RU2005724C1 - Способ производства натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья и установка для его осуществления - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнология и химико-фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: животное сырье (молоки осетровых рыб, селезенку, эритроциты цыпленка и т. д. ) измельчают и гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, обрабатывают гомогенат детергентом и концентрированным раствором хлористого натрия при повышенной температуре; затем реакционную смесь после предварительного формирования из нее слоя определенной толщины обрабатывают в течение 10 - 80 мин ультразвуком с частотой 8 - 35 кГц и интенсивностью 0,2 - 2,0 Вт/cм² "озвученную" массу смешивают с кизельгуром в соотношении соответственно 5 : 1 - 25 : 1 (объем/мас), жидкую фазу отделяют фильтрованием и концентрируют барофильтрацией; Na-соль ДНК осаждают из концентрата этиловым спиртом, а осадок высушивают при 20 - 60С. Масштабирование процесса осуществляется благодаря созданию и использованию новой промышленной установки. 1 ил.

Description

Изобретение относится к технологии получения биологически активных веществ и может быть использовано в биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности, а получаемый продукт - в медицине, ветеринарии, парфюмерии и научно-исследовательской практике.

Известен ряд способов получения натриевой соли ДНК из источников животного происхождения.

Основным недостатком большинства из них является то, что эти способы предназначены для использования в лабораторных условиях и не рассчитаны на получение целевого продукта в промышленных масштабах.

Среди немногочисленных методов выделения ДНК из животного сырья, предполагающих возможность масштабирования процесса, т. е. обладающих такими показателями, как доступность сырья, простота операций, отсутствие потребности в уникальном оборудовании и реактивах и т. д. , наиболее близким к предложенному по совокупности общих приемов является способ, включающий измельчение и гомогенизацию исходного сырья (молок осетровых рыб) в цитратно-солевом растворе, обработку реакционной смеси детергентом и хлористым натрием при 60-70^оС, охлаждение, смешивание с кизельгуром, элюцию ДНК цитратно-солевым раствором, отделение элюата фильтрованием и осаждение конечного продукта этиловым cпиртом. Указанный способ использует доступное сырье, допускает возможность обработки значительных его количеств, включает простые операции, не нуждающиеся в применении дефицитного оборудования и реактивов, однако его промышленное использование явно нецелесообразно вследствие недостаточной производительности и низкого выхода целевого продукта (не более 3% от содержания в исходном сырье).

Кроме того, получаемая этим, а также и другими известными способами, высокомолекулярная ДНК имеет ограниченную область применения и используется в генной инженерии и научно-исследовательских работах по молекулярной биологии и генетике.

Применение такой ДНК в медицинской практике возможно лишь после дополнительной обработки готового продуката с целью ограниченного (контролируемого) фрагментирования макромолекул, которое имеет следствием уменьшение вязкости раствора ДНК, а также устранение присущих высокомолекулярной форме свойств токсичности и канцерогенности.

При этом во многих случаях наблюдается значительная деградация нативной двунитевой структуры ДНК (там же), а следовательно, утрата ею ряда важнейших биологических свойств.

Осуществление промышленного способа, включающего дробление ДНК в виде конечной стадии процесса (после получения осадка высокомолекулярной формы) практичеспки невозможно из-за технологичеаских трудностей при отделении, растворении и дальнейшей обработке высоковязких осадков.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа производства натриевой соли ДНК, обусловливающего не только возможность (сохраняющего положительные качества прототипа), но и целесообразность масштабирования процесса, а именно отличающегося высокой производительностью и позволяющего получать высокий выход препарата ДНК с характеристиками, которые необходимы для существенного расширения области его применения (ограниченное снижение молекулярной массы при сохранении нативной структуры и высокое качество очистки).

Поставленная задача достигается за счет:
а) введения перед смешиванием реакционной массы с кизельгуром стадии ультразвуковой обработки при строго определенных режимах;
б) проведения "озвучивания" реакционной смеси в слое, толщина которого обеспечивает равномерную обработку всего материала при избранном режиме;
в) выбора оптимального соотношения кизельгур / реакционная смесь;
г) введения процедуры, концентрирования жидкой фазы баромембранным методом;
д) высушивания осадка в "мягких" условиях (20-60^оС).

Прием "а" позволяет осуществить не только контролируемое фрагментирование высокомолекулярной ДНК, но и такое изменение структуры реакционной массы, которое облегчает последующую очистку и улучшает ее качество.

Прием "б" повышает эффективность и однородность УЗ-обработки и обеспечивает увеличение "пропускной способности" на этой стадии.

Прием "в" сказывается на всех трех основных показателях способа: производительности, выходе продукта и качестве очистки.

Изменение соотношения кизельгур / реакционная смесь в сторону увеличения приводит к снижению скорости процесса; "задержке" на сорбенте не только балластных белков, но и части ДНК, что имеет следствием необходимость введения дополнительной операции элюирования; уменьшение соотношения приводит к быстрому образованию на сорбенте белковой пленки, ухудшающей качество отделения примесных соединений.

Прием "г" способствует более полному выпадению осадка ДНК, а следовательно, положительно сказывается на выходе целевого продукта. Концентрирование с использованием баромемран в работе с полноразмерной ДНК из животного сырья невозможно.

Прием "д" (высушивание при 20-60^оС) предохраняет полученный продукт от возможных неблагоприятных последствий лиофильной сушки, которая обычно применяется в аналогичных методах; он также возможен в данном случае благодаря снижению молекулярной массы препарата и высокому уровню очистки.

П р и м е р 1. 1 кг молок осетровых рыб измельчают на мясорубке, гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора (0,15 М NaCl и 0,015 М цитрат Na) и помещают в реактор с подогретым цитратно-солевым раствором (3 л), добавляют 10 л 6% -ного раствора додецилсульфата натрия (Na-ДС) в 45% -ном этиловом спирте и выдерживают реакционную смесь при 60^оС в течение 1,5 ч при постоянном перемешивании. Затем добавляют равный объем 5 М раствора NaCl и продолжают перемешивание при той же температуре еще 1,5 ч. После этого реакционную массу охлаждают до комнатной t^o.

Охлажденную массу выливают в ванну слоем 15 мм и обрабатывают ультразвуком с частотой 8 кГц и интенсивностью 2 Вт/см² в течение 80 мин. "Озвученную" массу смешивают с порошком кизельгура в соотношении 5: 1 (объем: мас), после чего отделяют жидкую фазу на нутч-фильтре.

После дополнительной микрофильтрации фильтрат концентрируют (баромембранным методом) на мембране с размером пор 0,45 мкм.

Получают 8 л концентрата, содержащего 7,5 мас. % ДНК в виде Na-соли. Целевой продукт выделяют путем переосаждения его этиловым спиртом. Осадок отделяют центрифугированием и сушат при 20-40^оС в течение 48 ч.

Получают 60 г натриевой соли ДНК, имеющей следующие характеристики: мол. м. 400 ± 100 кД, содержание белка не более 1% , содержание РНК не более 2% , содержание полисахаридов не более 2% , влажность 17% , гиперхромный эффект 44% . Конечный продукт представляет собой белый аморфный порошок.

П р и м е р 2. 1 кг селезенки свиньи измельчают и гомогенизируют в 2 л цитратно-солевого раствора. До стадии барофильтрации процесс осуществляют аналогично примеру 1; жидкую фазу концентрируют на мембране с размером пор 0,8 мкм.

Получают 0,5 л концентрата, содержащего 3,6 мас. % натриевой соли ДНК. Целевой продукт осаждают этиловым спиртом, взятым в соотношении с концентратом 1: 2; осадок отделяют и сушат при 50-60^оС.

Получают 1,8 г Na-соли ДНК со следующими характеристиками: мол. м. ≈455 кД, содержание белка не более 1,5% , содержание ДНК не более 2% , содержание полисахаридов не более 2% , влажность 15% , гиперхромный эффект 42% .

П р и м е р 3. Процесс проводят, как в примере 1, но время воздейсвия УЗ составляет 10 мин, частота 35 кГц, толщина слоя 70 мм, интенсивность 2,0 Вт/см²; соотношение кизельгура и реакционной массы 1: 25, t^o сушки 30-40^оС.

Получают 60 г Na-ДНК, имеющей следующие характеристики: мол. м. 400 ± 100 кД, содержание белка РНК не более 2,0 мас. % , влажность 16,5% , гиперхромный эффект 44% .

П р и м е р 4. До стадии обработки ультразвуком как в примере 1. Далее реакционную массу сразу смешивают с кизельгуром (5: 1) и отфильтровывают на нутч-фильтре. Из фильтрата без предварительного концентрирования выделяют ДНК двойным переосаждением в этиловом спирте. Получают ≈ 40 мг препарата со следующими характеристиками: мол. м. 15000 кД; содержание белка 1,5 мас. % ; содержание РНК 2,0 мас. % ; гиперхромный эффект 41% . Предложенный способ позволяет повысить выход целевого продукта до 80-90% от содержания ДНК в исходном сырье.

Контролируемый размер фрагментов, сохранность вторичной структуры макромолекулы и высокая степень очистки дают возможность использовать полученный заявленным способом препарат Na-ДНК в научно-исследовательской практике и работах по генной инженерии.

Ограниченное снижение молекулярной массы обеспечивает возможность применения получаемой Na-соли ДНК в медицине, ветеринарии и парфюмерии (после получения соответствующих лекарстенных форм).

Таким образом, заявленный способ производства Na-соли ДНК из животного сырья обуславливает не только возможность, но и целесообразность масштабирования процесса. Перевод способа на промышленную основу осуществляется благодаря применению предлагаемой установки.

Аналогов установки, обеспечивающей полный технологический цикл производства натриевой соли ДНК из животного сырья (от подготовки сырья до получения сухого порошкообразного продукта) в научно-технической и патентной литературе не обнаружено.

Создание настоящей установки направлено на решение задачи перевода способа получения натриевой соли ДНК с заявленными характеристиками (высокая степень очистки, определенный размер фрагментов, сохранение нативной структуры) на промышленную основу.

Решение этой задачи по-существу сводится к выполнению трех основных условий:
а) увеличение объема сырья, обрабатываемого в ходе одного цикла;
б) точному соблюдению последовательности операций способа и режимов их проведения;
в) предотвращению дополнительных потерь, обычно связанных с масштабированием процесса (т. е. сохранением высокого выхода целевого продукта, исходно обеспечиваемого предложенным способом).

На уровне устройства это достигается соответственно за счет:
а) наличия в установке подходящих конструктивных элементов;
б) расположения аппаратуры в строго определенном порядке (в соответствии с аппаратурной схемой);
в) конструктивного решения отдельных элементов оборудования и/или их количества в "узких" местах технологического процесса.

Что касается последнего условия, то необходимость его соблюдения диктуется тем, что из-за значительных различий в характере и скорости отдельных операций технологического процесса при переходе от стадии с высокой (за счет высокой скорости или большого объема) "пропускной способностью" к стадии с низкой может иметь место задержка в ходе обработки реакционной массы, имеющая следствием потери целевого продукта. Эти "простои" и соответственно дополнительные потери ДНК могут быть сведены до минимума благодаря либо новому конструктивному решению устройств, обслуживающих такие "узкие" места способа, либо наличию на этих участках необходимого числа элементов оборудования, подобранных из известных средств. В данном случае основным "узким" местом при масштабировании способа является ультразвуковая обработка, поскольку устройства, применяемые обычно для "озвучивания" биологических объектов, рассчитаны на небольшие объемы обрабатываемого материала. При создании настоящей установки эта трудность была преодолена благодаря тому, что участок УЗ-обработки включает несколько (в зависимости от объема сырья в каждом цикле) ванн с встроенным в дно магнитостриктором. Ранее такие ванны не использовались. Природа обрабатываемого материала и, главное, необходимость равномерной "проработки" всей массы при строгоо определенных режимах, определили такие конструктивные особенности устройства, как минимальный зазор между боковыми стенками ванны и магнитостриктором, а также наличие в конструкции ванны перемещаемого охлаждающего змеевика и сливного отверстия.

На чертеже изображена функционально-техническая схема предложенной установки.

Установка для производства натриевой соли ДНК из животного сырья включает разделочный стол 1; мясорубку 2 с электроприводом; микроизмельчитель 3 ткани; реактор 4 для варки реакционной масс; реактор 5 охлаждения; устройство 6 для ультразвуковой обработки; смеситель 7 для перемешивания реакционной массы с порошком кизельгура; устройство для отделения жидкой фазы, например, нутч-фильтры 8; устройства 9 (а, б) для микрофильтрации; баромембранное устройство 10 для концентрирования жидкой фазы; реактор для осаждения Na-соли ДНК, оборудование для отделения и высушивания осадка, например, стаканчиковую центрифугу 12, воронку Шотта 13 и, при необходимости, - сушильный шкаф 14.

Кроме этого, установка содержит мерные емкости 15 (в приведенном на схеме варианте 12 шт. ) для отмеривания жидкостей; смесители 16 (на схеме 5 шт. ) для приготовления растворов и суспензий при комнатной температуре; реакторы 17 (на схеме 4 шт. ) для получения растворов и смесей при температуре, отличающейся от комнатной, и емкости 18 (на схеме 4 шт. ) для сбора промежуточных продуктов и отходов производства.

Смесители 16 представляют собой емкости, снабженные перемешивающими устройствами; смеситель 6 для кизельгура имеет высокооборотную мешалку (8000 об/мин). Смесители и мерные емкости, предназначенные для работы со спиртом и спиртовыми растворами, дополнительно герметизированы.

Реакторы 17 - герметичные емкости, которые снабжены мешалкой, рубашкой для подогрева или охлаждения, термостатирующим устройством и системой подачи сжатого воздуха. Реактор варки 4 имеет низкоскоростное перемешивающее устройство, например мешалку якорного типа.

Мерные емкости, смесители, реакторы и сборники соединены между собой трудопроводами.

Устройство 6 для ультразвуковой обработки состоит из нескольких ванн, каждая из которых снабжена встроенным в дно магнитострикционным преобразователем, соединенным с ультразвуковым генератором, при этом зазор между магнитостриктором и боковыми стенками ванны не превышает 2 см. Система охлаждения выполнена в виде трубчатого теплообменника, который размещен внутри ванны таким образом, чтобы расстояние между ним и магнитостриктором обеспечивало отсутствие взаимодействия между ними. Каждая ванна имеет отверстие для выпуска реакционной массы.

Технологический процесс получения Na-соли ДНК с использованием настоящей установки осуществляется следующим образом.

1. Приготовление гомогената и растворов.

1.1. Приготовление гомогената.

1.1.1. Свежезамороженное сырье (молоки осетровых рыб) поступает на разделочный стол 1 и размораживается, после чего его вручную зачищают от жира и пленок.

1.1.2. Очищенное сырье измельчают с помощью мясорубки 2 и гомогенизируют с цитратно-солевым раствором (ССЦ) в гомогенизаторе 3.

1.1.3. Полученный гомогенат собирается в сборник 18а и поступает в реактор варки 4.

1.2. Приготовление цитратно-солевого раствора (ССЦ).

1.2.1. Навеску цитрата натрия и хлористого натрия засыпают в реактор 17а, заливают из мерной емкости 15а необходимое количество дистиллированой воды.

1.2.2. Включают мешалку реактора, перемешивают до полного растворения соли, полученный раствор "передавливают" в мерную емкость 15б.

1.2.3. Из мерной емкости 15б раствор самотеком поступает в реактор варки 4 и на участок приготовления гомогената.

1.3. Приготовление водно-спиртового раствора додецилсульфата натрия.

1.3.1. Этиловый спирт из мерной емкости 15в и дистиллированная вода из мерной емкости 15г самотеком поступают в смеситель 16а с работающей мешалкой в пропорциии, необходимой для получения 45% -ного спиртового раствора.

1.3.2. 45% -ный спиртовой раствор перекачивают в мерную емкость 15д, после чего он самотеком поступает в реактор 17б.

1.3.3. В реактор 17б, заполненный водно-спиртовым раствором, засыпают навеску додецилсульфата натрия, включают мешалку и продолжают перемешивание до полного растворения.

1.3.4. Полученный раствор перекачивается в мерную емкость 15е и далее самотеком поступает в реактор варки 4.

1.4. Приготовление раствора хлористого натрия (5 М).

1.4.1. Навеску NaCl загружают в реактор 17в, куда затем самотеком поступает дистиллированная вода из мерной емкости 15ж, перемешивание продолжается до полного растворения соли.

1.4.2. Полученный раствор "передавливают" в мерную емкость 15з, откуда он самотеком поступает в реактор валки 4.

1.5. Приготовление 70% -ного этилового спирта.

1.5.1. В смеситель 16б в необходимой пропорции дистиллированная вода поступает из мерной емкости 15и и 96% -ный этиловый спирт из мерной емкости 15к.

1.5.2. Полученный раствор поступает в смеситель 16в.

2. Варка реакционной смеси
2.1. В реактор варки 4 после загрузки реакционной массы последовательно поступают ССЦ, раствор додецилсульфата натрия и 5 М NaCl; обработку каждым из растворов (при постоянном перемешивании) проводят при t^o = 60-70^оС в течение определенного времени; по окончании процесса варки реакционная смесь перекачивается в реактор охлаждения 5 и охлаждается до комнатной t^o.

3. Обработка ультразвуком.

3.1. Охлажденная масса подается в ванны УЗ-устройства 6 порционно и обрабатывается ультразвуком в течение определенного времени при необходимых режимах.

3.2. По окончании процедуры "озвучивания" смесь сливается через нижний выпуск ванны и поступает в смеситель 7.

4. Смешивание с кизельгуром
4.1. Одновременно с "озвученной" массой в смеситель 7 подается рассчетное количество порошка кизельгура; смесь перемешивается заданное время.

4.2. Полученная суспензия поступает порционно на вакуумные нутч-фильтры 8, где происходит отделение твердой фазы.

5. Фильтрация.

5.1. Собранная жидкая фаза подается насосом на фильтр тонкой очистки 9а и далее на установку для концентрирования 10.

5.2. Концентрат поступает в сборник 18б, а пермеат - в сборник 18в и далее идет на регенерацию.

6. Осаждение и отмывка ДНК.

6.1. Концентрат из сборника 18б проходит через фильтр тонкой очистки 9б и закачивается в мерную емкость 15л.

6.2. Из мерника 15л концентрат самотеком поступает в реактор высаживания 11, куда из мерной емкости 15м поступает 96% -ный этиловый спирт, осжадение ДНК проводится при постоянном перемешивании.

6.3. По окончании процесса осаждения суспензия поступает порционно самотеком на центрифугу 12а.

6.4. Отделенный центрифугированием осадок ДНК загружают в смеситель 16в и перемешивают с 70% -ным этиловым спиртом, поступающим из смесителя 16б.

6.5. Суспензия из смесителя 16в подается на центрифугу 12б, отделенный осадок загружают в смеситель 16г и гомогенизируют с 96% -ным спиртом, поступающим самотеком из мерной емкости 15н.

6.6. После окончания процесса отмывки осадка ДНК спиртом суспензия повторно поступает на центрифугу 12б; осадок, отделенный центрифугированием в виде пасты переносят на фильтр 13, где происходит отделение под вакуумом остатков влаги.

6.7. Надосадочная жидкость с позиций 12а, 12б и 13 поступает в сборник 18г, откуда идет на регенерацию.

6.8. Обезвоженный порошок рассыпают тонким слоем на противнях и помещают в сушильный шкаф 14, где он высушивается до определенной влажности.

6.9. Высушенный порошок поступает далее на фасовку и упаковку.

Предложенный способ производства натриевой соли ДНК с использованием установки позволяет в ходе одного цикла обрабатывать до 10 кг животного сырья. Na-соль ДНК, полученная на промышленной установке, имеет следующие характеристики: мол. м. 300-500 кД, гиперхромный эффект не менее 37% . Содержание белка не более 1,5% . Содержание ДНК не менее 80% . (56) Авторкое свидетельство СССР N 487897, кл. С 07 Н 21/04, 1976.

Патент США N 3899481, кл. С 07 Н 21/04, 1975.

Claims (3)

1. Способ производства натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из животного сырья, включающий измельчение и гомогенизацию исходного сырья в цитратно-солевом растворе, обработку гомогената детергентом и концентрированным раствором хлористого натрия при повышенной температуре, охлаждение реакционной массы, смешивание ее с кизельгуром, отделение жидкой фазы фильтрованием и осаждение продукта этиловым спиртом, отличающийся тем, что перед смешиванием с кизельгуром реакционную смесь в течение 10 - 80 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 8 - 35 кГц и интенсивностью 0,2 - 2,0 Вт/см², воздействие ультразвуком осуществляют в слое реакционной массы толщиной, обеспечивающей полную и равномерную обработку всего материала при избранных режимах и температуре, при смешивании с кизельгуром используют соотношение сорбента и реакционной массы 1 : 5 - 25 (мас/об. ), отделенную фильтрованием жидкую фазу концентрируют барофильтрацией, а осадок натриевой соли ДНК высушивают при 20 - 60^oС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при концентрировании жидкой фазы используют мембраны с диаметром пор 0,05 - 1 мкм.

3. Установка для производства натриевой соли ДНК из животного сырья, содержащая разделочный стол, мясорубку с электроприводом, микроизмельчитель тканей, реактор варки и реактор охлаждения реакционной смеси, каждый из которых снабжен низкоскоростным перемешивающим устройством, например мешалкой якорного типа, теплообменной рубашкой, терморегулятором и системой подачи сжатого воздуха, связанные между собой, а также с мерными емкостями и смесителями трубопроводами, участок обработки реакционной массы ультразвуком, состоящий из нескольких ультразвуковых генераторов и ванн, где каждая ванна снабжена встроенным в дно магнитострикционным преобразователем, зазор между которым и боковыми стенками ванны не превышает 2 см, отверстием для выпуска реакционной массы и системой охлаждения, выполненной в виде трубчатого теплообменника, размещенного внутри ванны над магнитостриктором, смеситель для обработки реакционной смеси сорбентом с установленной внутри него высокооборотной мешалкой, устройство для отделения жидкой фазы, устройство для микрофильтрации, баромембранное устройство для концентрирования жидкой фазы, реактор для осаждения конечного продукта спиртом и оборудование для отделения и сушки осадка натриевой соли ДНК.

Images