RU2553334C2 - Способ выделения белков из клеток костного мозга - Google Patents
Способ выделения белков из клеток костного мозга Download PDFInfo
- Publication number
- RU2553334C2 RU2553334C2 RU2013134870/10A RU2013134870A RU2553334C2 RU 2553334 C2 RU2553334 C2 RU 2553334C2 RU 2013134870/10 A RU2013134870/10 A RU 2013134870/10A RU 2013134870 A RU2013134870 A RU 2013134870A RU 2553334 C2 RU2553334 C2 RU 2553334C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- bone marrow
- protein
- centrifugation
- marrow cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Способ предусматривает извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии и центрифугирование фильтрата. Осадки вместе с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации. Затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Белки раствора высаливают с помощью сульфата аммония при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°C и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин. Полученные осадки смывают спиртом и эфиром и высушивают на часовом стекле. К полученному порошку добавляют 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 сут и дистиллированной водой в течение 1 ч. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле. Изобретение обеспечивает упрощение способа выделения общего белка, повышение чистоты целевого продукта, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, доступность, поскольку клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. 3 пр.
Description
Изобретение относится к биохимии, а именно, к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.
Описан способ получения белка, RU 2041716 C1, A61K 35/28, 20.08.1995, известного как миелопид, путем выделения клеток из костного мозга свиньи, их культивирования в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования и выделения целевого продукта гельхроматографией на колонке, заполненной сефадексом G-50. Фракции, элюированные в области выхода цитохрома G с молекулярной массой около 13000 Da, концентрируют лиофилизацией.
Известен также способ получения белка, RU 2298939 C2, A61K 35/28, 20.05.2007, путем выделения клеток их костного мозга лисиц, их суспендирование, фильтрацию, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, фильтрации через капроновые фильтры и осаждению 10% раствором трихлоруксусной кислоты и последующему диализу проточной водой.
Недостатки данных способов заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.
Упрощение способа выделения общего белка из трубчатых костей костного мозга и повышение чистоты целевого продукта достигаются тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. Трубчатые кости отделяют от плоти. Клетки костного мозга из бедренной или плечевой кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой Игла М в колбу. Содержимое колбы тщательно перемешивают до однородного состава пипетированием. Полученные клетки суспензии пропускают через капроновые фильтры для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывают 3 раза охлажденной средой Игла М. Фильтрат подвергают центрифугированию в течение 5-7 мин при 3 тыс. об/мин, затем пипеткой с надосадочной жидкости снимают остатки желтого костного мозга. Далее осадки с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации, в результате которого достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга (который затем отбрасывают) и происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор.
Выделение общего белка проводят следующим образом.
В пробирки для центрифугирования с раствором белков добавляют раствор сульфата аммония из расчета 6 частей раствора белка 3 части раствора соли. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревают до температуры 40-60°C (в том случае если белки осаждаются плохо). Экстракты для полного осаждения оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°C. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, вследствие чего происходит дополнительное осаждение белка и увеличивается вес общего белка, выделенного из костного мозга. Осадок белков отделяют от раствора центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут - все перечисленные приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. более полное осаждение и отделение белка костного мозга от раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью полного удаления растворов сульфата аммония и трихлоруксусной кислоты и восстановления гидратных оболочек пептида. Для этого раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) коллодийной пленкой. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 суток при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1-2 часов. Отсутствие соли контролируют нейтральной реакцией с индикатором.
Пример 1.
Бедренные кости от 6 коз отделяют от плоти, затем проводят распил кости с двух сторон в центре и вымывают костное содержимое средой Игла М в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры, которые предварительно стерилизуют. Фильтрат центрифугируют в течение 7-10 минут при 3 тыс. об/мин. Осадок и надосадочную жидкость подвергают гомогенизации с помощью гомогенизатора типа Mini Mix 100VW в течение 12-15 минут. Впоследствии проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой Игла М в разведении 1:10 в камере Горяева, в осадке обнаруживается гомогенная масса. Содержимое центрифужных пробирок вновь фильтруют через капроновые фильтры. Белки осаждают из раствора путем высаливания раствором сульфата аммония из расчета на 6 частей раствора белка 3 части сульфата аммония, оставляют отстаиваться на 12 часов. Осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.
Вес общего белка, выделенного из костного мозга коз, составляет 206±0,34 мг. Белок представляет собой сухой аморфный порошок светло-коричневого цвета.
Пример 2.
Трубчатые кости от 4 сибирских косуль отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают путем высаливания сульфатом аммония из расчета на 6 частей раствора белка 3 части сульфата аммония.
Содержимое колбы нагревают до температуры 40-60°C, оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°C. В колбе наблюдаются обильные хлопья осажденного белка. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из мозгового вещества сибиркой косули, выделенных данным способом, составляет 208±0,28 мг. Белок представляет собой аморфный порошок красно-коричневого цвета.
(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).
Пример 3.
Трубчатые кости от трех лосей отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка из костного мозга лося составляет 219±0,53 мг. Сухой кристаллический белок костного мозга лося переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подвергают диализу, поместив в емкость с коллодийной пленкой. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде протекает сутки (pH 8,0-8,5). Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение двух часов (нейтральная реакция индикатора). Содержание общего белка определяют с помощью биохимического анализатора типа Chem-7.
Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из трубчатых костей костного мозга является доступность, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, увеличение веса целевого продукта.
Claims (1)
- Способ выделения белков из костного мозга, предусматривающий извлечение клеток костного мозга, их суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, осадки вместе с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации, затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры, белки раствора высаливают с помощью сульфата аммония при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°C и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, к надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле, к полученному порошку добавляют 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 сут и дистиллированной водой в течение 1 ч, центрифугирование раствора при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013134870/10A RU2553334C2 (ru) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | Способ выделения белков из клеток костного мозга |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013134870/10A RU2553334C2 (ru) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | Способ выделения белков из клеток костного мозга |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013134870A RU2013134870A (ru) | 2015-01-27 |
RU2553334C2 true RU2553334C2 (ru) | 2015-06-10 |
Family
ID=53281329
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013134870/10A RU2553334C2 (ru) | 2013-07-23 | 2013-07-23 | Способ выделения белков из клеток костного мозга |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2553334C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2726615C1 (ru) * | 2019-09-16 | 2020-07-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО Дальневосточный ГАУ) | Способ выделения белков из костного мозга животных |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2041716C1 (ru) * | 1993-01-05 | 1995-08-20 | Рэм Викторович Петров | Способ получения миелопида |
RU2298939C2 (ru) * | 2005-06-27 | 2007-05-20 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Дальневосточный государственный аграрный университет | Способ выделения белков из клеток костного мозга |
UA40805U (ru) * | 2008-11-26 | 2009-04-27 | Национальный Университет Биоресурсов И Природопользования Украины | Способ прижизненного получения стромальных стволовых клеток костного мозга животных |
-
2013
- 2013-07-23 RU RU2013134870/10A patent/RU2553334C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2041716C1 (ru) * | 1993-01-05 | 1995-08-20 | Рэм Викторович Петров | Способ получения миелопида |
RU2298939C2 (ru) * | 2005-06-27 | 2007-05-20 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Дальневосточный государственный аграрный университет | Способ выделения белков из клеток костного мозга |
UA40805U (ru) * | 2008-11-26 | 2009-04-27 | Национальный Университет Биоресурсов И Природопользования Украины | Способ прижизненного получения стромальных стволовых клеток костного мозга животных |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2726615C1 (ru) * | 2019-09-16 | 2020-07-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Дальневосточный государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО Дальневосточный ГАУ) | Способ выделения белков из костного мозга животных |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013134870A (ru) | 2015-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rider et al. | ExtraPEG: a polyethylene glycol-based method for enrichment of extracellular vesicles | |
EP2906717B1 (en) | Method of painting microvesicles | |
EP2875348B1 (en) | Method for the isolation of microvesicles | |
CN104152519B (zh) | 一种酶溶性高纯超螺旋结构ⅰ型胶原蛋白的制备方法 | |
WO2019160519A2 (en) | Exosome isolation method by two phase fluid system | |
Rao et al. | Novel approach towards recovery of glycosaminoglycans from tannery wastewater | |
WO2019142853A1 (ja) | エクソソームの製造方法及びその製造方法によって得られるエクソソーム | |
RU2553334C2 (ru) | Способ выделения белков из клеток костного мозга | |
Piening et al. | Matrix-Bound Nanovesicles: What Are They and What Do They Do? | |
RU2298939C2 (ru) | Способ выделения белков из клеток костного мозга | |
RU2621311C1 (ru) | Способ получения протеогликана | |
KR102153079B1 (ko) | 마린 콜라겐의 대량생산을 위한 고순도 정제방법 | |
EP4353815A1 (en) | Method for isolating extracellular vesicle using salt fractional precipitation | |
Lorenzini et al. | Producing vesicle-free cell culture additive for human cells extracellular vesicles manufacturing | |
RU2726615C1 (ru) | Способ выделения белков из костного мозга животных | |
HIRABAYASHI et al. | Studies on muscle differentiation. I. Isolation and purification of structural proteins from leg muscles of the frog, Rana nigromaculata. | |
KR102161946B1 (ko) | 측분비인자 및 이의 제조방법 | |
JP6853983B2 (ja) | 生物物理学的解析に適した膜小胞の調製方法 | |
Barraco et al. | Paleobiochemical analysis of an Egyptian mummy | |
US20180185472A1 (en) | Method of painting microvesicles | |
CN101698680A (zh) | IgY免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法 | |
JP6434525B2 (ja) | 綱赤血球増殖因子並びにその調製方法及び使用 | |
RU2270021C2 (ru) | Способ получения трансфер-фактора крупного рогатого скота | |
RU2669691C1 (ru) | Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью | |
CN116555160B (zh) | 一种白芍外泌体和汤剂体的提取方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150726 |