RU2092179C1 - Препарат, влияющий на тканевой обмен и модулирующий процессы иммунитета в биологических системах, и биологически активная пищевая добавка "мипро-вит" - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: предложено применение штамма гриба Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F 165) для получения препарата, который может быть использован для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ и функционирования иммунной системы организма, не имеющий противопоказаний к применению. Товарной формой указанного препарата представлена биологически активная пищевая добавка, представляющая собой сухую биомассу штамма гриба Fusarium sambucinum PS-64 и имеющая следующий состав, мас.%: общий белок 44-51, углеводы 21-23, липиды 6-8, нуклеиновые кислоты 4-6, минеральные вещества 8-10, витамины 2,6-3,1, вода - остальное. 2 с.п. ф-лы, 13 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и медицине и может быть использовано при производстве и применении физиологически активных препаратов и пищевых добавок на основе грибных продуцентов.

Известно, что биомассы многих базидиальных грибов обладают широким спектром физиологической активности, и на их основе создан ряд биологически активных препаратов иммуномодулирующего, противоопухолевого, антивирусного, анти-СПИД действия [1] При этом показано, что за эти эффекты ответственны, в первую очередь, содержащиеся в биомассе грибов высокомолекулярные полисахариды-гликаны, им отводят ведущую роль в активации макрофагов и индукции их цитотоксичности в отношении различных опухолевых клеток.

Однако промышленное культивирование базидиальных грибов является дорогостоящим процессом из-за их низкой скорости роста (до 10 сут) и малого урожая биомассы. Более экономичным является культивирование быстрорастущих несовершенных грибов, например, Fusarium, биомасса которых не менее богата биологически активными соединениями.

Например, известен способ получения иммуномодулирующих полисахаридов из биомассы гриба Fusarium equiset 1 [2] Однако в связи с токсичностью этого вида гриба требуется сложная химическая очистка при выделении целевого продукта, в то же время известны безопасные для человека и животных и пригодные в пищу виды грибов Fusarium. В частности, известны в качестве продуцентов белка пищевого и кормового назначения штаммы гриба Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165) и ВСБ-917 (ВКПМ F-169). Из этих двух штаммов биомасса шт. ВСБ-917 характеризуется наиболее высоким содержанием белка (60-63%) и является более предпочтительной для изготовления продукта, предназначенного для обогащения белком продуктов питания.

В связи с обнаружением в составе биомассы штамма ВСБ-917, комплекса биологически активных веществ, на его основе создан препарат "Милайф", влияющий на тканевой обмен, в том числе обладающий способностью нормализовать показатели холестерина и триглицеридов в сыворотке крови больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, повышать неспецифическую резистентность организма, способствовать увеличению числа лейкоцитов при лейкопениях, уменьшать выраженность аутоиммунных процессов, и являющийся гипосенсибилизирующим средством к бактериальным антигенам [3]
Препарат "Милайф" и штамм Fusarium sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-169) приняты за прототипы.

Однако штамм ВСБ-917 и изготавливаемый на его основе препарат "Милайф" характеризуются недостаточно высокой физиологической активностью, что связано со сниженным содержанием углеводов, в том числе полисахаридов, в биомассе используемого штамма до 13%
Сущность изобретения заключается в создании препарата, влияющего на тканевой обмен и модулирующий процессы иммунитета, с более высокой физиологической эффективностью и использовании для его получения культуры Fusarium sambucinum, характеризующейся повышенным синтезом углеводов. При этом в качестве продуцента препарата предлагается использовать культуру Fusarium sambucinum штамм PS-64 (ВКПМ F-165) по новому назначению, а именно в качестве продуцента физиологически активных веществ, так как штамм PS-64 характеризуется более высоким по сравнению со штаммом-прототипом уровнем синтеза углеводов до 23% Штамм Fusarium sambucinum PS-64 хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов института ГНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ F-165 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологическая характеристика
Агаризованное сусло. Колонии с хорошо развитым хлопьевидно-войлочным воздушным мицелием, сначала белым, позже серовато-белым, розовеющим, при старении приобретает охряно-коричневые тона. Край колонии приподнятый. Реверзум неизмененный. Пигментов, окрашивающих среду, не образует. Чашка Петри диаметром 90 мм с сусло-агаром зарастает культурой за 5 сут.

Гифы септированные, септы простые с тельцами Воронина, разветвленные: ветвление под острым углом, диаметр гиф от 2,5-3,5 мкм до 12 мкм. Образует макроконидии веретеновидные и серповидные, со слегка согнутой, резко суженной, удлиненной верхней клеткой с выраженной ножкой, обычно с 3-5 перегородками, размером 25-38 x 3,0-3,5 мкм.

Образует интеркалярные и апикальные хламидоспоры в клубочках, узлах и цепочках.

На рисе. На 30-ый день роста пигментация розовая. Окраска первичной грибницы лососево-розовая, местами серовато-белая, палевая, окраска зерен риса, в основном неизмененная, местами желтоватая, оливковая или коричневая. Окраска каймы зерен розово-оранжевая. Вторичная грибница белая, шерстисто-войлочная, паутинистая, покрывает поверхность частично (от 1/4 до 3/4).

Ломтики картофеля, воздушный мицелий ватно-войлочный, белый, местами оливково-коричневый. Стареющий мицелий палевый, местами до коричневого. Конидиальное спороношение на воздушном мицелии. Спородохии и пионотты отсутствуют. Макроконидии с 3, реже с 5 перегородками. Встречаются микроконидии, чаще яйцевидные с одной перегородкой, хламидоспоры в основном в клубочках, встречаются интеркалярные хламидоспоры цепочками. Склероции отсутствуют.

Картофельный агар. Воздушный мицелий на 30-ый день палево-песочного цвета. Темные склероции до 1 мм в диаметре. Хламидоспоры интеркалярные, редко апикальные в клубочках, парами, цепочками. Конидиальное спороношение отсутствует.

На средах Сабуро, МПА, сусло-агаре, картофельном агаре, картофеле, рисе пурпуровые, лиловые и малиновые оттенки отсутствуют.

В глубинной культуре на средах с мелассой рост дисперсный. Гифы толщиной в среднем 4-5 мкм, длинные, активно ветвящиеся, концы гиф закруглены, цитоплазма имеет гомогенную структуру, вакуоли мелкие и немногочисленные, липидных включений мало. При неблагоприятных условиях в культуре преобладают короткие широкие клетки, часто раздутые, слабо ветвящиеся, с большим количеством вакуолей, липидных включений, большим количеством мертвых клеток. При старении культуры в клетках гиф наблюдается обильное образование жировых включений. Наблюдается образование хламидоспор, расположенных в клубочках и цепочках.

В глубинной культуре иногда встречаются микроконидии 12-16x2,8-3,6 мкм, как правило с одной перегородкой, клетки мицелия устойчиво сохраняют дикариотическое состояние, деление ядер происходит синхронно, цитохимический биоритм составляет 3 сут.

Физиолого-биохимическая характеристика
Культура утилизирует глюкозу, сахарозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, галактозу, раффинозу, а также маннит, ксилит, этанол, глицерин, уксусную кислоту. Крахмал гидролизует.

В качестве азотного питания использует пептон, мочевину, аммиак, нитраты. Желатину не разжижает, молоко не свертывает и не пептонизирует.

Не нуждается для роста в аминокислотах, витаминах, ростовых веществах.

Растет в диапазоне температур (22-34)^oC, выдерживает температуру от 2 до 36^oC, оптимальная температура роста 26^oC.

Растет в интервале pH 4,5-7,0 при оптимуме 5,5-6,0.

Для роста требует кислород воздуха.

Патогенность
Штамм не патогенен, токсичных метаболитов, в том числе микотоксинов, таких как зеараленон, трихотецены, вомитоксин и др. не образует.

Антагонистические свойства
Вторичный адаптивный обмен редуцирован, антибиотиков не образует.

Биотехнологическая характеристика
При культивировании в питательной среде состава, меласса свеклосахарная 2,0 по редуцирующим веществам; аммоний азотнокислый 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2, с дозой засева посевным материалом 10,0 об. в условиях непрерывного мягкого перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,5 ммоль кислорода/л мин накопление биомассы через 14-18 ч ферментации составляет 10-12 г/л среды (по абс. сухому веществу).

Хранение штамма
Хранить штамм рекомендуется на агаризованном сусле при температуре (4 6)^oC с периодическими пересевами два раза в год.

На основе культуры Fusarium sambucinum PS-64 создан препарат, обладающий свойствами влиять на тканевой обмен и модулировать процессы иммунитета и обладающий повышенной по сравнению с препаратом-прототипом физиологической активностью. Товарной формой этого препарата является биологически активная пищевая добавка "Мипро-ВИТ".

Химический состав биологически активной пищевой добавки "Мипро-ВИТ", мас.

Общий белок 44-51
Истинный белок 31-36
Углеводы 21-23
Липиды 6-8
Нуклеиновые кислоты 4-6
Минеральные вещества 8-10
Витамины 2,6-3,1
Вода Остальное
По аминокислотному составу белка и содержанию витаминов Мипро-ВИТ не отличается от препарата-прототипа.

Углеводы, входящие в состав Мипро-ВИТа, представлены полисахаридами со следующим соотношением моносахаров: глюкоза, галактоза, манноза 1,0:0,6: 0,71. основная цепь разветвленного полисахарида состоит из остатков α - 1 _→ 6-связанной маннозы, а боковые цепочки из остатков галактозы или цепочек из маннозы и галактозы, связанных между собой α - 1 _→ 2-связями и присоединенных к главной цепи α - 1 _→ 2-связями.

Безвредность Мипро-ВИТа подтверждена результатами его медико-биологической оценки, выполненной НИИ питания РАМН. По заключению этого института, оформленного разрешением Минздрава и Госкомсанэпиднадзора, препарат не вызывает аллергических реакций и не имеет противопоказаний к применению в качестве пищевой добавки к продуктам питания.

Физиологическая активность заявляемого препарата изучена на лабораторных моделях и подтверждена клиническими исследованиями.

Влияние Мипро-Вита на тканевой обмен
Изучение влияния Мипро-ВИТа на тканевой обмен проводилось в клинических условиях на группах больных из зоны жесткого радиационного контроля. При этом оценивалось действие препарата на липидный обмен и на перекисное окисление липидов у больных с патологией органов пищеварения и заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Как известно, нарушения липидного обмена, выражающиеся в гиперхолестеринемии, являются одним из основных факторов развития атеросклероза, поэтому для клинических наблюдений были сформированы группы больных с избыточным весом, сочетавшимся с повышенным содержанием в сыворотке крови холестерина и триглицеридов. Одна группа больных получала традиционное лечение, другая дополнительно к этому лечению получала по 1 г Мипро-ВИТа 2 раза в день в течение 28 дней. В качестве показателей липидного обмена анализировали содержание в крови холестерина, триглицеридов, липопротеидов высокой плотности и сахара. Динамика этих показателей, а также данные снижения веса пациентов в результате проведенного лечения приведена в табл. 1.

Сравнение результатов лечения пациентов опытной и контрольной групп показывает, что прием Мипро-ВИТа способствует более выраженному статистически значимому снижению изученных клинико-биохимических показателей. При этом Мипро-ВИТ оказывает не только гипохолестеринемическое действие, но и способствует нормализации содержания в крови сахара, что свидетельствует о целесообразности его использования при начальных формах сахарного диабета.

Одним из ведущих механизмов нарушений тканевого обмена из-за повреждений клеточных мембран, в частности в результате радиоактивного поражения, является развитие процессов свободнорадикального окисления липидов, для подавления которых требуется поступление в организм соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Эти соединения блокируют перекисное окисление липидов плазматических и субклеточных мембран, предохраняя их от действия перекисей и свободных радикалов, образующихся при радиоактивном поражении особенно часто в метаболически активных клетках.

В связи с обнаружением липотропных свойств Мипро-ВИТа была проведена работа по выяснению его влияния на перекисное окисление липидов в организме человека,
Всестороннему обследованию были подвергнуты 116 человек, проживающих в зоне повышенного радиационного контроля, и лица, принимавшие участие в ликвидации аварии на ЧАЭС. В числе обследуемых преимущественно были люди среднего возраста от 24 до 55 лет. Эти пациенты были подразделены на две группы. В группу 1 вошли больные с преимущественной патологией органов пищеварения (хронические гастродуодениты, холецистоангеохолиты, спастикоатопические колиты).

Группу 2 составили больные с преимущественными заболеваниями сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь, миокардиодистрофии, эндотериит, тромбофлебиты).

Пациенты обеих групп получали Мипро-ВИТ по 2-6 г в сутки на протяжении 28 дней. До и после курса лечения проводились комплексные клинико-инструментальные, иммуно-микробиологические, биохимические и другие исследования.

В процессе лечения не было случаев отказа от приемов Мипро-ВИТа, не обнаружено случаев с усугублением клинического течения заболевания. На 10-12 день приема Мипро-ВИТа у 72,1% обследованных отмечалось улучшение общего состояния здоровья и уменьшение интенсивности ранее предъявляемых жалоб. Объективно, более чем у 2/3 обследованных отмечалась положительная динамика основных изученных показателей (табл. 2,3).

Свободнорадикальные процессы изучались биохемилюминесцентным методом, основанным на сверхслабом свечении биосред и клеток в видимой области спектра, обусловленном наличием липидных структур, изучение сверхслабого свечения проводилось с помощью Бета-2 анализатора, в котором в качестве детектора счета фотонов служит ФЭУ-39. При этом показатели спонтанной хемилюминесценции характеризуют уровень свободных радикалов, быстрая вспышка перекисной хемилюминесценции уровень гидроперекисей липидов, медленная вспышка перекисной хемилюминесценции уровень органических перекисных радикалов, в присутствии ингибиторов хемилюминесценция ослабляется, так как при этом снижается концентрация продуктов свободнорадикального окисления. Учитывая возможность миграции перекисных радикалов из внеклеточного пространства внутрь клеток, уровень свободнорадикальных процессов определяли в плазме, эритроцитах и лейкоцитах крови и по изменению показателей биохемилюминесценции в них судили об антиоксидантных свойствах Мипро-ВИТа.

Как видно из табл. 2 и 3, у обследуемых в исходном состоянии в крови определялись значительные накопления продуктов свободнорадикального окисления. Прием Мипро-ВИТа на протяжении 28 дней способствовал достоверному снижению внутриклеточного содержания перекисей, в том числе перекисных радикалов органического типа. Это свидетельствовало о стабилизирующем действии препарата на клеточные мембраны и метаболизм клеток.

Таким образом, вышеприведенные результаты показали, что Мипро-ВИТ способен стимулировать активность антиоксидантных систем организма, данный эффект у препарата-прототипа Милайфа не известен.

Экспериментальные исследования способности Мипро-ВИТа связывать и выводить из организма радионуклиды, кардинально нарушающие тканевой обмен в организме за счет инактивации ферментных белков, в сравнении с препаратом-прототипом Милайфом проводили на белых крысятах весом 35 40 г. В эксперименте наблюдалось накопление радионуклидов в мышечной ткани 4 групп животных: группа 1 контрольная, получавшая корм вивария: группа 2 - получавшая наряду с обычным кормом еще спецкорм из расчета по 1 г на животное в сутки (пшеница с суммарной активностью Cs-134 и Cs-137 12,9•10^-8кюри/кг и творог 40,7•10^-8кюри/кг); группы 3 и 4 получали, наряду со спецкормом, препараты Мипро-ВИТ и Милайф соответственно из расчета от 1,5 до 3 мг на животное. Корм выдавался ежедневно в течение 3 мес.

Из результатов, представленных в табл. 4, видно, что одновременное введение в организм радиоактивной пищи и испытуемых препаратов препятствовало накоплению радиоактивных веществ в мышечной ткани животных, при этом Мипро-ВИТ выводил радионуклиды более активно, снизив их суммарное содержание в мышечной ткани животных по сравнению с контролем в 8 раз, тогда как в результате применения Милайфа содержание радионуклидов снижалось только в 2 раза.

Данный эффект непосредственно связан с различным содержанием в испытуемых препаратах полисахаридных фракций, играющих роль своеобразного биологически активного фактора, оказывающего защитное действие на мембраны клеток, влияя на величину их поверхностного заряда и поддерживая в них статическое напряжение и метаболическую активность.

Иммуномодулирующие свойства Мипро-ВИТа
Влияние Мипро-ВИТа на неспецифическую резистентность организма изучалось в экспериментальных условиях на беспородных белых крысятах-откормышах весом 35-40 г, зараженных радионуклидами, в процессе их развития до половозрелого состояния.

Животные были распределены в три группы: группа 1 получала корм вивария, группа 2 получала спецкорм (пшеница с суммарной активностью Cs-134 и Cs-137 12,19•10^-8 кюри/кг и творог 40,7•10^-8 кюри/кг), который выдавали ежедневно из расчета 1 г на животное в течение 3 мес.

Группа 3, помимо спецкорма, получала Мипро-ВИТ в суточном количестве от 1,5 до 3.0 мг на животное, в процессе эксперимента было установлено, что у животных, получавших спецкорм и Мипро-ВИТ, достоверных нарушений в лейкограммах не определялось, тогда как у животных, получавших лишь спецкорм, регистрировалась лимфопения, в связи с этим необходимо было определить функциональную активность лимфоцитов до и после введения Мипро-ВИТа.

Известно, что при интоксикациях, в том числе и радиоактивных, структура нуклеарного аппарата лимфоцитов периферической крови претерпевает изменения, микроструктура нуклеол изучалась с применением метода цитохимической окраски РНК в мазках периферической крови 0,125% раствором метиленового синего.

Из табл. 5 видно, что ядрышковый аппарат лимфоцитов у животных, получавших радиоактивный корм, существенно отличался от животных интактной группы. Так, при достоверном снижении числа лимфоцитов с компактными нуклеолами наблюдался рост числа лимфоцитов с микронуклеолами. Введение Мипро-ВИТа одновременно с радиоактивным кормом приводило к достоверному повышению количества лимфоцитов с компактными нуклеолами и снижению их числа с микронуклеолами, так как наличие компактных нуклеол свидетельствует о состоянии активного синтеза РНК, а увеличение числа лимфоцитов с микронуклеолами о состоянии необратимой дегенерации и распада, то сделан правомерный вывод о том, что Мипро-ВИТ задерживает развитие обменных и структурных нарушений в клетках.

Для сравнительного изучения влияния препаратов Мипро-ВИТ и Милайф на показатели, характеризующие защитные силы организма, был применен общепринятый тест фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, отражающий состояние неспецифической реактивности организма.

Представленные в табл. 6 результаты исследования свидетельствуют о значительном повышении аттракционной способности нейтрофилов у групп животных, получавших испытуемые препараты, по сравнению с контрольными животными, получавшими корм, загрязненный радионуклидами. Практически при применении биопрепаратов в крови восстанавливалось количество нейтрофилов, способных адсорбировать микроорганизмы. Фагоцитарные числа в опытных и контрольной группах изучаемых животных мало различались, что свидетельствовало о том, что количество сохранившихся нейтрофилов во всех группах было одинаковым, однако фагоцитоза был достоверно выше у группы животных, получавшей Мипро-ВИТ, который, таким образом, способствовал сохранению значительно большего числа активных нейтрофилов, способных к фагоцитозу.

Для оценки переваривающей активности нейтрофилов, то есть второй стадии фагоцитоза, было проанализировано соотношение числа убитых бактерий к общему числу фагоцитируемых микробов. Установлено, что в группе животных, получавших Мипро-ВИТ, индекс переваривания и переваривания были в 2 раза выше, чем у животных контрольной группы, и в 1,5 раза выше, чем в группе животных, получавших Милайф.

В клинических условиях влияние Мипро-ВИТа на клеточный иммунитет изучалось на базе всестороннего обследования 118 человек, проживающих в зоне повышенного радиационного контроля. В результате изучения в динамике показателя T-B системы лимфоцитов установлено, что у всех обследованных до приема Мипро-ВИТа наблюдалось снижение абсолютного числа лимфоцитов (2078±211 в 1 мкл вместо 2395±355).

Статистически достоверным оказалось и уменьшение их процентного содержания (19,3±1.7% вместо 44,7±0,8% в контроле).

Таким образом, у обследованных лиц было установлено резкое нарушение соотношений между иммунокомпетентными клетками крови: коэффициент Т/В был равен 1,1 вместо 3,3 в контроле, что свидетельствовало о выраженном угнетении иммунной системы организма.

Прием Мипро-ВИТа на протяжении 26 дней способствовал достоверному снижению содержания О-лимфоцитов с 64,0±2,0% до 49,0±1,3% и тенденции к нормализации содержания Т и В лимфоцитов от 435,0±44,7 до 690,0±102,0 в 1 мкл и от 364,0±4,7 до 290,0±62,8 в 1 мкл соответственно.

Таким образом, коэффициент Т/В приблизился к норме, что свидетельствовало о нормализации в крови соотношений иммунокомпетентных клеток.

Учитывая, что у обследуемого контингента так же, как и в экспериментах на животных, при приеме Мипро-ВИТа зафиксировано повышение фагоцитарной активности нейтрофилов крови, необходимо было выяснить уровень восстановления метаболической активности фагоцитирующих клеток. Функциональный резерв этих клеток выяснялся при помощи определения разницы показателей стимулированного (с добавлением инертных частиц латекса) и спонтанного НСТ-теста, так называемого теста восстановления НСТ (нитросиний тетразоль).

Как видно из табл. 7, у обследованных пациентов степень стимуляции была значительно ниже, чем у здоровых лиц. Применение препаратов Мипро-ВИТ и Милайф способствовало восстановлению показателей спонтанного НСТ-теста. Однако значительные различия в эффективности использования этих препаратов выявились при изучении функционального резерва фагоцитирующих клеток. Прием Мипро-ВИТа позволил восстановить резервные возможности этих клеток в 1,8 раза, в то время как Милайф менее, чем в 1,2 раза.

Таким образом, лабораторными и клиническими испытаниями подтверждена более высокая по сравнению с препаратом-прототипом физиологическая активность Мипро-ВИТа, выражающаяся в его большей эффективности восстановления скрытой резервной активности кислородзависимого метаболизма фагоцитирующих клеток.

Положительное влияние Мипро-ВИТа на восстановление неспецифического иммунитета организма было также подтверждено результатами включения Мипро-ВИТа в сравнении с прототипом в схему общепринятого лечения больных, страдающих желудочно-кишечными заболеваниями (гастродуоденитами).

Наблюдения проводились за тремя группами пациентов. Контрольная группа из 30 пациентов получала только общепринятое лечение, а в схему лечения пациентов двух опытных групп численностью по 26 человек включались Мипро-ВИТ и Милайф соответственно. Результаты теста Клемпарской, отраженные в табл. 6, свидетельствовали о выраженных нарушениях защитных сил организма у всех больных.

Включение в общепринятое лечение обоих биопрепаратов значительно помогало организму восстанавливать бактерицидные свойства кожных покровов. Об этом свидетельствует достоверное снижение высеваемости на отпечатках кожных покровов пациентов опытных групп не только общего количества микроорганизмов, но и изменение их качественного состава: уменьшение численности гемолитических и маннитразлагающих форм. При этом, как видно из данных табл. 8, эффективность Мипро-ВИТа была выше, чем эффективность параллельно испытывавшегося прототипа Милайфа.

Данные, приведенные в табл. 9, свидетельствуют о положительном действии Мипро-ВИТа и при нарушениях биоценоза кишечника.

В табл. 10 приведены результаты изучения динамики Фермента лизоцим в группах больных с желудочно-кишечными заболеваниями при приеме Мипро-ВИТа, Милайфа (прототип) и в контрольной группе больных, получавших общепринятое лечение.

Как известно, фермент лизоцим продуцируется лейкоцитами, обладает бактерицидной активностью и, содержась во многих биосредах, обеспечивает барьерную функцию от проникновения в организм патогенных микроорганизмов, предотвращая генерализацию и хронизацию воспалительных процессов, а также развитие дисбактериозов.

Из данных табл. 10 видно, что у больных всех трех групп лизоцим в слюне, крови и содержимом желудка был снижен. Прием Мипро-ВИТа достоверно способствовал частичному восстановлению активности лизоцима в слюне и желудочном соке. Прототип Милайф несколько уступал Мипро-ВИТу по своей эффективности. Полученные данные позволяют рекомендовать Мипро-ВИТ для включения в общепринятое лечение у больных с пониженными защитными свойствами слизистых ротовой полости и желудочно-кишечного канала.

Таким образом, обширный комплекс проведенных исследований выявил более высокую по сравнению с препаратом-прототипом эффективность Мипро-ВИТа как стимулятора неспецифического иммунитета организма.

Эффективность применения Мипро-ВИТа при нарушениях функций иммунной системы изучалась также на фоне развития аутоиммунных процессов в организме.

Аутоиммунные процессы вызываются антигенами собственных тканей организма и сопровождаются появлением антител или сенсибилизированных лимфоцитов в тех ситуациях, когда организм утрачивает толерантность к собственным тканевым антигенам и начинает отторгать собственные ткани, принимая их за чужеродные. Согласно принятой научной теории аутоиммунизация представляет собой результат дестабилизации клеточных мембран тканей и органов, возникающей под действием различных повреждающих факторов, и является патологическим процессом.

Влияние Мипро-ВИТа на аутоиммунные процессы изучали при его пероральном применении в дозе 5 г в день в течение 14 дней у 47 человек, подвергшихся облучению в результате проведения аварийных работ на ЧАЭС. Исследования проводили по оригинальной методике, в которой регистрация аутоиммунных реакций осуществлялась по увеличению иммунохемилюминесцентного свечения в пробе, содержащей специфический антиген аутоиммунизации, по сравнению с пробой без антигена.

До и после применения Мипро-ВИТа проводили определение аутоантител к органоспецифическим антигенам сердца, печени, легкого, поджелудочной железы, желудка, почек, тонкого и толстого кишечника, а также щитовидной железы. Дополнительные исследования позволили установить, что по электрофоретической подвижности эти аутоантитела относятся к бета- и гамма-глобулинам.

Как показали результаты исследования, у всех лиц, подвергшихся радиационному облучению, прослеживалась интенсификация продукции аутоантител.

Как видно из табл. 11, положительные реакции на наличие противотканевых аутоантител ко всем использованным в исследованиях антигенам отмечались у 15 человек (группа 1 обследованных). При этом клинически выраженные проявления заболевания, преимущественно в виде вегето-сосудистой дистонии по гипертоническому типу, выявлены только у 9 из них. Это были лица в возрасте 41-60 лет. У 6 человек в возрасте моложе 40 лет повышение уровня противотканевых антител не сопровождалось клинически подтвержденными заболеваниями. Уровень повышения аутоантител у практически здоровых лиц был в 2-4 раза выше нормы, тогда как при клинически подтвержденных заболеваниях показатели аутоиммунизации превышали норму в 5 и более раз,
После проведения курса перорального приема Мипро-ВИТа интенсивность аутоиммунизации изменялась, однако выраженность этих изменений для различных антигенов была неодинакова, существенное снижение концентрации аутоантител в группе 1 обследованных отмечалось только в отношении тканей печени (почти в 2 раза), почек (более, чем в 3 раза) и толстого кишечника (в 2.5 раза), клинически у всех лиц данной группы наблюдалось улучшение общего состояния и снижение частоты перепадов артериального давления.

У остальных 32 обследованных первоначальное повышение концентрации аутоантител обнаруживалось лишь в отношении одного или нескольких антигенов, однако повышение концентрации антител к этим антигенам было более выражено, чем в группе 1. Эти 32 человека были распределены на 2 группы: группа 2 14 человек и группа 3 18 человек.

У лиц группы 2 выраженное повышение аутоантител обнаруживалось лишь в отношении ткани легкого (в среднем в 9 и более раз) и печени (в 8 и более раз по сравнению с нормой). Клинически у этих лиц отмечались выраженные признаки бронхита (у большинства обследуемых бронхит курильщика) и хронического холецистита, данные приведены в табл. 12.

После проведения курса приема Мипро-ВИТа достоверное снижение процессов аутоиммунизации было выявлено только в отношении ткани печени (в 2 и более раз) и не отмечалось в отношении ткани легкого. Одновременно наблюдалось снижение клинических признаков холецистита: уменьшение признаков интоксикации, болей в животе, диспептических явлений.

У 18 человек группы 3 обследованных значительное повышение (в 7 и более раз по сравнению с нормой) противотканевых антител отмечалось в отношении большинства основных паринхиматозных органов (почек, печени, поджелудочной железы), а также органов желудочно-кишечного тракта (тонкого и толстого кишечника, желудка). У всех этих лиц отмечались клинически выраженные проявления заболеваний желудочно-кишечного тракта в виде хронического гастродуоденита, хронического панкреатогенного колита, хронического холецистопанкреатита, хронического панкреатогенного колита. Токсико-аллергическое поражение почек у этих лиц проявлялось в виде признаков пиелоцистита и гломерулонефрита.

В этой группе 10 пациентов принимали Мипро-ВИТ и 8 пациентов Милайф (препарат-прототип). После введения препаратов наиболее выраженное снижение уровня противотканевых антител отмечалось в отношении антигена почки (в 2 - 3,5 раз), антигена печени (в 1,5 2 раза), поджелудочной железы и толстого кишечника (в 1,5 1,7 раз). Как видно из данных, приведенных в табл. 13 из двух использованных препаратов наиболее результативным оказалось применение Мипро-ВИТа.

У всех обследованных обнаружено существенное повышение продукции антител к щитовидной железе, что видимо связано с прямым воздействием излучения на этот орган, в результате попадания аутоантигенов щитовидной железы в кровь происходит сенсибилизация к ним лимфоцитов и выработка аутоантител. Аутоаллергические процессы затрудняют репарацию щитовидной железы.

В процессе биохимических исследований выявилось, что в отличие от прототипа применение препарата Мипро-ВИТ способствовало снижению аутоиммунных процессов в отношении щитовидной железы, однако оно было выражено умеренно (в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем) и отмечалось только у 67% пациентов, принимавших Мипро-ВИТ. Прием Милайфа не приводил к снижению уровня аутоантител к щитовидной железе.

Проведенный комплекс лабораторных и клинических исследований заявляемого препарата подтвердил его более высокую физиологическую эффективность в сравнении с препаратом-прототипом Милайфом.

Физиологическое действие препарата заключается в его способности оказывать влияние на тканевой обмен и эффективно воздействовать на иммунные системы организма, способствуя повышению неспецифического иммунитета и подавлению аутоиммунных процессов. Согласно полученным эффектам препарат может быть использован в схемах профилактики и лечения соматических заболеваний у лиц, живущих или работающих в экологически опасных условиях, включая повышенную радиацию; для профилактики и лечения дисбактериозов; как дополнительное средство в комплексном лечении сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний желудочно-кишечного тракта; для профилактики и лечения нарушений кроветворной функции и при сдвиге биохимических показателей крови, при снижении резистентности организма (иммунодепрессии).

Биологически активная пищевая добавка Мипро-ВИТ может быть получена биотехнологическим способом с использованием культуры гриба Fusarium sambucinum PS-64. Указанная культура выращивается глубинным способом в жидкой стерильной питательной среде, включавшей углеводы, а также минеральные азот- и фосфорсодержащие соли. По окончании ферментации мицелиальную массу отделяют от нативного раствора, тщательно отмывают, отжимают, гранулируют и высушивают с последующим тепловым обеззараживанием. Сухой продукт подвергается стандартизации и упаковке,
Возможность получения препарата указанного состава промышленным способом и возможность использования для его получения культуры Fusarium sambucinum PS-64 по новому для него назначению, а именно, в качестве продуцента физиологически активных веществ, влияющих на тканевой обмен и модулирующих процессы иммунитета, иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма PS-64 хранят в пробирках на скошенном сусло-агаре при температуре 4 6^oC.

Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 750 мл со 150 мл стерильной питательной среды состава, меласса свеклосахарная 4,0; аммоний азотнокислый 0,3: фосфат калия однозамещенный 0,2: pH 6,0, засевают агаровыми блоками культуры из пробирок.

Посевную культуру выращивают на качалке при 26^oC в течение 24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата.

В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды вышеуказанного состава вносят 0,6 л посевной культуры (4 колбы) и выращивание осуществляют при 26±1^oC, непрерывно работающей мешалке и подаче стерильного сжатого воздуха 40 куб.м/ч в течение 20 ч. Выросший гомогенный посевной материал передают в асептических условиях на засев ферментатора емкостью 15 куб.м с 10 куб.м стерильной ферментационной среды вышеуказанного состава,
Процесс ферментации осуществляют при 26±1^oС без механического перемешивания и при аэрации 600 куб.м/ч в течение 16 ч. По окончании ферментации культуральную жидкость подают на фильтр-пресс для отделения биомассы, отмывки ее водой и тщательной продувки сжатым воздухом до получения плотных, легко расслаивающихся пластов биомассы. Биомассу подвергают сушке в сушилке кипящего слоя при 65^oC, гранулируют для получения чешуек неправильной формы и прогревают в той же сушилке при температуре 95^oC в течение 60 мин. Количество полученного готового продукта 105 кг.

Полученная биологически активная пищевая добавка имеет следующий состав, мас.

Общий белок 51,0
Углеводы 21,0
Липиды 6,0
Нуклеиновые кислоты 4,0
Минеральные вещества 8,0
Витамины 3,1
Вода 6,9
После анализа качества препарат подвергают фасовке и упаковке.

Пример 2. Выращивание посевного материала в колбах и посевных аппаратах осуществляют аналогично изложенному в примере 1,
Выросший посевной материал передают в асептических условиях на засев ферментатора емкостью 15 куб.м с 10 куб.м стерильной питательной среды состава, меласса свеклосахарная 4,0; аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,2: экстракт кукурузный сгущенный 0,1; pH 5,9.

Процесс ферментации осуществляют при 26±1^oC, с периодической работой механической мешалки по 10 мин через каждый час, при аэрации 400 куб.м/ч. Длительность ферментации 15 ч.

Переработку культуральной жидкости и получение готового продукта осуществляют аналогично изложенному в примере 1. Количество готового продукта 108 кг.

Полученный продукт имеет состав, мас.

Общий белок 48,0
Углеводы 22,0
Липиды 7,0
Нуклеиновые кислоты 5,0
Минеральные вещества 9,0
Витамины 2,8
Dода 6,2
Пример 3. Выращивание посевного материала в колбах и посевных аппаратах осуществляют аналогично изложенному в примере 1.

Культивирование в ферментере проводят на питательной среде состава, сахар пищевой 2,0: аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,2; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1; pH 5,0, при 26±1^oC, без механического перемешивания, с аэрацией 600 куб.м/ч длительность ферментации 18 ч,
Переработку культуральной жидкости и получение готового продукта осуществляют аналогично изложенному в примере 1. Количество готового продукта 103 кг.

Полученный продукт имеет состав, мас,
Общий белок 44,0
Углеводы 23,0
Липиды 8,0
Нуклеиновые кислоты 6,0
Минеральные вещества 10,0
Витамины 2,6
Вода 6,4
Приведенные данные подтверждают преимущество заявляемого препарата Мипро-ВИТ перед препаратом-прототипом Милайфом, а именно его более высокую физиологическую активность, отвечая критерию "изобретательский уровень" предложения, а также подтверждают, что предложение "промышленно осуществимо".

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения поставленной задачи, аналогичные заявляемому, то есть предложение соответствует критерию "новизна".

Источники информации
1. W.A.Hayes, S.H.Wright. Ediblemushooms. In book: Economic microbiology vol. 4, Microbia1 biomass, ed. by A.H. Rose. London, Acad. Press, 1979, p. 141.

2. Патент СССР N 944491, А 61 К 39/00, 1977.

3. Патент РФ 2040932, А 61 К 35/70, 1993, прототип.

Claims (2)

1. Применение гриба Fusarium sambucinum штамм PS-64 (ВКПМ F-165) для получения препарата, влияющего на тканевой обмен и модулирующего процессы иммунитета в биологических системах.

2. Биологически активная пищевая добавка, обладающая свойствами влиять на тканевой обмен и модулировать процессы иммунитета, представляющая собой сухую биомассу, полученную в результате глубинного культивирования штамма гриба Fusarium sambucinum с последующим отделением и сушкой биомассы, отличающаяся тем, что используют штамм гриба Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165), а готовый продукт имеет следующий состав, мас.

Общий белок 44 51
Углеводы 21 23
Липиды 6 8
Нуклеиновые кислоты 4 6
Минеральные вещества 8 10
Витамины 2,6 3,1
Вода Остальноео

Images