл (количество бактерий рода Lactobacillus в 1 г вагинального отделяемого) определяют по максимальному разведению, в котором обнаружены типичные грамположительные палочки. В посевах вагинального отделяемого, кроме лактобацилл, в указанных условиях могут расти дрожжеподобные грибы, которые легко отличимы по морфологии в мазках по Граму. Отмечают пробирки с разведениями, в которых обнаружен рост бактерий рода Lactobacillus без дрожжеподобных грибов, или с минимальным их присутствием, а затем из этих пробирок бактериологической петлей делают высев для получения изолированных колоний на поверхности плотной селективной питательной среды, которую готовят следующим образом:
в колбу вместимостью 1 литр помещают 100,0 г дрожжевого аутолизата концентрированного (содержание аминного азота 583 мг%), 27,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 20,0 г агара, 3,3 г ледяной уксусной кислоты, воды дистиллированной до 1 литра, 2,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до pH 5,5, нагревают до расплавления агара, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)oC в течение 15 минут. Среду охлаждают до температуры 45 - 50oC, разливают в асептических условиях по 20 мл в стерильные чашки Петри, перед посевом чашки подсушивают в термостате при 37 - 39oC до исчезновения капель конденсата на поверхности среды.A series of 10-fold dilutions in test tubes containing 4.5 ml of liquid selective nutrient enrichment medium, ranging from 10 -2 to a dilution of 10 -10, is prepared from the test material. Crops are incubated at 39 o C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen for 24 to 48 hours. The result is taken into account visually, by the presence of a general turbidity of the medium or the growth of isolated colonies. Then, smears are prepared from tubes with growth, stained according to Gram. The last breeding is noted, where the growth of gram-positive rods characteristic of morphology was detected. The titer of lactobacilli (the number of bacteria of the genus Lactobacillus in 1 g of vaginal discharge) is determined by the maximum dilution in which typical gram-positive bacilli are found. In the cultures of the vaginal discharge, in addition to lactobacilli, under the indicated conditions, yeast-like fungi can grow, which are easily distinguishable by morphology in Gram smears. Tubes with dilutions in which the growth of bacteria of the genus Lactobacillus were detected without yeast-like fungi, or with their minimal presence, are noted, and then these tubes are sowed with a bacteriological loop to obtain isolated colonies on the surface of a dense selective nutrient medium, which is prepared as follows:
100.0 g of concentrated yeast autolysate (amine nitrogen content 583 mg%), 27.0 g skimmed milk powder hydrolyzate (amine nitrogen content 1485 mg%), 20.0 g agar, 3.3 g are placed in a flask with a capacity of 1 liter glacial acetic acid, distilled water to 1 liter, 2.5 ml of a 20% sodium hydroxide solution to pH 5.5, heated until the agar melts, sterilized in an autoclave at a temperature of (121 ± 1) o C for 15 minutes. The medium is cooled to a temperature of 45 - 50 o C, poured under aseptic conditions of 20 ml into sterile Petri dishes, before sowing the dishes are dried in an thermostat at 37 - 39 o C until droplets of condensate disappear on the surface of the medium.
Инкубацию посевов на плотной селективной питательной среде проводят в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, крышкой вниз, при 39oC в течение 24 - 48 часов.The incubation of crops in a dense selective nutrient medium is carried out in an atmosphere containing 5% carbon dioxide and 16% oxygen, with the lid down, at 39 o C for 24 to 48 hours.
Колонии лактобацилл вырастают разной величины, от точечных (росинки), до 2 - 3 мм в диаметре, чаще плоские, шероховатые, слегка опалесцирующие, прозрачные, иногда с возвышением в центре и валиком по краю, редко белого цвета. В мазке по Граму - грамположительные мелкие или крупные, без капсулы, неспорообразующие палочки, расположенные отдельно или цепочками. Для накопления чистой культуры бактерий рода Lactobacillus, после микроскопии производят посев остатков колонии в 5 мл молочно- дрожжевой жидкой среды накопления. Инкубацию посевов на среде накопления проводят при 39oC в течение 16 - 20 часов, проверяют чистоту культуры и используют для дальнейшего изучения (определения биосовместимости с эубиотическими штаммами бактерий рода Lactobacillus, приготовления лактобактерина на основе аутоштамма бактерий рода Lactobacillus, определения чувствительности аутоштамма бактерий рода Lactobacillus к антибиотикам). Результаты определения представлены в табл. 5. При обследовании 68 больных женщин и 46 здоровых было обнаружено достоверное различие в количественном содержании вагинальных лактобацилл. У здоровых женщин обнаружено содержание лактобацилл в пределах 5,5 - 7,0 Lg КОЕ/мл, а у больных 3,3 - 4,7 Lg КОЕ/мл.Colonies of lactobacilli grow in different sizes, from punctate (dewdrops) to 2–3 mm in diameter, often flat, rough, slightly opalescent, transparent, sometimes with an elevation in the center and a roller along the edge, rarely white. In a Gram smear, gram-positive small or large, capsule-free, non-spore-forming sticks located separately or in chains. To accumulate a pure culture of bacteria of the genus Lactobacillus, after microscopy, the remains of the colony are seeded in 5 ml of milky-yeast liquid accumulation medium. The incubation of crops on the accumulation medium is carried out at 39 o C for 16 to 20 hours, the purity of the culture is checked and used for further study (determination of biocompatibility with eubiotic strains of bacteria of the genus Lactobacillus, preparation of lactobacterin based on the auto-strain of bacteria of the genus Lactobacillus, determination of the sensitivity of the auto-strain of bacteria of the genus Lactobacillus to antibiotics). The results of the determination are presented in table. 5. When examining 68 sick women and 46 healthy, a significant difference was found in the quantitative content of vaginal lactobacilli. In healthy women, the content of lactobacilli was found in the range of 5.5 - 7.0 Lg CFU / ml, and in patients 3.3 - 4.7 Lg CFU / ml.
Таким образом, полученные результаты доказывают, что заявляемый способ выделения бактерий рода Lactobacillus из вагинального отделяемого позволяет не только значительно улучшить диагностику гинекологических заболеваний, но и значительно повысить качество бактериотерапии и антибиотикотерапии. Thus, the obtained results prove that the claimed method for the isolation of bacteria of the genus Lactobacillus from the vaginal discharge can not only significantly improve the diagnosis of gynecological diseases, but also significantly improve the quality of bacteriotherapy and antibiotic therapy.
Claims (1)
Гидролизат обезжиренного молока жидкий - 225,0 ± 25,0
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0 ± 10,0
Агар - 0,8
Вода дистиллированная - До 1 л
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4 ± 0,1
а затем проводят выделение лактобацилл на плотной селективной питательной среде при следующем соотношении компонентов среды, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока жидкий - 225,0 ± 25,0
Аутолизат дрожжей концентрированный - 110,0 ± 10,0
Агар - 22,5 ± 2,5
Вода дистиллированная - До 1 л
Раствор едкого натра 20% до рН среды - 5,4 ± 0,1A method for isolating bacteria of the genus Lactobacillus from clinical material (feces, vaginal discharge), which consists in preparing a series of 10-fold dilutions of the test material in a liquid selective nutrient enrichment medium, seeding from dilutions on the surface of a dense selective nutrient medium, culturing crops for 24 - 48 hours with a high content of carbon dioxide (5%) and a low oxygen concentration (16%) in the atmosphere of cultivation, characterized in that the accumulation of bacteria of the genus Lactobacillus from material at 39 o C on a liquid selective nutrient enrichment medium in the following ratio of medium components, g / l:
Skim milk hydrolyzate liquid - 225.0 ± 25.0
Concentrated yeast autolysate - 110.0 ± 10.0
Agar - 0.8
Distilled water - Up to 1 L
A solution of caustic soda 20% to a pH of 5.4 - 0.1
and then lactobacilli are isolated on a dense selective nutrient medium in the following ratio of medium components, g / l:
Skim milk hydrolyzate liquid - 225.0 ± 25.0
Concentrated yeast autolysate - 110.0 ± 10.0
Agar - 22.5 ± 2.5
Distilled water - Up to 1 L
A solution of caustic soda 20% to a pH of 5.4 - 0.1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99109319A RU2154822C1 (en) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99109319A RU2154822C1 (en) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2154822C1 true RU2154822C1 (en) | 2000-08-20 |
Family
ID=20219385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99109319A RU2154822C1 (en) | 1999-04-29 | 1999-04-29 | Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2154822C1 (en) |
-
1999
- 1999-04-29 RU RU99109319A patent/RU2154822C1/en active
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90086C (en) | FOERFARANDE FOER ISOLERING AV EN TERAPEUTISKT ANVAENDBAR LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS -STAM | |
| CN110373342B (en) | Lactobacillus reuteri and uses thereof | |
| RU2661102C2 (en) | Lactobacillus crispatus strain for treatment or prevention of sexual and urogenital infections, such as vaginosis and candidiasis, and use thereof | |
| CN112143680B (en) | Lactobacillus paracasei ZJUIDS05 with antioxidant effect and application thereof | |
| RU2580002C1 (en) | Method of producing autoprobiotic containing living bifidus bacteria and lactic acid bacilli | |
| Dudgeon | A study of the intestinal flora under normal and abnormal conditions | |
| CN113755409A (en) | Bifidobacterium longum for relieving insulin resistance and application thereof | |
| RU2303058C2 (en) | Agent "biobalans-k" for treatment of intestine infections complicated with dysbacteriosis | |
| RU2154822C1 (en) | Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material | |
| CN114164157B (en) | Lactobacillus salivarius strain ZK-88 for inhibiting inflammation, relieving swelling and aching of gum, and improving oral flora balance | |
| RU2320355C1 (en) | Method for production of biomass from liquid lactobacterium autostrain | |
| RU2178171C1 (en) | Method of isolation of lactobacillus genus bacterium from clinical material | |
| RU2391395C1 (en) | Lactobacillus fermentum TS3-06 STRAIN USED FOR MAKING BACTERIAL PREPARATIONS AND PRODUCTION OF LIQUID SOUR MILK BROTH AS FOOD PRODUCT FOR MEDICAL AND PREVENTIVE PURPOSES | |
| RU2193060C1 (en) | Method of isolation of bacterium of genus lactobacillus from clinical material | |
| RU2605626C2 (en) | Method of producing bacterial preparation with probiotic activity | |
| RU2213779C2 (en) | Nutrient medium for isolation of lactobacilli | |
| CN111011590A (en) | Composite probiotic agent and preparation method and application thereof | |
| RU2376366C2 (en) | Lactis acid bacillus strains syndicate and production method of biologically active additive or leaven for production of fermented milk products based on this syndicate | |
| Raju et al. | Isolation, Characterization and Sequencing of Lactobacillus from the Oral and Fecal Samples of Healthy Dogs | |
| RU2103353C1 (en) | Strain of bacterium lactobacillus acidophilus used for correction of disbacteriosis at gastroenteric diseases and in patient with large intestine cancer | |
| RU2542484C1 (en) | Stimulation method of growth of agricultural plants | |
| RU2244744C2 (en) | Method for preparing liquid lactobacterin | |
| Sahu et al. | Isolation and characterization of Probiotic from fermented rice, idly and dosa batter and screening of antimicrobial activity | |
| RU2675315C1 (en) | Method of selective allocation of auto strains of lactobacillus speciales from clinical material | |
| CN115386523B (en) | Lactococcus lactis and application thereof in resisting helicobacter pylori infection |