RU2005133633A - Способ продукции рекомбинантной стафилокиназы при регулировании уровня кислорода - Google Patents

Claims (23)

1. Нуклеотидная последовательность кассеты экспрессии OXY-1 с последовательностью SEQ ID No. 1.

2. Ген модифицированной стафилокиназы SAK-2 с последовательностью SEQ ID No. 2.

3. Пептидная последовательность гена модифицированной стафилокиназы SAK-2 с последовательностью SEQ ID No. 3.

4. Плазмида pOXYSAK-1 с международным инвентарным номером BPL-0020, депонированная в международном банке-депозитарии "Microbial Type Culture Collection" при институте "Institute of Microbial Technology", Chandigarh, India.

5. Плазмида pOXYSAK-2 с международным инвентарным номером BPL-0021, депонированная в международном банке-депозитарии "Microbial Type Culture Collection" при институте "Institute of Microbial Technology", Chandigarh, India.

6. Рекомбинантная E. Coli с международным инвентарным номером 5147, международным банком-депозитарием является "Microbial Type Culture Collection" при институте "Institute of Microbial Technology", Chandigarh, India, содержащая плазмиду pOXYSAK-1 с международным инвентарным номером BPL-0020.

7. Рекомбинантная E. Coli с международным инвентарным номером 5148, международным банком-депозитарием является "Microbial Type Culture Collection" при институте "Institute of Microbial Technology", Chandigarh, India, содержащая плазмиду pOXYSAK-2 с международным инвентарным номером BPL-0021.

8. Способ повышенной продукции стафилокиназы и ее аналогов путем модуляции уровня кислорода в среде для ее выращивания в системе-хозяине, где указанный способ включает в себя стадии

a. получения части ДНК, несущей генетическую информацию для продукции стафилокиназы,

b. модифицирования 10 амино-концевых остатков ДНК, кодирующей SAK, где остатки Lys6 и Lys8 SAK заменяют на небольшие нейтральные аминокислотые остатки,

c. конструирования ДНК кассеты экспрессии OXY-1 по п.1,

d. интегрирования части ДНК, полученной на стадии (a) или на стадии (b) в кассету-экспресси OXY-1 с получением pOXYPRO и последующее введение pOXYPRO в плазмидный вектор с получением плазмидной конструкции pOXYSAK-1 и pOXYSAK-2 соответственно,

e. введения плазмидной конструкции стадии (е) в систему-хозяин,

f. культивирования клетки-хозяина для повышенной продукции SAK или ее производных при высокой степени аэрации и при изменении уровня кислорода ниже атмосферного уровня кислорода на 5%, когда рост клетки достигает экспоненциальной фазы с получением клеточной массы, и

g. лизирования клеток стадии (g) для отделения клеточного лизата от клеточного дебриса с получением, таким образом, стафилокиназы и ее аналогов.

9. Способ по п.8, где остатки Lys6 и Lys8 SAK заменяют на небольшие и нейтральные аминокислотные остатки.

10. Способ по п.8, где плазмидным вектором является плазмида с высоким или средним числом копий.

11. Способ по п.8, где система-хозяин выбрана из группы, включающей E. coli, Bacillus и дрожжи.

12. Способ по п.8, где последовательность OXY-1 модифицирована в зависимости от системы-хозяина.

13. Способ по п.8, где аминокислоты выбраны из группы, включающей аланин и глицин.

14. Способ по п.8, где средой для выращивания является среда Luria Broth (LB).

15. Способ по п.8, где культивирование клетки-хозяина для повышенной продукции SAK или ее производных осуществляют в культуре встряхиваемой колбы или при ферментации.

16. Способ по п.15, где культивирование клеток-хозяев осуществляют до тех пор, пока O.D. 600 не достигнет значения 0,6-0,7.

17. Способ по п.15, где ферментация является двухстадийной периодической ферментацией с подпиткой.

18. Способ по п.8, где клетчатую массу получают путем центрифугирования или фильтрации.

19. Способ по п.8, где лизирование клеток осуществляют способом, выбранным из группы, включающий лизис ультразвуком, химический и механический лизис.

20. Способ по п.8, где отделение клеточного лизата от клеточного дебриса осуществляют путем центрифугирования.

21. Применение введения фармацевтически эффективного количества аналога стрептокиназы SAK-2, необязательно, с добавкой (добавками), растворяющего кровяной сгусток у пациента при необходимости такого растворения.

22. Применение по п.21, где добавка выбрана из группы, включающей питательные вещества, состоящие из белков, углеводов, сахара, талька, стеарата магния, целлюлозы, карбоната кальция, крахмал-желатиновой пасты, и/или фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, разбавитель или растворитель.

23. Применение по п.21, где соотношение SAK-2 и добавок изменяется в пределах от 1:10 до 10:1.