RU2081906C1 - Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент рибофлавина - Google Patents
Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент рибофлавина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2081906C1 RU2081906C1 RU94021756A RU94021756A RU2081906C1 RU 2081906 C1 RU2081906 C1 RU 2081906C1 RU 94021756 A RU94021756 A RU 94021756A RU 94021756 A RU94021756 A RU 94021756A RU 2081906 C1 RU2081906 C1 RU 2081906C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- riboflavin
- bacillus subtilis
- producer
- erythromycin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, получение рибофлавина. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-6797 - продуцент рибофлавина. Предлагаемый штамм - продуцент рибофлавина получен путем введения в реципиентный штамм Bacillus subtilis рекомбинантной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон штамма Bacillus subtilis с нарушенной негативной регуляцией. Штамм -продуцент устойчив к 8-азагуанину, метионинсульфоксиду, диацелиту, псикофуранину и к эритромицину и позволяет получать до 12,4 г/л рибофлавина за 42 ч культивирования.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности, конкретно к микробиологическому синтезу рибофлавина (витамин В2), используемого в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных, в пищевой и фармацевтической промышленности.
Известен штамм B.subtilis ВНИИГенетика 304 продуцент рибофлавина (а.с. СССР N 908092, C I2 P 25/00, 1984), синтезирующий до I г/л рибофлавина за 48 часов культивирования при 37oC.
К недостаткам этого штамма следует отнести низкую продуктивность.
Важной задачей представляется получение нового штамма Bacillus subtilis
продуцента рибофлавина, обладающего более высокой продуктивностью.
продуцента рибофлавина, обладающего более высокой продуктивностью.
Поставленная задача достигается получением генетико-селекционными методами штамма Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186 (ВКПМ В-6797) продуцента рибофлавина.
Работа по конструированию штамма Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186 включала несколько этапов:
конструирование с применением генетико-селекционных методов реципиентного штамма Bacillus subtilis Y6 с ненарушенной системой рекомбинации,
конструирование с применением генетико-селекционных методов рекомбинантной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон штамма Bacillus subtilis 53А с нарушенной негативной регуляцией,
конструирование рекомбинантного штамма-продуцента рибофлавина Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186.
конструирование с применением генетико-селекционных методов реципиентного штамма Bacillus subtilis Y6 с ненарушенной системой рекомбинации,
конструирование с применением генетико-селекционных методов рекомбинантной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон штамма Bacillus subtilis 53А с нарушенной негативной регуляцией,
конструирование рекомбинантного штамма-продуцента рибофлавина Bacillus subtilis 62/рМХ30ribo186.
Конструирование реципиентного штамма. Известно, что биосинтез рибофлавина в Bacillus subtilis подвержен негативному контролю. Имеются два типа мутаций, снимающих этот контроль: мутации в операторной области рибофлавинового оперона ribO и мутации по репрессору биосинтеза рибофлавина ribC. На первом этапе получения реципиентного штамма в штамм Bacillus subtilis RK6121 (коллекция отделения молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского Института Ядерной Физики АН России) методом генетической трансформации вводят мутации ribC862 и ribO186. Затем для увеличения пула предшественника рибофлавина (гуанозин-5-трисфосфата) методом мутагенеза in vivo под действием N-метил-N-нитрозонитрогуанидина и ультрафиолета последовательно вводят мутации, определяющие устойчивость к 0.5 мг/мл 8-азагуанина и к 10 мг/мл метионин-сульфоксида. В полученный штамм, названный Bacillus subtilis 53А, также дополнительно вводят мутации, определяющие устойчивость к метионин-сульфоксиду (20 мг/мл), диацетилу (10 в ростовой среде) и псикофуранину (0,5 мг/мл). Таким образом был получен штамм-реципиент Bacillus subtilis Y6. Этот штамм синтезирует до 4 г/л рибофлавина за 48 часов культивирования при 37 41 oC.
Конструирование рекомбинантной плазмиды. К бациллярному вектору рМХ30 [Мол. Биол. 1984, т. 18, с.189 196] определяющему устойчивость бацилл к эритромицину и имеющему размер 18,3 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов), присоединяют фрагмент ДНК с рибофлавиновым опероном Bacillus subtilis 53А, содержащим мутацию ribO186 в операторной области. В результате была получена гибридная плазмида, которой присвоено название рМХ30 ribO186, обусловливающая устойчивость к 10 мкг/мл эритромицина и имеющая размер 28,6 т.п.н.
Конструирование рекомбинантного штамма Bacillus subtilis 62/рМХ30ribO186. В штамм Bacillus subtilis Y6 методом генетической трансформации вводят плазмиду рМХ30ribO186. Трансформанты отбирают по признакам устойчивости к 19 мкг/мл эритромицина и по повышению биосинтеза рибофлавина.
Полученный таким образом штамм Bacillus subtilis 62/рМХ30ribO186 способен синтезировать до 12,4 г рибофлавина (витамина В2) за 42 часа культивирования. Штамм депонирован 10.05.1994 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-6797.
Культурально-морфологические признаки.
Морфология под микроскопом. Спорообразующая грамположительная палочка длиной 2 3 мкм.
Морфология на разных средах.
Мясопептонный агар (МПА). На 2 сут. роста при 37oC образует колонии с неровным краем диаметром 3 4 мм, поверхность гладкая, блестящая, колонии выделяют в среду пигмент, флуоресцирующий в УФ-лучах желтым цветом.
Мясопептонный бульон (МПБ). Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды. Рост без качания на поверхности в виде пленки.
Минимальная среда Спицайзена с глюкозой. На 2 сут. роста образует колонии диаметром 2 3 мм, выделяющие в среду флуоресцирующий в УФ-лучах ярко-желтый пигмент.
Агар Хоттингера (АХ). На 2 сут. роста при 37oC образует колонии с ровным краем диаметром 3 5 мм, поверхность гладкая, блестящая, колонии выделяют в среду пигмент, флуоресуирующий в УФ-лучах желтым цветом.
Физиолого-биохимические признаки. Растет при температуре 28 44oC, оптимум температуры 41oC, pH ростовых сред 5,5 9,0, оптимум pH 6,5 - 7,2.
Отношение к источникам углерода: хорошо утилизирует глюкозу, сахарозу, крахмал, мальтозу, мелассу. Отношение к источникам азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину, (NH4)2НРО4, (NH4)2SO4.
Штамм Bacillus subtilis 62/рМХ30ribO186 имеет хромосомную ribC862-мутацию, ribO186-мутацию в хромосомной и плазмидных копиях рибофлавинового оперона, хромосомные мутации, обусловливающих устойчивость к 8-азагуанину (AzgR), метионин-сульфоксиду (MsoR), диацетилу (DacR), а так же плазмидную устойчивость к эритромицину (EmR).
Культивирование штамма Bacillus subtilis 62/pMX30ribO186 осуществляют следующим образом.
Односуточную культуру, выращенную на агаре Хоттингера с глюкозой и эритромицином, переносят в колбы с посевной средой, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт или кукурузный экстракт, пептон, минеральные соли, эритромицин.
Посевной материал выращивают 8 20 ч при 37 41 oC в условиях аэрации и в количестве 2 5% переносят в основную ферментационную среду.
Ферментационная среда содержит глюкозу, сахарозу или мелассу, высушенную биомассу дрожжей, дрожжевой экстракт, минеральные соли, содержит или не содержит эритромицин.
Ферментацию осуществляют при 37 43 oC, перемешивании и аэрации (сульфитное число 1 5 г О2/л ч ). Ферментация ведется с постоянной подачей подпитки, содержащей глюкозу, сахарозу или мелассу, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, содержащий или не содержащий эритромицин.
Через 42 ч ферментации штамма Bacillus subtilis 62/pMXribO186 в среде накапливается до 12,4 г/л рибофлавина.
Пример 1.
Односуточную культуру Bacillus subtilis Y6, выращенную при 37oC на косяке с агаризованной средой следующего состава:
пентон 10 г/л
дрожжевой экстракт 10 г/л
глюкоза 20 г/л
NaCl 2,5 г/л
агар-агар 15 г/л
(pH 6,8 7,2),
переносят петлей на жидкую среду следующего состава:
пептон 10 г/л
дрожжевой экстракт 10 г/л
глюкоза 20 г/л
NaCl 2,5 г/л
(pH 6,8 7,2)
Посевной материал выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке 260 об/мин при температуре 41oC в течении 8 ч и вносят в количестве 5% в ферментационную среду следующего состава:
меласса 15 г/л
дрожжевой экстракт 1,5 г/л
(NH4)2HPO4 14,2 г/л
К2 SO4 5,33 г/л
MgSO4 7H2O 0,71 г/л
(pH 6,8 7,2)
Ферментацию осуществляют в ферментерах типа MDL фирмы
Marubishi объемом 1 л с исходным объемом ферментационной среды 0,45 л при перемешивании (1100 об/мин), уровне аэрации 0,6 л/мин и температуре 41 oC. Подпитка подается в течении всей ферментации со скоростью подачи 3,6 г/л ч сахара. Объем поданной подпитки составляет 280 мл.
пентон 10 г/л
дрожжевой экстракт 10 г/л
глюкоза 20 г/л
NaCl 2,5 г/л
агар-агар 15 г/л
(pH 6,8 7,2),
переносят петлей на жидкую среду следующего состава:
пептон 10 г/л
дрожжевой экстракт 10 г/л
глюкоза 20 г/л
NaCl 2,5 г/л
(pH 6,8 7,2)
Посевной материал выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке 260 об/мин при температуре 41oC в течении 8 ч и вносят в количестве 5% в ферментационную среду следующего состава:
меласса 15 г/л
дрожжевой экстракт 1,5 г/л
(NH4)2HPO4 14,2 г/л
К2 SO4 5,33 г/л
MgSO4 7H2O 0,71 г/л
(pH 6,8 7,2)
Ферментацию осуществляют в ферментерах типа MDL фирмы
Marubishi объемом 1 л с исходным объемом ферментационной среды 0,45 л при перемешивании (1100 об/мин), уровне аэрации 0,6 л/мин и температуре 41 oC. Подпитка подается в течении всей ферментации со скоростью подачи 3,6 г/л ч сахара. Объем поданной подпитки составляет 280 мл.
Состав подпитки:
меласса 330г/л сахара
кукурузный экстракт 150 мл/л
дрожжевой экстракт 1,5 г/л
(pH 6,8-7,2)
Через 42 ч культивирования концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 4,1 г/л.
меласса 330г/л сахара
кукурузный экстракт 150 мл/л
дрожжевой экстракт 1,5 г/л
(pH 6,8-7,2)
Через 42 ч культивирования концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 4,1 г/л.
Пример 2.
Тоже как, в примере 1, только в состав сред для получения односуточной культуры, посевного материала, для ферментации и подпитки дополнительно входит эритромицин в концентрации 10 мг/л и используют штамм Bacillus subtilis 62/pMXribO186.
В результате через 42 ч культивирования концентрация рибофлавина в культуральной жидкости составляет 12,4 г/л.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-6797 продуцент рибофлавина.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94021756A RU2081906C1 (ru) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент рибофлавина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94021756A RU2081906C1 (ru) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент рибофлавина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94021756A RU94021756A (ru) | 1996-07-27 |
| RU2081906C1 true RU2081906C1 (ru) | 1997-06-20 |
Family
ID=20157032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94021756A RU2081906C1 (ru) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент рибофлавина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2081906C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460773C2 (ru) * | 2010-07-27 | 2012-09-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | Жидкая питательная среда для накопления высокоактивных метаболитов штаммом bacillus pumilus "пашков", обладающих ингибирующим действием в отношении бактерий, грибов и вирусов |
| CN112980715A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-06-18 | 内蒙古工业大学 | 一株枯草芽孢杆菌株b13及其应用 |
-
1994
- 1994-06-15 RU RU94021756A patent/RU2081906C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Авторское свидетельство СССР N 908092, кл. С 12 Р 25/00, 1984. Молекулярная биология, 1984, т. 18, с. 189 - 196. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460773C2 (ru) * | 2010-07-27 | 2012-09-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН) | Жидкая питательная среда для накопления высокоактивных метаболитов штаммом bacillus pumilus "пашков", обладающих ингибирующим действием в отношении бактерий, грибов и вирусов |
| CN112980715A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-06-18 | 内蒙古工业大学 | 一株枯草芽孢杆菌株b13及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94021756A (ru) | 1996-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2119536C1 (ru) | Штамм escherichia coli - продуцент l-гистидина | |
| US4278765A (en) | Method for preparing strains which produce aminoacids | |
| EP0593792B1 (en) | Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine | |
| US6132999A (en) | L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine | |
| CN100564516C (zh) | 生产靶物质的方法 | |
| KR960705947A (ko) | 물지 제조법(Process for producing substance) | |
| CN1085950A (zh) | 生产色氨酸的微生物及其制备方法 | |
| FR2484448A1 (fr) | Procede pour produire de la l-arginine par fermentation | |
| NO964754D0 (no) | DNA-kjede anvendelig i ökning av karotenoid utbytte | |
| CN1333074C (zh) | 反式－4－羟基－l－脯氨酸的制造方法 | |
| Jung et al. | Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for vancomycin production by Amycolatopsis orientalis | |
| RU2081906C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент рибофлавина | |
| Poshekhontseva et al. | Streptomyces tsukubensis VKM Aс-2618D—an Effective Producer of Tacrolimus | |
| CN111378673B (zh) | 转录调控因子tr2的突变体在制备维生素b12中的应用 | |
| CN106635945A (zh) | 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 | |
| CN1156180A (zh) | 用大肠杆菌生产色氨酸 | |
| FR2546907A1 (fr) | Procede de production de la riboflavine | |
| JPH022349A (ja) | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| CN101137743A (zh) | 能够将XMP转化成GMP并保持与GMP降解有关的基因为失活状态的Escherichia菌株及其使用方法 | |
| KR100422307B1 (ko) | 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법 | |
| Debbia | Filamentation promotes F'lac loss in Escherichia coli K12 | |
| JP3239903B2 (ja) | エシェリヒア・コリによる新規ｌ−スレオニン生産菌の創成とそれによるｌ−スレオニンの生産方法 | |
| Jones et al. | Guanosine 5′-diphosphate 3′-diphosphate (ppGpp), guanosine 5′-diphosphate 3′-monophosphate (ppGp) and antibiotic production in Streptomyces clavuligerus | |
| KR880002417B1 (ko) | 구아노신의 제조법 | |
| CN85107905A (zh) | 尿嘧啶核苷的制备 |