RU2021113722A - Мембрана для отделения стволовых клеток от биологических образцов, способ получения указанной мембраны и способ и устройство для отделения, включающие указанную мембрану - Google Patents

Claims (36)

1. Мембрана для отделения целевых стволовых клеток от суспензии отдельных клеток, содержащей стволовые клетки, причем указанная суспензия отдельных клеток получена из биологического образца, содержащего стволовые клетки, где мембрана состоит из трехмерной структуры-носителя с интегрированными целевыми молекулами на поверхности и/или в порах указанной структуры-носителя, причем указанная структура-носитель изготовлена из по меньшей мере одного слоя биосовместимого полимера с порами, имеющими диаметр в диапазоне от 50 до 500 мкм, и где указанная структура-носитель имеет на своей поверхности и/или в порах ковалентно связанные целевые молекулы, которые распознают и связывают характеристические антигены на поверхности целевых стволовых клеток.

2. Мембрана по п. 1, где каждый отдельный слой структуры-носителя имеет либо структурированную геометрию с формой, размером и распределением пор, одинаковыми по всему слою, либо неструктурированную геометрию с формой, размером и распределением пор, произвольными по всему слою.

3. Мембрана по п. 1 или 2, где в случае, когда структура-носитель составлена из нескольких слоев, имеющих структурированную или неструктурированную геометрию, отдельные слои изготовлены из одинаковых или разных биосовместимых полимеров, и геометрия отдельных слоев является одинаковой или разной.

4. Мембрана по любому из пп. 1-3, где диаметр пор в отдельном слое находится в диапазоне от 100 до 200 мкм.

5. Мембрана по любому из пп. 1-4, дополнительно включающая функционализированные наночастицы, интегрированные в/на структуру мембраны, т.е. «in situ» в биосовместимом полимере, из которого изготовлена структура-носитель, при этом целевые молекулы ковалентно связаны с функционализированными наночастицами через их поверхностные функциональные группы, т. е. активные центры на функционализированных наночастицах.

6. Мембрана по любому из пп. 1-5, выполненная в виде трехмерной структуры-носителя, изготовленной из нескольких слоев биосовместимого полимера, где каждый отдельный слой имеет структурированную геометрию с порами, имеющими диаметр в диапазоне от 100 до 200 мкм, и при этом отдельные слои структуры-носителя изготовлены из того же биосовместимого полимера с интегрированными функционализированными наночастицами, с которыми целевые молекулы ковалентно связаны через поверхностные функциональные группы.

7. Мембрана по любому из пп. 1-6, где биосовместимые полимеры включают, но не ограничивается перечисленным, различные тканые и нетканые натуральные материалы, например, производные полисахаридов, представляющие собой альгинат (ALG), карбоксиметилцеллюлозу (CMC), вискозу (VIS), шелк, коллаген, нанофибриллированную целлюлозу (NFC) и другие и их комбинации, полусинтетические материалы, такие как хитозан (CHI) и его производные, целлюлоза и другие производные, а также их комбинации, и синтетические материалы, например, поликапролактон (PCL), полиэтилентерефталат (PET), полибутилентерефталат (PBT), полипропилен (PP), полигидроксиэтилметакрилат (PHEMA), поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (PHPMA), поливиниловый спирт (PVA), полиэтиленоксид (PEOX), различные дендримеры, например, полиамидоамин (PAMAM), полиэтиленимин (PEI) и другие и их комбинации, предпочтительно биосовместимые полимеры выбраны из PCL, CMC, HIT, ALG, PET, PEOX и PHEMA/PHPMA.

8. Мембрана по любому из пп. 1-7, где указанная целевая молекула представляет собой целое антитело или часть антитела, которое распознает характеристический антиген на поверхности целевой стволовой клетки и обеспечивает возможность специфичного связывания с характеристическим антигеном, предпочтительно это антитела, которые распознают следующие антигены: CD90, CD146, CD44, CD73, CD105, CD34, STRO-1, STRO-3 и другие.

9. Мембрана по любому из пп. 1-8, где функционализированные наночастицы представляют собой неорганические, органические, гибридные, композитные, магнитные наночастицы или их комбинации, и состоят из металлов или их сплавов, и/или оксидов металлов, и/или полимеров, или любой комбинации указанных выше основных материалов, и имеют на своей поверхности функциональные группы, например, NH₂, OH, COOH, SH.

10. Мембрана по любому из пп. 1-9, включающая трехмерную структуру-носитель, состоящую из десяти слоев, имеющих структурированную геометрию и изготовленных из поликапролактона, с размером пор приблизительно 100 мкм и интегрированными функционализированными наночастицами NiCu, заключенными в слой диоксида кремния, с функциональными группами NH₂ на поверхности, с которой связаны целевые молекулы.

11. Способ получения мембраны, включающий следующие стадии:

предварительное получение функционализированных наночастиц, имеющих на своей поверхности функциональные группы для связывания целевых молекул, которые распознают и связывают характеристические антигены, связанные с поверхностью стволовых клеток;

интеграция предварительно полученных функционализированных наночастиц в/на структуру-носитель, изготовленную из биосовместимого полимера, в ходе способа получения мембраны, при котором функционализированные наночастицы интегрируются «in situ» или химически связываются в объеме, на поверхности и/или в порах структуры-носителя;

активация мембраны, при которой структуру-носитель с интегрированными функционализированными наночастицами погружают в раствор целевых молекул, при этом целевые молекулы связываются с указанными выше функциональными группами функционализированных наночастиц.

12. Способ по п. 11, где интеграция предварительно полученных функционализированных наночастиц в структуру-носитель включает плавление биосовместимого полимера, добавление предварительно полученных «in situ» функционализированных наночастиц с поверхностными функциональными группами в расплав, за которым следует получение структуры-носителя, во время которого функционализированные наночастицы интегрируются в структуру мембраны.

13. Способ по п. 11 или 12, где структура-носитель получена с применением 3D-печати или электроспиннинга, или плетения обработанных или необработанных бесконечных волокон или их комбинаций.

14. Способ по любому из пп. 11-13, необязательно включающий дополнительную обработку поверхности структуры-носителя с интегрированными функционализированными наночастицами для увеличения количества активных центров на поверхности и/или в порах структуры-носителя, причем указанная дополнительная обработка поверхности включает механическую, химическую или плазменную обработку.

15. Способ по любому из пп. 11-14, при котором активацию мембраны через функционализированные наночастицы можно также осуществлять до получения мембраны, при этом к расплаву выбранного биосовместимого полимера добавляют предварительно полученные «in situ» биофункционализированные наночастицы с целевыми молекулами, уже связанными с их поверхностными функциональными группами, с последующим получением мембраны с помощью 3D-печати, при этом биофункционализированные наночастицы со связанными целевыми молекулами интегрируют в структуру-носитель в ходе способа ее получения.

16. Способ получения мембраны, включающий получение структуры-носителя из биосовместимого полимера с последующей химической обработкой поверхности носителя с получением, таким образом, ковалентно связанных поверхностных функциональных групп на поверхности или в порах структуры-носителя с последующей активацией мембраны, при этом целевые молекулы связываются с указанными выше поверхностными функциональными группами.

17. Способ отделения целевых стволовых клеток от биологических образцов с помощью мембраны по любому из пп. 1-10, где указанный способ включает:

получение исходной суспензии отдельных клеток, содержащей целевые стволовые клетки, а также другие нецелевые клетки, которые представляют собой клетки других тканей, нецелевые стволовые клетки, продукты клеточного распада и другие компоненты, присутствующие в биологическом образце, при этом размер отдельных клеток и/или возможных более мелких кластеров клеток в суспензии не превышает размер пор мембраны, и плотность исходной суспензии отдельных клеток поддерживается на уровне ниже 2×10⁸ клеток/мл;

отделение целевых стволовых клеток от исходной суспензии, происходящее на основании прохождения свободного потока исходной суспензии отдельных клеток по меньшей мере через одну мембрану, при этом целевые стволовые клетки захватываются на поверхности мембраны и в порах из-за специфического распознавания и связывания между характеристическими антигенами на поверхности целевых стволовых клеток и целевыми молекулами, связанными с мембраной.

18. Способ по п. 17, где получение исходной суспензии отдельных клеток включает процессы разрушения биологических образцов, которые включают, но не ограничиваются перечисленным, механическую обработку, например, мацерацию, разрезание, соскабливание, центрифугирование, химическую обработку, например, обработку буфером для лизиса эритроцитов, добавление антикоагулянтов, ферментативную обработку, например, применение коллагеназы, гиалуронидазы, трипсина или их комбинаций, и/или их комбинации.

19. Способ по п. 17 или 18, где получение исходной суспензии отдельных клеток включает механическую фильтрацию с применением сетчатых фильтров с пористостью от 10 до 100 мкм, при условии, что материал сетчатого фильтра не связывает целевые стволовые клетки, и при этом сетчатые фильтры используются по отдельности или в виде каскада последовательных фильтров с уменьшающимся размером пор, и при этом отдельные фильтры в каскаде изготовлены из разных материалов.

20. Способ по любому из пп. 17-19, где получение исходной суспензии отдельных клеток необязательно включает стадию удаления эритроцитов до механической фильтрации.

21. Способ по любому из пп. 17-20, где размер отдельных клеток и/или возможных более мелких кластеров клеток в суспензии не превышает 70 мкм в по меньшей мере двух измерениях, и плотность исходной суспензии отдельных клеток составляет от 1×10⁶ до 1×10⁷ клеток/мл.

22. Способ по любому из пп. 17-21, где подходящую плотность исходной суспензии отдельных клеток обеспечивают путем добавления физиологического буфера для осуществления разбавления или путем увеличения их количества в суспензии путем концентрирования, если необходимо.

23. Способ по любому из пп. 17-22, включающий отделение клеток с помощью нескольких мембран в каскаде, при этом каждая последующая мембрана, расположенная в каскаде, имеет такие же или меньшие размеры пор.

24. Способ по любому из пп. 17-22, необязательно включающий удаление целевых стволовых клеток с мембраны, причем способы удаления включают, но не ограничивается перечисленным, физические или механические способы, например, изменение давления, физико-химические способы, например изменение ионной силы путем добавления соли, буферов, ополаскивания сверхчистой водой; биохимические способы, например применение ферментов, расщепляющих связь между антигеном и мембраной; химические способы, например восстановление дисульфидных связей до тиоловых групп; способы на основе аффинности, например добавление соединений с большей афинностью к выбранной активной функционализированной поверхности, чем клетки; и их комбинации, причем указанные способы могут использоваться по отдельности, или в комбинации, или как каскадные системы одинаковых или разных способов с любым количеством повторений.

25. Устройство для отделения целевых стволовых клеток от биологического образца с помощью мембраны по любому из пп. 1-10, где указанное устройство состоит из корпуса, содержащего электронные и механические компоненты с соответствующей регулировкой, и сменной кассеты, причем сменная кассета содержит коллекторный контейнер (FC) для исходной суспензии отдельных клеток, камеру смешивания (MIX), где путем добавления физиологического буфера из контейнера (PBS) обеспечивается, при необходимости, плотность исходной суспензии отдельных клеток на уровне ниже 2×10⁸ клеток/мл, по меньшей мере одну мембрану (AM) для отделения целевых стволовых клеток от суспензии отдельных клеток, контейнер для отходов (W) и коллектор (SC) для суспензии целевых стволовых клеток.

26. Устройство по п. 25, где электронный компонент включает источник питания ИБП (источник бесперебойного питания), датчики потока и температуры для обеспечения контроля потока и оптимальной температуры 37°C, устройство для подсчета клеток, аналого-цифровые преобразователи (АЦП) и электрические преобразователи.

27. Устройство по п. 25 или 26, где механическая часть устройства включает системы клапанов, насосную систему и/или компрессор, направляющую систему для открытия/закрытия части, в которую вставляется сменная кассета, зажимы для фиксации кассеты в корпусе устройства, а также соединение жидкостной системы на основе быстроразъемных зажимов, чтобы упростить замену кассет.

28. Устройство по п. 26, где подача исходной суспензии отдельных клеток на мембрану (AM) регулируется автоматически, при этом устройство для подсчета клеток определяет количество клеток и поддерживает плотность исходной суспензии на уровне ниже 2×10⁸ клеток/мл путем автоматического добавления физиологического буфера из контейнера (PBS).

29. Устройство по любому из пп. 26-28, где устройство для подсчета клеток работает, основываясь на принципе биоимпеданса, и состоит из двух электродов, изготовленных из любого материала, определяющих изменение электрического сопротивления, причем устройство для подсчета клеток установлено в двух частях устройства, а именно, на участке до того, как исходная суспензия отдельных клеток достигла мембраны (AM), и до того, как стерильная суспензия целевых стволовых клеток в физиологическом буфере достигла контейнера (SC).

30. Устройство по любому из пп. 25-29, необязательно содержащее очищающую кассету для самоочищения, осуществляемого автоматически и в соответствии с протоколом для автоматического самоочищения.

31. Устройство по любому из пп. 26-30, где датчики подключены к компьютеру-концентратору с сенсорным экраном с соответствующим интерфейсом, и устройство подключено к Интернету через порт LAN компьютера-концентратора.