CN115820585A

CN115820585A - 一种腺苷酰化蛋白a8突变体及其编码基因与应用

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Publication number: CN115820585A
Application number: CN202211082606.5A
Authority: CN
Inventors: 吴杰群; 翁杨菁
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-09-06
Filing date: 2022-09-06
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了一种腺苷酰化蛋白A8突变体以及其编码基因，以及其作为腺苷酰化结构域关键酶在Gly⁸取代的达托霉素结构类似物中的应用。所述腺苷酰化蛋白A8突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺苷酰化蛋白A8第277位氨基酸经点突变而得。本发明利用基因工程和酶工程手段，对A域的活性位点进行研究，通过构建突变体确定了与A域底物特异性相关的关键氨基酸残基(A8第277位残基)，为达托霉素家族化合物结构的扩展提供了新的途径。本发明获得的突变体Y277P与腺苷酰化蛋白A8相比，底物特异性发生改变，对L‑Ala的活性大幅降低，而对L‑Gly的活性大幅提高，为获得Gly⁸取代的达托霉素结构类似物提供了新的途径。

Description

一种腺苷酰化蛋白A8突变体及其编码基因与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种腺苷酰化蛋白A8突变体以及其编码基因，以及其作为腺苷酰化结构域关键酶在催化合成Gly⁸取代的达托霉素结构类似物中的应用。

(二)背景技术

达托霉素是一种由玫瑰孢链霉菌产生的环状脂肽，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等高致病性耐药菌具有很好的杀菌效果，具有较高的临床应用价值。不同于传统的由核糖体通过中心法则转录翻译合成蛋白质或多肽的机制，达托霉素是由非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptidesynthetases，NRPSs)合成的一类多肽。非核糖体肽合成酶是由多个模块组成的复合酶酶系，每个模块负责一轮肽键的延伸，并且模块与氨基酸的组装顺序存在一一对应的关系。其中模块化催化单元最基本的功能域包括缩合域、腺苷酰化域、肽基载体蛋白结构域(Thiolation domain,T域)。达托霉素的NRPS包含由DptA、DptBC、DptD三个亚基，每个亚基分别包含5、6、2个模块。13个模块和末端的硫酯酶结构域线性化排列组成，每个模块依次加载一个特定的氨基酸到正在延伸的肽链上。其中A域识别激活相应的氨基酸后，在Mg2+作用下，利用ATP形成氨基酰-AMP；磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶从辅酶A分子捕获磷酸泛酰巯基转移到T域的Ser羟基上，使T域成为活化的形式，氨基酰-AMP被转运到活化后的T域巯基上，形成氨酰硫酯；随后转移到C域，C域催化该氨酰硫酯与上游肽链的缩合；最后在硫酯酶结构域的催化下，Kyn13的羧基与Thr4的羟基之间形成酯键，环肽从NRPS上释放下来；Trp残基上连有一个正癸酰基，被DptE、DptF活化后通过DptE、DptF与DptA的相互作用，在DptA第一个CIII结构域的催化下与模块一T域上的Trp₁之间发生缩合，最终形成达托霉素。

在达托霉素的生物合成过程中，A域从氨基酸底物池中选择相对应的特异氨基酸合成相应的氨基酰-AMP。有报道显示，A结构域中有十个非连续编码的关键氨基酸残基决定了其底物识别的特异性。因此确定A域的活性位点并对其进行改造，从而获得更多具有重要生物活性的新型达托霉素结构类似物，具有重大应用意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供能够改变腺苷酰化蛋白A8底物特异性的腺苷酰化蛋白A8突变体以及其编码基因，以及其作为腺苷酰化结构域关键酶在催化合成达托霉素结构类似物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种腺苷酰化蛋白A8突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺苷酰化蛋白A8第277位氨基酸经点突变而得。本发明利用基因工程和酶工程手段，对A域的活性位点进行研究，通过构建突变体确定了与A域底物特异性相关的关键氨基酸残基(A8第277位残基)，为达托霉素家族化合物结构的扩展提供了新的途径。

该腺苷酰化蛋白A8基因来源于玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseospoous)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，相应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1序列如下：

ARVLTEWNDTGVPGVPETFLELFEAQVAARGDAPAVVYEGEVLSYRELDARANRLAGLLVGRGAGPEHFVGVALPRGLDLIVALLAVLKSGAAYVPLDPEYPAERLVHMVTDAAPVVVVTSTDVRTLRTVPRVELDDEATRATLVAAPATGPDVKMSASHPAYVIYTSGSTGRPKGVVISHGSLANFLAWAREDLGAERLRHVVLSTSLSFDVSVVELFAPLSCGGTVEIVRNLLALVDRPGRWSASLVSGVPSAFAQLLEAGLDRADVGMIALAGEALSARDVRRVRAVLPGARVANFYGPTEATVYATAWYGDTPMDAAAPMGRPLRNTCVYVLDDGLRVVPVGVVGELYVAGVGLARGYLGRVGLTAERFVACPFGARGERMYRTGDLVRWRVDGTLEFVGRADDQVKVRGFRVELGEVEGAVAAHPDVVRAVVVVREDRPGDHRLVAYVTGVDTGGLSSAVMRAVAERLPAYMVPSAVVVLDEIPLTPNGKVDRAGLPVPVVSVAGFCAPSSPREEVLCGLFAEVLGVERV

优选的，所述腺苷酰化蛋白A8突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3序列如下(下划线为突变位点)：

ARVLTEWNDTGVPGVPETFLELFEAQVAARGDAPAVVYEGEVLSYRELDARANRLAGLLVGRGAGPEHFVGVALPRGLDLIVALLAVLKSGAAYVPLDPEYPAERLVHMVTDAAPVVVVTSTDVRTLRTVPRVELDDEATRATLVAAPATGPDVKMSASHPAYVIYTSGSTGRPKGVVISHGSLANFLAWAREDLGAERLRHVVLSTSLSFDVSVVELFAPLSCGGTVEIVRNLLALVDRPGRWSASLVSGVPSAFAQLLEAGLDRADVGMIALAGEALSARDVRRVRAVLPGARVANFYGPTEATVPATAWYGDTPMDAAAPMGRPLRNTCVYVLDDGLRVVPVGVVGELYVAGVGLARGYLGRVGLTAERFVACPFGARGERMYRTGDLVRWRVDGTLEFVGRADDQVKVRGFRVELGEVEGAVAAHPDVVRAVVVVREDRPGDHRLVAYVTGVDTGGLSSAVMRAVAERLPAYMVPSAVVVLDEIPLTPNGKVDRAGLPVPVVSVAGFCAPSSPREEVLCGLFAEVLGVERV

由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及编码所述腺苷酰化蛋白A8突变体的基因。

具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(该基因编码SEQ ID NO.3所示氨基酸)。

SEQ ID NO.4序列如下(下划线为突变位点)：

gcccgtgtcctgacggagtggaatgacacgggcgtccccggtgtgccggaaacattcctggagttgttcgaggcgcaggtcgcggcccggggtgacgcgccggcggtcgtgtacgagggtgaggttctgtcgtaccgggaactcgacgcgcgggcgaaccgcctggccgggctgctggtggggcgcggtgcgggcccggagcatttcgtgggggtggcgctgccgcgtgggctggatctgatcgtggccctgctggccgtgctcaagtccggtgccgcgtacgttcccctggacccggagtacccggccgagcggctggtccacatggtcaccgacgccgcccccgtcgtggtcgtgacctccaccgacgtacgtactctgcggaccgttccccgggtcgagctggacgacgaggcgacccgcgccaccctggtcgcagcccccgccacagggcccgacgtgaagatgtccgcctcccaccccgcgtacgtgatctacacctccgggtccacgggccgccccaagggcgtcgtcatcagccacggcagcctggccaacttcctcgcctgggcgcgggaagacctgggtgccgagcggctccggcacgtcgtgttgtccacgtccctcagcttcgacgtctccgtggtcgaactcttcgccccgctgtcctgcggcggcaccgtcgagatcgtccggaatctgctggccctcgtcgaccgccccggccgatggtccgcgagcctggtcagcggcgtgccgtcggccttcgcgcagctgctggaagccggcctcgaccgggccgacgtgggcatgatcgccctggccggcgaggcgctgtccgctcgcgacgtgcgccgcgtccgcgctgtgctgcccggggcccgcgtggccaacttctacggcccgaccgaagccaccgtccccgccacggcctggtacggcgacacccccatggacgccgcggcccccatgggccggcccctgcgcaacacgtgtgtgtatgtgctggacgacgggctgcgcgtggtgccggtcggtgtggtgggtgagctgtatgtggcgggtgtgggtctggcgcggggctatctcgggcgtgtgggtctgacggcggagcggtttgtggcgtgtccgttcggtgcgcggggtgagcgtatgtatcgcacgggggatttggtgcggtggcgggtggacggcacgcttgagtttgttggtcgtgcggatgatcaggtgaaggtccgtggtttccgtgtggagttgggtgaggtggagggtgctgttgcggcgcatcctgatgtggtgcgtgcggttgttgtggtgcgtgaggaccggccgggtgatcaccggttggttgcgtatgtcaccggtgttgacacgggtggactgtcctctgcggtgatgcgtgccgttgctgagcgtctgcctgcgtacatggtgccgtcggcggtggtggttctggatgagatcccgttgacgccgaacgggaaggtggaccgggcgggtcttccggtgccggtggtgtcggtggcggggttctgtgcgccgtcgtcgccgcgggaggaggtgttgtgtggtctgttcgcggaggtgctgggtgttgagcgggtg

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组菌。

本发明还涉及所述腺苷酰化蛋白A8突变体作为腺苷酰化结构域关键酶在催化合成达托霉素结构类似物中的应用。达托霉素的生物合成途径参见图1，本发明体外改造的突变体来源于module 8中的A域。

本发明关键在于突变位点的选择，在已知所述腺苷酰化蛋白A8序列及其突变体位点的前提下，本领域普通技术人员可根据SEQ ID NO.1的腺苷酰化蛋白基因，设计定点突变的突变引物，以携带腺苷酰化蛋白A8的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pET-28a或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)细胞筛选验证后的阳性单克隆进行培养，获得含有本发明突变体的重组菌株。

具体的，建突变体的步骤如下：

(1)将从玫瑰孢链霉菌达托霉素生物合成基因簇中获得的编码腺苷酰化蛋白A8的基因，克隆到表达载体中，构建A8重组表达质粒；

(2)利用定点突变技术，设计含有突变氨基酸的密码子碱基的互补引物，以重组质粒为模板进行反向PCR，得到含有定点突变目标载体片段；

(3)将含有定点突变目标载体片段的PCR反应液用Dpn I内切酶消化，去除未成功突变的原质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳回收片段；

(4)将回收得到的含有定点突变目标载体片段转化到感受态大肠杆菌DH5α中，平板培养挑取正确单克隆，并提取正确突变的质粒；

(5)将正确的重组质粒分别与五种分子伴侣质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。

所述方法还进一步包括使用Ni-NTA 1mL镍柱、脱盐柱、超滤管对腺苷酰化蛋白进行纯化。

将所述方法中步骤(5)获得的重组菌株挑取至卡那霉素浓度为50μg/ml、氯霉素浓度为25μg/ml的5mL LB液体培养基中，37℃下220rpm摇床中过夜培养，取1.5mL的LB液体培养物，接种至150mL TB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为0.4mMIPTG 16℃过夜诱导，培养完后12000rpm 4℃离心收集菌体，并称重，加入重量5倍体积的破胞液，重悬，在4℃的低温超高压细胞破碎仪中破胞，在4℃下12000rpm离心10min收集上清，此即为粗酶液。

本发明的有益效果主要体现在：本发明获得的突变体Y277P与腺苷酰化蛋白A8相比，底物特异性发生改变，对L-Ala的活性大幅降低，而对L-Gly的活性大幅提高，为获得Gly⁸取代的达托霉素结构类似物提供了新的途径。

(四)附图说明

图1为达托霉素的生物合成途径。

图2为达托霉素及Gly⁸取代的结构类似物的化学结构式，方框内的氨基酸分别为丙氨酸和甘氨酸。

图3为腺苷酰化蛋白A8及突变体G220T、A242L、Y277P、G220T/A242L的蛋白表达；泳道1为蛋白Marker、泳道2为A8上清、泳道3为A8^-G220T上清、泳道4为A8^-A242L上清、泳道5为A8^-G220T/A242L上清、泳道6为A8^-Y277P上清。

图4为FeCl₃检测法的反应原理。

图5为腺苷酰化蛋白A8对不同底物的活性比较。

图6为腺苷酰化蛋白突变体G220T对不同底物的活性比较。

图7为腺苷酰化蛋白突变体A242L对不同底物的活性比较。

图8为腺苷酰化蛋白突变体G220T/A242L对不同底物的活性比较。

图9为腺苷酰化蛋白突变体Y277P对不同底物的活性比较。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例1：野生型腺苷酰化蛋白A8表达质粒的构建

(1)以实验室保存的玫瑰孢链霉菌基因组为模板，设计带有与pET-28a(+)重组同源片段的上下游引物F/R进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用小量DNA纯化试剂盒回收目的片段备用。

F：TGCCGCGCGGCAGCCATATGGCCCGTGTCCTGACGGAGTG

R：CAAGCTTGTCGACGGAGCTCCTACACCCGCTCAACACC

(2)抽提表达质粒pET-28a(+)，用Nde I和Hind III双酶切，回收备用。

(3)将上述回收备用的载体和片段用SoSoo试剂盒进行重组，并化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得到含重组表达质粒pET-28a+A8的克隆菌株。

实施例2：通过序列比对预测关键氨基酸残基

为预测腺苷酰化蛋白与底物结合口袋相关的关键残基，通过NCBI下载了GrsA、SlgN1、CmiS6、IdnL1、DltA这5种已通过X射线衍射确定蛋白结构及活性位点的氨基酸序列，它们的PBD编号分别为1AMU、4GR5、5JJP、5JJQ、3DHV。将这些氨基酸序列和实施例1中A8的氨基酸序列进行多序列比对，初步筛选得到可能与该模块A域底物特异性相关的关键残基如表1所示。

表1：通过多序列比对预测活性位点的结果

实施例3：腺苷酰化蛋白突变体表达质粒的构建

(1)以实施例1中构建的pET-28a+A8表达质粒为模板，设计定点突变引物G220T-F/R、A242L-F/R、G220T/A242L-F/R、Y277P-F/R分别进行反向PCR。

具体定点突变引物如下(下划线为突变位点)：

G220T-F:ACTGTGCCGTCGGCCTTCGCGCAGCTGCTGGAAGCCGGCC

G220T-R:GCGAAGGCCGACGGCACAGTGCTGACCAGGCTCGC GGACC

A242L-F:CTCCTGGCCGGCGAGGCGCTGTCCGCTCGCGACGTGCGCC

A242L-R:AGCGCCTCGCCGGCCAGGAGGATCATGCCCACGTCGGCCC

G220T/A242L-F:CTCCTGGCCGGCGAGGCGCTGTCCGCTCGCGACGTGCGCC

G220T/A242L-R:AGCGCCTCGCCGGCCAGGAGGATCATGCCCACGTCGGCCC

Y277P-F:CCCGCCACGGCCTGGTACGGCGACACCCCCATGGACGCCG

Y277P-R:CCGTACCAGGCCGTGGCGGGGACGGTGGCTTCGGTCGGGC

(2)PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。检测到有目的产物后加入Dpn I酶消化模板，用小量DNA纯化试剂盒回收目的片段备用。

(3)回收得到的突变体PCR片段化转大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到突变体G220T(编码基因SEQ ID NO.5)、A242L(编码基因SEQ ID NO.6)、G220T/A242L(编码基因SEQ IDNO.7)、Y277P(SEQ ID NO.3，编码基因SEQ ID NO.4)的表达质粒pET-28a+G220T、pET-28a+A242L、pET-28a+G220T/A242L、pET-28a+Y277P。

实施例4：腺苷酰化蛋白A8及突变体蛋白的表达与纯化

(1)将构建的质粒pET-28a+A8、pET-28a+G220T、pET-28a+A242L、pET-28a+G220T/A242L、pET-28a+Y277P(与分子伴侣质粒一起)以及pET-28a空质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，构建表达菌株。从平板上挑取单菌落接种到卡那霉素浓度为50μg/ml、氯霉素浓度为25μg/ml的LB培养基试管中，37℃、220rpm下恒温震荡培养过夜，按照1％接种量接种到卡那霉素浓度为50μg/ml、氯霉素浓度为25μg/ml的TB液体培养基中。37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为0.4mM IPTG 16℃过夜诱导蛋白表达。

(2)在16℃、180rpm条件下过夜诱导表达后，12000rpm 4℃离心收集菌体，并称重，加入重量5倍体积的破胞液，重悬，在4℃的低温超高压细胞破碎仪中破胞，在4℃下12000rpm离心10min收集上清，此即为粗酶液。

(3)经SDS-PAGE验证蛋白表达，如图3所示，结果表明目的蛋白有可溶性表达。

实施例4：FeCl₃检测法测定A8及各个突变体蛋白对底物的腺苷酰化活性

FeCl₃检测法原理：A域识别激活底物氨基酸会将其腺苷酰化形成氨基酰-AMP，当有羟胺存在时，氨基酰-AMP会与羟胺反应形成异羟肟酸，异羟肟酸会与Fe³⁺形成红色或紫红色的络合物，可以在480nm-540nm之间的吸收波长检测到。如图4所示。

FeCl₃检测法使用到的试剂包括2×腺苷化检测缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0)，100mM MgSO₄溶液，4M羟胺溶液，7M NaOH溶液，100mM ATP，100mM氨基酸溶液，8％三氯乙酸溶液，3.4％FeCl₃溶液。具体反应体系如表2所示，其中2M的羟胺溶液需要现用现配，用移液枪取400μL 4M溶液，225μL 7M NaOH，175μL去离子水，混匀放置于冰上。

表2：FeCl₃法检测A域腺苷酰化活性的具体反应体系

以一个蛋白对20种天然氨基酸进行选择性测定为例，可在100μL体系基础上扩大21倍配制成体系母液，母液中加入除氨基酸外的所有所需试剂。取0.2mL PCR管标记为管1至管20加入5μL不同的100mM氨基酸溶液，管21加入5μL去离子水作为对照，每个PCR管中分别加入95μL体系母液，置于37℃恒温培养箱进行反应，反应24h后向每个反应体系中加入50μL 8％三氯乙酸溶液猝灭反应，再加入50μL 3.4％FeCl3溶液，吸打混匀，显色5min，混合物以12000rpm转常温离心10min，小心吸取100μL上清到透明96孔板中，使用酶标仪在490nm的波长下进行检测。将实验组的吸光值减去以水为底物的对照组的吸光值作为该蛋白对每个氨基酸的选择性。

将PET-28A质粒转化E.coli BL21(DE3)的对照组、腺苷酰化蛋白A8及突变体G220T、A242L、G220T/A242L、Y277P蛋白分别使用FeCl₃检测法对L-丙氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸，L-2-氨基丁酸进行底物特异性检测，结果显示，空PET-28A质粒转化BL21的对照组上清液对底物均无活性，可排除上清液中除目的蛋白外其它杂蛋白对活性检测的干扰。与野生型A8蛋白比较，突变体A8^-Y277对L-丙氨酸的腺苷酰化活性急剧下降，但对L-甘氨酸的腺苷酰化活性急剧提高，这为获得Gly⁸取代的达托霉素结构类似物提供了参考。同时表明A8蛋白277位氨基酸与底物特异性识别相关，对该位点的氨基酸残基进行改造能够改变A8蛋白的底物特异性，对该位点进行突变研究可为达托霉素家族化合物结构的扩展提供新的途径。

以上所述实施例仅是为充分说明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替代或变换，均在本发明的保护范围内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种腺苷酰化蛋白A8突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腺苷酰化蛋白A8第277位氨基酸经点突变而得。

2.如权利要求1所述的腺苷酰化蛋白A8突变体，其特征在所述腺苷酰化蛋白A8突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.编码权利要求1所述腺苷酰化蛋白A8突变体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.含有权利要求3所述编码基因的重组菌。

6.权利要求1所述腺苷酰化蛋白A8突变体作为腺苷酰化结构域关键酶在催化合成Gly⁸取代的达托霉素结构类似物中的应用。